Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Сравнительный анализ плюрипотентных свойств эмбриональных стволовых (ES) клеточных линий мыши in vitro и in vivo

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Сравнительный анализ плюрипотентных свойств эмбриональных стволовых (ES) клеточных линий мыши in vitro и in vivo"

8 АВГ №

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК МЕДИКО-ГЕНЕТИЧЕСКИЙ НАУЧНЫЙ ЦЕНТР

На правах рукописи

УДК 576.536+576.316.7+575.16+591.3

МИТАЛИЛОВ Шухрат Музапарович

СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ ПЛЮРИПОТЕНТНЫХ СВОЙСТВ ЭМБРИОНАЛЬНЫХ СТВОЛОВЫХ (ES) КЛЕТОЧНЫХ ЛИНИЙ МЫШИ IN VITRO И IN VIVO

03.00.15 - Генетика 03.00.23 - Биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1994

Работа выполнена в лаборатории генетики развития Медико-генетического научного центра РАМН. Директор - член-корреспондент РАМН, профессор В.И. Иванов.

Научные руководители:

член-корреспондент РАМН, профессор В.И.Иванов кандидат биологических наук Л.М.Федоров

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Л. Ф.Курило кандидат биологических наук Е.С.Платонов

Ведущее учреждение: Институт молекулярной генетики РАН

Защита диссертации состоится в /(О часов на заседании специализированного Ученого Совета (Д.001.16.01) Медико-генетического научного центра РАМН по адресу: Москва. 115478. ул. Москворечье, д. 1

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Медико-генетического научного центра РАМН.

Автореферат разослан С/'/О-^ ^ 1994Г

Ученый секретарь Специализированного Совета доктор биологических наук, профессор

Л. Ф. Курило

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. Быстрое развитие биологии в целой и генетики в частности за последние десятилетия явилось прежде всего результатом разработки новых, современных методов. Получение культуры эмбриональных стволовых (ES) клеток, сохраняющих основные свойства ранних эмбриональных клеток предстазляет собой аовый ш.отрумент для решения различных вопросов генетики, биологии развития. медицинг и др.

ES клетки мыши способны дифференцироваться in vitro, при этом симулируя нормальное развитие постимплантационного эмбриона. Таким образом. ES клетки могут служить моделью in vitro для изучения процессов дифференцировки и морфогенеза эмбриона в раннем развитии (Doetschroan et al..1985^

Введенные в полость нормальной бластоцисты ES клетки включаются в развитие и могут участвовать в формировании любых органов и тканей химерного организма, включая линию зародышевых клеток. Последнее свойство ES клеток позволяет использовать их в качестве носителей для введения чужеродных генов и получения трансгенных мышей новым, непрямым способом (Gossler et al.,1986; Robertson et al..1986a).

Наибольший интерес для исследователей представляет возмоя-ность сайт-специфичного мутагенеза ES клеток посредством механизма гомологичней рекомбинации между вновь введенной ДНК и гомологичным регионом в геноме ES клеток (gene targeting). Модификация уже идентифицированных генов у ES клеток путем гомологичной рекомбинации дает возможность изучить функции этих генов в процессе развития (DeChlara et al..1990; DeChlara et al..1991; Soriano et al..1991).

Одним из основных вопросов медицинской генетики является изучение патогенеза наследственных аномалий человека, что является

необходимым условием их успешной профилактики и лечения. Изучение механизмов развития наследственных аномалий у человека крайне затруднено в связи с необходимостью получения достаточного материала ранних стадий развития эмбриона и невозможностью в боль-тшнстве случаев проведения экспериментального анализа действия гена. Эффективные методы лечения и профилактики имеются только для относительно небольшого числа болезней, механизмы развития которых известны. В то же время патогенез многих наследственных болезней неясен. Для изучения механизмов развития наследственных болезней могут быть использованы мутантные линии мышей, имевдие сходные с человеком аномалии (Конюхов, 1969). В последнее время придается большое значение поискам таких мутантных линий мышей. Последние могут выступать в роли биологических моделей соответствующих наследственных болезней человека

Использование механизма гомологичной рекомбинации и так называемой "ES клеточной технологии" позволяет направленно индуцировать мутации и получать мутантных мышей с целью моделирования наследственных заболеваний человека (Kuehn et al..1987: Tybule-wlcz et al..l992). Используя подобный подход можно также корректировать мутантные гены ES клеток, что позволяет исправлять наследственные аномалии животных (Koller et al.,1989). Возможность проведения экспериментов такого рода представляет собой идеальную модельную систему генотерапии. что имеет огромное значение для медицинской генетики.

Несмотря на широкое распространение линий ES клеток и интенсивное их использование в научных экспериментах, остается еще ряд проблем ES клеточной технологии. К ним можно отнести убывающую способность ES клеток формировать химер вшьть до полной утраты этой функции, находящейся в прямой зависимости от длительности пас си;: звания культуры. •

Однако публикаций в литературе, посвященных изучению различных факторов, влияющих на способность ES клеток формировать химе-

ры, а в особенности germ-line химеры крайне мало.

Выход химер после инъекции ES ¡слеток в эмбрионы также эг^исит в значительной степени от генотипа и стадии развития эмбриона-реципиента. Однако, исчерпывающий анализ сочетания донор-реципиент даже по наиболее распространенным линиям ES клеток и линиям мышей еще не сделан.

' Цель и задачи исследований- В соответствии с вышеизложенным, целыз работы являлся сравнительный анализ плюрипотентных свойств э: Эриональных стволовых клеточных линий мыши и изучение влияния генетических " средовых факторов на способность ES клеток формировать химеры после инъекции в эмбрионы.

Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:

- освоить технику культивирования ES клеток и методы получения инъекционных химер с использованием ES клеток и клеток ВКМ.

- охарактеризовать в условиях in vitro и in vivo плюрипотент-ные свойства новой ES клеточной линии STR. полученной от мутант-ной линии мышей 14C0S/Glw;

- изучить влияние длительности пассирования и происходящих при этом кариотипических изменений на способность ES клеток линии D3 формировать химерное потомство:

- изучить влияние генотипа эмбриона-реципиента на способность ES клеток продуцировать генеративные химеры;

- разработать простой и наглядный метод предварительного тестирования плюрипотентности ES клеток in vitro, основанный на специфической активности щелочной фосфатазы ES клеток;

Научная новизна. Впервые охарактеризованы в условиях in vitro и In vivo плюрипотентные свойства новой ES клеточной линии STR. Впервые показано влияние длительности пассирования и происходящего при этом увеличения доли анеуплоидных клеток на способность ES клеточной линии D3 формировать хнлерное потомство, .федлокен простой метод предварительного тестирования плюрипотентности ES клеток in vitro по специфической активности эндогенной щелочной

- в -

фосфатазы.

. Практическая значимость. Полученные данные о влиянии различных факторов на потенции эмбриональных стволовых клеток ln vivo позволяют более эффективно использовать ES клетки ь научных экспериментах и получать с высокой частотой химеры и генеративные химеры.

Экспериментальные данные по изучению плюрипотентных свойств ES клеток являются новыми для нашей страны и могут представлять практический интерес в методическом аспекте.

Результаты исследования представляют также медико-генетический интерес и могут послужить первым шагом в создании модельных животных, имеющих сходные с человеком наследственные аномалии.

Апробация диссертации. Основные положения диссертации были представлены на отчетной конференции ГНТП "Приоритетные направления генетики" (Москва. 1993), на V научной конференции по генетике соматических клеток в культуре (Черноголовка. 1993). на 4-ой конференции "Геном человека" (Черноголовка. 1994), на научном семинаре лаборатории генетики развития МГНЦ РАМН в марте 1994 года, на научной конференции отдела биотехнологии ВНИИ животноводства РАСХН в апреле 1994 года и на научном семинаре института генетики человека МГНЦ РАМН, состоявшемся в мае 1994 года.

Публикации. По материалам диссертации опубликованы 2 экспериментальные научные статьи. 3 тезиса.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 114 страницах машинописного текста, состоит из следующих разделов: введение. обзор литературы, материал и методы, результаты, обсуждение, выводы, список литературы. Указатель литературы содержит 13 отечественных и 135 иностранных библиографических источника. Диссертация иллюстрирована 2 схемами, 12 таблицами. 4 рисунками и 10 фотографиями.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

Работа выполнена по плану НИР лаборатории генетики развития

МГНЦ РAlfil в рамках ГНТП "Приоритетные направления генетики" и "Геном человека" (гранты N06-r93 и N482). На рисунке 1 представлена комплексная схема проведения экспериментов, в результате которых были получены данные по характеристике ES клеток In vitro, их кариологии и способности формировать химеры.

1. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

ES клетки. Два клона~D3M и D3W ES клеточной линии D3 Ujeta-с: .пап et al., 1985) лвбезно предоставлены соответственно Dr.'G. Brem из университета Людвига Максимилиана (Мюнхен,Германия) и Dr.R.Kemler из института иммунобиологии Общества Макса Планка (Фрайбург, Германия). ES-D3 клетки являются мужской линией и получены из бластоцисты мышей линии 129/Ter Sv (окрас агути).

Линия ES клеток STR предоставлена к.б.н. Н. С. Стрельченко (Institut fur Tierzucht und Tierverhalten. Мариензее, Германия). ES-3TR клетки получены из бластоцисты мышей линии 14C0S/G1W.- В гомозиготном состоянии (с14со® /с,4С0В , мутация albino letale) мыш погибавт вскоре после рождения. Гомозиготы дефицитны по крайней мере по пяти печеночным ферментам: глютсозо-6-фосфатазе, тирозин аминотрансферазе. серин дегидратазе, глютамин синтетазе, UDP-гажоронилтрансферазе, а такта характеризуются низким уровнем .печеночного микросонального цитохрома Р-450 и белков плазмы: альбумина, альфа-фетопротеина и трансферрина (Green,1981).

Культивирование ES клеток проводили в среде DMEM, содержащей 1555 эмбриональной телячьей сыворотки. 0.1 гаМ 2-меркаптоэтанола и 1шМ L-глютамина. . В качестве питающего (фидерного) слоя для ES клеток использовали первичную культуру эмбриональных фиброблас-тов, пролиферация которых была блокирована митомицином С (10 мкг/мл).

Цитохимический тест на специфическую активность шель «ой Дюс-• Фатазы ES клеток. ES клетки высевали на покровные стекла с блокированным слоем фидерных клеток. Через сутки клетки фиксировали

СХЕМА ЭКСПЕРИМЕНТА 129/^1/

изоляция ВК.1 бластоцасты

ЕЗ-клеил в культуре

инъекция бластовдст

трофектодерка

внутренняя клеточная касса ( БКм )

дадаереишровка Е5-клеток

караотипическаИ анализ К-клеток

трансплантация локнобеременноЕ О сайке ^ -

химерное потомство

^рансыассия Рдс. I.

вазэктоьшрованныЯ ^ самец

охладденным ацетоном (+4° С) в течение 1 мин, затем инкубировали в свежеприготовленном растворе красителя прочный синий ВВ и субстрата AS-BI фосфат в течение 1 часа при 37° С. Раствор красителя и субстрата готовили согласно методике изложенной лойдом (Лойда и др.1982).

Препараты метафазных пластинок ES клеток готовили согласно методике, нзлопенной Робертсон (Robertson 1987);

Получение химерных w'refl. Эмбрионы на стадии бластоцисти изв-л^.шли из рогов матки самок линий C57BL/6. BALB/c я тетрагибридов CBWA на 3,5 су-ки после обнарукения вагинальных пробок.

ES клетки на 2-е сутки после пересева диссоциировали до одноклеточной суспензии, используя раствор трипсин-EDTA и удаляли фидерные клетки. Суспензию ES клеток и эмбрионы переносили в камеру с каплей среды М2 (Hogan et al.,1986), покрытую силиконовым маслом и смонтированную на ггоедметный столик инвертированного микроскопа (Nikon). 10-15 (либо 35-40) клеток инъецировали в полость бластоцисты, используя инъекционную и придерживающую пипетки соединенные с микроманипуляторами (Narlshlge). как описано нами ранее (Миталипов и др. 1993).

После 1-2 часов культивирования в среде М2 при 37° С, прооперированные бластоцисты трансплантировали в матку лоннобеременных самок CBWA. Идентификацию химер проводили визуально, по окрасу шерстного покрова.

В возрасте 8-10 недель химерных мышей скрещивали для выявления животных способных передавать ES генотип потомству. Химер D3-*-C57BL/6 подсаживали к мышам линии C57BL/6. Мыши линии 129/Sv (ES-D3) имеют гены окраски шерсти А"А",ВВ.СС. а мыши C57BL/6 -аа.ВВ.СС. Наличие в потомстве мышей с окрасом агути свидетельствует о передаче химерной мышью генотипа ES клеток.

Химер D3->-BALB/c и D3-»-CBWA -крещивали с мылами AKR • (aa.bb.cc).

Статистическая обработка результатов. Полученные данные обра-

батывали при помощи статистических методов, используя критерий X2 и.критерий качественных различий, рассчитанный точным методом Фишера.

2. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Тестирование на шшрипотентностъ ES клеток в системе In vltrn Как указывалось выше ES клетки линий STR и D3 культивировались на монослое блокированных митомицином С эмбриональных фибробластов мыши. ES-STR и ES-D3 клетки имели морфологию, характерную для ES клеток, культивируемых на фидерном слое. Колонии ES клеток становились хорошо видимыми на 2-е сутки после пересева.

Клетки STR имели меньшую по сравнению с D3 скорость роста и пересевались с интервалом 3-е суток в соотношении 1:3. Клетки D3 пересевались на 2-е сутки в соотношении 1:5 или 1:7.

Одной из важных характеристик ES клеток является их способность дифференцироваться in vitro в различные типы клеток при культивировании без фидерного слоя. При суспензионном культивировании ES клеток наблюдали образование эыбриоидных тел различной слояности.

Известно, что плюрипотентные клетки эмбриобласта бластоцисты. эпибласта 5-6-дневного эмбриона, первичные половые клетки, линии стволовых клеток тератокарцином и ES клетки обладают высокой активностью эндогенной щелочной фосфатазы (ALP) (Wobua et al.. 1984; Дыбан, 1988). Специфическая активность ALP ранних эмбриональных клеток, по мнению Wobus с соавторами (1984), может рассматриваться как биохимический маркер плюрипотентности стволовых клеток. Авторы в этих работах выделяли клеточные зкс.ракты. и проводили количественную оценку активности ALP флюориметрическим методомГ При эрм было показано; что активность ALP ранних эмбриональных клеток более чем в 10 раз превосходит таковую у дифференцированных клеток. Однако использовать данный метод' выявления ALP в ка-

честве теста на плюрнпотентность ES клеток In vitro не представляется возможным из-за слогности. Поэтому мы поставили перец собой задачу разработать простой, но вместе с тем достаточно наглядный метод тестирования, основанный на качественной оценке активности ALP ES клеток.

Цитохимическим окрашиванием нами впервые выявлена специфическая активность щелочной фосфатазы ES клеток, которая падает в процессе дифференцировки.~ Представленные результаты цитохи [чес-к го окрашивания ES клеток и безуспешные попытки окрашивания других культур дифференцированных клеток убепдаат. что данный метод могэт слугить достаточно наглядным и просты:! тестом на плюрнпотентность ES клеток In vitro.

Результаты капиотипического анализа ES клеток. Для выявления кариотипическнх изменений ES клеток, прошедших различное число пассагей с момента введения в культуру (STR), либо с момента субклошфопання (DSV/. DSM). проведен кариотипическиП анализ двух клопов ES клеточной лппш D3 jj линии STR. Отбор метафазных плас-тгаюк, пригодных для подсчота числа хромосом, проводили по критериям, прэдлогемпмм Н.П.Бочковые с соавторами (1972). Было исслэ-добшю по 50 мотг^ззньк пластинок каядого образца. Распределение ниan хромосом па ггасс&м показано в таблице 1.

Кая видно из таблицы, с увеличением числа naccasefl ES-D3 клеток, меняется и распределение числа хромосом в сторону увеличения " доли клеток с аиеуплоидным набором. У клона D3M. прошедшего 42 пассата с момента субклонирования, только 58% клеток имели нормальный эуплоидиый (2п - 40) набор хромосом, в то время как у клона D3W (17-й пассая) 82% клеток имели нормальное число хромосом.

У линии ES клеток STR; прошедших к моменту анализа более 20 пассааей. модальный класс хромосом 5ыл 39 (66%). Попытки субкло-' пировать линию STR. для того чтобы отселектировать и размножить клетки с нормальным эуплоидным набором хромосом оказались безус-г

Таблица 1

Распределение метафазных пластинок с различным числом г амосом по классам

Линия I Пол I Число I Модальный I Распределение по классам ES клеток I I пассажейI класс (К) I 35|36I37|38I39|40U1U2<

D3W XY 17 40 (82%) 3 О 1 3 1 41 1

«а

D3M XY 42 40 (58%) 4 2 3 1 4 29 3 4

STR ? 20-24 39 (66Х) 3 3 1 2 33 2 3 3

пешными. Очевидно утеря хромосомы произошла еще на ранних пассажах клеток STR при изоляции.

Изучение потенций клеток STR в системе ln vivo. С целью изучения способности клеток линии STR генерировать химер, нами впервые был проведен эксперимент по инъекции ES-STR клеток в бласто-цисты с последующей трансплантацией их в катку ложнобеременных

Таблица 2.

Сравнительный анализ способности ES клеток STR и D3W продуцировать химер

Линия I Линия |Трансп-| Число I из них дали I Роди- I из них ЕБ I (5ласто-|планти-| реципи- I потомство I лось I химер клеток! цист |ровано I ентов I I мышат I

STR C57BL/6 132 14 5 18 О

D3W C57BL/6 91 8 6 29 14

самок. В параллельном эксперименте в качестве контроля использовалась линия ES-D3. Результаты эксперимента суммированы в тр*лице 2. Все 18 мышат, родившиеся после трансплантации бластоцист STR-*-C57BL/6 оказались черными по окрасу, что соответствует линии C57BL/6. Следует отметить, что у 10 самок-реципиентов (из 14) методом пальпации была обнаружена беременность на 8-9-й день после операции. В последующие дни у 2-х реципиентов наблюдали спонтанный аборт, а у 3-х резорбцию плодов. И только у 5-ти рецип. ;нтов э- Зрионы благополучно развились до рождения.

Из 29 мышей, родившихся.в параллельном эксперименте с ES-D3W клетками. 14 оказались химерными. Соотношение участков шерсти с агути и черной окраской было различным у химер и варьировало от 20 до 90* ¿гути окраски.

В связи с тем, что линия STR оказалась неспособной формировать химер, исследования были продолжены на клетках D3.

Сравнительный анализ способности клонов D3W и D3H генерировать химер. С целью изучение потенций ln vivo двух клонов ES-D3 клеток D3VÍ и D3M. прошедших различное число пассажей с момента субклонирования проведен эксперимент по получению химерных мышей.

В таблице 1 показано, что хотя модальный класс хромосом у обоих клонов составляет 40, тем не менее они существенно различаются по дола эуплоидных клеток.

В таблице 3 показаны результаты этого эксперимента. В качестве реципиентных при инъекции были использованы бластоцисты линий C57BL/6, BALB/o и тетрагибридов CBWA. Данные таблицы свидетельствуют, что клон D3W, более раннего пассажа, статистически достоверно превосходит клон D3M как по числу химер средй потомства (43 и 95555 соответственно. Р<0.02), так и по процентному содержанию окраса агути (компонент ES-D3 клеток) в шерстном-покрове химер (10-90355! и 5-405555 соответственно. PO.Ó22).

Снижение потенций к развитию ES клеток при длительном культивировании можно объяснить двояко. Первое предположение исходит из

того, что ЕБ клетки не способны полностью сохранять плюрипотент-ный статус при последующих делениях. Каждое новое поколение ЕБ клеток частично теряет шаг шотентность по сравнению, с предыдущим. и через определенное число клеточных делений Е£> клетки полностью теряют свои качества стволовых клеток.

Таблица 3

Частота формирования химер клонами 1Ш и ВЗН

Клон Число Линия Транс- Родилось из них 35 агути в

пасса- бласто планти- мышей химер шерстном покрове

жей цисты ровано (35) (*) .

C57BL/6 51 29 14 90,80.3X70.2X60,

3x50.40.2x30.20

D3W 17 BALB/C 43 И 4 50.2X40.20

CBWA 32 13 5 70.60.30.2X10**

Итого 126«*« 53(42%) 23(4335)*

C57BL/6 31 9 0

D3M 42 BALB/C 55 24 5 40.30.20.10.5

CBWA 28 11 4 50.40.10,5**

Итого 114*** 44(3935) 9(2035)*

* Р(Хг) < 0,02 ** Рты» ■ 0.022

Примечание: Р1|(в рассчитан по разнице частоты встречаемости химер. полученных от 2-х клонов ES-D3 клеток, с содержанием окраса" агути в шерстном покрове 50% и более.

«*» В учет брали только те эмбрионы, после трансплантации которых самка становилась беременной и рожала живое потомство.

Второе предполояение заключается в том, что определенная пропорция клеток из всего массива способна полностью передавать статус стволовых клеток при каздом последующем'делении дочерним клеткам. Остальная часть клеток не способна полностью копировать свои плврипотентные качества и формирует популяцию клеток с частично делетированниш стволовыми качествами. Эта популяция ES клеток монет иметь селективные преимущества перед истинно стволо-клеткам и чероэ определенное число пассагей полностью вы-тесшпъ их.

Справедливость второго предположения подтверждается экспери-нентапьтгм даинкяг. в которых показана возможность восстановления первоначальных плзрипотентных свойств ES клеток путем периодического субклонирования (Nagy et al.,1993: Glle3 et al.,1992).

Сшгаяио потенция к развита ES клеток при длительном культи-ппровашш нельзя объяснить только "видимыми" кариотипическшм нз-¡¡знсггл^п. Ilagy с соавтор-чи (1993) наблюдали лишь незначительное сш:геш!в доли эуплоидиых клеток с 11-го по 33-Я пассаз. в то время глк способность Соршфовать химерное потомство при агрегация с тотраплоидшки эмбрионами была утрачена полностью.

Вероятно, наряду с изменениями хромосомного набора происходят

так» суСмикроскопические хромосомные перестройки и гекныа нута»

шт. Нельзя исключить аккумулирование эпигенетически изменения в ES клетках, выражающиеся в изменении процессов ттакпровагага и и:шр:шпшга ДНК.

На способность ES клеток участвовать в формгфованпи химерного организма после реинтродукции в бластоцисту в пемалоЯ степени влияет генотип последнего. В таблица 4 проанализированы результаты экспериментов с целью выявления наллучаей сочетаемости ES-D3 клеток с линиями мышей C57BL/6. BALB/c п тетрагибрадами CBWA. Наилучшие результаты быда получены пря сочетании D3-C57BL/6 и D3-CBWA.

Таблица 4

Влг-ние-генотипа бластоцисты-реципиента на формирование химер с ЕБ-БЗ клетками

Бластоциста Трансплан- Родилось из них химер- 35 агути в

-реципиент тировано потомства химер самцов шерстном

бластоцист покрове

С57ВЬ/6 82 38(4655) 14(3735) 8 90.80.70.70.70

60.60.50.50.50

40.30.30.20

ВАЬВ/с 98 35(3635) 9(25.735) 6 50.40,40.40,30

20.20.10.5

СВУк 60 24(4035) 9(37.535) 6 70,60.50,40,30

- -10.10.10,5

Итого 240 97 (4035) 32(3335) 20

Необходимо отметить, что используя критерий X2. мы не обнаружили статистически достоверных различий в частоте рождения химер при сочетании ЕБ-БЗ клеток с мышами С57ВЬ/6, В/и,В/о и СВМА на основе имеющегося материала. Для более объективного суждения о влиянии генотипа бластоцисты-реципиента на частоту формирования химер с ЕБ клетками необходимо продолжить эксперименты. Однако, необходимо отметить, что генеративная химера была выявлена только в группе химер 03-*-С57ВЬ/6. Сочетание 03 (129/Бу) с тетрагибридами СВША не дало генеративных химер, хотя степень химеризма тестированных самцов была достаточно высокой (табл.7).

Влияние числа инъецированных ЕБ клеток и стадии развития эмбриона-реципиента на частоту получения химер. Помимо генетических факторов, влияющих на способность ЕБ клеток давать химер сущест-

вуют и другие. Мы провели эксперимент по изучению влияния числа инъецированных ЕБ клеточ в бластоцисту на эффективность продуцирования и степень химеризма у потомства.

Таблица 5

Частота формирования химер при инъекции различного числа ЕБ клеток в бластоцисту

Линия I Линия I Число I Число I Родилось I из них

ЕБ клеток|бластоцисты|проопериро-|инъециро-| мышей I химер

I I ванных I ванных I (X) I (35)

I I бластоцист! клеток I I

D3W CBVfA 67 10-15 13 (19.435) 5 (38,535)

D3W США "3 35-40 7 (8.135) 1 (14, IX)

Оптимальным числом ES клеток, инъецируемых в бластоцисту считается 10-15. По экспериментальным данным Robertson и Biddloy (1986) при инъекции 3-5 ES клеток в бластоцисту только 28.9% потомства оказалось химерным. Во второй серии экспериментов пря инъекции 10-15 ES клеток 54.835 потомства были химергагя. Логично было предположить, что дальнейшее увеличение числа пнъецяруслп клеток такие увеличит частоту химер в потомстве.

По результатам наших экспериментов (табл.5), увеличение числа инъецируемых' клеток до 35-40 отрицательно отразилось на пряашвля-емости трансплантированных эмбраоаоз (8. Ш. Единственный родившийся химерный мышонок лишь ва ЗОЯ состоял лз ES компонента. Не наблюдалось также ожидаемого увшшчензл степени химеризка.

Ряд публикаций, появавшхся сравнительно -недавно (Kagy et al., 1990; Lalleraand & Brulet. 1990) позволяют сделать вывод, что

степень химеризма в значительной мере зависит от стадии развития змбриок~. Lallemand и Brulet (1990) сравнили степень колонизации ES клетками у 8,5-дневных плодов, полученных пооле инъекции ES клеток в бластоцисты и морулы. В геном ES клеток предварительно был введен маркерный ген lac-Z. Используя X-gal окрашивание, довольно точно можно было выявить степень участия ES клеток в формировании различных тканей химерного плода. Анализ показал, что степень колонизации ES клеток после инъекции их в морулы значительно выше по сравнению с инъекцией в бластоцисты. Большая часть ES клеток в последнем случае была выявлена в производных трофэк-тодермы и экстразмбриональной энтодермы. Однако авторы ограничились лишь исследованием 8-10-дневных эмбрионов, не сообщая о рос-дении нивого потомства.

Мы инъецировали ES клетки в поздние морулы на 16-32-клаточной стадии , в которых еще нет полости. Эмбрионы иа..зтой стадии (3-П день после обнаружения пробок), проходят место соединения кПцово-да с маткой. Поэтому мы промывали не только яйцеводы, но и оба рога матки. Наиболее подходящей для этого эксперимента оказалась линия мышей BALB/c. так как на ранних стадиях эмбрионы у этой линии мышей развиваются более медленно, по сравнению с C57BL/6 и CBWA. После извлечения утром на 3-й сутки (день обнаружения пробок - 0) до 80« эмбрионов находились на стадии поздней (компактной) морулы.

Процедура инъекции была сходной с инъекцией в бластоцисту. за исключением того, что клетки инъецировались не в бластоцель. а с пространство мезду бластомерами в центр морулы. прооперированные эмбрионы трансплантировались в тот se день в матку ложноберемен-ных самок на 2,5 сутки после обнаружения пробок. Из результатов представленных в таблице 6, видно, что ни одна самка с трансплантированными морулами не стала беременной. Причинами неудачи могут быть две: 1) сильное повреждение эмбрионов при инъекции клеток в центр морулы; 2) несоответствие стадии развития эмбрионов и катки

. - 19 -

ложнобеременных самок (2.5 дня после обнаружения пробок) при трансплантации. В контрольной группе, посла инъекции 10-15 клеток в ' полость бластоцисты. родились 11 мышат, среди которых 4 были химерными по окрасу шерсти.

Таблица 6

Частота формирования химер при инъекции Е5 клеток в эмбрионы на различной стадии развития

Линия' 1 ES клеток 1 1 1 линия ишей 1 Стадия 1 1 развития 1 1 эмбрионов 1 1 1 Число 1 проопери- 1 ванных 1 эмбрионов 1 1 Родилось 1 1 ишей 1 1 (» i 1 1 1 из них 1 химер 1 (*) 1

DSV/ .', BALB/c поздняя 62 0 0

(ОПЫТ) »орула

D3W BALB/o бластоциста 51 11(22%) 4(36%)

(контроль)

Анализ химерных мшей на способность передавать генотип ¿S клеток потомству. 18 из 33 родившихся в экспериментах химер, достигших половозр.елости, были использованы для скрещивания с целью выявления germ-line химер. Из них 13 были самцами и 5 фенотапи-чески нормальными самками.. Химер D3->-€57BL/6 скрещивали с мышами ЛИНИИ C57BL/Ö, а D3-»~BALB/c и D3—CBWA с ¡шшами линии AKR. Ровде-ние в потомстве мышат с окрасом агути свидетельствует о передаче химерами генотипа ES клеток. Результаты суммированы в таблице 7.

Как видно из таблицы один химерный самец D3-C57BL/6 (Н 40893-4) дал в потомстве 3 мышат с окрасом агути. „ ричем 5 других из его потомства "были черными, что свидетельствует о химеризма в

популяции половых клеток.

Таблица 7

Результаты скрещивания химер для выявления germ-line трансмиссии

Номер I Генотип I Пол I % агути I Число | Родилось I из

химеры I I * |в шерстном! пометов { мышей I них

I | I покрове I I I агути

I II II I

10493-1 D3-C57BL/6 ? 70 1 5 0

20493-1 D3-C57BL/6 ОТ 40 3 13 0

100893-7 D3-C57BL/6 Я ' 80 1 1 % 0

110893-7 D3-C57BL/6 V 50 3 8 0

120893-7. D3-C57BL/6 о" 50 2 5 0

130893-7 D3-C57BL/6 S 30 0 0 0

30893-2 D3-C57BL/6 Я 60 0 0 0

40893-4 D3-C57BL/6 or 70 2 8 3

50893-5 D3-CBWA 60 4 23 0

70893-5 D3-CBWA 10 3 21 0

60893-5 D3-CBWA С 30 0 0 0

80893-5 D3-CBWA (Г 5 0 0 0

90893-5 D3-CBWA or 40 2 8 0

160993-24 D3-BALB/C 2 30 3 15 0

150993-24 D3-BALB/C С" 10 1 3 0

170893-11 D3-BALB/C or 40 1 2 0

180893-11 D3-BALB/C ,<r 30 0 0 0

190893-11 D3-BALB/C 50 2 7 0

При использовании мужских ES клеток обычно наблюдается смеще-

нив соотношения полов химерного потомства от нормального (50:50) в сторону увеличения доли самцов. Это объясняется тем. что часть химер XY*-XX развиваются в фенотипических самцов, так как Y хромосома у млекопитающих ответственна за детерминацию пола. Поэтому обычным бывает соотношение 70% самцов и 30% самок (Robertson & Bradley. 1986). В наших экспериментах 62% химер были самцами.

Как правило, в фенотипических самок развиваются половые мозаики XY—XX лишь с незначительным участием ES клеток (XY компо- ' нент). Однако бывают пока еще труднообъяснимые исключения. В наших экспериментах три химеры NN 30893-2 (60%). 10493-1 (70%) и 100893-7 (80S) оказались фенотипически самками о высокой долей участия ES клеток (табл.7), причем две последние из них были фер-тильными, хотя и не было зарегистрировано рождения агути потомства. Этот Факт можно объяснить тем. что на ранних этапах эмбрионального развития у этих животных произовла полная или частичная утеря Y хромосомы.

Большинство экспериментаторов не тестируют химерных самок на germ-line трансмиссию. Однако имеется ряд публикаций, сообщающих о выявлении химерных самок, способных передавать генотип мужских ES клеток (Sawai et al.,1991; Pledrahlta et al.. 1992: Momfc .erts et al.,1992).

По всея видимости, первичные половые клетки с муаским карио-типом XY проходят нормальный оогенез в яичниках химерной самки. Такие самки дают два типа гамет X и Y. Экспериментально это было показано ранее у агрегационных мозаичных по полу химерных самок (Evans et al.. 1977). Поэтому мы тестировали наряду с самцами также и химерных самок, которые, к сожалению. • не дали потомства с окрасом агути.

Довольно часто генеративные (gero-llne) химеры дают смётанное потомство, причем доля потомства, несущих генотип ES клеток (агути). может быть очень низкой, от 0.3 до 3% (Robertson. Bradley. 1986). Низкий выход генеративных (germ-line) химер в наших экспе-

риментах поэтому можно объяснить небольшим числом полученного потомстве недостаточного для более объективного суждения о germ-llne трансмиссии.

ВЫВОДЫ

1. Впервые охарактеризована новая ES клеточная линия STR. Плврипотентность ES-STR клеток подтверждена в условиях In vitro тестом на специфическую активность щелочной фосфатазы и способностью образовывать эмбриоидные тела. Основная популяция клеток STR (66%) на момент анализа (20-22-й пасса») имела анеуплоидный набор хромосом (Мг0-39). Наличие анеуплоидии явилось причиной неспособности клеток STR формировать химерных животных, несмотря на плюрипотентность этих клеток в системе in vitro.

2. Проведен сравнительный анализ двух клонощ. ES-D3 клеток: D3W (17-й пассаж) и D3M (42-й пассаж).. Установлено, что клон D3W содержит, значительно большую долю клеток с нормальным кариотипом М-40 (82%). по сравнению с клоном D3M М-40 (58%).

3. Используя методы оценки lh vitro (способность образовывать эмбриоидные тела, высокая активность щелочной фосфатазы) не удалось выявить каких либо различий в плюрипотентных свойствах {слеток этих клонов.

4. Изучение потенций In vivo, путем инъекции ES клеток в бластоцисты показало, что клетки D3W (по сравнению с клетками D3M) обладают большей способностью колонизовать ткани химерных животных, что подтверждено относительно большим количеством химер среди потомства и большим процентным содержанием клеток D3VJ в тканях химерных животных. В одном случае клетки D3W участвовали в закладке первичных половых клеток, сперматогенезе химеры и дали потомство. Снижение плюрипотентных свойств клеток клона D3M, вероятно, связано с кариотипическими изменения]«! в течение длительного культивирования.

5. Выявлено, что лучвей комбинацией ES-D3 клеток при получении генеративных химер является сочетание о Оластоцистамн мыаей C57BL/6 ПО сравнению с BALB/c и CBWA.

6. Разработан простой метод предварительного тестирования плврипотентности ES клеток, основанный на цитохимическом выявлении высокой активности щелочной фосфатазы. Показана корреляция между выявленной данным методом плюрипотентностьо ES клеток in vitro и способностью формировать химерное потомство In vivo.

ПОЛОЖЕНИЯ ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ

1. Проведено тестирование плюрипотентных свойств In vitro п in vivo новой ES клеточной линии STR. Основная популяция клеток STR на момент анализа имела анеуплоидный набор хромосом, что явилось причиной неспособности формировать химерное потомство.

2. Установлено, что при длительном культивировании в ES-D3 клетках происходят кариотипические изменения, выражающиеся d увеличении доли анеуплоидных клеток. При этом наблюдалось также снижение потенций ES-D3 клеток In vivo.

5. Разработан простой метод предварительного тестирования плврипотентности ES клеток, основанный на цитохимическом выявлении высокой активности щелочной фосфатазы. Показана корреляцля «езду выявленной данным методом плюрипотентностью ES клеток In vitro и способностью формировать химерное потомство In vivo.

СПИСОК РАБОТ. ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Миталипов Ш.И. .Федоров Л.М.,Стрельченко Н.С. Анализ химерных мышей, полученных путем инъекции клеток внутренней клеточной массы в бластоцисту. //Онтогенез. 1993.Т.24.N5. С.5-10.

2. Миталипов Ш.М..Федоров Л.К..Стрельченко Н. С Инъекционные химеры. // Тез. докл.3-й конференции "Геном человека". 10-12 мар-

та 1993 г.Черноголовка..С. 86.

3. Миталипов Ш.М..Миталипова М.И..Федоров Л.И. Изучение плю-рипотентных свойств эмбриональных стволовых клеток мыши In vitro и In vivo. // Тез. докл. 5-ой конференции по генетике соматических клеток в культуре. 22-24 ноября 1993г. Черноголовка. С.42.

4. Неверова М.Е..Петрова Т. В.. Мамаева Т.В.. Миталипов Ш.И..Миталипова И.М..Иванов В.И..Калинин В.Н. Разработка модельной системы генотерапии на основе синтетического "гена" биологически акт тивного пептида брадикинина. // Тез. докл. 4-ой конференции "Геном человека - 94". 9-11 марта 1994г. С. 64.

5. Миталипов Ш. И.. Миталипова М. М.. Иванов В. И. Влияние длительности культивирования на плврипотентность эмбриональных стволовых (ES) клеток мыши in vitro и In vivo. // Онтогенез. 1994. Т.25.Н6.