Получение, характеристика и генетическая модификация индуцированных плюрипотентных стволовых клеток крысы для применения в целях тканезаместительной терапии

Лисковых, Михаил Александрович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Получение, характеристика и генетическая модификация индуцированных плюрипотентных стволовых клеток крысы для применения в целях тканезаместительной терапии
ВАК РФ 03.03.04, Клеточная биология, цитология, гистология

Автореферат диссертации по теме "Получение, характеристика и генетическая модификация индуцированных плюрипотентных стволовых клеток крысы для применения в целях тканезаместительной терапии"

На правах рукописи

лисковых

Михаил Александрович

ПОЛУЧЕНИЕ, ХАРАКТЕРИСТИКА И ГЕНЕТИЧЕСКАЯ МОДИФИКАЦИЯ ИНДУЦИРОВАННЫХ ИЛЮРИПОТЕНТНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК КРЫСЫ ДЛЯ ПРИМЕНЕНИЯ В ЦЕЛЯХ ТКАНЕЗАМЕСТИТЕЛЬНОЙ

ТЕРАПИИ

03.03.04 - Клеточная биология, цитология, гистология

2 О 0К7 20:1

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург 2011

4857993

Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург.

Научный руководитель: доктор биологических наук>

Томилин Алексей Николаевич

Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Михельеон Виктор Михайлович

Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург

доктор биологических наук, Тиллиб Сергей Владимирович Институт биологии гена РАН, Москва

Ведущая организация: Учреждение Российской академии наук, Институт

цитологии и генетики СО РАН, Новосибирск

Защита диссертации состоится «11» ноября 2011 года в 15 часов на заседании

Диссертационного совета Д002.230.01 при Институте цитологии РАН по адресу:

194064, Санкт-Петербург, Тихорецкий проспект, д.4

e-mail: cellbio@mail.cytspb.rssi.ru

Сайт: http://www.cytspb.rssi.ru

Факс: 8(812)297-35-41

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии РАН.

Автореферат разослан «-Г» октября 2011 года.

Учёный секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

Общая характеристика работы Актуальность проблемы

Одной из актуальных задач исследований , проводимых на стыке биологии и медицины, является выбор модельного организма. Крыса представляет собой удобную модель в физиологии , фармакологии , трансплантологии , иммунологии, онкологии и изучении старения и сердечно-сосудистой системы . При сравнимой с продолжительностью репродуктивного цикла у мышей и стоимостью содержания крыса имеет более подходящий размер, например, для рутинного отбора проб крови и измерения физиологических параметров. Так же , полное понимание физиологических процессов невозможно без описания функции генов , что в свою очередь должно опираться на генный нокаут. Проведение генного нокаута на мыши стало возможным только благодаря возможности получения эмбриональных стволовых (ЭС) клеток (Evans et al., 1981). Проведение генного нокаута на крысе до недавнего времени не предст авлялось возможным, так как ЭС клетки этого вида были впервые получены только в 2008 году (Buehr et al., 2008). К тому же, процесс их получения оказался очень трудоёмким и дорогостоящим. Получение индуцированных плюрипотентных стволовых (иПС) клеток крысы позволит обойти особо трудоёмкий процесс получения ЭС клеток и приблизит нас к проведению исследований , использующих крысу как экспериментальную модель заболеваний человека.

Известно, что попадание в организм взрослой мыши хотя бы нескольких ЭС клеток приводит к возникновению тератом - быстрорастущих опухолей, несущих в своём составе типы клеток и тканей, являющихся производными трёх зародышевых листков. Несмотря на значительный прогресс в области изучения биологии плюрипотентных стволовых клеток, одним из важнейших препятствий, стоящих на пути практического применения этих клеток в клинике является их туморогенность. Кроме того, по существующим протоколам направленной диффсрснцировки ЭС клеток in vitro получаются весьма гетерогенные популяции клеток , в которых практически всегда присутствуют резидуальные недифференцированные клетки , обладающие высоким туморогенным потенциалом. Очевидно, что описанная выше ситуация в полной мере относится и к иПС клеткам. Таким образом, в клинике присутствие даже неболь шого количества недифференцированных ЭС/иПС клеток (и даже одной такой клетки ) в трансплантируемом пациенту клеточном материале недопустимо ввиду возможности возникновения тератомы. Соответственно, разработка технологий, гарантирующих полное удаление резидуальных ЭС/иПС клеток из гетерогенных клеточных суспензий, остаётся одной из самых актуальных на сегодняшний день задач в области биологии стволовых клеток. Данная проблема особенно актуальна в свете бурно развивающегося направления заместительной клеточной/тканевой терапии.

Цели и задачи исследования:

Данное исследование преследовало две цели: 1) получить и всесторонне охарактеризовать иПС клетки крысы; 2) предложить метод безопасного использования ЭС/иПС клеток в терапевтических целях.

Для достижения поставленных целей необходимо было решить ряд конкретных задач:

1. Разработать протокол эффективного репрограммирования крысиных эмбриональных фибробластов (КЭФ) в иПС клетки.

2. Генерировать иПС клетки из КЭФ и получить несколько независимых клеточных линий.

3. Изучить плюрипотентные свойства полученных линий иПС клеток крысы в экспериментах in vitro и in vivo.

4. Использовать полученные иПС клетки крысы для проведения генетических манипуляций, таких как стабильное внедрение в геном чужеродной ДНК (трансгенез).

5. Разработать стратегию контроля над туморогенностью ЭС/иПС клеток , заключающуюся в генетической сенсибилизации этих клеток за счет «суицидальной кассеты», несущей гена тимидин киназы (ТК).

6. Протестировать разработанную технологию в экспериментах по тканезамещению на модельных лабораторных животных (мышах).

Основные положения, выносимые на защиту

1. Использование нового метода получения и поддержания в культуре иПС клеток крысы, позволяет повысить выживаемость иПС клеток по меныцей мере в 2 раза по сравнению с опубликованными ранее протоколами.

2. Полученные иПС клет ки крысы, при использовании вирусных векторов с последующим их удалением, обладают нормальным кариотипом и плюрипотентными свойствами. О плюрипотентности полученных иПС клеток свидетельствуют экспрессия в них известных маркеров плюрипотентности (Nanog, Oct4, SSEA1, щелочной фосфатазы ), а также способность этих клеток образовать тератомы и участвовать в формировании химерного организма.

3. Возможно внедрение в геном иПС клетки крысы стабильного трансгена, что является необходимым шагом на пути к проведению генного нокаута путём гомологической рекомбинации.

4. Стабильное введение в геном ЭС/иПС клеток мыши и крысы «суицидальной кассеты» 2A2Btk-TKiresPuro обеспечивает контроль над туморогенностью, что подтверждено в в экспериментах in vitro и in vivo.

5. Эксперимент по восстановлению кроветворения у летально облучённых мышей доказывает работоспособность предлагаемой «суицидальной стратегии »в тканезамещении.

Научная новизна полученных результатов

В настоящей ра боте впервые представлены сравнительные данные по эффективности получения иПС клеток крысы при помощи предлагаемого нами и уже известных протоколов. Проведён всесторонний анализ полученных линий иПС клеток крысы, доказана необходимость присутствия в среде культивирования используемых ингибиторов и LIF.

Доказана возможность использования иПС клеток крысы в экспериментах по введению стабильного трансгена, что является первым шагом на пути к проведению гомологичной рекомбинации и изучению функции гена с помощью генного нокаута.

Разработана стратегия безопасного (безопухолевого) использования ЭС/иПС клеток в терапевтических целях , принципиально отличающаяся от известных опубликованных экспериментальных данных и патентов . Достоверно подтверждено , в экспериментах in vitro и in vivo, что обработка клеточных культур и экспериментальных животных ганцикловиром безопасна.

Теоретическое и практическое значение работы

Открывается перспектива проведения генетических исследований, использующих крысу как основную экспериментальную модель.

Несмотря на то, что к настоящему моменту есть только одна модель, на которой была продемонстрирована возможность тканезамещения с использованием ЭС клеток, данную технологию необходимо активно развивать. Это позволит уже в недалёком будущем разработать принципиально новые методы лечения и направить знания из фундаментальной области биологии в прикладное русло. В дальнейшем предполагается

расширить спектр моделей заболеваний человека, а так же набор экспериментальных животных.

Применение описанной кассеты 2A2Btk-TKiresPuro в экспериментах in vitro и in vivo открывает перспективы безопасного использования иПС клеток крысы в исследованиях связанных с тканезамещением в терапевтических целях . Кроме того, открывается возможность рассматривать крысу как основную животную модель при изучении возможности лечения различных заболеваний человека методами тканезамещения.

С учётом того , что ганцикловир является одобренным противовирусным препаратом, технология имеет все шансы вырасти в полноценную методику лечения, основанную на клеточном материале , полученном непосредственно от пациента (аутологичные иПС клетки).

Апробация работы

Материалы диссертации были представлены на Ш коле-конференции «Биология развития» (Звенигород, 2008); Отчетной конфере нции по Программе президиума РАН «Молекулярная и клеточная биология» (Москва 2008, 2009); Всероссийском симпозиуме «Культивируемые клетки как основа клеточных технологий» (Санкт-Петербург, 2009); III Всероссийской научной школе -конференции «Стволовые клет ки и регенеративная медицина» (Москва, 2010); 3-м международном конгрессе «3rd International Congress on Stem Cells and Tissue Formation» (Дрезден, Германия, 2010); конференции «The 18th International Workshop on Genetic Systems in the Rat» (Киото, Япония, 2010).

Финансовая поддержка работы

Работа выполнена при финансовой поддержке гранта Р оссийского Фонда Фундаментальных Исследований и Объединения Гельмгольца (проект 07-04-92281/HRJRG-024), программы Президиума РАН «Молекулярная и клеточная биология», Госконтрактов 02.512.11.2253 и 16.512.11.2085, а также фонда некоммерческих программ «Династия» ДП-Б-22/10.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 11 печатных работ , из них 4 статьи в рецензируемых журналах.

Структура и объем работы

Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, глав «материалы и методы» и «результаты и обсуждения », выводов , списка цитируемой литературы и одной страницы приложений. Работа изложена на 134 страницах машинописного текста, содержит 35 рисунков и 10 таблиц.

Материалы и методы исследований

Получение мышиных эмбриональных фибробластов (МЭФ) из 13.5-суточных плодов мыши. Беременных мышей умерщвляли на 13.5 сутки после оплодотворения (д.п.о.). Маточные трубы с эмбрионами промывали 3 раза по 10 мл фосфатно-солевым буферным раствором (PBS) с добавлением гентамицина (до конечной концентрации 5 мМ ) (Биолот, Россия ). Эмбриональные сумки открывали , используя хирургические пинцет и ножницы, и извлекали эмбрионы. Эмбрионы переносили в новую чашку и промывали Зраз а по 10 мл PBS с гентамицином и освобождали их от мягких висцеральных тканей; затем переносили в новую чашку, промывали 3 раза по 10 мл PBS с гентамицином и измельчали ножницами. Измельчённые фрагменты далее инкубировали в 2 мл 0.25%-ного трипсина-ЭДТА (Gibco, CILIA) в течение несколько минут. К полученной

суспензии добавляли ещё 5 мл 0.25%-ного трипсина-ЭДТА (Gibco, США), интенсивно пипетировали 5-6 раз и помещали в инкубатор еще на 15 мин . По окончании инкубирования отбирали 5 мл суспензии клеток , ингиб ировали действие трипсина добавлением среды , содержащей сыворотку . Содержимое интенсивно перемешивали , переносили в 15-миллилитровую пробирку и центрифугировали при 1700 об/мин 3 мин. К клеточному осадку добавляли 10 мл среды, содержащей сыворотку, ресуспендировапи и переносили на 10-сантиметровую культуральную чашку (Corning, Orange или Falcon, Германия). Полученные МЭФ оставили в инкубаторе, при 37°С и 5% С02. К оставшемуся содержимому добавляли ещё 5 мл 0.25%-ного трипсина-ЭДТА и проводили описанную процедуру ещё дважды. Чашки с МЭФ инкубировали (37'С и 5% СО2) в течение ночи. Плотность МЭФ, прикрепившихся к поверхности чашки, оценивали визуально с помощью световой микроскопии утром следующего дня. Когда плотность клеток составляла 90%, клетки пересевали согласно общепринятой методике.

МЭФ (а также эмбриональные фибробласты крыс (КЭФ) и клетки линии НЕК293Т) культивировали на среде DMEM (Dulbecco's Modification of Eagle's Medium) (Gibco, США) с добавлением 10% сыворотки плодов коровы (Sigma, Германи я), 50 мкг/мл пенициллина (Gibco, США), 50 мкг/мл стрептомицина (Gibco, США), 2 мМ L-глютамина (Gibco, США).

КЭФ получали из 20-суточных зародышей аналогичным методом.

Культивирование ЭС клеток мыши. ЭС клетки мыши культивировали на среде Knock-OUT DMEM (Gibco, США) с добавлением 10%сыворотки плодов коровы (Sigma, Германия ), 50 мкг/мл пенициллина (Gibco, США ), 50 мкг/мл стрептомицина (Gibco, США), 2 мМ L-глютамина (Gibco, США), 50 мг/мл пирувата натрия (Gibco, США), 1% заменимых аминокислот (Gibco, США), 50 мкМ ß-меркаптоэтанола (Sigma, Германия). Клетки культивировали на культуральных чашках, предварительно обработанных 0.1%-ным раствором желатина (Sigma, Германия).

Трансфекция кальций-фосфатным методом. За день до трансфекции клетки линии НЕК293Т рассевали в плотности 4><106 на 10-сантиметровую культуральную чашку. За 2 ч до трансфекции клеткам меняли среду на свежую. Свежие трансфекционные смеси готовили следующим образом: в пробирке смешивали 87.5 мкп 2 М CaCh (Sigma, Германия), 32.5 мкл ТЕ, необходимое количество ДНК , объём доводили до 600 мкл стерильной Н2О. Далее, в полученный раствор вкапывали (примерно 1 капля в секунду) 600 мкл 2-кратного буфера HBS (NaCl 280 мМ, Hepes 100 мМ, Na2HP04 1.5 мМ; 7.11<рН<7.13). Полученную смесь оставляли на 15 мин при комнатной температуре для образования преципитата, который затем медленно вкапывали вереду культивирования подготовленных для трансфекции клеток НЕК293Т. Клетки инкубировали с преципитатом в течение ночи при 37'С и 5% С02. Среду меняли на свежую через 16-18 ч.

Упаковка вирусных частиц. Полноразмерные кДНК генов Oet4, Sox2, Klf4 и сМус получали из ЭС клеток мыши путем реакции обратной транскрипции, амплифицировали методом ПЦР и клонирова ли в лентивирусный вектор LVTHM, предоставленный Д. Троно (Wiznerowicz and Trono, 2003). Для сборки вирусных частиц клетки линии НЕК293Т (4х 106 на 10-сантиметровую чашку) трансф ецировали кальций -фосфатным методом, одновременно вводя плазмиду pMD2G (4 мкг), кодирующую белки вирусной оболочки , плазмиду pCMV-dR8.74PAX2 (8 мкг ), кодирующую белки, необходимые для сборки вирусной частицы , и одну из лентивирусных плазмид, кодирующих Oct4, Sox2, Klf4, сМус или EGFP (11 мкг ). На следующий после трансфекции день клеткам меняли среду. Супернатант, содержащий вирусные ча стицы, собирали в течение 2 последующих дней . Общий объём супернатанта , содержащего вирусные частицы, фильтровали через целлюлозо-ацетатные фильтры 0.22 мкм (Millipore, Германия). Вирусные частицы концентрировали путём ультрацентрифугирования (Backman, rotor SW-32-Ti, США ) 17000 об/час в течение 3 ч. Осаждённые вирусы растворяли в бессывороточной среде (OptiMEM, Gibco, США) в течение ночи при +4°С

при постоянном покачивании, титровали по стандартной методике (http://tcf.epfl.ch/page-6764.html) и хранили в аликвотах при -80'С.

Получение иПС клеток крысы. КЭФ пассажа 3 высевали за день до заражения в плотности 1.5х105 клеток / 9.4 см (1 лунка 6-луночного планшета) и инфицировали на следующий день лентивирусами , экспрессирующими Oct4, Sox2, Klf4, сМус и, для визуализации эффективности трансфекции, EGPF. Через четыре дня после вирусного заражения клетки пересевали на культуральные чашки (10см, Falcon, США), предварительно покрытые монослоем митотически инактивированных МЭФ , и культивировали в одной из следующих сред: (1) N2B27, 50 мкг/мл пенициллина (Gibco, США), 50 мкг/мл стрептомицина (Gibco, США), 2 мМ L-глютамина (Gibco, США), 0.1 мМ ß-меркаптоэтанола (Gibco, США), 3 мкМ CHIR99021 (Stemgent, США) - ингибитора GSK3ß, 0.5 мкМ PD0325901 (Stemgent, США) - ингибитора МЕК, и 103 Ед/мл L1F (leukemia inhibitory factor) (РАА, Австрия) (Buehr et al., 2008) (далее по тексту - среда N2B27+2i+LIF); (2) KnockOUT-DMEM (Gibco, США), 20%-ного заменителя сыворотки KnockOut-SR™ (Gibco, США ), 50 мкг/мл пенициллина (Gibco, США ), 50 мкг/мл стрептомицина (Gibco, США ), 50 мг/мл L-глютамина (Gibco, США ), 1% заменимых аминокислот (Gibco, США ), 0.1 мМ ß-меркаптоэтанол, 3 мкМ CHIR99021, 0.5 мкМ PD0325901, 0.5 мкМ А-83-01 (Tocris Bioscience, США) - ингибитора ALK5 и 103 Ед/мл L1F (РАА, Австрия) (Li et al., 2009) (далее по тексту - среда KSM+3i+LIF). Через 10-12 сут после пересева колонии крысиных иПС клеток индивидуально отбирали, обрабатывали трипсином (0.25% TrypLE™ Express, Gibco, США) и переносили в лунки 96-луночного планшета, предварительно покрытые митотически инактивированными МЭФ , и продолжали вести 1-2 пассажа в соответствующих средах .В дальнейшем, культивирование всех полученных культур иПС клеток крысы проводилось в среде N2B27+2i+LIF. Замена среды производилась каждые 1-2 сут.

Получение иПС клеток мыши. иПС клетки мыши получали аналогично крысиным клеткам , при помощи лентивирусного заражения на среде N2B27+2i+LIF. Далее, иПС клетки мыши культивировали в среде на основе KnockOUT-DMEM (Gibco, США), 20%-ного за менителя сыворотки KnockOut-SR™ (Gibco, США ), 50 мкг/мл пенициллина (Gibco, США ), 50 мкг/мл стрептомицина (Gibco, США ), 50 мг/мл L-глютамина (Gibco, США), 1% заменимых аминокислот (Gibco, США ), 0.1 мМ ß-меркаптоэтанола, 103 Ед/мл LIF (РАА, Австрия ) н а чашках , покрытых митотически инактивированными фибробластами или желатином, в зависимости от задачи.

Эле кгро по рация ЭС клеток мыши и иПС клеток крысы. Находящиеся в логагифмической фазе роста ЭС (иПС) клетки , культивируемые на подслое из митотически ина ктивированных фибробласто в, обрабатывали трипсином , действие трипсина останавливали средой для культивирования МЭФ, клетки ресуспендировали до одноклеточной суспензии и оставляли в инкубаторе для удаления МЭФ, имеющих более высокие в сравнении с ЭС (иПС) клетками адгезионные свойства (для клеток, культивируемых на желатин е, этот шаг опускали). Через 30 мин. суспензию ЭС (иПС) клеток собирали, центрифугировали и отмывали один раз PBS. ЭС (иПС) клетки мыши электропорировали (5х10б клеток; кюветы 0.4 см; BioRad GenePulser: 240В, 500 мкФ) линеаризованной плазмидой p2A2B-tk-TKiresPuro; в случае иПС клеток крысы проводили ко-электропорацию циркулярной плазмид ой рМС-Сге и линеаризованной плазмид ой p2A2B-tk-TKiresPuro в молярном отношении 10:1. После электропорации клетки высевали на чашки, покрытые митотически инактивированными фибробластами, и культивировали в соответствующих средах. Через 48 ч после электропорации в среду культивирования добавляли пуромицин (Sigma, Германия) до конечной концентрации 1 мкг/мл, селекцию проводили в течение двух суток. Через 10-12 д после окончания селекции колонии ЭС (иПС) клеток индивидуально отбирали, обрабатывали трипсином и культивировали, как описано выше.

Иммунофлуоресцентное окрашивание культивируемых клеток.

Адгезивные клетки фиксировали в 4%-ном ПФА на PBS 10 мин при комнатной температуре, промывали в PBS и блокировали в блокировочном растворе (2% БСА (бычий сывороточный альбумин ), 1% овечья сыворотка , разведённые в PBS) 30 мин при комнатной температуре. Клетки затем промывали один раз PBS с добавлением детергента Tween-20, разведенного до конечной концентрации 0.1%. Первичные антитела на исследуемые белок (Oct4 (sc-5279, Santa Cruz Biotechnology Inc), SSEA-1 (MC-480, Developmental Studies Iowa Hybridoma Bank), Nanog (ab21603, Abeam), III ß-Tubulin (TUJ1) (MMS-435P, Covance)) разводили в блокировочном растворе и инкубировали с образцом один час при 37°С или в течение ночи при 4'С. После этого препараты промывали 5-6 раз 0.1%-ном Tween-20-PBS и инкубировали 0.5 ч при комнатной температуре в блокировочном буфере со вторичными антителами, конъюгированными с флуоресцентными красителями А1еха-488 или Alexa-546 (Molecular Probes, США), отмывали два раза в 0.1% Tween-20-PBS. Для флуоресцентной визуализации клеточных ядер образцы докрашивали раствором DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole, Sigma, Германия), концентрацией 1 мкг/мл. Препараты анализировали при помощи флуоресцентного микроскопа Axiovert40 (Zeiss, Германия ) или лазерного сканирующего микроскопа Leica (Leica, Германия).

Проточная цитофлу ореметрия (FACS). Мышей анестезировали раствором кетамина. Кровь для FACS-анализа (примерно 1 мл ) забирали из сердца шприц ом, содержащим 100 мкл 2.5%-ную ЭДТА, перемешивали и переносили в пробирку. К клеткам затем добавляли 10 мл буфера ERY (Erythrocyte-lysis-buffer: 155 мМ NH4CI; 16 мМ NajCCb; 1 мМ ЭДТА pH 7.3). Кровь центрифугировали при скорости 1200 об/мин в течение 3 мин. Осадок промывали 1 раз в PBS. Если сохранялся красный цвет клеточного осадка, раунд промывки с исп ользованием буфера ERY повторяли. Клетки суспендировали в буфере FACS (2% FBS; 2 мМ EDTA на PBS) (5-10х 106 кл/мл). Антитела (CD45.1 (BD Pharmingen, CD 45.1-PE (clone: A20) BD 553776) CD45.2 (BD Pharmingen, CD 45.2 APC (clone: 104) BD 558702)) разводили 1:10 в буфере FACS. 10 мкл свежеприготовленного раствора антител смешивали с 100 мкл суспензии клеток в буфере FACS (5-10х105 клеток). Клетки затем инкубировали 20 мин в темноте , промывали дважды буфером FACS, суспендировали в 500 мкл буфера FACS и инкубировали с 2 мкг/мл йодид а пропидия. Полученную суспензию анализировали на проточном цитофлуориметре FACSAria2 (BD Biosciences, США).

Результаты и обсуждение

Раздел 1. Получение иПС клеток крысы

После нескольких неудачных попыток репрограммирования крысиных фибробластов в иПС клетки по стандартным протоколам, зарекомендовавшим себя при получении иПС клеток мыши и человека (Takahashi and Yamanaka, 2006; Okita et al., 2007; Takahashi et al., 2007; Yu et al. 2007), мы использовали недавно предложенную методику получения ЭС клеток крысы (Buehr et al., 2008). Методика базируется на продемонстрированном в более ранних публикациях положительном эффекте удаления сыворотки при одновременном добавлении ингибитора MAP киназы (MEK1/ERK), PD0325901, ингибитора киназы глико ген-синтазы 3 (GSK3b) CHIR99021 и активатора LIF/STAT3 сигнального пути LIF на поддержание плюрипотетности ЭС клеток человека и мыши (Buehr et al., 2008).

Использование такой среды (сокращенно обозначенной в настоящей работе как N2B27+2Í+LIF) позволило нам успешно получить иПС клетки из КЭФ (Рис. 1).

Рис. 1. Получение иПС клеток крысы. (А) Исходные эмбриональные фибробласты крысы; (Б) полученные из них при помощи заражения Ос(4, 8ох2, КЦ'4, сМус первичные колонии иПС клеток крысы; (В) иПС клетки крысы после нескольких пассажей в среде К2В27 (-2Н Ы1'

Далее мы сравнили эффективность репрограммирования КЭФ при культивировании в среде Ы2В27+2\+ИР и в К8М+31+1ЛР - среде, успешно использованной для получения иПС клеток (У е1 а1., 2009). Эффективность репрограммирования в случае использования среды К2В27+21+ЫР была в 1.5 раза ниже, однако доля выживаемости отбираемых клонов через два пассажа культивирования в этой среде был примерно в 3 раза выше (Таблица I).

Таблица 1.

Эффективность получения иПС клеток крысы при различных условиях культивирования.

Среда культивирования Источник Эффективность репрограммирования Доля выживаемости в % от общего числа клонов

ОМЕМ+ 10-15% РСБ + ЬП? (ТакаИазЫ апс! Уатапака, 2006) 0 0

ЭМЕМ + + 2\ + Ш + А-83-01 (и е( а]., 2009) 8.9±1.3х10'4 25

N2827 + 2] + Ш (ВиеЬг е1 а!., 2008) 5.4± 0.9x10^ 71

Известно, что анеуплоидия и принадлежность ЭС клеток (вероятно, это же относится и к иПС клеткам) к женскому полу негативно сказывается на их способности дифференцироваться в клетки полового пути - свойство, абсолютно необходимо е для проведения генного нокаута. Поэтому, для дальнейшей работы были отобраны 6 клонов, давших положительную ПЦР на наличие У-хромосомы (Таблица 2).

Изначально кариотипировали 6 клонов иПС клеток, у которых с помощью ПЦР был выявлен мужской генотип. У всех клонов, за исключением ШАЮ, который оказался смесью двух клонов , был подтверждён статус ХУ. При анализе выявил ась довольно высокая для как тетраплоидных, так и анеуплоидных клеток. Для дальнейшей работы был выбран клон (ШВ9), геном которого сохранил максимальную целостность (Таблица 2, Рис.2).

Таблица 2.

Анализ кариотипа полученных клонов иПС клеток крысы.

Клоны (субклоны) иПС клеток Кариотип в диплоидных клетках Доля метафаз, %

диплоидных анеуплоидных полиплоидных

ОТЗ 42,ХУ 60 17 23

ОТ2 42,ХУ 50 50 н/а

1УС2 42,ХУ 68 9 23

ШАЮ 42.ХУ/42ХХ 45 27 28

1УОЗ 42,ХУ 25 25 50

ШВ9 42,ХУ 79 1 20

03* 42,ХУ 58 36 6

G4* 42,XY 90 6 4

Н5* 42, XY 63 58 8

*- Субклоны IIIB9 после выщепления лентивирусов н/а - не анализировано

> /» .

if ¡

и ti

!! я i»

г i i S

H ít ti H

7 9 1 И

" I! H II

ч ii i¡ и If

)! II >» и

II К II и t)

6 7 S 5 10

Ч В ll |1 II

1! II

19 3)

Рис. 2. Результат кариотипирования клона 1ПВ9 (А) иПС клеток крысы и производного клона 04 после Сге-опосредованного удаления лентивирусов из генома (Б).

Нестабильность хромосомного состава культивируемых ЭС клеток - явление, недавно описанное в литературе . Недавнее исследование , проведён ное на ЭС клетках человека, показало , что увеличение числа центросом , наблюдаемое в процессе культивирования, приводит к возникновению как поли-, так и анеуплоидии (Holubcova et al., 2010). В результате подробного анализа 540 линий ЭС клеток мыши было выяснено, что только 60% обладают нормальным кариотипом, у 25% линий была обнаружена потеря Х-хромосомы, у 5% обна ружены иные аномалии (Sugawara et al., 2006). Подобные исследования проводились также и для иПС клеток мыши (Takahashi and Yamanaka, 2006; Minina Iu et al., 2010). Возможно, причиной хромосомных нарушений являются, с одной стороны, условия культивирования, с другой - собственно свойства иПС клеток. Также, возможно, что причиной хромосомных нарушений являются изменения в эпигенетическом статусе клеток.

Несмотря на то , что лентивирусные векторы на основе ВИЧ , как считается , не подвержены процессу эпигенетического глушения в большинстве дифференциров анных клеток, в иПС клетках, равно как и в других плюрипотентных клетках любых видов, мы наблюдали частую спонтанную деактивацию лентивирусов. Кроме того , постоянная экспрессия 4 репрограммирующих факторов в иПС клетках может негативно сказаться на их диф ференцировке. Сообщалось также, что реактивация провируса сМус после прохождения через клетки полового пути может приводить к опухолевому росту (Okita et al., 2007; Brambrink et al., 2008). Таким образом, чтобы избежать возможных проблем, нами была поставлена задача удалить провирусы из генома репрограммированных клеток, для чего были использованы loxP-сайты, введенные в LTR (long terminal repeats) использованных для репрограммирования вирусных векторов (Wiznerowicz and Trono, 2003). Клон IIIB9 ко-электропорировали двумя плазмидами : циркулярной плазмидой, кодирующей Сге-рекомбиназу, необходимую для выщепления провирусов из генома иПС клеток, и линеаризованной плазмидой р2А 2Btk-TKiresPuro, преимущества стабильного введения которой в геном иПС клеток приведены ниже. Первичную оценку успешного удаления провирусов из генома — отсутствие сигнала EGFP - проводили визуально, с помощью флуоресцентной микроскопии (Рис. ЗА). Удаление остальных провирусов отслеживали при помощи ПЦР геномной ДНК , используя праймеры , специфичные к экзогенным Oct4, Sox2, Klf4, сМус и GFP (Рис. ЗБ). В двух из 96 проанализированных клонов (G4 и Н5) успешно прошло удаление всех пяти провирусов.

вш н

HBES

яН^^М

RRhQI ■1

В! Щ

о> 0> „ $$ /Ъ V- £>

TS> ^ С? С? -с

IIIB9

III В9 Н5

III В9 G3

I В9 G4

tkTK Oct4 Klf4

Sox2 Мус EGFP Sry

Рис. 3. А - Визуализация вьлцепления ЕвРР лентивируса на примере исходного клона ШВ9 и его производных - клонов Н5, вЗ и в4. Б - Выщепление лентивирусов из генома клона П1В9 (кроме Ой4 в вЗ), показанное при помоши ПЦР на экзогенные Ос14, К\(4. 5ох2, сМус, ЕвРР и гена тимидинкиназьг (tk'ÍK) ДНК. ПЦР на ген Эгу (расположен на У хромосоме) проведена для нормализации и для подтверждения пола иПС клеток крысы.

Все проанализированные субклоны имели нормальный кариотип 42,ХУ (Рис. 2Б), сохраняли морфологию, подобную ЭС клеткам (Рис. ЗА), и экспрессировали основные маркеры плюрипотентного состояния, такие как Ой4, Nanog, БвЕА 1 (Рис. 4).

DAPI DAPI OAPI

9 Ь\ Nanog • чВЕ* Oct4 * f щг * 'Яшо* ' —ч* > SSEA1

Рис. 4. Иммунофлуоресцентная окраска иПС клеток (клон Н5) на указанные маркеры плюрипотентного состояния. Верхний ряд - окраска ядер DAPI, нижний - антителами, специфичными для указанного белка.

При введении иПС клеток (1-2х106) под кожу иммунодефицитным крысам или мышам линии Nude у животных-реципиентов наблюдалось образование тератом (Рис. 5) -опухолей, несущих в своём составе клетки и ткани, которые являются производными всех трёх зародышевых листков.

Рис. 5. Гистологический анализ срезов тератом, образованных при инъекции иПС клеток (клон Н5) бестимусным крысам. Показаны слева направо: многослойный эпителий (эктодерма), хрящ (мезодерма), и бронхиальный эпителий (эндодерма).

Все вышеперечисленные данные достоверно подтверждают , что нами были получены новые линии иПС клеток крысы , отвечающие общеприня тым критериям клеточной плюрипотентности. Результаты этой части работы также свидетельствуют о том что Сге-опосредованное удаление провирусов из генома не прив одит к появлению хромосомных нарушений и не влияет на плюрипотентный статус полученных клеток.

На следующем этапе работы была поставлена задача проверить зависимость иПС клеток крысы от присутствия в среде культивирования ингибиторов MAP киназы (MEK1/ERK), PD0325901, киназы гликоген-синтазы 3 (GSK3b) CHIR99021 и известного активатора LIF/STAT3 сигнального пути - фактора ингибирования лейкимии (L1F). С этой целью был проведён клональный анализ , который показал, что для поддержания пролиферативной активности и жизнеспособности этим клеткам абсолютно необходимы и LIF, и CHIR99021, а удаление из среды культивирования хотя бы одного из них приводит к гибели клеток. Удаление из среды культивирования ингибитора PD0325901 приводит к быстрой дифференцировке клеток (Рис. 6).

N2B27 + LIF + CHIR99021 + PD0325901

Г>

_ N2B27 + LIF + CHIR99021

Рис 6. Клональный тест иПС клеток крысы. Типичный пример окраски на щелочную фосфатазу (маркер недифференцированных иПС клеток). Примерно 500 клетки сеяли в лунку 6-луночного планшета и культивировали в течение 5 сут в указанных условиях. Слева - изображение при увеличении в 2.5 раза, справа - при увеличении в 10 раз.

Таким образом , н аличие обоих ингибиторов и LIF необходимо как для репрограммирования, так и для поддержания плюрипотентного состояния в процессе дальнейшего культивирования иПС клеток крысы , что согласуется с литературными данными, касающимися ЭС клеток крысы (Buehr et al., 2008; Ying et al., 2008).

Стабильное введение 2А 2Btk-TKiresPuro кассеты, помимо впервые показанной в настоящей работе возможности проведения трансгенеза на иПС клетках (необходимой предпосылки для дальнейших попыток проведения гомологичной рекомбинации в заданных геномных локусах , необходимой для дальнейшего осуществления генного нокаута на крысах с использованием иПС клеток), сообщало иПС клеткам крысы важные свойства. Так, даже в присутствии вереде культивирования ЫГи обоих ингибиторов киназ, получе иные нами иПС клетки крысы имели предрасположенность к спонтанной дифференцировке при культивировании in vitro и могли поддерживаться в культуре, сохраняя недифференцированное состояние, лишь ограниченное число пассажей (Рис. 7).

- puromyoin + puromycin

• V V . »

•.'К-- j •Я "-г / -V ^р-Лгс Ъ- <аГт «ч ti ! ** л' - ■"■'■} . -XJt •, V,, • О И- I 'с

Рис. 7. Элиминация дифференцированных производных от иПС клеток крысы после двухдневного культивирования в присутствии пуромицина (правая колонка). Для сравнения показаны клетки без подобной обработки (левая колонка). Верхний ряд - окраска на щелочную фосфатазу (АР), известный маркер недифференцированных плюрипотентных клеток, нижний ряд - фазовый контраст.

Присутствие же 2А 2Btk-TKiresPuro кассеты позволяло , даже после кратковременного воздействия на культуры иПС клеток пуромицином , существенно улучшать морфологические характе ристики, эффективно элиминируя дифференцированные клетки (Рис.7). С другой стороны , присутствие гена тимидин киназы (ТК) в кассете позволяло не менее эффективно удалять из популяции недифференцированные клетки при обработке ганцикловиром (GCV) как in vitro, так и in vivo (данные не представлены ). Последнее свойство особенно ценно при проведении исследований, нацеленных на использование иПС (равно как и ЭС ) клеток в целях заместительной клеточной терапии , поскольку предупреждает возникновение и рост тератом из остаточных недифференцированных иПС и ЭС клеток, которые практически всегда присутствуют при направленной дифференцировке этих клеток in vitro.

при формировании на среде N2B27+CHIR и среде, содержащей 15% сыворотки.

В дальнейшем нами была исследована способность полученных линий иПС клеток крысы дифференцироваться in vitro. Во-первых, нами был сделан вывод о необходимости присутствия ингибитора CHIR99021 в процессе формирования эмбриональных телец (ЭТ) из иПС клеток крысы , так как формирование ЭТ , равно как и культивирование иПС клеток крысы , невозможно в присутствии сыворотки (Рис. 8). После того как были подобраны условия для успешного формирования ЭТ , нами был опробован протокол нейрональной дифференцировки. Для этого ЭТ, сформированные в течение двух сут. по методике «висячих кап ель» и дополнительно культивируемые в течение 4 сут. на низкоадгезивных чашках, помещали на покрытые ультратонким слоем матригеля чашки и культивировали в среде N2B27. По прошествии недели в культурах визуально выявлялись нейроны, что подтвержд алось при иммунофлуоресцентном окрашивании клеток на известный нейрональный маркер - ßS-тубулин (Tujl) (Рис 9, а, б).

«3 о

М ЕВ2 . ЕВ6 . dpp6 ? в

AFP

Flk

Nestln Gata4 TBP Sox17

Рис 9. Результаты дифференцировки иПС клеток крысы, а, б - Дифференцировка иПС клеток в нейроны, показанная при помощи иммунофлуоресцентного окрашивания на белок Зр-тубулин (Tujl). в - Анализ экспрессии различных маркеров в эмбриональных тельцах на основе иПС клеток 2 и 4 сут. после формирования (ЕВ2, ЕВ6) и 6 дней после рассева (dpp6), показанный м етодом ОТ-ПЦР. Анализировали мезодермальные (AFP и Flkl), эндодермальные (Gata4 и Soxl7) и эктодермальный (Nestin) маркер клеточных типов.

Направленная дифференцировка в другие клеточные типы в настоящей работе детально не исследовалась. Однако нами были проанализированы, с помощью ОТ-ПЦР, РНК из эмбриональных телец на разных стадиях зрелости и была выявлена экспрессия генов, характерных для всех 3 зародышевых листков (Рис 9, в).

Несмотря на то, что мышь и крыса являются близкородственными видами, условия культивирования ЭС и иПС клеток двух видов заметно отлича ются. Составы сред, подходящие для пол учения и рутинного культивирования ЭС (иПС) клеток мыши, вызывают гибель крысиных клеток ; то же касается и дифференцировочных сред. Невозможность использования сыворотки в дифференцировочных протоколах значительно усложняет подбор условий для направленной дифференцировки. Кроме того, исключается возможность использования уже имеющихся протоколов, в которых используется сыворотка , успешно работающих на кле тках мыши . Однако такие ограничения заставляют выискивать новые протоколы дифференцировки на основе бессывороточных условий , что особо актуально ввиду их востребованности в заместительной терапии у человека. иПС клетки крысы культивируются нами в среде N2B27, изначально разработанной для культивирования клеток нейронального ряда, то при удалении ингибиторов и LIF, клетки имеют больший потенциал к дифференцировке именно в нейрональном направлении. При рассмотрении крысы и крысиных иПС клеток как полноценной модели при изучении вопросов заместительной клеточной терапии человека очевидна необходимость разрабо тки протоколов дифференцировки на основе бессывороточных сред. Это позволит в дальнейшем провести параллель между экспериментами на крысе и исследованиями на человеке.

Наиболее строгим доказательством плюрипотентной природы иПС клеток является их способное ть встраиваться в три зародышевых листка в процессе эмбриогенеза. Поэтому полученные нами иПС клетки крысы (клон Н5) были использованы в

эксперименте по формированию химерного организма . На 18-ые сутки после подсаживания эмбрионов псевдобеременным крысам самок-реципиентов забивали и проводили ПЦР -анализ на включение иПС клеток в различные части эмбриона . Как можно видеть по результату ПЦР-анализа геномной ДНК (Рис. 10), химера №12 показала включение иПС клеток во все проанализированные ткани эмбриона, представляющие производные всех 3 зародышевых листков.

Н5 13Т 13Н 13L 12Т 12Н 12L 12К 12Р Н20

Рис. 10. Участие дифференцированных потомков иПС клеток в иПС-крысиных химерах. Показан генотипический ПЦР-анализ геномной ДНК эмбриона №13 (негативный контроль) и №12. Потомки иПС клеток присутствуют в хвосте (Т), печени ([,), голове (Н), почках (К), но, как и ожидалось, не в плаценте (Р). Анализ проводили с помощью праймеров на тимидинкиназу (ТК).

Таким образом, подтверждается принципиальная возможность дифференцировки полученных нами иПС кле ток во все клеточные типы . Представленные данные могут служить заделом для дальнейших исследований, в частности, стимулировать работы по поиску условий для направленной дифференцировки в клеточные типы, не описанные в настоящем исследовании.

Раздел 2. Метод генетической сенсибилизации

При создании суицидальной кассеты 2А 2Btk-TKiresPuro нами был использован энхансер 2А+2В из дистапьной консервативной области гена Pou5fl (Oct4), представляющий собой последовательность из 200 нуклеотидов , содержащую сайт связывания для гетеродимера Oct4/Sox2 (2В) и ДНК элемент для связывания неизвестного транскрипционного фактора (2А). В сочетании с промотором гена Pou5fI или же с иным минимальным промотором , таким как промотор гена тимидинкиназы (1к), энхансер 2А +2В может служить элементом управления транскрипции, специфичным для ЭС клеток в опытах по временной трансфекции (Okumura-Nakarrishi et al., 2005). Описанный комбинированный регуляторный элемент 2A2Btk может эффективно и, что особо важно, избирательно экспрессироват ься в плюрипотентных клетках при условии стабильной интеграции в геном. Исходя из этого мы поместили под контроль регуляторного элемента 2A2Btk бицистронную кассету ТКiresPuro, позволяющую проводить как позитивную (за счет маркера резистентности к пуромицину (Puro)), так и негативную селекцию (за счет гена тимидинкиназы (ТК) вируса герпеса, сообщающего клеткам чувствительность к ганцикловиру). Относительно небольшой размер 2А 2Btk-TKiresPuro кассеты позволил нам поместить её в лентивирусный вектор и, тем с амым, осуществлять её доставку в геном посредством вирусного заражения (Рис. 11).

Геномный конструкт

DE 18 кб вацмш 2А2В Г~* ТК ires Puro рА

CR1 • "Л Г-ИИг- exonl exon

Лентивирусный конструкт

start r-fcN. LTR HIV PS RRE 2A28 tk ТК »res Puro z V) ë 2 WPRE 5 g 2 lЛ a. ..

Рис. 11. Ген-сенсибилизатор, кодирующий тимидинкиназу вируса герпеса (HSV-TK), введен под транскрипционный контроль энхансера (2А2В) и промотора (CR1) гена Ocl4 или промотра гена тимидинкиназы ((к), обеспечивающих экспрессию ТК в недифференцированных ЭСК/иПСК, но не в производных дифференцированных клетках. IresPuro (часть этой бицистроной кассеты) позволит отбирать, в присутствии пуромицина, обладающие ею ЭС/иПС клетки. Кассета помещена в геномный, плазмидный и лентивирусный векторы. LTR/SIN, cPPT, WPRE, tetO, Н1 - необходимые элементы вируса, 1охР - 1охР-сайт, рА - сигнал полиаденилирования.

Для доставки в ЭС/иПС клетки геномный и плазмидный конструкты линеаризовались и вводились в эти клетки путем электропорации , а лентивирусный конструкт упаковывался в вирусные частицы, как описано в разделе «Материалы и методы», и использовался для вирусного заражения ЭС/иПС клеток. Селекцию стабильно трансфицированных/трансдуцированных клонов проводили в присутствии пуромицина (1-2 мкг/мл ). Резистентные клоны (названные ТК-ЭС или ТК-иПС) отбирали на 8-12-е сут. после электропорации/инфицирования и подвергали дальнейшему тестированию -направленной дифференцировке и негативной селе кции в присутствии ганцикловира. О присутствии остаточных недифференцированных ЭС/иПС клеток судили по морфологическим характеристикам (Рис. 12) и окрашиванию фиксированных культур клеток на щелочную фосфатазу - известный маркер недифференцированных ЭС/иП С клеток (Рис. 13 и 14).

Рис. 12. Функциональное тестирование ЭС клеток, несущих стабильно интегрированный 2A2B-tk-TKiresPuro плазмидный конструкт (ТК-ЭС). (А) обычный вид культуры ЭС клеток: присутствуют как недифференцированные, так и спонтанно дифференцированные клетки. (Б) В присутствии пуромицина (Puro) последние эффективно элиминируются, тогда как недифференцированные ЭС клетки остаются жизнеспособными. ЭС клетки направлялись в дифференцировку в монослое под действием ретиноевой кислоты (RA) (В) и ли через формирование эмбриональных телец (Г), а затем подвергались негативной селекции в присутствии ганцикловира, элиминирующего остаточные недифференцированные ЭС клетки.

Рис. 13. Эффективное удаление резидуальных недифференцированных ЭС/иПС клеток после ' дифференцировки ТК-ЭСК/иПСК в монослое под действием ЯА и дальнейшего культивирования в

| присутствии ганцикловира, показанное окраской на щелочную фосфатазу - маркер недифференцированных

ЭС/иПС клеток (А). Необработанные ганцикловиром культуры показывают высокое содержание

I позитивных на щелочную фосфатазу клеток (Б).

(

I i

Рис. 14. Эффективное удаление резидуальных недифференцированных ЭС/иПС клеток после дифференцировки ТК-ЭС/иПС в нейрональном направлении посредством образования эмбриональных телец. Культивируемые клетки обрабатывали после дифференцировки ганцикловиром и окрашивали либо антителами на нейрональный маркер ТиЛ (А) либо на щелочную фосфатазу (Б). Необработанные ганцикловиром культуры показывают высокое содержание позитивных на щелочную фосфатазу клеток (В).

Наиболее достоверным способом оценки присутствия резидуальных ЭС/иПС клеток явилось введением клеточных суспензии под кожу иммунодефицитным мышам линий NUDE и отслеживанием образования тератом спустя 3-6 недель (Рис. 15).

Рис. 15. (А) Типичный пример тератом, возникающих у реципиентных мышей линии NUDE спустя 4 недели после введения им под кожу недифференцированных ЭС или иПС клеток, либо дикого типа, либо несущих 2A2A-fk~TKiresPuro трансген (ТК-ЭСК) и не прошедших курс инъекций ганнцикловира. (Б) Вырезанные тератомы; отрезок соответствует 1 см. (В) Парафиновые срезы тератом, окрашенные гематоксилином и эозином; представлены различные типы тканей (поперечно-полосатые мышцы, хрящ, нейрональный эпителий, многослойный эпителий, бокаловидный эпителий, кишечный эпителий и др.) -потомков всех трех зародышевых листков.

Участие суицидальных ТК -ЭС клеток в восстановлении функций повреждённой поджелудочной железы.

У лабораторных мышей линии Nude индуцировали сахарный диабет путём интраперитонеалыгаго (i/p) введения стрептозотоцина (STZ) (Sigma, Германия) (Schein et al., 1967) (Lenzen, 2008), растворённого в ледяном цитратном буфере (pH 4.5), из расчета 200 мг/кг массы тела . Нарушение функции поджелудочной железы у ряда экспериментальных животных наблюдалось уже через 24 ч после введения препарата. За основу данного эксперимента нами была взята работа (Takeshita et al., 2006), в которой авторы демонстрируют хо уминг и заселение повреждённой поджелудочной железы ЭС клетками при их интраперитонеальном введении, но наблюдается образование тератом и не наблюдается терапевтического эффекта и восстановление функции органа. Динамика событий в ходе заложенного нами эксперимента отражена в таблице 3 и на рис. 16.

Таблица 3

Сводная таблица условий проведения эксперимента по восстановлению функций повреждённой __поджелудочной железы.

STZ GCV масса Glc доза Glc ЭС клоп s.c./i.p. Glc Glc i.m. Glc (10 № г (мМ) мг/кг (мМ) мЭС/5542 (106/106) (mM) (mM) мг/кг) (м\1) опухоли

1 23.2 7.9 200 9.3 G2 1/1 23.4 18.8 + 29.2

2 22.7 7.0 200 2.9 G2 1/1 20.6 24.0 + 31.1

3 23.6 7,3 200 7.0 G2 1/1 13.0 15.5 _ 15.6 +

4 23.5 6.2 200 7.8 G2 1/1 11.0 12.8 + 17.5

5 19.6 7.8 200 6,9 G2 1/1 7.3 10.4 + 8.5

6 22.9 7.8 200 8.5 . . 8.8 25.2 + 27.3

7 23.7 5.8 200 8.0 G2 1/1 7.2 8.7 9.4 +

8 23.4 8.3 . 7.5 G2 1/1 7.7 6.3 _ 8.2 +

9 25.1 8.5 200 7.3 AI I/l 12.4 18.1 + 23.7

10 24.8 6.6 200 9.0 AI 2/2 9.9 15.4 _ 25.8 +

11 23.4 7.1 200 7.6 AI 2/2 8.9 9.0 + 9.7

12 24.0 6.7 200 7.5 - . 8.9 23.5 + 22.3

13 25.1 6.4 200 4.1 AI 2/2 8.6 16.9 20.8 +

14 20.0 6.1 _ 3.8 AI 2/2 4.6 6.7 _ 4.8

д0 д! д2 д9 дЮ-15 д18

Примечание, № - номер экспериментального животного. Glc - глюкоза, STZ - стрептозотоцин, А1 и G2 - имена клонов ЭС клеток мыши, s.c./i.p. - метод введения клеток, соответственно подкожно и внутрибрюшинно (subcutaneous/ intraperitoneal), GCV- ганцикловир, i.m. - intramuscular (внутримышечно), д-день эксперимента.

Измерение уровня глюкозы (глюкометр AccuCheck-Performa) в крови подопытных животных проводили начиная с первого дня и в течение двух месяцев. Динами ка измерений приведена на рис. 16.

►-РЯД1 Ряд2 РядЗ *— Ряд4 *-Ряд5 1 Рядб Ряд7 — Ряд8 Ряд9 Ряд 10 Ряд11 Ряд 12 Ряд 13 Ряд14

Рис 16. Диаграмма, отражающая изменение уровня глюкозы в крови подопытных животных. По оси абсцисс - время (недели), по оси ординат - концентрация глюкозы в крови (мМ). Ряд - номер экспериментального животного, соотретствует номеру в таблице 3.

Через два месяца после введения клеток подопытных мыши умерщвляли , проводили вскрытие, извлечение опухолей, поджелудочных желёз и их анализ. Опухоли и поджелудочные железы заключали в парафин и анализировали гистологически и иммуногистохимически.

Во всех случаях при обработке мышей ганцикловиром опухоли не возникают (Таблица 3, мыши 1, 2, 4, 5, 6, 9, 11, 12). Следует, однако, отметить, что среди мышей, не обработанных ганцикловиром (Таблица 3, мыши 3, 7, 8, 10, 13) хоминг в область повреждения был достоверно обнаружен только у мыши №7 (Рис 17).

Рис. 17. Результат вскрытия экспериментальной мыши №7. Чёрной стрелкой обозначена контрольная опухоль, образованная клетками, введёнными под кожу. Белой стрелкой обозначена опухоль в области ПЖЖ, демонстрирующая хоминг ЭС клеток, введённых внутрибрюшинно.

Следовательно, наблюдается разночтение с работой (ТакезЬка е( а1., 2006), в которой авторы демонстрируют хоминг в 100% случаев . Но, так как эксперимент был поставлен лишь еди ножды, мы не можем настаивать на этом, возможно, нами не были соблюдены некоторые технологические нюансы.

Поджелудочные железы мышей , которые прошли обработку ганцикловиром , анализировали иммуногистохимически , сравнивая с железами не обработанных STZ мышей из контрольной группы (Рис. 18).

Рис, 18. Окрашивание парафиновых срезов поджелудочной железы антителами на инсулин здоровой (слева) мыши и обработанной ЗТг и пролеченной ТК-ЭС клетками и ганцикловиром (справа).

Хоуминг клеток в нашем случае обнару жен не был , о чем свидетельствует отсутствие позитивной окраски на инсулин у экспериментальной группы животных.

Исходя из выше описанных данных, можно сделать вывод, что на данном этапе испытания предлагаемая технология не даёт достоверного терапевтического эффекта на модели химически индуцированного диабета.

Участие суицидальных ТК -ЭС клеток в восстановлении гематопоэза у летально облучённых мышей.

Для доказательства возможности применения «суицидальной стратегии » для восстановления функции органа или ткани реципиента ¡n vivo, что должно достигаться путем прямого введения недифференцированных ТК-ЭС клеток без каких -либо предварительных дифференцировок и удаления резидуальных ТК-ЭС клеток в культуре, была предложена модель восстановления гематопоэза у л етально облучённых мышей (Рис. 19).

Клетки-помощники

тк-эск (CD45.1J

(С045.2) ©

о i + áSiáSs

Клетки реципиентов Потомки ТК-ЭСК

+/- ганцикловир

- 2-6 недели

CD45.2/45.1 реципиенты

ё /CD45.2A \ 45.1 )

< ?

Клетки-помощники (CD45.1)

Рис. 19. Схема эксперимента по восстановлению кроветворения у летально облученных мышей путем прямой инъекции ТК-ЭС клеток (вместе с клетками-помощниками, полученным из костного мозга С045.1 мышей). Справа показан ожидаемый результат анализа периферической крови реципиентных мышей спустя 6 недель после инъекции ТК-ЭС клеток, проведенного методом проточной цитофлуориметрии. Использованные антитела позволяют различать аллели пан-гемапоэтического поверхностного маркера С045.

Иллюстрацией предложенного подхода является описанный ниже эксперимент, показывающий восстановления кроветворной функции костного мозга мышей за счет ТК-ЭС клеток . Гибридных мышей (129 х С57В16, представляющие собой гемизиготы С045.1/С045.2) подвергали летальной дозе облучения (2x5.5 Гр с 5-минутным интервалом). В тот же день мыши получали внутривенную инъекцию пуромицин -резистентных ТК-ЭС клеток (2х106 клеток) и, для облегчения визуализации развития тератом, дополнительно подкожную инъекцию (1x106 клеток) различных клонов ТК-ЭС клеток, представляющих собой С045.2/С045.2 гомозиготы . Дополнительно , мышам вводили 5х105 клеток-помощников, взятых из костного мозга мышей линии С57В16 (генотип С045.1). По прошествии 6-10 сут., в течение которых, как мы ожидали, основная масса ТК-ЭС клеток должна дифференцироваться в клетки крови , проводился 5-7-дневный курс внутримышечных инъекций ганцикловира (10 мг/кг веса тела). Спустя еще 6 недель (а) регистрировалось наличие тератом в месте введения ТК-ЭС клеток , (б) проводился анализ клеток крови с использованием метода проточной цитофлуориметрии, имевшего целью обнаруж ить среди клеток крови потомков донорских ТК-ЭС клеток (генотип СГ)45.2/С[}45.2). Общая схема прохождения эксперимента отражена так же в таблице 4.

Таблица 4

Сводная таблица условий проведения эксперимента по восстановлению кроветворения у летально облучённых мышей

ДО д 6 д 7 д 8 д 9 д 10 д И д 12 д 13 д 14 д 24 Д40

№ п 0 л ТК- эск клон ККМ С С С в б С С С С

2*10' 0,5*106

1 { 15 + + + + + + + +

2 ( 15 + + + + + + + +

3 { 15 + + + + + +

4 f 15 + 1 ЭС+ 1

5 { 15 + 1 БС+

6 { 15 + БС 1 1/Ь

7 { 15 + + + + + + + + +

8 ( 15

9 т 14 + + + + + + + +

10 т 14 + + + + + + + +

И щ 14 + + + + + +

12 т 14 + 1 ЭС+

13 т 14 + 1 ЭС+ Ь

14 т 14 + 1 ЭС+ 1

Сокращения, использованные в таблице: № - номер экспериментального животного; F, т ~ принадлежность особи к женскому и мужскому полу соответственно; ККМ- клетки костного мозга (они же «клетки-помощники» выше по тексту); С - инъекции ганцикловира; д - день эксперимента; - опухоль, выросшая при подкожном введении ЭС клеток (+ 1- в легких, - в щитовидной железе, +Ь - в костном мозге). Красным отмечены мыши, умершие на 9 (мышь №11) и 13-ые сутки (мыши 7, 8).

Во-первых, все облученные реципиенты (Таблица 4, мыши 7, 8), не получившие инъекции клеток , как и ожидалось , погибали на 8-14-ые сутки после облучения . Во-вторых, у всех реципиентов (Таблица 4, мыши 4, 5, 6, 12, 13, 14), получивших инъекции ТК-ЭС клеток, но не прошедших курс ганцикловира развились опухоли в месте подкожного введения и, что обнаруживалось после вскрытия , в других местах (щитовидная железа, костный мозг, легкие и т.д.). Развитие тератом явилось причиной

гибели Г~ реципиентов к 6-й неделе после облучения. В то же время, у всех реципиентов, получивших инъекцию ТК-ЭС клеток и ганцикловира (Г+) (Таблица 4, мыши 1, 2, 3, 9, 10), тератомы не развивались.

клон 15 клон 14 клон 15 клон 14

Рис. 20. Вклад производных ТК-ЭСК (клоны 14 и 15) в клетки периферической крови через 6 недель после облучения реципиентных мышей в ходе эксперимента, проиллюстрированного на Рис. 19.

СЭ45.1 •'-клетки-помощники

В220* (В-клетки)

Ч*660-А»:ССМ5-2АРС

:Е 5?0-А>: СОНЬ РесРСу5

СОЗ4 (Т-клетки)

Рис. 21. С045.2-позитивные гемапоэтические потомки ТК-ЭС клеток способны дифференцироваться как в В- и Т-лимфоциты, так и в миелоидные клеточные типы гемопоэтической системы, как показано методом проточной цитофлуориметрии с использованием поверхностных маркеров на соответствующие типы клеток.

Анализ клеток периферической крови с использованием метода проточной цитофлуориметрии показал значительный (до 40%, в среднем 20%) вклад ТК-ЭС клеток как в миелоидные, так и в лимфоидные типы клеток реципиентов как у Г", так и у Г + реципиентов, причем у последних - без каких -либо видимых тератомных или иных осложнений (Рис. 20, 21).

Таким образом , проведенный эксперимент демонстрирует возможность применения в клинической практике ЭС/иПС клеток . Основная идея заключается в безопасном (безопухолевом) и прямом (не нуждающемся в дорогостоящей, длительной и неэффективной предварительной ди фференцировке в культуре ) применении недифференцированных плюрипотентных стволовых клеток для заместительной терапии по схеме, приведенной на Рис. 22.

OÓ

эск/*пск

Рис. 22. Схема, иллюстрирующая разработанный в настоящей работе подход (выделен жирной линией) к безопухолевому использованию ЭС/иПС клеток в клинической практике, без использования более традиционной процедуры (пунктирная линия), включающей в себя этап дифференцировки in vitro, чаще всего неэффективной и негомогенной.

Выводы

1. Новый, разработанный автор ом метод получения и поддержания в культуре иПС клеток крысы позволяет повысить выживаемость иПС клеток по меньшей мере в 2 раза по сравнению с опубликованными ранее протоколами.

2. Полученные иПС клетки крысы, при использовании вирусных векторов с последующим их удалением, обладают нормальным кариотипом и плюрипотентными свойствами. О плюрипотентности полученных иПС клеток свидетельствуют экспрессия в них известных маркеров плюрипотентности (Nanog, Oct4, SSEAI, щелочной фосфатазы ), а также способность этих к леток образовать тератомы и участвовать в формировании химерного организма.

5. Эксперимент по восстановлению кроветворения у летально облучённых мыше й доказывает работоспособность предлагаемой «суицидальной стратегии »в тканезамещении.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

Лисковых М.А., Толкунова E.H., Бадер М., Аленина Н. и Томилин А.Н. (2008) На пути к получению индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (иПСК) крысы // Школа-конференция «Биология развития», Звенигород. Сборник тезисов, с 57-58 Томилин А.Н., Толкунова E.H., Лисковых М.А ., Попов Б.В ., Петров Н.С., Чихиржина Е.В., Костылева Е.И . Михайлова Н.А ., Морозова Л.П. (2008) Изучение возможности применения эмбриональных стволовых (ЭСК) и индуцированных плюрипотентных стволовых (иПСК, ¡PS) клеток в за местителыюй терапии у человека // "Отчетная конференция по Программе президиума РАН Молекулярная и клеточная биология", Москва. Сборник тезисов, с 146-147

Лисковых М.А., Толкунова E.H., Минина Ю.А., Шилов А.Г., Петров Н.С., Попов Б.В., Чихиржина Е.В., Костылева Е.И., Жданова Н.С., Томилин А.Н. (2009) Изучение возможности применения эмбриональных (ЭС) и индуцированных плюрипот ентных стволовых (иПС, iPS) клеток в заместительной терапии у человека // Всероссийский симпозиум «Культивируемые клетки как основа клеточн ых технологий », Санкт -Петербург. // Цитология. 51(9): 774-775

Томилин А.Н., Толкунова E.H., Лисковых М.А., Попов Б.В., Петров Н.С., Чихиржина Е.В., Костылева Е.И . Михайлова Н.А ., Морозова Л.П. (2009) Изучение возможности применения эмбриональных стволовых (ЭСК) и индуцированных плюрипотентных стволовых (иПСК, iPS) клеток в за местителыюй терапии у человека // "Отчетная конференция по Программе президиума РАН Молекулярная и клеточная биология", Москва. Сборник тезисов, с 63

Минина Ю.М, Жданова Н.С., Шилов А.ГТолкунова E.H., Лисковых М.А., Томилин

A.Н. (2010) Нестабильность хромосомного состава культивируемых in vitro плюрипотентных клеток мыши// Цитология. 52(5): 420-425

Лисковых М., Чуйкин И., Толкунова Е., Минина Ю., Жданова Н., Ранян А., Бадер М., Аленина H., Томилин А. (2010) Получение и анализ индуцированных плюрипотентных стволовых (иПС) клеток крысы // III Всероссийская научная школа -конференция «Стволовые клетки и регенеративная медицина», Москва. Сборник тезисов . с 21 Liskovy kh M., Chuykin I., Tolkunova E., Ranjan A., Bader M., Tomilin A., Alenina N. (2010) Derivation of iPS cells from rat embryonic fibroblasts // 3rd International Congress on Stem Cells and Tissue Formation in Dresden. Germany, p 146

Liskovykh M., Chuykin I., Safina D.,Ranjan A., Peter A., Tolkunova E., Mullins J.,Bader M., Tomilin A., Alenina N. (2010) Derivation of iPS cells from rat embryonic fibroblasts // The 18th International Workshop on Genetic Systems in the Rat. Kyoto. Japan, p 69 Liskovykh M., Chuykin I., Ranjan A., Safina D., Popova E., Tolkunova E., Mosienko V., Minina lu., Zhdanova N., Mullins J.J., Bader M., Alenina N., Tomilin A. (2011) Derivation, characterization, and stable transfection of induced pluripotent stem cells Fischer rat // PLoS ONE.

Лисковых М.А., Чуйкин И Ранян А., Сафина Д.А ., Толкунова E.H., Минина Ю.М., Жданова Н.С., Дыбан П.А., Маллинс Дж., Костылева Е.И ., Чихиржина Е.В ., Бадер М., Аленина H ., Томилин A.II. (2011) Получение индуцированных плюрипотентных стволовых (иПС) клеток крысы: анализ условий репрограммирования и культивирования // Цитология. 53(12): 927-934

Лисковых М.А., Чуйкин И., Ранян А., Попова Е., Толкунова E.H., Чечик Л.Л., Мосиенко

B., Бадер М., Аленина Н., Томилин А.Н. (2011) Проведение генетических манипуляций и исследование дифференцировочных свойств индуцированных плюрипотентны х стволовых (иПС) клеток крысы // Цитология. 53(12): 934-939

Список цитируемой литературы

Brambrink T., Foreman R., Welstead G.G., Lengner C.J., Wernig M., Suh H., Jaenisch R. Sequential expression of pluripotency markers during direct reprogramming of mouse somatic cells // Cell Stem Cell. 2008. 2: 151-159.

Buehr M„ Meek S., Blair K., Yang I, Ure J., Silva J., McLay R., Hall J., Ying Q.L., Smith A. Capture of authentic embryonic stem cells from rat blastocysts // Cell. 2008. 135: 1287-1298.

Evans M.J., Kaufman, M.H. Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos//Nature. 1981.292: 154-156.

Holubcova Z., Matula P., Sedlackova M., Vinarsky V., Dolezalova D., Barta T., Dvorak P, Hampl A. Human embryonic stem cells suffer from centrosomal amplification // Stem Cells. 2010. 29: 46-56.

Lenzen S. The mechanisms of alloxan- and streptozotocin-induced diabetes // Diabetologia. 2008.51:216-226.

Li VV., Wei W., Zhu S., Zhu J., Shi Y., Lin T., Hao E., Hayek A., Deng H., Ding S. Generation of rat and human induced pluripotent stem cells by combining genetic reprogramming and chemical inhibitors // Cell Stem Cell. 2009. 4: 16-19.

Minina Iu. M., Zhdanova N.S., Shilov A.G., Tolkunova E.N., Liskovykh M.A., Tomilin A.N. Chromosomal instability of in vitro cultured mouse embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells // Tsitologiia. 2010. 52: 420-425.

Okita K., Ichisaka T., Yamanaka S. Generation of germ line-competent induced pluripotent stem cells //Nature. 2007. 448: 313-317.

Okumura-Nakanishi S., Saito M., Niwa H., Ishikawa F. Oct-3/4 and Sox2 regulate Oct-3/4 gene in embryonic stem cells III Biol Chem. 2005. 280: 5307-5317.

Schein P.S., Cooney D.A., Vernon M.L. The use of nicotinamide to modify the toxicity of streptozotocin diabetes without loss of antitumor activity // Cancer Res. 1967. 27:2324-2332. Sugawara A., Goto K., Sotomaru Y., Sofuni T., Ito T. Current status of chromosomal abnormalities in mouse embryonic stem cell lines used in Japan // Comp Med. 2006. 56: 31-34. Takahashi K. and Yamanaka S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors // Cell. 2006. 126: 663-676.

Takahashi K., Tanabe K., Ohnuki M., Narita M., Ichisaka T., Tomoda K., Yamanaka S. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors // Cell. 2007. 131:861-872.

Takeshita F., Kodama M., Yamamoto H., Ikarashi Y., Ueda S., Teratani T., Yamamoto Y.,

Tamatani T., Kanegasaki S., Ochiya T., Quinn G. Streptozotocin-induced partial beta cell

depletion in nude mice without hyperglycaemia induces pancreatic morphogenesis in

transplanted embryonic stem cells // Diabetologia. 2006. 49:2948-2958.

Wiznerowicz M., Trono D. Conditional suppression of cellular genes: lentivirus vector-

mediated drug-inducible RNA interference // J Virol. 2003. 77: 8957-8961.

Ying Q.L., Wray J., Nichols J., Batlle-Morera L., Doble B., Woodgett J., Cohen P., Smith A.

The ground state of embryonic stem cell self-renewal // Nature. 2008.453: 519-523.

Yu J., Vodyanik M.A., Smuga-Otto K., Antosiewicz-Bourget J., Frane J.L., Tian S., Nie J.,

Jonsdottir G.A., Ruotti V., Stewart R., Slukvin I.I., Thomson J.A. Induced pluripotent stem cell

lines derived from human somatic cells // Science. 2007. 318: 1917-1920.

Подписано в печать 03.10.2011. Формат 60x84/16. Печать цифровая. Усл. печ. л. 1,0. Тираж 100. Заказ 2228.

Отпечатано с готового оригинал-макета, предоставленного автором, в типографии Издательства Политехнического университета. 195251, Санкт-Петербург, Политехническая ул., 29. Тел.: (812) 550-40-14 Тел./факс: (812) 297-57-76

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Лисковых, Михаил Александрович, Санкт-Петербург

УЧРЕЖДЕНИЕ РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК ИНСТИТУТ ЦИТОЛОГИИ РАН

61 12-3/395 пРавах рукописи

ДИСКОВЫХ Михаил Александрович

Получение, характеристика и генетическая модификация индуцированных плюрипотентных стволовых клеток крысы для применения в целях тканезаместительной терапии

03.03.04

Клеточная биология, цитология, гистология

ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург 2011

Содержание

Введение.........................................................................................................................................4

I. Обзор литературы......................................................................................................................8

1.1. Эмбриональные стволовые клетки....................................................................................8

1.1.1. Основные сигнальные пути, обеспечивающие самообновление клеток и поддержание плюрипотентного состояния в ЭС клетках...............................................10

1.1.1.1. LIF/gpl30/STAT3 - сигнальный путь...........................................................10

1.1.1.2. BMP/Smad каскад............................................................................................13

1.1.1.3. Wnt/p-Catenin/TCF..........................................................................................15

1.1.1.4. Фосфотидилинозитол-3 (PI3) киназный сигнальный путь.........................17

1.1.1.5. Ras/Raf/ERK сигнальный путь.......................................................................18

1.1.1.6. Перекрещивание и совместное действие сигнальных путей......................19

1.1.2. Ключевые транскрипционные факторы, характерные для ЭС клеток, обеспечивающие контроль самоподдержания и плюрипотентного состояния............23

1.1.2.1. Oct4...................................................................................................................23

1.1.2.2. Nanog................................................................................................................24

1.1.2.3. Sox2..................................................................................................................25

1.1.2.4. Klf4...................................................................................................................26

1.1.2.5. сМус.................................................................................................................27

1.1.3. Эпигенетический статус ЭС клеток.........................................................................28

1.1.4. Влияние химически-синтезированных веществ на ЭС клетки.............................29

1.2. Индуцированные плюрипотентные стволовые клетки.................................................31

1.2.1. Предпосылки открытия феномена индуцированной плюрипотентности............31

1.2.2. Открытие феномена индуцированной плюрипотентности....................................33

1.2.3. Необходимые характеристики иПС клеток.............................................................36

1.2.3.1. Способы доставки репрограммирующих факторов в клетки: интегрирующие системы............................................................................................36

1.2.3.2. Способы доставки репрограммирующих факторов в клетки: неинтеграрующие системы........................................................................................40

1.2.3.3. Идентификация иПС клонов..........................................................................43

1.2.4. Механизмы, лежащие в основе формирования иПС клеток.................................45

1.2.4.1. Детерминистическая и стохастическая гипотезы перехода соматических клеток в плюрипотентное состояние.........................................................................46

1.2.4.2. Предполагаемая последовательность событий при переходе клеток в плюрипотентное состояние........................................................................................49

1.2.5. Роль репрограммирующих транскрипционных факторов в процессе перестройки хроматина.............................................................................................................................52

1.2.6. Перспективы использования иПС клеток в терапевтических целях....................55

II Материалы и методы...............................................................................................................57

II.1. Работа с клетками эукариот в культуре.........................................................................57

II. 1.1. Получение МЭФ из 13.5-дневных плодов мыши..................................................57

II. 1.2 Обработка МЭФ митомицином................................................................................58

II. 1.3. Культивирование ЭС клеток мыши........................................................................58

II. 1.4. Трансфекция кальций-фосфатным методом..........................................................59

II. 1.5. Упаковка вирусных частиц......................................................................................59

И. 1.6. Титрование вирусов.................................................................................................60

II. 1.7. Заражение клеток лентивирусными частицами....................................................60

II. 1.8. Модификации пластика для культивирования......................................................61

II. 1.9. Получение иПС клеток крысы................................................................................62

II. 1.10 Получение иПС клеток мыши................................................................................63

II. 1.11.Электропорация ЭС клеток мыши и иПС клеток крысы.....................................63

II. 1.12. Клональный анализ................................................................................................64

II.1.13. Реакция на щелочную фосфатазу..........................................................................65

II. 1.14. Тест на формирование тератом.............................................................................65

II. 1.15. Дифференцировка иПС клеток крысы in vitro.....................................................65

II. 1.16. Инъекция иПС клеток в эмбрион крысы..............................................................66

II.2. Молекулярно-биологические методы...........................................................................67

11.2.1. Генотипирование клонов ЭС (иПС) клеток...........................................................67

11.2.2. Кариотипирование ЭС (иПС) клеток......................................................................67

11.2.3. Иммунофлуоресцентное окрашивание клеток, находящихся в культуре..........68

11.2.4. Реакция обратной транскрипции............................................................................68

11.2.5. Полимеразная цепная реакция................................................................................69

11.2.6. LacZ-окрашивание....................................................................................................70

11.2.7. Проточная цитофлуореметрия (FACS)...................................................................70

II.2.8 Молекулярное клонирование...................................................................................71

III. Результаты и обсуждения.....................................................................................................72

III. 1. Получение иПС клеток крысы......................................................................................72

III. 1.1. Индукция плюрипотентного состояния в КЭФ....................................................72

III. 1.2. Доказательства плюрипотентного статуса полученных иПС клеток крысы ....77

111.1.3. Особенности условий культивирования иПС клеток крысы..............................81

III. 1.4. Проведение генетических манипуляций с иПС клетками крысы......................82

III. 1.5. Подбор условий для направленной дифференцировки иПС клеток крысы......83

III. 1.6. Обсуждение..............................................................................................................87

III.2. Метод генетической сенсибилизации..........................................................................88

111.2.1. Создание ДНК конструкций для генетической сенсибилизации.......................88

111.2.2. Генетическая сенсибилизация через введение «маркера-самоубийцы»............90

111.2.3. Мечение ТК-ЭС/иПС клеток..................................................................................94

111.2.4. Пример использования генетической сенсибилизации в терапевтических целях ...............................................................................................................................................96

111.2.4.1. Участие суицидальных ТК-ЭС клеток в восстановлении функций повреждённой поджелудочной железы....................................................................97

111.2.4.2. Участие суицидальных ТК-ЭС клеток в восстановлении гематопоэза у летально облучённых мышей...................................................................................100

III.2.5.Обсуждение.............................................................................................................104

Выводы.......................................................................................................................................106

Литература.................................................................................................................................107

Приложение 1............................................................................................................................134

Введение

В последнее время всё более возрастает потребность в новых экспериментальных моделях. В первую очередь это касается тех областей науки, которые близки к терапевтическим медицинским исследованиям. Одной из актуальных задач исследований, проводимых на стыке биологии и медицины, является выбор модельного организма. Крыса представляет собой удобную модель в физиологии, фармакологии, трансплантологии, иммунологии, онкологии, и изучении старения и сердечно-сосудистой системы. При сравнимой с мышиной продолжительностью репродуктивного цикла и стоимостью содержания, крыса имеет более подходящий размер, например, для рутинного отбора проб крови и сложных физиологических опытов. С другой стороны, полное понимание физиологических процессов невозможно без описания функции генов, что в свою очередь должно опираться на генный нокаут. Проведение генного нокаута на мыши стало возможным только благодаря возможности получения эмбриональных стволовых (ЭС) клеток (Evans et al., 1981). Однако проведение генного нокаута на крысе до недавнего времени не представлялось возможным, так как ЭС клетки этого вида были впервые получены только в 2008 году (Buehr et al., 2008). Помимо прочего, процесс их получения оказался очень трудоёмким и дорогостоящим.

Таким образом, получение индуцированных плюрипотентных стволовых (иПС) клеток крысы позволит обойти особо трудоёмкий процесс получения ЭС клеток и приблизит нас к проведению различных исследований, использующих крысу, как экспериментальную модель.

Эмбриональные стволовые клетки и индуцированные плюрипотентные стволовые клетки обладают рядом уникальных особенностей: способны неограниченно долго делиться в культуре, а также подвергаться генетическому манипулированию, сохраняя свои свойства. Путём изменения условий культивирования можно добиваться дифференцировки ЭС/иПС клеток in vitro практически во все клеточные типы тканей

взрослого организма. При подсадке в доимплантационные эмбрионы, ЭС/иПС клетки способны встраиваться в ткани, происходящие из всех трех зародышевых листков. Описанные свойства, характерные для ЭС/иПС клеток обозначаются термином "плюрипотентность" и делают их ценным объектом, как для фундаментальных (изучение функции генов при проведении генного нокаута), так и для прикладных (заместительная клеточная/тканевая терапия) исследований.

Несмотря на значительный прогресс в области изучения биологии плюрипотентных стволовых клеток, одним из важнейших препятствий, стоящих на пути практического применения этих клеток в клинике является их туморогенность.

Известно, что попадание в организм взрослой мыши хотя бы нескольких ЭС клеток приводит к возникновению тератом. Кроме того, существующие протоколы направленной дифференцировки ЭС клеток in vitro позволяет получить весьма гетерогенные популяции клеток, в которых практически всегда присутствуют резидуальные недифференцированные клетки, обладающие высоким туморогенным потенциалом. Очевидно, что описанная выше ситуация в полной мере относится и к иПС клеткам. Таким образом, присутствие даже небольшого количества недифференцированных ЭС/иПС клеток (и даже одной такой клетки) в трансплантируемом пациенту клеточном материале недопустимо ввиду возможности возникновения тератомы. Соответственно, разработка технологий, гарантирующих полное удаление резидуальных ЭС/иПС клеток из гетерогенных клеточных суспензий или же обеспечивающих получение дифференцированных клеток для ткане-заместительной терапии вообще без использования ЭС/иПС клеток, остаётся одной из самых актуальных на сегодняшний день задач в области биологии стволовых клеток. Данная проблема особенно актуальна в свете бурно развивающегося направления заместительной клеточной/тканевой терапии.

Помимо наиболее актуальной проблемы туморогенности ЭС/иПС клеток, существует ряд проблем, связанных, непосредственно с получением и последующими манипуляциями именно с ЭС клетками. Помимо уже изложенных трудностей нельзя исключать возможность иммунного ответа при использовании искусственно полученного трансплантата из клеток донора. Эти и многие другие проблемы на сегодняшний день остаются нерешёнными.

Существует также морально-этический вопрос использования ЭС клеток в фундаментальных исследованиях и особенно, в тканезаместительной терапии человека. Так, что получение ЭС клеток сопряжено с необходимостью умерщвления эмбриона, что на сегодняшний день недопустимо при работе с человеческим материалом в ряде стран мира.

Задачи исследования:

2. Генерировать иПС клетки из КЭФ и получить несколько независимых клеточных линий.

3. Изучить плюрипотентные свойства полученных линий иПС клеток крысы в экспериментах in vitro и in vivo.

5. Разработать стратегию контроля над туморогенностью ЭС/иПС клеток, заключающуюся в генетической сенсибилизации этих клеток за счет «суицидальной кассеты», несущей гена тимидин киназы (ТК).

I. Обзор литературы

1.1. Эмбриональные стволовые клетки

Эмбриональные стволовые клетки - популяция клеток, происходящая из внутренней клеточной массы (ВКМ) предымплантационных бластоцист. Отличительной особенностью этой клеточной популяции являются способность к бесконечно долгому самоподдержанию и пролиферирации в культуре без потери свойств. ЭС клетки при определённых условиях способны дифференцироваться in vitro, а также in vivo, при подсадке в доимплантационные эмбрионы, во все типы клеток и тканей взрослого организма (за исключением двух внезародышевых клеточных типов - трофэктодермы и первичной эндодермы), и, что особо важно для успешного проведения генного нокаута, в линию половых клеток. Впервые ЭС клетки были получены из мышиных бластоцист в 1981 году Ивенсом (Evans and Kaufman, 1981), что привело в дальнейшем к расширению спектра исследований, в частности, к созданию технологии нокаута гена (Doetschman et al., 1987). Это позволило значительно ускорить изучение функций генов, с помощью их «выключения».

В 1998 году, когда были впервые получены ЭС клетки человека (Thomson et al., 1998), появилась реальная возможность использования их в заместительной терапии при различных заболеваниях человека (Smith, 1998). В настоящее время отработаны методы эффективной дифференцировки ЭСК в различные высокоспециализированные клеточные типы, такие как (3-клетки поджелудочной железы, нейроны, кардиомиоциты. Есть все основания полагать, что в дальнейшем, эти исследования приведут к решению таких сложных проблем медицины, как диабет, нейродегенеративные заболевания (болезни Паркинсона и Альцгеймера), инфаркт миокарда, и т. п. (Wobus and Boheler, 2005).

Несмотря на открывающиеся перспективы, использование человеческих ЭС клеток

в терапии сопряжено с рядом проблем. Одной из этих проблем является морально-

этическая, поскольку получение ЭС клеток человека опирается на необходимость

умерщвления эмбриона, что запрещено на законодательном уровне в ряде стран мира (http://eulaw.edu.ru/documents/articles/zapr_clon_chel.htm). Кроме того, в настоящее время, культивирование человеческих ЭС клеток проводится на подложке из мышиных эмбриональных фибробластов (МЭФ) в среде, содержащей бычью сыворотку. Приведенные условия культивирования подвергают ЭС клетки риску воздействия патогенными вирусами, которые могут присутствовать как в сыворотке, так и в МЭФ. Такое межвидовое соседство небезопасно для целостности генома ЭС клеток и, как следствие, может привести к невозможности их использования в терапии. Также остаётся проблема иммунной совместимости при использовании чужих клеток и, как результат, реакции «хозяин против трансплантата» или «трансплантат против хозяина». Вышеперечисленные проблемы можно частично обойти с помощью создания пациент-специфичных ЭС клеток, например, путём подсаживания в ооцит, лишённый ядра, ядра соматической клетки (т.н. терапевтическое клонирование) или слиянием соматической и ЭС клетки (Cowan et al., 2005) и получения популяции клеток, обладающих свойствами ЭС клеток (Hwang et al., 2005). Кроме того, избавиться от фидерного слоя и использования сыворотки может помочь культивирование ЭС клеток в среде без сыворотки, с использованием специальных ростовых факторов, но данная технология находится на стадии развития и в настоящее время является очень дорогостоящей. Помимо прочего, нерешенной остаётся проблема туморогенности ЭС клеток, которая стоит наравне с другими, вышеперечисленными проблемами.

Особый интерес в последние годы представляют индуцированные плюрипотентные стволовые (иПС) клетки, впервые полученные японским учёными в 2006 году (Takahashi and Yamanaka, 2006). Так, иПС клетки могут являться альтернативой ЭС клеткам во многих экспериментах, а так же при изучении механизмов возникновения заболеваний человека (Okita et al., 2007; Wernig et al., 2007). Использование именно иПС клеток в исследовательской и клинической областях более предпочтительно, нежели ЭС

клеток, так как позволяет решить две из трёх описанных выше проблем, а именно морально-этическую (для получения

Информация о работе

Лисковых, Михаил Александрович
кандидата биологических наук
Санкт-Петербург, 2011
ВАК 03.03.04

Диссертация

Получение, характеристика и генетическая модификация индуцированных плюрипотентных стволовых клеток крысы для применения в целях тканезаместительной терапии - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы