Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Закономерности нормального и патологического развития плюрипотентных стволовых и тератокарциномных клеток млекопитающих
ВАК РФ 03.03.04, Клеточная биология, цитология, гистология
Автореферат диссертации по теме "Закономерности нормального и патологического развития плюрипотентных стволовых и тератокарциномных клеток млекопитающих"
На правах рукописи
ГОРДЕЕВА Ольга Федоровна
ЗАКОНОМЕРНОСТИ НОРМАЛЬНОГО И ПАТОЛОГИЧЕСКОГО РАЗВИТИЯ ПЛЮРИПОТЕНТНЫХ стволовых и ТЕРАТОКАРЦИНОМНЫХ КЛЕТОК МЛЕКОПИТАЮЩИХ
03.03.04-клеточная биология, цитология, гистология
АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук
Москва — 2014
15 БКЗ 2015
005557376
Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институт биологии развития им Н.2. Кольцова РАН, Москва
Научный консультант:
Официальные оппоненты:
Ведущая организация:
Васецкий Сергей Григорьевич
доктор биологических наук, главный научный сотрудник лаборатории экспериментальной эмбриологии ФГБУН Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН, г. Москва Анисимов Владимир Николаевич член-корр. РАН, доктор медицинских наук, профессор, руководител отдела канцерогенеза и онкогеронтологии ФГБУ "Институт онкологии им. H.H. Петрова" Министерства здравоохранения РФ, г. Санкт-Петербург Евгеньев Михаил Борисович доктор биологических наук, профессор, заведующий лабораторией молекулярных механизмов биологической адаптации ФГБУН Институт молекулярной биологии им. В.А.Енгельгарта РАН, г. Москва
Дыбан Павел Андреевич
доктор медицинских наук, профессор, ведущий научный сотрудник отдела молекулярной генетики ФГБУ "Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины" СЗО РАМН, г. Санкт-Петербург
Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск
Защита диссертации состоится «13» февраля 2015 года в «........» часов на заседании
Диссертационного совета Д 002.230.01 на базе ФГБУН Института цитологии РАН по адресу: 194064, Санкт-Петербург, Тихорецкий пр., д. 4.
Адрес электронной почты Института: cellbio@mail.cytspb.rssi.ru Сайт: Ьйр//\у\у\у.су18рЬ.г88^ги Факс: 8 (812) 297-35-41
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии РАН и на сайте www.cytspb.rssi.ru
Автореферат разослан --¿-2014 г.
Ученый секретарь Диссертационного совета,
кандидат биологических наук / Е.В.Каминская
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы
Плюрипотентные клетки млекопитающих участвуют в формировании всех типов соматических и половых клеток развивающегося организма и некоторых внезародышевых структур. Способность участвовать в развитии не только различных соматических клеток, но и линии половых клеток является основным отличием клеток, находящихся в базовом статусе плюрипотентности (ground/naive state), от клеток в первичном статусе плюрипотентности (primed state) (Nichols, Smith, 2009). Для исследования механизмов раннего развития млекопитающих и специализации различных типов клеток широко используются in vitro модели -постоянные клеточные линии плюрипотентных стволовых клеток, полученные из разных источников клеток и с помощью различных экспериментальных методов. Одним из основных критериев плюрипотентности полученных клеточных линий является их способность дифференцироваться в линию половых клеток. Однако установлено, что не все линии способны обеспечивать развитие полноценных гамет у химерных животных (Hayashi, Surani, 2009). Кроме того, этот критерий не применим для тестирования плюрипотентных стволовых клеток человека. Несмотря на интенсивные исследования плюрипотентных стволовых клеток различного происхождения, вопросы эквивалентности их статуса и потенциала к дифференцировке, сходства механизмов поддержания базового и первичного статуса плюрипотентности, обеспечения баланса пролиферации и ' дифференцировки, а также способности к онкогенной трансформации остаются
открытыми и актуальными. | В ряде работ было установлено, что продолжительное культивирование in
vitro плюрипотентных стволовых клеток приводит к накоплению в них генетических аберраций и аномальных эпигенетических изменений, которые : ведут к нестабильности генома, клеточной трансформации и канцерогенезу (обзор Lund et al., 2012). Кроме того, большинство линий индуцированных ! плюрипотентных стволовых клеток были получены путем трансдукции и дополнительной активации онкогенов С-Мус и Klf4, экспрессия которых может усиливаться в недифференцированных плюрипотентных стволовых клетках и дифференцирующихся из них клеток-предшественников, а следовательно, в этих клетках существует большая вероятность трансформации в раковые стволовые клетки (Laurent et al., 2011). Эти данные свидетельствуют о том, что при использовании линий плюрипотентных стволовых клеток в целях клеточной терапии необходим регулярный генетический и эпигенетический мониторинг. Помимо этого, необходим поиск новых маркеров для идентификации и селекции клеток, подвергшихся онкогенной трансформации, а также разработка технологий для экспериментальной оценки онкогенного потенциала плюрипотентных стволовых клеток и их производных в животных-биомоделях. Кроме того, линии
плюрипотентных стволовых клеток могут быть использованы для экспериментального моделирования генеза нормальных и опухолевых тканей и установления механизмов канцерогенеза.
Способность плюрипотентных стволовых клеток рекапитулировать ранние стадии развития млекопитающих позволяет рассматривать и использовать их как уникальную модель не только для фундаментальных исследований в области биологии развития, но и как тест-систему для фармакологических и токсикологических исследований. На основе линий плюрипотентных стволовых клеток может быть создана уникальная технологическая платформа, позволяющая охватить большой набор клеточных типов, появляющихся на разных стадиях онтогенеза, и оценить действие новых лекарств и химических веществ на весь спектр клеток организма. Таким образом, вышеперечисленные фундаментальные и прикладные аспекты биологии плюрипотентных стволовых клеток определяют актуальность исследований механизмов самообновления, дифференцировки и морфогенеза плюрипотентных стволовых клеток и их потомков, а также их малигнизированных аналогов различного происхождения, что и являлось предметом исследований в рамках представленной диссертационной работы.
Цели и задачи исследования
Основная цель работы: выявить закономерности в молекулярных и клеточных механизмах самообновления, дифференцировки и морфогенеза плюрипотентных стволовых и тератокарциномных клеток мыши и человека.
Для достижения цели были поставлены следующие задачи:
i
1. Определить паттерны экспрессии генов, специфических для линии половых клеток, в плюрипотентных стволовых и тератокарциномных клетках для установления их связи с различными фазами плюрипотентного статуса и для характеристики статуса новых получаемых линий плюрипотентных стволовых клеток млекопитающих.
2. Изучить паттерны экспрессии раково-тестикулярных антигенов семейств MAGE-A, MAGE-B, MAGE-D и GAGE в плюрипотентных стволовых клетках и опухолевых клетках различного происхождения с целью определения потенциальных маркеров трансформированных плюрипотентных стволовых клеток и их производных.
3. Выявить различия в механизмах функционирования сигнальных путей, обеспечивающих поддержание баланса процессов пролиферации и дифференцировки, в нормальных плюрипотентных стволовых клетках и их I опухолевых аналогах тератокарциномных клетках.
4. Исследовать динамику роста и дифференцировки, сохранение туморогенного потенциала плюрипотентных стволовых и тератокарциномных клеток мыши и человека in vivo после трансплантации иммунодефицитным и иммунокомпетентным животным-реципиентам для разработки
стандартизованных методов тестирования онкогенного потенциала производных плюрипотентных стволовых клеток.
5. С целью создания тест-систем для изучения эмбриотоксичности разработать in vitro модели раннего развития млекопитающих с использованием линий плюрипотентных стволовых клеток и установить факторы, влияющие на динамику дифференцировки и морфогенеза клеток-предшественников трех зародышевых листков в трехмерных клеточных моделях в норме и при воздействии повреждающих химических факторов.
Основные положения, выносимые на защиту
1. Поддержание базового (ground state) и первичного (primed state) статусов плюрипотентности клеток млекопитающих ассоциировано с экспрессии генов, специфических для линии половых клеток. Паттерны экспрессии генов, специфических для линии половых клеток, коррелируют с потенциалом к дифференцировке в соматические и половые клетки для линий плюриоптентных стволовых, но не тератокарциномных клеток. Уровни экспрессии генов Oct4/OCT4, и Ddx4/DDX4 в нормальных клетках могут служить индикаторами удаленности от базового статуса плюрипотентности (ground state).
2. Характер экспрессии раково-тестикулярных антигенов семейств MAGE-A и MAGE-B стадиеспецифичен и тканеспецифичен в процессе дифференцировки плюрипотентных стволовых клеток человека и мыши, тогда как в тератокарциномных, а также в раковых клетках нейроэктодермального и мезодермального происхождения раково-тестикулярные антигены экспрессируются аберрантно. На основе различий в специфических профилях раково-тестикулярных антигенов в нормальных плюрипотентных и опухолевых клетках могут быть выявлены трансформированные клетки в культивируемых популяциях in vitro.
3. Регуляция самообновления клеток в базовом и первичном статусах плюрипотентности значительно различается вследствие различий в уровнях эндогенной экспрессии факторов TGFfil, BMP4 и ActivinA, а также FGF2, активирующих соответствующие сигнальные пути. Для поддержания недифференцированных клеток в первичном статусе плюрипотентности усиление ActivinA/Nodal/Lefty/Smad2/3 сигналинга с помощью экзогенных факторов является необходимым для ослабления влияния эндогенных BMP/Smadl/5/8 сигнальных путей, стимулирующих дифференцировку.
4. Нарушения баланса процессов самообновления и дифференцировки в тератокарциномных клетках человека и мыши обусловлено изменениями в регуляции пролиферативных и антипролиферативных сигналов: снижением активности эндогенных сигнальных путей факторов семейства TGFP и усилением активности PI3K/Akt и MEK/ERK-сигнальных путей.
5. Динамика роста и дифференцировки плюрипотентных стволовых клеток мыши и человека после трансплантации их в различные ткани иммунодефицитных и иммунокомпетентных мышей зависит от статуса плюрипотентности клеточной линии. Инициация и прогрессия опухолей, формирующихся после трансплантации плюрипотентных стволовых и нуллипотентных тератокарциномных клеток человека и мыши, зависит от тканевого сайта трансплантации и статуса иммунной системы животных-реципиентов.
6. Разработана ЗБ-модель in vitro дифференцировки плюрипотентных стволовых клеток млекопитающих для изучения механизмов раннего развития млекопитающих и оценки эффектов фармакологических препаратов и токсических веществ. Основными факторами, влияющими на динамики роста, дифференцировки и морфогенеза эмбриоидных тел, являются онтогенетическое происхожение линии плюрипотентных стволовых клеток и состав среды для культивирования.
Научная новизна и теоретическое значение работы
На основе исследований линий нормальных плюрипотентных стволовых и малигнизированных тератокарциномных клеток мыши была сформулирована концепция о ключевых факторах, которые регулируют различные фазы плюрипотентного статуса. Впервые показано, что базовый (ground state) и первичный (primed state) статус плюрипотентности клеток млекопитающих ассоциирован с паттернами экспрессии генов, специфических для линии половых клеток. В частности, уровни экспрессии генов Oct4/OCT4, и Ddx4/DDX4 могут служить индикаторами удаленности от базового статуса плюрипотентности (ground state). Полученные критерии оценки на основе профиля экспрессии генов, специфических для линии половых клеток, были успешно применены для характеристики полученных новых линий эмбриональных стволовых клеток человека HESC1-3, SC3a, SC5-7 (Кольцова и др., 2011) и прогнозирования их потенциала к дифференцировке. Впервые показано, что на основе профиля экспрессии генов, специфических для линии половых клеток, статусы малигнизированных клеток тератокарцином можно рассматривать как неопределенные устойчивые состояния с частичной аналогией статусам нормальных плюрипотентных клеток.
Впервые обнаружено, что нормальные плюрипотентные стволовые клетки человека и мыши имеют сходные профили экспрессии раково-тестикулярных антигенов семейств MAGE-A, MAGE-B и MAGE-D, которые изменяются в процессе дифференцировки в соматические и половые клетки. На основе обнаруженных различий в специфических профилях раково-тестикулярных антигенов в нормальных плюрипотентных и опухолевых клетках могут быть выявлены трансформированные клетки в культивируемых популяциях in vitro.
Впервые показано, что механизмы сигнальной регуляции самообновления и дифференцировки клеток в базовом и первичном статусах плюрипотентности значительно различаются вследствие различий в уровнях эндогенной экспрессии факторов TGFßl, ВМР4 и ActivinA, а также FGF2. Впервые установлено, что потенциал к дифференцировке у плюрипотентных и нуллипотентных клеток мыши и человека обусловлен различными паттернами эндогенной экспрессии факторов семейства TGFß, активирующих соответствующие сигнальные пути, различиями их функциональной активности и биологической роли в этих клетках. Дисбаланс пролиферативных и антипролиферативных сигналов, приводящий к нарушению процессов дифференцировки ЭТК, обусловлен снижением активности эндогенных сигнальных путей факторов семейства TGFß и усилением митогенной активности PI3K/Akt и MEK/ERK сигнальных путей.
На основе комплексных исследований роста и дифференцировки плюрипотентных стволовых клеток в 3 D-системах in vitro установлены факторы, влияющие на динамику дифференцировки и морфогенеза эмбриоидных тел и их устойчивость к повреждающим факторам, что позволяет использовать разработанные модели ранних стадий развития млекопитающих для оценки эмбриотоксичности.
Практическое значение работы
Результаты работы имеют практическую значимость для решения задач регенеративной медицины, онкологии, фармакологии и токсикологии. Полученные результаты исследования транскрипционных профилей генов, специфических для линии половых клеток, и раковотестикулярных антигенов могут быть использованы для стандартизации линий плюрипотентных стволовых клеток, которые предполагается использовать как источник клеточных производных в регенеративной медицине. Использование профиля экспрессии раково-тестикулярных антигенов для оценки плюрипотентных стволовых клеток и их производных может быть полезным для идентификации аномальных клеток, что способствует повышению уровня безопасности клеточных технологий. На основе результатов и протоколов по трансплантации плюрипотентных стволовых и тератокарциномных клеток мыши и человека иммунодефицитныи и иммунокомпетентным животным-реципиентам может быть разработана стандартизованная технология тестирования онкогенного потенциала производных стволовых клеток. Результаты исследований ранней 3D-дифференцировки линий плюрипотентных стволовых клеток показали, что она может быть использована в качестве in vitro модели раннего развития млекопитающих для разработки высокотехнологичных тест-систем для фармакологических и токсикологических исследований новых лекарств и
химических веществ.
Результаты работы используются при чтении специальных курсов лекций для студентов кафедры эмбриологии биофака Московского государственного университета. Они могут быть использованы в курсах лекций по частным
разделам биологии развития и клеточной биологии при подготовке специалистов в других высших учебных заведениях биологического профиля и включены в руководства и учебные пособия по данным специальностям.
Апробация работы
Основные научные результаты диссертации были представлены на Всероссийских симпозиумах по биологии клетки в культуре (Санкт-Петербург 2001, 2003, 2006, 2007, 2009, 2013), на международных конференциях по биологии стволовых клеток Annual Meeting of the International Society for Stern Cell Research (Сан-Франциско, США, 2005; Торонто, Канада, 2006; Керне, Австралия, 2007; Филадельфия, США, 2008; Барселона, Испания, 2009; Сан-Франциско, США, 2010; Йокогама, Япония, 2012; Флоренция, Италия, 2013), на международных конгрессах 30™ FEBS Congress -9th IUBMB Conference "The Protein World Proteins and Peptides: Structure, Function and Organization" (Будапешт, Венгрия, 2005) и 31я FEBS Congress (Стамбул, Турция, 2006), на II, III и IV съездах Общества биотехнологов России им. Ю.А. Овчинникова (Москва, 2004, 2005, 2006), на VI Международной конференции по молекулярной генетике соматических клеток (Звенигород, 2005), на II и IV ежегодных конференциях "Стволовые клетки и перспектива их использования в здравоохранении" (Москва, РГМУ, 2003, 2005), на I и III конференциях "Стволовые клетки: фундаментальные аспекты" (Москва, 2005, 2011), на международной конференции по биологии развития Joint Annual Spring Meeting of British Societies for Cell and Developmental Biology (Йорк, Великобритания, 2006), на Первом Российском Форуме "Новые технологии - инновационному бизнесу" (Москва, 2007), на Всероссийской научно-практической конференции "Питательные среды и методы культивирования клеток" (Пущино, 2007), на 14 Европейском конгрессе по биотехнологии "Symbiosis: Science, Industry & Society" (Барселона, Испания, 2009), на международных конгрессах по регенеративной медицине I и III Annual World Congress Regenerative Medicine and Stern Cells (Фошан, Китай 2008; Шанхай, Китай, 2010), на 14й1 International Biotechnology Symposium and Exibition Biotechnology for the Sustainability of Human Society (Римини, Италия, 2010) на международной конференции по биологии стволовых клеток International Conference "Stem Cells in Development and Disease" (Берлин, Германия, 2011), на Школе-конференции "Клеточные технологии для регенеративной медицины" (Санкт-Петербург, 2011), на конференции "Морфогенез в индивидуальном развитии" (Москва, 2012), на Всероссийской конференции к 135-летию со дня рождения П.П. Иванова "Эмбриональное развитие, морфогенез и эволюция" (Санкт-Петербург, 2013), а также обсуждены на межинститутском Семинаре "Современные проблемы генетики человека" (Институт молекулярной генетики РАН, Москва, 20 апреля 2006), семинаре для аспирантов и молодых ученых Института общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН (Москва, 8 апреля 2008), объединенных семинарах лабораторий ИБР РАН и ИНЦ РАН (Москва и Санкт-Петербург, июнь 2014).
Финансовая поддержка работы. Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ (проекты 01-04-49704-а, 02-04-48434а, 05-04-49185-а, 06-04-08279-офи, 08-04-01307-а, 11-04-00379-а) и Программ фундаментальных исследований Президиума РАН "Динамика генофондов" (2001-2003) и "Молекулярная и клеточная биология" (2004-2007).
Личный вклад автора заключается в проведении экспериментальных и теоретических исследований. Основные результаты работы получены лично автором, под его непосредственным руководством или при его непосредственном участии в планировании и проведении экспериментов. Имена соавторов указаны в соответствующих публикациях.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 22 статьи в рецензируемых отечественных (17) и международных журналах (5), 3 статьи в сборниках и 13 тезисов докладов конференций.
Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 275 страницах, содержит 68 рисунков, 8 схем, 7 таблиц и состоит из следующих разделов: введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов, обсуждения, выводов и списка литературы, включающего 573 цитируемых источника.
КРАТКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ОБЪЕКТОВ И МЕТОДОВ ИССЛЕДОВАНИЯ
Объекты исследований. В исследованиях были использованы линии ЭСК мыши R1 и ССЕ, а также линии ЭГК мыши EGC-10 и EG-12.5, ранее любезно предоставленные доктором А. Макларен (A. McLaren, WTCR Institute of Cancer and Developmental Biology, Cambridge, UK). Линии ЭСК человека ESM01-03 были любезно предоставлены академиком Г.П. Георгиевым и д.б.н. C.JI. Киселевым (Институт биологии гена РАН, Москва, 2004). Линии ЭСК человека HESC1, 3, SC3a, SC5, SC6 и SC7 любезно предоставлены д.б.н. Г.Г. Полянской (Отдел клеточных культур, Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург). Из Российской коллекции клеточных культур позвоночных (Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург) были получены культуры эмбриональных фибробластов человека FetMSC и SC5-MSC, а также постоянные линии опухолевых клеток: линии эмбриональных тератокарцином мыши F9 и Р19; линия эмбриональной тератокарциномы человека РА-1; линии нейробластом человека IMR-32 and SK-N-MC; линии глиобластом человека А-172, GL-6 (U-251MG), T-98G; линия рабдомиосаркомы человека A-204v; линия эмбриональной рабдомиосаркомы человека RD; линии остеосарком человека HOS (ТЕ85, clone F5), MG-63, U-20S.
В исследованиях использовали мышей линии С57В1/6 и Nude (Nu/Nu) из питомника лабораторных животных НПП "Пущино" ФИБХ РАН (стоковые линии мышей получены из Charles River Laboratories, Inc., Wilmington, MA), а также мышей-гибридов F1 СВА X C57B1/6 5-6 мес возраста из питомника лабораторных животных РАМН "Столбовая" (Московская обл., ст. Столбовая). Эксперименты с животными проводили в соответствии с требованиями комиссии по биоэтике ИБР
РАН и ИБХ РАН. Для получения ранних эмбрионов и зачатков гонад эмбрионов использовали стандартные методики получения эмбрионов с датированным сроком развития с помощью гормональной стимуляции. Исследовали бластоцисты (стадия Е4.5), эпибласты с удаленными оболочками и плацентами (Е6.5), зачатки гонад вместе с мезонефросами (Е10.5) и семенники зародышей (Е13.5), а также органы взрослых животных в возрасте 3-4 мес.
Для исследования экспрессии раково-тестикулярных антигенов в тканях человека было получено разрешение на изъятие аутопсийного материала в Бюро судебно-медицинской экспертизы Департамента здравоохранения г. Москвы. Процедуры по изъятию образцов тканей человека проводили в Судебно-медицинском морге № 2 г. Москвы в соответствии с биоэтическими требованиями и соблюдением законодательства Российской Федерации.
Культивирование клеток in vitro. Все плюрипотентные клеточные линии мыши и человека культивировали в среде DMEM, содержащей 1 мМ L-глутамина, 0.1 мМ заменимых аминокислот, 0.1 мМ Р-меркаптоэтанола и 15 % телячьей фетальной сыворотки (FBS, HyClone, США) или в среде Knockout DMEM с 15 % заменителя сыворотки (Knockout Serum Replacement, Gibco, США). Для линий ЭСК человека в среду добавляли 10 нг/мл основного фактора роста фибробластов человека (bFGF, Invitrogen, США). При культивировании в бесфидерной системе ЭСК и ЭГК мыши добавляли в среду фактор ингибирования лейкемии (LIF, 10 нг/мл) (Sigma, США), ЭСК человека - в среду кондиционированную фидерными клетками добавляли bFGF. Недифференцированные плюрипотентные стволовые клетки мыши и человека поддерживали на фидере из эмбриональных фибробластов мыши (МЭФ) или человека (чЭФ), инактивированных митомицином С (10 мкг/мл, Sigma, США). Клетки линий эмбриональных тератокарцином мыши и человека, линий опухолевых клеток человека и эмбриональные фибробласты мыши и человека культивировали в среде DMEM, содержащей 2 мМ L-глутамина и 10-15 % телячьей фетальной сыворотки (HyClone, США).
Получение и культивирование эмбриоидных тел. Для получения эмбриоидных тел (ЭТ), формируемых клетками линий Rl, ССЕ, EGC-10, EG-12.5, F9, Р19 и РА-1, использовали метод "висячей капли". Сформированные ЭТ переносили в планшеты для суспензионного культивирования (Greinerbio, Германия). ЭТ из ЭСК человека получали при механическом разделении колоний недифференцированных клеток и последующем культивировании их в планшетах из низкоадгезивного пластика (Greinerbio, Германия).
Анализ роста и дифференцировки клеток in vitro. Дифференцировку плюрипотентных стволовых и эмбриональных тератокарциномных клеток мыши и человека стимулировали ретиноевой кислотой в течение 5-10 сут (1 мкМ all-trans-retinoic acid, RA; Sigma). В конце экспериментов проводили анализ скорости роста клеток, экспрессии генов и белков с помощью ПЦР и иммуноцитохимических методов, изучали онкогенный потенциал клеточных популяций после трансплантации иммунодефицитным мышам. Для изучения
действия цитостатиков использовали митомицин С (10 мкг/мл), этопозид (1 и 10 мкМ), винбластин (10 мкг/мл), циклогексимид (10 мкг/мл) (все Sigma, США).
Для изучения функциональной активности сигнальных путей PI3K/Akt, MEK/ERK и факторов семейства TGFß ЭСК и ЭТК культивировали в стандартных средах в присутствии факторов роста человека и специфических ингибиторов. В экспериментах были использованы следующие концентрации факторов и ингибиторов: активин A (ActivinA, 100 и 300 нг/мл, Invitrogen); фактор морфогенеза костей (ВМР4 100 и 300 нг/мл, Invitrogen; Sigma); факторы роста фибробластов и эпителиев (bFGF2 и EGF, 30 нг/мл, Pan-Biotech, Германия); инсулиноподобный фактор роста (IGF1, 30 нг/мл, Biolndustries, Израиль); ингибитор ERK.1/2 - PD98059 (50 мкМ; Sigma); ингибитор PI3- киназы - LY294002 (25 мкМ; Sigma); ингибитор ALK4/5/7- киназ рецепторов Активин A/Nodal/ TGFßl - SB431542 (20 мкМ; Sigma); ингибитор ALK2/3- киназ рецепторов ВМР4/2 - DMH1 (20 мкМ; Sigma).
Более подробное описание использованных в работе методов иммуногистохимического, гистологического и кариологического анализов, электронной и конфокальной микроскопии, а также ссылки на первоисточники приведены в статьях, опубликованных по теме диссертации.
Анализ генной экспрессии с помощью ОТ-ПЦР и ПЦР в реальном времени.
Для анализа экспрессии изучаемых генов выделяли тотальную РНК из плюрипотентных и тератокарциномных клеток, из тканей эмбрионов и взрослых животных, используя смесь Trizol (Invitrogen, США). Все образцы тотальной РНК обрабатывали ДНКазой (TurboDNA kit, Ambion, США) по протоколу производителя. Для синтеза кДНК использовали 1 мкг тотальной РНК для каждого образца с помощью обратной транскриптазы M-MuLV и олиго^Т)^ или рандом праймеров (Fermentas, Литва). ОТ-ПЦР анализ экспрессии изучаемых генов проводили с использованием набора с Taq-полимеразой (Силекс, Россия) по предлагаемому производителем протоколу на амплификаторе Eppendorf (Германия) по следующей программе: предварительная денатурация: 94°С - 5 мин; отжиг праймеров: 58°С - 45 с; удлинение цепи: 72°С - 45 с; денатурация 94°С - 45 с, 35 циклов; завершающее удлинение цепи: 72°С - 5 мин. Количественный анализ генной экспрессии проводили на амплификаторе 7500 Real-Time PCR System (Applied Biosystems, США) с использованием набора для проведения ПЦР в реальном времени в присутствии интеркалирующего красителя EVA Green и референсного красителя ROX (Синтол, Россия) по протоколу производителя.
Специфические праймеры были сконструированы на основе данных о структуре исследуемых генов в базах GenBank, MGI и Ensemble. Уровень экспрессии генов в каждом образце был нормализован к уровню экспрессии мРНК гена гипоксантин-гуанин фосфорибозилтрансферазы (HPRT/Hprt). Относительные уровени экспрессии мРНК были рассчитаны с помощью сравнительного Ct-метода (ABI Relative Quantification Study software, Applied Biosystems, США).
Трансплантация клеток иммунодефицитным и иммунокомпетентным мышам для изучения роста тератом и тератокарцином in vivo. Для изучения развития экспериментальных тератом и тератокарцином в качестве реципиентов были использованы иммунодефицитные мыши линии Nude (Nu/Nu) и иммунокомпетентные мыши линии С57В1/6 в возрасте 8-10 нед, а также мыши-гибриды Fl СВА X С57В1/6 5-6 мес возраста, которых за 5 дней до трансплантаций облучали с помощью прибора RUM-17 (Россия) в дозе 5.72 Гр. В период экспериментов (до 50 нед) мышей спф- статуса содержали в стерильных условиях.
Анестезию экспериментальных животных проводили с помощью внутриперитонеальной инъекции нембутала или 100 мг/кг кетамина (MEZ, Россия) и 10 мг/кг ксилазина (Rometar, Spofa, Чехия). При подкожной и внутриперитонеальной трансплантациях клетки инъецировали мышам стеклянными или пластиковыми капиллярами Cook Flexipet Pipettes (Cook Medical, Bloomington, IN) с помощью микроманипулятора CellTram Vario Eppendorf Microinjector (Eppendorf, Германия). По завершении экспериментов (от 3 до 50 нед) животных умерщвляли, проводили аутопсию и гистологический и ПЦР анализ развившихся опухолей. Для изучения остаточных недифференцированных клеток тератом и тератокарцином образцы опухолей диссоциировали с помощью раствора 0.25% trypsin-EDTA (HyClone) и полученные клеточные суспензии культивировали в течение 5-7 сут в среде с LIF до образования ЭСК-подобных колоний, которые переносили на новые планшеты для ре-клонирования. Для нескольких сублиний ЭСК мыши был исследован потенциал роста и дифференцировки in vitro и in vivo (вторичные трансплантации иммунодефицитным мышам и формирование опухолей), а также экспрессия генов Oct4, Nanog и Afp.
Статистическая обработка данных. При обработке результатов оценивали значение средней величины, стандартное отклонение. Статистический анализ данных проводили с использованием ANOVA и парного t-критерия Стьюдента. Различия считали достоверными при р<0.05 для трансплантационных экспериментов и при р<0.001 для экспериментов in vitro.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
1. Поддержание базового и первичного плюрипотентного статусов в плюрипотентных стволовых и тератокарциноиных клетках мыши и человека ассоциировано с экспрессией генов, специфических для линии половых клеток.
В регуляцию дифференцировки плюрипотентных клеток в линию половых клеток вовлечены гены с материнским эффектом, которые экспрессируются как в половых клетках, так и в тотипотентных и плюрипотентных клетках ранних эмбрионов (Lacham-Kaplan, 2004). Была выдвинута гипотеза о том, что способность к формированию линии половых клеток может быть
предетерминирована в плюрипотентных клетках млкопитающих, подобно "зародышевой плазме" у низших животных, благодаря экспрессии определенного набора генов, обеспечивающих специализацию линии половых клеток у млекопитающих. С целью определения молекулярных механизмов, вовлеченных в регуляцию различных фаз плюрипотентности, мы исследовали паттерны экспрессии генов, участвующих в регуляции плюрипотентности и развития линии половых клеток млекопитающих, в различных типах плюрипотентных стволовых клеток мыши и человека, а также в эмбрионах мыши.
Ген Паттерн экспрессии Ссылки
Oct4 и Nanos Плюрипотентные и половые клетки Pesce, Schaler, 2001
Stella/Dppa3 и Fragilis/Iftm3 Ранние предшественники первичных половых клеток (Е6.5-Е7.5) Saitouetal., 2002
Dazl/Tpx2 Доимплантационные эмбрионы и половые клетки Cauffman et al., 2005; Reynolds, Cooke, 2005
Blimpl/Prdml Ранние предшественники первичных половых клеток (Е7.0) Ohinata et al., 2005
Vasa/Mvh/Ddx4 Линия половых клеток (с Е9.5 до зрелых половых клеток) Tanaka et al., 2000; Toyooka et al., 2000; Reynolds et al., 2005
Scp3 В мейотических половых клетках Reynolds et al., 2007
E-ras Плюрипотентные стволовые и первичные половые клетки Takahashi et al., 2003
Для характеристики динамики ранней дифференцировки плюрипотентных стволовых клеток была также исследована экспрессия гена Gata4, специфически экспрессирующегося в клетках внезародышевой энтодермы (Zhang et al., 2007).
В наших исследованиях было обнаружено, что клетки бластоцисты, и гоноциты (Е13.5) мыши, а также мЭСК и эмбриональные герминативные клетки (мЭГК) имеют сходные профили экспрессии этих генов (Рис. 1А). В мЭСК и мЭГК, а также в ЭТ экспрессировались гены Oct4, Nanog, Stella, Fragiiis, Dazl, Vasa/Mvh/Ddx4, а также E-ras и C-kit. В ЭТ было обнаружено возрастание экспрессии генов Blimpl/Prdml и Scp3. Уровень экспрессии гена Vasa/Mvh/Ddx4 был ниже в мЭСК и мЭГК, чем в клетках бластоцисты и гоноцитах (Е 13.5), но существенно выше, чем в клетках эпибласта и первичных половых клетках на стадии El0.5 (Рис. 1Б). Иммуногистохимический анализ показал, что в недифференцированных мЭСК и мЭГК и в бластоцистах ген Vasa/Ddx4 экспрессируется не только на уровне мРНК, но и на уровне белка. Впервые было обнаружено, что ген Vasa/Ddx4 экспрессируется не только в мигрирующих половых клетках и гоноцитах, но и в бластоцистах мыши, причем уровни экспрессии этого гена в бластоцистах и гоноцитах были практически одинаковыми, тогда как в клетках эпибласта Е6.5 его экспрессия была значительно ниже. Ранее в эпибласте мыши были выделены две субпопуляции, различающиеся по активности гена Oct4 и по способности участвовать в развитии линии половых клеток химерных мышей (Han et al., 2010). Можно предположить, что субпопуляция эпибласта, сохраняющая способность к формированию химер, представляет собой клетки самых ранних предшественников линии половых клеток, экспрессирующие Vasa/Ddx4. Выявленные паттерны экспрессии Vasa/Ddx4 в линиях мЭСК и мЭГК также свидетельствуют о сходстве их статусов
мЭСКССЕ мЭГКЕСС-10 иЭГК EG-I2.5
Ос/4 Nanog Stella Frcigilis Dazl Vusa/DJx4 C-kit Blimpl ScpS E-rus Gata4 Hprl
ЭСК ЭТ1 ТГ5 т И ЭСК ЭТ1 ЭТ5 ЭГК ЭТ1 )T5 T в ЭГК ЭТ1 ЭТ5 M )Ф
[til S ssss 5 Sj S
■BH^-J -ГЧ'- - ЕВШН _____ ШЦ1 1 II, 1 1 1
■"■"""И ' i ^^ ■■■
■ » » ' ' ' ' 1 ; ; * ;
*" î 1 I î ' Й î i
LI*—t—1 jH^-J
1111 1 1 » 1
1 "» » 1 "il' lui 1
bd
Эмбрионы Органы взрослых
ЛИНИИ ПЛЮРИПОТЕНТНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК мыши
Oct4 250 Vasa/Dilx4 700 п E-ras 1200 Gata4
МЭФ CCF. RI F.GC-lfl F.G-12.5 МЭФ CCF. RI F.GC-l« F.G-12.5 M )<D CCF RI F.GC'-IU E(,-12.5
ЭМБРИОНЫ МЫШИ
E-ras
МЭФ CCF. RI F.<;C-!II If.-l 2.5
5000 Oct4 70(111 Vasa/D(Lx4 ли
6000 Ш 25
5110П ::
4000
2000 5000 i
■ 2000
1 _ 1000 * Я
Gata4
МЭФ E4.5 F6.5 EHI.5 F.13.5CEM МЭФ F.4.5 E6.5 F10.5 E13.5 с FM МЭФ E4.S E6.5 EI0.5 E13.5CEM
МЭФ F.4.5 Г.Л.5 F 10.5 F13.5 СЕМ
Рис. 1. (A). Профили экспрессии генов, специфических для линии половых клеток, в линиях плюрипотентных стволовых клеток, в зародышах мыши и органах взрослых мышеи. (Б). Количественный анализ экспрессии генов Oct4, Vasa/Ddx4, E-ras и Gata4 в линиях плюрипотентных стволовых клеток мыши, бластоцистах, эрибластах и первичных половых клетках эмбрионов мыши. По оси ординат -относительный уровень генной экспрессии, нормализованной к уровню экспрессии гена Hprl; уровень экспрессии в МЭФ принят за 1 относительную единицу. ЭТ1, ЭТ5 - эмбриоидные тела на 1-е и 5-е сут развития, МЭФ - мышиные эмбриональные фнбробласты, Тер - тератомы, сформированные линией ЭСК или ЭГК; Сем - семенник, Яич - яичник, M - мозг, Печ - печень. | - недифференцированные клетки; - ЭТ5
с клетками внутренней клеточной массы бластоцисты (базовый статус плюрипотентности).
Исследования экспрессии генов, специфических для линии половых клеток, в недифференцированных чЭСК ESM01, ESM02 и ESM03 и формируемых ими ЭТ показали, что паттерны их экспрессии сходны и в целом аналогичны мЭСК, однако уровень экспрессии генов VASA/DDX4 и E-RAS был значительно ниже, чем в мЭСК и мЭГК (Рис. 2А, Б). Эти данные подтверждаются и результатами иммуногистохимического анализа, который не выявил VASA/DDX4-no3HTHBHbix клеток в колониях недифференцированных чЭСК ESM01, ESM02 и ESM03.
При характеристике линий чЭСК HESC-1, HESC-3, SC3a, SC5, SC6 и SC7 были обнаружены существенные различия в профилях экспрессии генов, специфических для линии половых клеток, а также в потенциале к
чЭСК ESMOl ч)СК ESM02 чХк' ES.MU3 чЭФ чСем Б
ЭСКЭТ1 ЭТ5 'ЗСК ЭТ1 ЭТ5 ЭСК ЭТ1 ЭТ5 """1°
ОСТ4
VASA/DDX4
чЭСК SC5
чЭСК SC6
чЭСК SC7
)Ф ESMDI ESM(>2 ESM03 СЕМ
чЭСК SC3a Г
EKMÖI ES.MÜ2ESM03Í ЕМ
ЭСК .111 ЭГ5 ЭПО ЭСК ЭП Л? ЭТШ ЭСК ЭТ] ЭТ5 ЭТЮ ЭСК ЭТ1 ЭТ5 ЭПО
чЭСК
»ESC-1 HESC-3
осп
KANOG DPPA3 IFTM3 DAZL VASA РАХ6 RPL19
Рис. 2. Экспрессия генов, специфических для линии половых клеток, в ЭСК человека. (А) Профили линий ESMOl, ESM02 и ESM03; (Б) Количественный анализ экспрессии генов ОСТ4, VASA/DDX4, E-RAS и GATA4 в линиях ESMOl, ESM02 и ESM03. По оси ординат - относительный уровень генной экспрессии по отношению к уровню экспрессии гена в ЭФ человека; (В) Профили линии SCS, SC6, SC7 и SC3a; (Г) Профили линий HESC-1 и HESC-3.
I - недифференцированные клетки: - ЭТ5. ЭФ - эмбриональные фнбробласты человека.
дифференцировке (Гордеева и др., 2006; Кольцова и др., 2011). В чЭСК SC5, SC6 и SC7 была выявлена экспрессия ОСТ4, NANOG, DP РА 3/STELLA и DAZL, однако VASA/DDX4 экспрессировался на более низком уровне, чем в чЭСК ESM01-03, и поэтому не детектировался в стандартных условиях ОТ-ПЦР-анализа (Рис. 2В). В чЭСК SC3a экспрессировались только ОСТ4 и NANOG, но не DPPA3/STELLA, DAZL и VASA/DDX4 (Рис. 2В). В недифференцированных чЭСК HESC-1 и HESC-3 была выявлена экспрессия генов ОСТ4, NANOG и IFTM3, экспрессия DAZL выявлена в HESC-3, однако экспрессия генов STELLA и VASA/DDX4 не была обнаружена в этих клеточных линиях (Рис. 2Г). Эксперименты по изучению потенциала полученных линий чЭСК к дифференцировке in vivo после трансплантации иммунодефицитным мышам также выявили различия между линиями. Способность формировать тератомы, содержащие производные трех зародышевых листков, не выявлена для чЭСК SC3a, в отличие от линий ESM01-03 и SC5-7. Кроме того, чЭСК HESC-1 были способны к дифференцировке только в мезодермальные производные (соединительная ткань, гладкомышечные волокна и др.) в экспериментальных тератомах, что свидетельствует об ограниченном потенциале к дифференцировке линии HESC-1, как и линии чЭСК SC3a. Если
предположить, что паттерны экспрессии генов, специфических для линии половых клеток, коррелируют с потенциалом к развитию линии половых клеток, то на основании полученных результатов можно заключить, что линии чЭСК, находящиеся в первичном статусе плюрипотентности, имеют более низкий потенциал к развитию линии половых клеток, чем мЭСК, так как низкий уровень экспрессии гена УАБАЮБХ4 в чЭСК указывает на сходство чЭСК с клетками эпибласта мыши, которые не способны к развитию в линию половых клеток. Данные по разным линиям чЭСК позволяют прогнозировать их статус на основе профиля генов, специфических для линии половых клеток.
Таблица 1. Профили экспрессии генов, специфических для линии половых клеток, и потенциал к дифференцировке для линий ЭСК мыши и человека.
Ген/Линия R1 ССЕ ESM01 ESM02 ESM03 HESC-1 HESC-3 §СЗа SC5 SC6 SC7
Oct4 + + + + + + + + + + +
Nanog + + + + + + + + + + +
Dppa3 + + + + + ± - - + + +
Dazl + + + + + + - - + + +
Vasa/Ddx4 + + ± ± ± - - - - - -
Iftm3 + + + + + + + + + + +
Blimp I - + - - нд нд нд нд нд нд
Scp3 _ + + + + нд нд нд нд нд нд
C-kit + + + + + нд нд нд нд нд нд
Дифференцировка в соматические производные + + + + + ± ± ± + + +
Дифференцировка в линию половых клеток + + ? ? ? ? ? ?
(+) экспрессируется; (±) выявлен слабый уровень экспрессии; (-) экспрессия не выявлена; (нд) - нет данных; (?) -потенциал неизвестен.
Результаты анализа экспрессии генов, специфических для линии половых клеток, в линиях ЭТК мыши и человека показали, что их профили частично сходны с профилями соответствующих линий ЭСК мыши и человека (Рис. 3). Экспрессия гена Vasa/Ddx4/DDX4 была значительно ниже в ЭТК Р19 и РА-1, чем в соответствующих ЭСК, тогда как в мЭТК F9 эти различия были не столь существенны. На основании полученных результатов можно сделать вывод о частичном сходстве клеток этих линий с их нормальными клетками-прототипами, но в отличие от плюрипотентных стволовых клеток невозможно определить их статус в рамках двух фаз плюрипотентности на основе профилей экспрессии генов, специфических для линии половых клеток.
В ряде работ было показано, что усиление экспрессии VASA/DDX4 в ЭСК человека и мыши связано с их дифференцировкой в линию половых клеток и i даже к формированию гаплоидных половых клеток, однако эти работы не получили дальнейшего развития и подтверждения (Hiibner et al., 2003; Clark et al., 2004; Kee et al., 2006; Nayernia et al., 2006). Большинство авторов отмечают низкий уровень экспрессии VASA/DDX4 в недифференцированных чЭСК, тогда как данные по его экспрессии в мЭСК сильно различаются (Hiibner et al., 2003; Toyooka et al., 2003; Clark et al., 2004; Tilgner et al., 2008). В нашей работе
Oc¡4 Nanog Stella Fragillis Dad Yasa/Ddx4 C-kit BUmpí Scp3 E-ras Gara4 Hpn
ЭТК ЭТ1 ЭТ5 TCF9) ЭТК ЭТ1 ЭТ5 Т(Р 19)
S
мм щ Н—Н гп
щ
лив
ЭТК ЭТ1 ЭТ5 Т(РА1)
ОСТ4
NANOG
DPPA3
IFITM1
DAZL
VASA/DDX4 С-К1Т BUMPÍ ш
ЯШ
SCP3
E-RAS
GATA4
1IPRT
Ocl4
Vasa/Ddx4
iA,
Gala4 pfc
_n
6000 5000 4000 3000 2000 1000
OCT4
J
VASA/DDX4
E-RAS
С ATA 4
и
Рис. 3. Анализ экспрессии генов, специфических для линии половых клеток, в линиях ЭТК мыши и человека. (А) Профили экспрессии линий F9, Р19 и РА-1. ЭТ1, ЭТ5 -эмбриоидные тела на 1-е и 5-е сут развития, T(F9), Т(Р19), Т(РА-1) - тератокациномы, сформированные линиями ЭТК in vivo. (Б) Уровни экспрессии генов Oct4/OCT4, Vasa/Ddx4/DDX4, E-ras/E-RAS и Gata4/GATA4 в линиях ЭТК мыши и человека. По оси ординат — относительный уровень генной экспрессии по отношению к уровню экспрессии гена в ЭФ мыши и человека. Щ - недифференцированные клетки; - ЭТ5.
экспрессия мРНК и белка Vasa/Dck4 была обнаружена в недифференцированных мЭСК и мЭГК, хотя уровень экспрессии был ниже, чем в клетках бластоцисты и гоноцитов Е13.5, но значительно выше, чем в чЭСК. Таким образом, мы предполагаем, что паттерн экспрессии гена Vasa/Ddx4/DDX4 предетерминирован и поддерживается в плюрипотентных клетках млекопитающих для сохранения их потенциала к формированию линии половых клеток, поэтому его этот ген можно рассматривать как еще один молекулярный детерминант базового статуса плюрипотентности.
2. Изучение паттернов экспрессии раково-тестикулярных антигенов в плюрипотентных стволовых клетках и опухолевых клетках различного происхождения с целью поиска маркеров трансформированных плюрипотентных стволовых клеток и их производных.
При исследовании механизмов плюрипотентного статуса нами было выдвинуто предположение, что уникальный паттерн экспрессии раково-тестикулярных антигенов (РТА) в половых клетках может быть частью программы раннего развития, которая предполагает разграничение линии половых клеток от соматических клеток для дальнейшей их специализации в развитии. В связи с этим, отклонения от нормальной программы дифференцировки линий могут быть ассоциированы с нарушениями паттернов экспрессии РТА, специфических для разных клеточных линий, как это происходит в раковых клетках. Сравнительный анализ паттернов экспрессии РТА для недифференцированных, дифференцирующихся и дифференцированных ЭСК, а также раковых клеток из тканей нейроэктодермального и мезодермального происхождения был проведен с целью идентификации сходства и различия генных профилей.
Анализ экспрессии РТА показал, что в недифференцированных чЭСК SC5, Î SC7 и SC3a экспрессируются РТА семейств MAGE-A, D и GAGE (Рис. 4А). В j линиях чЭСК SC5 и SC7, была обнаружена экспрессия MAGE-A3, Аб, A4, А8 и ; GAGE, а в SC3a экспрессировались MAGE-A3, Аб, А8 и GAGE, но не ген MAGE-А4. Экспрессия MAGE-A2 и MAGE-В2 не была обнаружена ни в одной линии j чЭСК. Экспрессия белков семейства MAGE была выявлена ; иммуногистохимически в недифференцированных чЭСК (Рис. 4Е). Анализ , экспрессии РТА в дифференцированных клетках-производных чЭСК показал, что клетки внезародышевой энтодермы (GATA4 и AFP-позитивные) экспрессировали гены M AGE-А 8 и MAGE-D1, D2 (Рис. 4В). Профиль экспрессии РТА мезенхимных I клеток (a-Actinin-позитивные) был сходен с профилем клеток внезародышевой j энтодермы (Рис. 4В). Напротив, NESTIN-позитивные нейроэктодермальные клетки экспрессировали M AGE-A4 и MAGE-D1, D2, но не MAGE-А 8 (Рис. 4В). , Однако во всех трех типах дифференцированных клеток-производных чЭСК не была выявлена экспрессия генов семейства GAGE. Полученные данные показывают, что в процессе ранней дифференцировки чЭСК снижается или прекращается экспрессия некоторых РТА, выявленных в недифференцированных ЭСК и ЭТ.
Изучение экспрессии РТА в опухолевых клетках показало, что чЭТК РА-1 экспрессировали практически все изучаемые гены РТА: MAGE-A2, A3, Аб, А8, MAGE-B2, MAGE-D1, D2 и семейства GAGE. В отличие от линий чЭСК SC5 и SC7, но не SC3a, ЭТК РА-1 не экспрессировали MAGE-A4, но экспрессировали MAGE-A2 и MAGE-В2 (Рис. 4А). Таким образом, генетически нормальные чЭСК и опухолевые чЭТК имеют сходные, но не идентичные профили экспрессии РТА. (
Для того чтобы выяснить тканеспецифичность экспрессии РТА, были исследованы профили РТА в линиях эмбриональных и постнатальных
SC5 SC7 SC3a PA-1 ЭСК ЭТ ЭСК ЭТ ЭСК ЭТ ЭТК ЭТ
RI EGC-10 F9 Эмбрионы HS KB EG EB EC KB E7.5 E1I.5 El 4.5
RPL-19 В ВнзЭ Мсэ НЭ
OCT4 I
NANOG I
GATA4 1
AFP I
BRY
NESTIN
MAGEA2
ишн
МАОЕА3.6
MAGEA4
MAGEA8
MAGEB2
MAGEDI
MAGED2
GAGEU, 10,12,13
RPL19 E9C3S
мЭСК R1
мЭТК F9
чЭСК SC5
чЭТКРА-1
k 1 _ ' V * ' !
DAPI w И r > !*i 1
Рис. 4. Диализ экспрессии раково-гестнкулярных антигенов в плюрипотентных стволовых клетках мыши и человека, в нормальных и опухолевых клетках нейроэкстодермального и меходермального происхождения, а также в развивающейся линии половых клеток мыши. (А) Профили РТА в чЭСК SC5, SC6, SC3a и чЭТК РА-1. (Б) Профили РТА мЭСК, мЭГК, мЭТК и развивающихся половых клеток мыши. (В) Профили РТА дифференцированных клеток-производных чЭТК. (Г) Профили РТА раковых линий клеток нейроэктодермального происхождения. (Д) Профили РТА раковых линий клеток мезодермального происхождения. (Е) Иммунофлюоресцентный анализ белков семейства MAGE в ЭСК и ЭТК мыши и человека. Масштаб: 100 мкм.
опухолевых клеток нейроэктодермального (нейробластомы IMR-32, SK-N-MC и глиобластомы GL-6, А-172, T-98G) и мезодермального (рабдомиосаркомы RD, А-204v и остеосаркомы HOS (ТЕ85, clone F5), MG-63, U-20S) происхождения (Рис. 4 Г, Д). В большинстве раковых линий из тканей нейроэктодермального
происхождения была выявлена экспрессия MAGE-A8 and MAGE-B2, но не генов семейства GAGE (Рис. 4Г). Анализ экспрессии РТА в раковых клеточных линиях из тканей мезодермального происхождения выявил экспрессию генов MAGE-A8 и MAGE-A4. В линиях RD и U-2 OS также была выявлена экспрессия генов семейства GAGE (Рис. 4Д). Сравнение профилей экспрессии РТА в нейроэктодермальных производных чЭСК и раковых клетках нейроэктодермального происхождения не выявило ни одного общего гена семейств MAGE-A, MAGE-B и GAGE в нормальных и опухолевых клетках нейроэктодермального происхождения. С другой стороны, экспрессия MAGE-A8 и MAGE-A4 является характерной для профилей экспрессии клеток линий рабдомиосарком и остеосарком, а также для мезенхимных производных чЭСК. Кроме того, раковые линии и нейроэктодермального, и мезодермального происхождения экспрессировали MAGE-A8, хотя в норме его экспрессия была обнаружена только в клетках мезодермального происхождения.
Профили экспрессии РТА были изучены в мЭСК, мЭГК и мЭТК F9, а также в линии половых клеток на критических стадиях развития: в клетках эпибласта на ранних стадиях гаструляции (Е 7.5), первичных половых клетках после заселения в гонады (Е 11.5) и гоноцитах в развивающихся мужских гонадах (Е 14.5). Было обнаружено, что в мЭСК, мЭГК и мЭТК экспрессируются гены Mage-al, 2, 3, 4, 5, 6, 8 и Mage- dl, -d2, но не экспрессируются гены семейства Mage-b, причем уровни экспрессии гена Magea-4 различались в мЭСК, мЭГК и мЭТК (Рис. 4Б). Профили экспрессии РТА в развивающихся предшественниках линии половых клеток были сходными, однако экспрессия Mage-a4 была обнаружена только в семенниках взрослых самцов мышей, но не в развивающихся половых клетках. (Рис. 4Б) Проведенный анализ показал, что профили экспрессии РТА в мЭСК, мЭГК и мЭТК отличаются от профилей экспрессии клеток в развивающейся линии половых клеток.
Таким образом, было впервые показано, что несколько РТА, MAGE-A3, -A4, -А6, -А8 и GAGEs экспрессируются в недифференцированных чЭСК и ЭТ, и экспрессия этих генов снижается в процессе дифференцировки. Как и чЭСК, мЭСК и мЭГК также экспрессируют гены семейства Mage-a, но не Mage-b, в отличие от клеток эпибласта и первичных половых клеток эмбрионов мыши. Несмотря на значительное сходство профилей РТА чЭСК и чЭТК, только в чЭТК была выявлена экспрессия MAGE-A2 и MAGE-B2. Эти РТА могут быть рассмотрены и исследованы в качестве генов-кандидатов для маркирования трансформированных плюрипотентных стволовых клеток. Результаты сравнительного анализа профилей экспрессии РТА в нормальных и раковых клетках нейроэкстодермального и мезодермального происхождения свидетельствуют о том, что в большинстве случаев в раковых клетках РТА экспрессируются аберрантно и профиль их экспрессии не является тканеспецифичным. Дальнейшие исследования экспрессии РТА необходимы для идентификации трансформированных плюрипотентных клеток и их производных и удаления клеток с аномальным профилем экспрессии РТА с целью повышения безопасности клеточных технологий на основе стволовых клеток.
3. Анализ сигнальных путей в нормальных плюрипотентных стволовых клетках и их опухолевых аналогах - тератокарцииомных клетках.
3.1. Экспрессия факторов семейства TGFfi и фактора роста фибробластов FGF2 в эмбриональных стволовых клетках мыши и человека, поддерживаемых в разных системах культивирования. Для поддержания in vitro мЭСК и чЭСК в плюрипотентном статусе используют разные системы культивирования, которые можно рассматривать как искусственные клеточные ниши, обеспечивающие оптимальное микроокружение для самообновления плюрипотентных клеток. ЭСК человека и мыши способны расти на фидерных клетках, полученных из фибробластов различного происхождения, а также в бесфидерных системах, включающих различные компоненты внеклеточного матрикса и определенные наборы факторов роста (Smith et al., 1988; Xu et al., 2001; Eiselleova et al., 2008; Evseenko et al., 2009; Montes et al., 2009; Кольцова и др., 2012). Однако для самообновления мЭСК и чЭСК in vitro необходимы разные наборы факторов роста, что свидетельствует о различных механизмах сигнальной регуляции базового и первичного плюрипотентного статуса. Сигнальные пути факторов семейства TGFP и FGF2 являются ключевыми регуляторами плюрипотентного статуса и дифференцировки ЭСК in vivo и in vitro (Dreesen, Brivanlou, 2007), однако функциональная роль этих сигнальных путей в клетках с базовым и первичным статусом плюрипотентности остается неясной. Для анализа роли сигнальных путей факторов семейства TGF(3 и FGF2 в регуляции базового и первичного плюрипотентного статуса нами была исследована экспрессия этих сигнальных факторов в недифференцированных и дифференцирующихся ЭСК мыши и человека, а также в поддерживающих их фидерных клетках. Было обнаружено, что паттерны эндогенной экспрессии этих факторов значительно различаются в мЭСК и чЭСК (Рис. 5). Так, в мЭСК самый высокий уровень экспрессии был обнаружен для гена Leftyl, а в чЭСК для генов TGF/31 и ВМР4. Экспрессия NODAL/Nodal, TGF/31/Tgfpi, ВМР4/Втр4, GDF3/Gdf3 и FGF2/Fgf2 была выше в чЭСК, чем мЭСК, а экспрессия ACTIVINA в обеих линиях чЭСК была ниже, чем в мЭСК. Таким образом, различия в паттернах эндогенной экспрессии изучаемых сигнальных факторов в недифференцированных мЭСК и чЭСК демонстрируют внутренние различия в сигнальной регуляции этих клеточных популяций. Кроме того, более высокая скорость дифференцировки чЭСК по сравнению с мЭСК в ЭТ сопровождалась более динамичным снижением экспрессии факторов NODAL/Nodal, LEFTY1/Leftyl, GDF3/Gdf3 и FGF2/Fgf2. При этом уровни экспрессии TGF/31/Tgfpi и ВМР4/Втр4 мало изменялись в процессе спонтанной дифференцировки всех клеточных линий и оставались самыми высокими по сравнению с другими факторами. На основе этих данных был сделан вывод о том, что высокий уровень экспрессии TGF¡31/Tgf]31 и ВМР4/Втр4 на фоне относительно более низкого уровня экспрессии остальных факторов характеризует более дифференцированное состояние ЭСК. В этом случае большую склонность к спонтанной дифференцировке чЭСК по сравнению с мЭСК можно объяснить более высоким уровнем экспрессии TGFpi/Tgffil и ВМР4/Втр4 в недифференцированных чЭСК, находящихся на более продвинутой
А мЭСК R1 чЭСК ESM02 чЭСК SC5
ЛОЛ Nodal Ltftyl Tg/Ы Втр4 Сф Fgfl ACTA NODAL LEFTYl TGFbt BMP4 GDF1 FGF2
Рис. 5. Системы in vitro поддержания самообновления ЭСК мыши и человека, находящихся в разных фазах плююрипотентности. (А) Колонии недифференцированных мЭСК R1 и чЭСК ESM02, SC5, растущих на фидере из эмбриональных фибробластов мыши и человека. (Б) Количественный анализ экспрессии факторов семейства TGFp и FGF2 в ЭСК мыши и человека и поддерживающих их фидерных клетках. - недифференцированные ЭСК; фидер мЭФ и чЭФ .
стадии плюрипотентности (первичный статус). Другой особенностью сигнальной регуляции в недифференцированных чЭСК является более низкий уровень эндогенной экспрессии ACTIVINA, который также драматически снижается в процессе дифференцировки мЭСК и чЭСК.
Анализ экспрессии факторов TGF/3 и FGF2 в фидерных клетках мЭФ и чЭФ показал, что гены ActivinA, TGFfil и FGF2 экспрессировались на более высоком уровне, чем в ЭСК, причем уровень их экспрессии в мЭФ был значительно ниже, чем в чЭФ. Известно, что для самообновления чЭСК (но не мЭСК) необходимы экзогенные факторы ActivinA и FGF2. Оба используемых фидера способны
эффективно поддерживать самообновление чЭСК, т. к. экспрессируют высокие уровни ACTIVINA/ActivinA и TGFßl/Tgfßl. При поддержании чЭСК на мЭФ требуется добавление экзогенного рекомбинантного фактора FGF2, т.к. Fgß экспрессируется на низком уровне в этих фидерных клетках. Напротив, при использовании чЭФ или кондиционированной среды добавление рекомбинантного FGF2 не является необходимым (Кольцова и др., 2012). В обоих типах фидерных клеток уровень экспрессии ВМР4/Втр4 был значительно ниже, чем в ЭСК, что также способствовало их поддержанию в недифференцированном состоянии. Ранее было показано, что в чЭСК экзогенный ВМР4 стимулировал дифференцировку в клетки внезародышевых структур, а ингибирование киназ рецепторов BMP способствовало самообновлению чЭСК (Xu et al., 2002, 2005; Greber et al., 2007). Следовательно, различные эффекты стимуляции BMP/Smad 1/5/8 сигнальных путей на дифференцировку ЭСК мыши и человека можно объяснить более высоким уровнем эндогенной экспрессии ВМР4 в чЭСК по сравнению с мЭСК, поэтому их поддержание возможно только на фидерных клетках, экспрессирующих низкий уровень факторов BMP.
Для поддержания недифференцированного состояния плюрипотентных ЭСК in vitro необходима сбалансированная активность различных сигнальных путей, в том числе ActivinA/Nodal/Lefty/Smad2/3 и BMP/Smadl/5/8 ветвей TGFß сигналинга (Xiao et al., 2006; Greber et al., 2007). Роль фактора FGF2 в самообновлении чЭСК остается неясной, т.к. имеются противоречивые данные о взаимодействии сигнальных путей, инициируемых FGF2 и ActivinA. Известно, что FGF2 может стимулировать активность PI3K- и ERK-сигнальных путей и в кооперации с ActivinA/Nodal сигналингом поддерживать самообновление и жизнеспособность чЭСК in vitro (Vallier et al., 2005; Eiselleova et al, 2009). С другой стороны, показано, что добавление экзогенного ActivinA является достаточным для поддержания чЭСК в недифференцированном состоянии (Beattie et al., 2005; Xiao et al., 2006; Na et al., 2010). Реверсия от первичного статуса к базовому статусу плюрипотентности для стволовых клеток эпибласта мыши и чЭСК (в мЭСК-подобные) возможна при культивировании их в среде с ингибиторами ERK1/2 (PD0325901) и GSK3-raraa3 (CHIR99021) (Silva et al., 2008; Ying et al., 2008; Hanna et al., 2010), т.е в обоих случаях ингибирование ERK1/2 сигнальных каскадов приводило к ослаблению зависимости от экзогенных факторов ActivinA. В наших экспериментах чЭСК ESM02 и SC5, поддерживаемые на фидерных клетках с различными уровнями экспрессии FGF2, оставались недифференцированными только в случае высокой концентрации экзогенного FGF2. По-видимому, высокий уровень эндогенной экспрессии TGFßl в чЭСК не достаточен для того, чтобы нейтрализовать стимулирующие дифференцировку эффекты эндогенного ВМР4, поэтому необходимо усиление активности ActivinA/Nodal/Smad2/3 сигналинга с помощью экзогенных факторов ActivinA и Nodal. На основе полученных нами данных можно заключить, что самообновление плюрипотентных клеток in vitro достигается в мЭСК и чЭСК с помощью различных схем регуляций ActivinA/Nodal/Lefty/Smad2/3 и BMP/Smadl/5/8 ветвей TGFß сигналинга. Необходимость экзогенной стимуляции
или ингибирования этих сигнальных путей обусловлена внутренними различиями в паттернах экспрессии факторов семейства TGFß и FGF2 в мЭСК и чЭСК.
3.2. Сравнительный анализ экспрессии факторов семейства TGFß в нормальных плюрипотентных стволовых и тератокарциномных клетках мыши. Сравнительный количественный анализ экспрессии генов ActivinA, Nodal, Leftyl, TGFßl, BMP4 n GDF3 показал сходство паттернов экспрессии большинства изучаемых генов в плюрипотентных мЭСК R1, мЭГК EGC-10 и опухолевых мЭТК F9 и Р19 (Рис. 6). Расчет уровней экспрессии изучаемых факторов относительно уровня экспрессии гена Hprt показал, что во всех изученных линиях клеток наибольший уровень экспрессии характерен для гена Leftyl. Экспрессия факторов Nodal, TGFßl, BMP4 и GDF3 не значительно различалась между линиями. Однако значительные различия были обнаружены в уровнях экспрессии гена ActivinA в плюрипотентных стволовых и тератокарциномных клетках мыши.
Рис. 6. Сравнительный анализ экспрессии факторов семейства Г(.I |> в линиях плюрипотентных стволовых и тератокарциномных клеток мыши.
3.3. Анализ механизмов сигнальной регуляции самообновления и дифференцировки плюрипотентных чЭСК и нуллипотентных чЭТК. Для
сравнительного анализа механизмов самообновления и дифференцировки плюрипотентных стволовых и тератокарциномных клеток были использованы линии чЭСК ESM01 и чЭТК РА-1. Для чЭТК РА-1 характерна точечная мутация в гене N-RAS и транслокация по 20 и 15 хромосоме (46, XX, (t(15;20)(pl 1.2;ql 1.2)) (Zeuthen et al., 1980; Tainsky et al., 1984). Нуллипотентные чЭТК РА-1 не способны к спонтанной и индуцированной дифференцировке in vitro и in vivo, их пролиферация зависит от митогенной стимуляции и характеризуются более высоким уровнем экспрессии онкогенов C-MYC, N-RAS, H-RAS, K-RAS. Однако чЭТК РА-1 и чЭСК ESM01 имеют ряд общих характеристик - экспрессия ОСТ4, NANOG, SOX2.
в 3"
Е8М01
«
Ж о. 2
В
¡я н о
СоШг +ЕСЕ +ГСР +ЮР +!.¥ +РО
СоШг +ЕСГ +ГСГ +1СЕ +ЬУ +РЦ
13 КС ■ +А«А О +АйА+ЬРСР-□ +ВМР4
ОСТ4 КИЧОв 50X2 вЛТЛ4 С-ШС летит NOD.iL ЬЕГП! Т01Ы ВМР4 ави
□ Соп1г ■ +АЙА
П +А<*А+ЬРСР
□ +ВМР4
0СТ4 ,\Л\0<; 30X2 0АТА4 С-ШС АСТ1УШ N01)4!. ЬЕГТГ! ТвШ>1 ВМР4
Рис. 7. Анализ функциональной активности и роли сигнальных путей МЕК/ЕИК, Р13К/АКТ, АсйутА/Мо(1а1/ЬеЙу/ТСЕр/8та<12/3 и ВМР/8гпа(11/5/8 в регуляции самообновления и дифференцирован чЭСК ЕвМО! и чЭТК РА-1. КС- контрольная среда для чЭСК - кондиционированная среда.
Для анализа механизмов самообновления чЭСК ESM01 и чЭТК РА-1 мы исследовали роль ERK/MEK и PI3K/AKT сигнальных путей в этих клетках. При стимуляции клеток митогенными факторами EGF, bFGF и IGF1 рост чЭТК РА-1 усиливался (в среднем на 40%), а при воздействии специфическими ингибиторами ERK/MEK и PI3К/АКТ сигнальных путей (PD98059 и LY294002 соответственно) снижался на 20-40% (Рис. 7). Анализ экспрессии генов маркеров и онкогенов в чЭТК РА-1 показал, что при воздействиях факторов роста изменяется только экспрессия NANOG (снижение более 50%), а при воздействии ингибиторов падает экспрессия C-MYC, тогда как экспрессия ОСТ4, GATA4, N-RAS, H-RAS, K-RAS практически не изменяется (Рис. 7). Рост чЭСК, культивируемых в некондиционированной среде с добавлением факторов EGF, bFGF, IGF1 и ингибитора PD98059 в течение 3 сут, незначительно снижался по сравнению с контролем (кондиционированная среда), однако снижались уровни экспрессии генов ОСТ4, NANOG, SOX2 и возрастал уровень экспрессии GATA4 (Рис. 7), что указывает на инициацию дифференцировки в этих условиях. Наибольший эффект был обнаружен при ингибировании PI3K/AKT сигнального пути (LY294002). Эти эксперименты показали, что PI3K/AKT сигнальный путь участвует в регуляции самообновления чЭСК и чЭТК, тогда как ERK/MEK сигнальный путь стимулирует самообновление в чЭТК РА-1, но не в чЭСК ESM01. Эти результаты согласуются с ранее полученными данными (Na et al., 2010). Можно предположить, что высокий уровень самообновления чЭТК РА-1 обусловлен вовлечением обоих сигнальных путей ERK/MEK и PI3K/AKT в усиление их пролиферации.
Для исследования механизмов, вовлеченных в регуляцию дифференцировки чЭСК ESM01 и чЭТК РА-1, был проведен сравнительный анализ паттернов экспрессии факторов семейства TGFß и функциональной активности активируемых ими сигнальных путей. Было обнаружено, что гены ACTIVINA, NODAL, LEFTY 1, GDF3 и BMP4 экспрессируются в чЭТК РА-1 на более низком уровне, чем в чЭСК ESM01. Анализ функциональной активности сигнальных путей факторов TGFß в чЭСК ESM01 и чЭТК РА-1 показал, что при стимуляции сигнальной ветви BMP/Smad 1/5/8 с помощью экзогенного фактора ВМР4 чЭСК вступали в дифференцировку, а в чЭТК не происходило изменений роста или дифференцировки, о чем также свидетельствовали уровни экспрессии генов ОСТ4, NANOG, SOX2, GATA4 и C-MYC (Рис. 7). При ингибировании этого сигнального пути ингибитором DMH1 практически не изменялся рост и статус чЭСК ESM01, но снижался рост чЭТК РА-1. Следовательно, функциональная активность и биологическое значение сигнальной ветви BMP/Smadl/5/8 в чЭСК ESM01 и чЭТК РА-1 различны: в чЭСК ESM01 - стимуляция дифференцировки, а в чЭТК РА-1 - модуляция активации пролиферации. При анализе функциональной активности ActivinA/Nodal/Lefty/TGFß/Smad2/3 сигнальных путей в чЭТК РА-1 было обнаружено, что воздействие экзогенного ActivinA или ингибитора SB431542 приводило снижению и усилению их пролиферации соответственно. При этом паттерныэкспрессии ОСТ4 и GATA4 не изменялись, свидетельствуя о том, что снижение скорости пролиферации не приводит к
инициации дифференцировки в чЭТК (Рис. 7). Наши результаты показали, что в чЭСК ActivinA/Nodal/Lefty/TGFß/Smad2/3 сигнальные пути необходимы для самообновления недифференцированных клеток, т.к. ингибирование этих сигнальных путей с помощью SB431542 или удаление ActivinA из среды приводило к остановке роста и дифференцировке. Эти данные согласуются с результатами других исследований роли ActivinA в поддержании плюрипотентного статуса чЭСК (Vallier et al., 2005; Beattie et al., 2005; Xiao et al., 2006; Na et al., 2010).
Таким образом, несмотря на очень низкий уровень экспрессии эндогенных факторов TGFß в чЭТК по сравнению с нормальными чЭТК, функциональная активность сигнальных путей, активируемых этими лигандами, сохраняется. При этом функциональная роль этих ветвей сигналинга факторов TGFß принципиально различается в чЭСК и чЭТК. Вероятно, относительно высокие уровни экспрессии эндогенных факторов ActivinA, Nodal, Lefty и ВМР4 в чЭСК и, следовательно, высокая активность этих сигнальных путей не только обеспечивают их самообновление и поддержание в плюрипотентном состоянии, но и необходимы для их дальнейшей дифференцировки. Низкие уровни экспрессии факторов семейства TGFß и их низкая сигнальная активность в чЭТК РА-1 приводят к снижению антипролиферативных сигналов и нарушению инициации дифференцировки. Следовательно, дисбаланс пролиферативных и антипролиферативных сигналов в чЭТК, обусловленный снижением активности эндогенных сигнальных путей факторов семейства TGFß и усилением митогенной активности PI3K/Akt и MEK/ERK сигнальных путей, приводит к нарушению процессов дифференцировки и усилению пролиферации.
4. Изучение роста и дифференцировки плюрипотентных стволовых и тератокарциномных клеток мыши и человека in vivo после трансплантации животным-реципиентам.
Анализ влияния различных факторов на туморогенность плюрипотентных стволовых клеток в разных фазах является необходимым для понимания механизмов канцерогенеза и процессов нормального развития плюрипотентных клеток (плюрипотентности, самообновления и дифференцировки), а также принципиально важен для разработки технологии оценки безопасности клеточных технологий на основе производных плюрипотентных стволовых клеток. Предшествующие исследования показали, что эффективность формирования и роста тератом варьирует при трансплантациях недифференцированных плюрипотентных стволовых клеток в различные тканевые сайты реципиентов (Cook et al., 2006; Prokhorova et al., 2009; Dressel, 2011). Оставалось неясным, зависит ли эффективность роста тератом от сайта трансплантации при ксеногенных трансплантациях или это характерно для всех плюрипотентных стволовых клеток, трансплантируемых в ткани взрослых реципиентов. В связи с этим нами была исследована эффективность роста опухолей, формируемых ЭСК и ЭТК мыши и человека, в разных сайтах трансплантации этих клеток у иммунодефицитных и иммунокомпетентных мышей.
Результаты показали, что после подкожной и внутриперитонеальной трансплантации 1х106ЭСК и ЭТК мыши и человека опухоли развивались у 100% мешей-реципиентов, но скорость роста опухолей была более интенсивной в перитонеальной полости для всех типов трансплантированных клеток. Однако наиболее значительные различия в эффективности формирования опухолей были выявлены после трансплантации малого числа клеток (10~104)(Таблицы 2 и 3). Минимальное число клеток, способных индуцировать развитие опухоли при перитонеальной трансплантации, было значительно меньше, чем при подкожной трансплантации для всех изученных линий клеток. При этом минимальное число клеток, способных индуцировать развитие опухоли при подкожной трансплантации, было одинаковым для ЭСК и ЭТК каждого вида (Таблицы 2 и 3). Эти данные свидетельствуют о том, что эффективность формирования и роста опухолей зависит от сайта трансплантации для всех типов клеток. Эти сайт-специфические различия в эффективности формирования тератом ЭСК мыши и человека могут быть обусловлены разной жизнеспособностью, скоростью роста и дифференцировки трансплантируемых клеток; различной реакцией иммунной системы реципиента в разных тканевых сайтах даже иммунодефицитных животных и различиями в васкуляризации и трофических условиях тканевого сайта трансплантации. Следовательно, для оценки безопасности клеточных технологий на основе плюрипотентных стволовых клеток при тестировании туморогенности клеток рекомендуется исследовать рост клеток в нескольких тканевых сайтах трансплантации, т. к. при подкожной трансплантации могут быть получены ложноотрицательные результаты.
Таблица 2. Развитие опухолей после подкожных и внутриперитонеальных трансплантаций различного числа мЭСК и мЭТК в иммунодефицитных мышей Nude
Число транспл. Эффективность развития опухолей, Эффективность развития опухолей,
клеток_сформированных мЭСК R1_сформированных мЭТК F9
ВП ПК ВП ПК
10 0/5 (0%), 50 нед 0/10 (0%), 50 нед 0/5 (0%), 50 нед 0/12 (0%),50 нед
102 0/6 (0%), 50 нед 0/12 (0%), 50 нед 4/6 (67%), 20 нед 0/9 (0%), 50 нед
10' 5/6 (83%), 15 нед 0/12 (0%), 50 нед 5/5 (100%), 10 нед 0/12 (0%), 50 нед
ю4 4/4 (100%), 10 нед 0/9 (0%), 40 нед 5/5 (100%), 6 нед 0/12 (0%), 40 нед
10' 4/4 (100%), 5 нед 4/5 (80%), 6 нед 4/4 (100%), 4 нед 4/4 (100%), 4 нед
Указаны число и процент экспериментальных животных, у которых были выявлены опухоли в сайтах трансплантации после аутопсии через указанное время эксперимента. ПК - подкожные трансплантации, ВП -внутриперигонеальные трансплантации (под капсулу почки).
Анализ видовых различий в эффективности развития тератом после трансплантации недифференцированных ЭСК мыши и человека показал, что минимальное число клеток, инициирующее развитие опухоли в иммунодефицитных мышах было в 10 раз меньшим для мЭСК, чем для чЭСК в обоих изученных сайтах. Кроме того, минимальное число ЭТК мыши и человека, инициирующих рост тератокарцином, было в 10 раз меньшим, по сравнению с нормальными ЭСК мыши и человека соответственно. Похожие значения критического числа клеток были ранее определены для чЭСК, трансплантированных в миокард или скелетные мышцы мышей линии 8СГО/Ье1§е
(105 и 104 клеток, соответственно) (Lee et al., 2009; Kooreman, Wu, 2010), и для мЭСК, трансплантированных в миокард и мозг (0,5-1х103 клеток) (Cao et al., 2007; Harkany et al., 2004). В других работах были определены и меньшие значения числа клеток, инициирующих развитие тератом, при ко-инъекции клеток с матригелем или фибробластами (Lawrenz et al., 2004; Hentze et al., 2009). Однако матригель может маскировать истинную эффективность развития опухолей, т.к. значительно увеличивает выживаемость и рост любых трансплантированных клеток.
Таблица 3. Развитие опухолей после подкожных и внутриперитонеальных трансплантаций различного числа чЭСК и чЭТК в иммунодефицитных мышей Nude
Число Эффективность развития опухолей, Эффективность развития опухолей, транспл. сформированных ЧЭСКЕ8М01 сформированных чЭТК РА-1 клеток_______
вп ПК ВП ПК
10 0/5 (0%), 50 нед 0/12 (0%), 50 нед 0/5 (0%), 50 нед 0/12 (0%),50 нед
102 0/6 (0%), 50 нед 0/12 (0%), 50 нед 0/6 (0%), 50 нед 0/12 (0%), 50 нед
10' 0/6 (0%), 50 нед 0/12 (0%), 50 нед 3/5 (60%), 50 нед 0/12 (0%), 50 нед
ю4 1/6 (17%), 50 нед 0/10 (0%), 50 нед 4/4(100%), 15 нед 0/11 (0%), 50 нед
ю5 3/5 (100%), 20 нед 0/6 (0%), 50 нед 5/5 (100%), 6 нед 0/6 (0%), 40 нед
Указаны число и процент экспериментальных животных, у которых были выявлены опухоли в сайтах трансплантации после аутопсии через указанное время эксперимента.
Полученные нами данные показывают, что вероятность и эффективность развития опухолей могут значительно возрастать в случае аллогенной или аутологичной трансплантации, а также в случае онкогенной трансформации плюрипотентных стволовых клеток, как это показано для малигнизированных аналогов плюрипотентных стволовых клеток - ЭТК. Мы обнаружили общую тенденцию более высокой туморогенности мЭСК и мЭТК, чем чЭСК и чЭТК после трансплантации как в иммунодефицитных, так и в иммунокомпетентных мышей. Полученные данные показывают, что малые количества мЭСК им ЭТК могут эффективно удаляться иммунной системой аллогенных иммунокомпетентных реципиентов, тогда как большое число клеток способно образовывать опухоли, вероятно, вследствие их иммуносупресиивного влияния и высокой скорости самообновления. Однако в случае ксеногенных трансплантаций их результаты варьируют и трудно прогнозируемы (8ЫЬа1а е1 а1., 2006; БЫИ е1 а1., 2007; Тапака е1 а1„ 2008; Биг^Ье^ е1 а1„ 2011).
Показано, что специфичность дифференцировки трансплантированных плюрипотентных стволовых клеток мыши и человека не зависит от сайта трансплантации. Анализ природы остаточных недифференцированных ЭСК в тератомах показал, что потенциал к росту и дифференцировке у мЭСК и чЭСК различается, т.к. недифференцированные мЭСК, в отличие от чЭСК, могут быть реклонированы из тератом в виде сублиний мЭСК. Результаты исследований первичных и вторичных опухолей показали отсутствие различий в потенциале к росту и дифференцировке родительских и реклонированных линий мЭСК и мЭТК. Ни в одном случае не было обнаружено тератом, состоящих
преимущественно из недифференцированных клеток, как тератокарциномы. Поэтому мы пришли к заключению, что ЭСК мыши и человека, находящиеся в в разных фазах плюрипотентности, формируют различные типы тератом. Вероятно, ЭСК человека более склонны к спонтанной дифференцировке в соматические, а не половые клетки. Напротив, мЭСК, как истинные плюрипотентные клетки, могут дифференцироваться как в соматические, так и в половые клетки, поэтому остаточные недифференцированные клетки тератом, сформированных мЭСК, можно рассматривать скорее как ранних предшественников первичных половых клеток, которые также способны формировать тератомы, но не как раковые клетки, подобные тератокарциномам с ограниченным потенциалом к дифференцировке. Однако предложенная нами гипотеза о природе остаточных недифференцированных клеток тератом нуждается в дальнейших масштабных экспериментальных исследованиях.
Таким образом, полученные результаты показывают, что эффективность роста опухолей после трансплантации зависит от баланса между реакцией клеток иммунной системы реципиентов и адаптивными свойствами и скоростью роста трансплантированных клеток. Следовательно, чтобы прогнозировать риск образования опухолей после аллогенной/аутологичной трансплантации производных чЭСК необходимо тестировать их онкогенный потенциал в нескольких трансплантационных сайтах животных-биомоделей независимо от используемой "терапевтической" модели на животных. При тестировании безопасности продуктов для клеточной терапии необходимо учитывать, что ксеногенные трансплантации могут показывать заниженный риск туморогенности, поэтому для эффективной и достоверной оценки рисков необходимо создание новых "гуманизированных" животных-биомоделей.
5. Моделирование in vitro раннего развития млекопитающих с использованием линий плюрипотентных стволовых клеток с целью создания тест-систем для фармакологических и токсикологических исследований.
5.1. Изучение динамики роста и дифференцировки плюрипотентных стволовых и тератокарциномных клеток мыши в ЭТ для создания модели раннего развипшя млекопитающих in vitro. Наши исследования были направлены на создание фундаментальных основ комплексной технологии оценки влияния различных химических веществ на ЭСК мыши и человека, используемых в качестве клеточных моделей раннего эмбрионального развития. В первую очередь были исследованы факторы, оказывающие влияние на динамику ранней ЗБ-дифференцировки плюрипотентных стволовых клеток мыши.
Плюрипотентные стволовые клетки способны формировать клеточные сфероиды - ЭТ, которые являются аналогами ранних эмбрионов на пери-имплантационных и прегаструляционных стадиях (Evans and Kaufman, 1981; Martin, 1981; Doetschman et al., 1985). Ранние морфогенетические события, формирование 3D- структуры, дифференцировка клеток-предшественников трех зародышевых листков и внезародышевыз структур в ЭТ воспроизводят соответствующие процессы в эмбрионах.
Сравнительный анализ процессов дифференцировки и морфогенеза в ЭТ. формируемых мЭСК, мЭГК и мЭТК, и в ранних эмбрионах мыши выявил сходные динамики формирования и развития эвнезародышевой энтодермы. Обнаружено, что начальные стадии формирования первичной внезародышевой энтодермы (Са1а4-позитивные клетки) сходны в эмбрионах и в ЭТ, однако дальнейшее развитие внезародышевой энтодермы имеет значительные различия в этих структурах (Рис. 8). Изучение ЭТ, сформированных мЭСК, мЭГК и мЭТК показало, что наибольшая степень развития внезародышевой энтодермы имеет место в ЭТ ЭСК, а наименьшая в — ЭТ ЭГК (Рис. 8). Кроме того, уровни экспрессии генов-маркеров для клеток-предшественников трех зародышевых листков также различались для разных линий.
Морула Е2.5 Бластоциста Е3.5 Бластоциста Е4.5 Бластоцнста Е5.0
ЭТ1 ЭТЗ ЭТ5 ЭТ10
Рис. 8. Сравнительный анализ динамики ЗО-дифференцировки ЭТ, формируемых мЭСК, мЭГК и мЭТК, с ранним развитием эмбрионов мыши с помощью конфокальной микроскопии. ЭТ1, 3, 5, 10 — дни дифференнировки ЭТ.
При анализе динамики дифференцировки ЭТ, формируемых мЭСК, мЭГК и мЭТК, были исследованы клеточные контакты и межклеточные коммуникации в разных слоях сфероидов. С помощью прижизненного анализа диффузии флюоресцентно меченых белков в ЭТ разных стадий дифференцировки было обнаружено, что по мере роста во всех ЭТ постепенно уменьшается диффузия
белков и низкомолекулярных веществ, а в ЭТ, формируемых ЭСК, она полностью прекращается на 10 сут. Таким образом, рост сфероида и дифференцировка внезародышевой энтодермы приводит к прстранственному разграничению клеточных слоев в ЭТ, и как следствие к снижению диффузии и ограничению транспорта химических и биологически активных веществ из внешней среды.
При анализе факторов, влияющих на динамику роста и дифференцировки ЭТ, было обнаружено, что несмотря на некоторые морфологические различия ЭТ, сформированных разным числом клеток, соотношение в них разных типов клеток-предшественников мало различается, о чем свидетельствуют уровни экспрессии генов-маркеров Oct4, Nanog, Gata4, Рахб, ВгуТ и Vasa. Наибольшие различия в экпрессии были установлены для Gata4 - маркера внезародышевой энтодермы. Другим фактором, влияющим на динамику дифференцировки ЭТ, является состав среды для культивирования. В средах с фетальной сывороткой процессы дифференцировки ЭТ были интенсивнее и значительно различались для линий мЭСК, мЭГК и мЭТК, тогда как в в бессывороточной среде динамики роста и дифференцировки были сходна для всех линий. Однако в бессывороточных средах наблюдалось значительное снижение дифференцировки внезародышевой энтодермы и мезодермапьных предшественников во всех ЭТ.
Таким образом, наши данные свидетельствуют о том, что динамика дифференцировки ЭТ зависит от происхождения клеточной линии (мЭСК, мЭГК, мЭТК), хотя пространственно-временные паттерны дифференцировки всех ЭТ имеют значительное сходство. Скорость роста и динамика дифференцировки зависят от состава среды для культивирования ЭТ (сывороточные-бессывороточные) и, в меньшей степени, от исходного числа клеток, формирующих ЭТ. Дифференцировка клеток предшественников трех зародышевых листков и внезародышевой энтодермы в ЭТ происходит стохастически, без строгой пространственной упорядоченности и детерминации, что препятствует формированию осей полярности и инициации процессов гаструляции в ЭТ. Пролиферация и дифференцировка клеток внезародышевой энтодермы приводит к формированию внешнего клеточного слоя в ЭТ, который значительно гипертрофирован по сравнению с ранними эмбрионами.. В процессе дифференцировки ЭТ нарастает их неупорядоченная асимметрия. Гипертрофия слоя внезародышевой энтодермы процессе дифференцировки ЭТ in vitro спосбствует их высокой метаболической устойчивости, но препятствует дальнейшему развитию и переходу к процессам гаструляции.
5.2. Изучение токсических и антипролиферативных эффектов цитостатиков на недифференцированные ЭСК, ЭГК, ЭТК и бластоцисты мыши. Для анализа эффектов веществ с различной токсичностью в разработанной тест-системе и в ранних эмбрионах были изучены повреждающие эффекты цитостатиков с различными механизмами действия: алкилирующие агенты, образующие сшивки в структуре ДНК (митомицин С), ингибиторы топоизомеразы II (этопозид), ингибиторы сборки микротрубочек (винбластин) и ингибиторы синтеза белков (циклогексимид) в в плюрипотентных стволовых клетках (мЭСК R1, мЭГК EGC-10 и мЭТК F9) и бластоцистах мыши (Е 4.0).
Анализ клеточного роста показал, что эффекты всех изучаемых цитостатиков были сходными для мЭСК, мЭГК и мЭТК. Наибольшие токсические и антипролиферативные эффекты оказывали митомицин С и этопозид, т.к. после их воздействия выживали не более 1-2 % клеток. Эффекты винбластина на мЭСК, мЭГК и мЭТК несколько различались: наибольшую чувствительность проявляли мЭСК и мЭГК (2.4-2.9 % жизнеспособных клеток), наименьшую - мЭТК (7.7 %). После воздействия циклогексимида на мЭСК, мЭГК и мЭТК было выявлено наибольшее число жизнеспособных клеток по сравнению с другими цитостатиками. Однако при воздействии изучаемых веществ на бластоцисты мыши никаких морфологических изменений в эмбрионах мы не наблюдали в течение 24 ч культивирования. При воздействии цитостатиков на бластоцисты мыши в течение 48 ч плюрипотентные клетки внутренней клеточной массы полностью погибали, тогда как клетки трофобласта оставались жизнеспособными. В этот период времени бластоцисты прикреплялись к подложке планшета, и в ходе этого процесса нарушалась целостность их трофобласта. Вследствие этих структурных морфологических изменений проявлялся токсический эффект цитостатиков на плюрипотентные клетки внутренней клеточной массы. Таким образом, недифференцированные плюрипотентные стволовые и тератокарциномные клетки мыши проявляют высокую чувствительность к воздействиям различных групп цитостатиков, как и плюрипотентные клетки внутренней массы бластоцисты мыши. Чувствительность к цитотоксическим эффектам изученных препаратов снижается в дифференцированных плюрипотентных стволовых клетках, а также в клетках трофобласта, которые способны эффективно защищать внутреннюю клеточную массу от токсических веществ при условии сохранения целостности трофэктодермы.
5.3. Изучение токсических эффектов этопозида на разных стадиях дифференцировки эмбриоидных тел (ЭТ), сформированных мЭСК. Для исследования вопроса о формировании защитных механизмов от повреждающих факторов в аналогах ранних эмбрионов - ЭТ разных стадий дифференцировки были изучены прямые и отсроченные повреждающие эффекты этопозида в ЭТ разных стадий дифференцировки (Гордеева, 2013). Было обнаружено, что мЭСК и ЭТ разных стадий дифференцировки проявляют различную чувствительность к цитостатику. На основе полученных данных можно заключить, что цитостатические и цитотоксические эффекты этопозида в недифференцированных мЭСК и ЭТ разных стадий дифференцировки являются стадиеспецифическими. В недифференцированных мЭСК, поддерживаемых в Ю-культуре, эти эффекты были максимальными и необратимыми. В ЗО-моделях наибольшие эффекты в ингибировании роста и дифференцировки были выявлены в ранних ЭТ1, однако эти эффекты постепенно снижались по мере роста и дифференцировки ЭТ (Рис. 9). Снижение чувствительности ЭТ к этопозиду в процессе их дифференцировки, вероятно, связано и с изменением их ЗЭ-структуры, которая эффективно защищает от повреждающих эффектов. Клетки центральных слоев ЭТ выживали лучше и были способны к восстановлению роста и дифференцировки после отмены цитостатика. Таким образом, развитие
Рис. 9. Экспрессия транскрипционных факторов Oct4 (красный) и Gata4 (зеленый) в ЭТ на 1, 5 и 10 дни дифференцировки после 24 ч воздействия этопознда (А) и через 72 ч после его отмены (Б). ЭТ1, ЭТ5, ЭТ10 - эмбриондные тела на 1, 5, и 10 сут дифференцировки соответствен но.
гипертрофированного слоя внезародышевой энтодермы и увеличение клеточного объема ЭТ хотя и приводят к снижению диффузии химических и биологически активных веществ, необходимых для роста и дифференцировки, но одновременно препятствуют действию повреждающих факторов. В этом контексте ЭТ можно рассматривать как ЗО-клеточные структуры, более близкие к структурам ранних эмбрионов млекопитающих, чем мЭСК, поддерживаемые в 20-системах культивирования, а соответственно, как более адекватные in vitro модели для фармакологических и токсикологических исследований.
5.4. Оценка токсических эффектов 5НТР (5-Hydroxytryptophan) на эмбриональные стволовые клетки и ранние эмбрионы мыши. На следующем этапе нашей работы были исследованы фармакологические и токсические эффекты веществ с неизвестной эмбриотоксичностью на примере 5-НТР. Ранее предшественник синтеза серотонина 5-НТР был разрешен к применению для лечения депрессии, фибромиалгии и бессонницы (Das et al„ 2004). Однако эмбриотоксичность 5-НТР не была исследована. Наши токсикологические исследования веществ-компонентов синтеза серотонина - триптофана, 5НТР и серотонина (5-НТ) - на недифференцированные мЭСК, ЭТ1 и ЭТ6, а также ранние эмбрионы мыши показали, показали, что эти вещества не являются токсичными в концентрациях от 10"6- 10"4 М. Однако в концентрации 10"3 М 5-НТР проявляет токсичность в недифференцированных мЭСК и ЭТ, хотя его эффекты обратимы после его отмены (Рис. 10).
С другой стороны, эмбриотоксические эффекты 5-НТР не были выявлены в эмбрионах, развивающихся от стадии поздней морулы до поздней бластоцисты, при условии сохранения целостности трофобласта. Таким образом, токсические
ЭТЮ
Контроль 1 мкМ 10 мкМ Б Контроль 1 мкМ ЮмкМ
иЭСК R1
мЭСК ССЕ
МЭФ
□ 24ч+48ч
г
*
и *
-f-
1 rfi
I1 г*
Г ñ
1 1
Контроль 0.5 мМ 1 мМ 2 v М
Контроль 0.5 мМ 1 мМ 2мМ
Контроль 0.5 мМ 1 мМ 2 мМ
ЭТ2
ЭТ7
Контроль 0.5 мМ 1 мМ 2 мМ
Контроль 0.5 мМ 1 мМ 2мМ
Контроль 0.5 мМ 1 мМ 2мМ
Рис. 10. Анализ воздействия 5-НТР на мЭСК К1 и ССЕ (А) и формируемые ими эмбриоидные тела на 1 и 6 сут дифференцировки ЭТ (Б). Исследован рост мЭСК и ЭТ через 24 ч после воздействия 5-НТР и через 48 ч после его отмены в мЭСК. * - различия достоверны при /><0.(Ш.Средние объемы ЭТ рассчитаны для обеих линий мЭСК К1 и ССЕ.
эффекты 5-НТР в мЭСК имели высокую степень корреляции с эффектами в клетках внутренней массы бластоцисты, но не всего эмбриона на этой стадии. Сравнительный анализ влияния 5-НТР на мЭСК, ЭТ1 и ЭТ6 выявил стадиеспецифичность его эффектов, т. к. в процессе дифференцировки ЭТ и изменения их ЗО-структуры снижалась их чувствительность к 5-НТР. Несмотря на различную степень токсичности 5-НТР в эмбрионах, мЭСК и ЭТ характер повреждающих эффектов был сходным во всех типах клеток (ингибирование роста, клеточная гибель и перестройки цитоскелета). Предположительно, механизм токсического действия 5-НТР в этих клетках связан с превышением пороговой концентрации внутриклеточного серотонина и дерегуляции модулируемых им различных клеточных процессов (Mercado et al., 2011), т. к. повреждающие эффекты 5-НТР были полностью блокированы при добавлении ингибитора декарбоксилаз ароматических амнокислот (3-hydroxybenzyl hydrazine), препятствующего синтезу серотонина.
Таким образом, разработанные нами модели раннего развития млекопитающих на основе ранних стадий дифференцировки плюрипотентных стволовых клеток млекопитающих in vitro могут быть использованы для оценки эмбриотоксичности новых лекарственных препаратов и токсических химических веществ, так как позволяют с высокой степенью достоверности прогнозировать эмбриотоксичность тестируемых веществ. Разработанные тест-системы не имеет аналогов в мировой практике.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
В представленном цикле исследований на основе сравнительного анализа механизмов самообновления и дифференцировки плюрипотентных стволовых и тератокарциномных клеток млекопитающих было впервые показано, что регуляция различных фаз плюрипотентности (ground /primed state) связана с экспрессией генов, специфических для линии половых клеток. Эти подходы были успешно применены при характеристике новых линий эмбриональных стволовых клеток человека. В ходе исследований впервые обнаружено, что нормальные плюрипотентные стволовые клетки человека и мыши имеют сходные профили экспрессии раково-тестикулярных антигенов семейств MAGE-A, MAGE-B и MAGE-D, которые изменяются в процессе дифференцировки в соматические и половые клетки. На основе обнаруженных различий в специфических профилях раково-тестикулярных антигенов в нормальных плюрипотентных и опухолевых клетках различного происхождения могут быть выявлены трансформированные клетки в культивируемых популяциях in vitro. Эти данные способствуют разработке новых подходов, направленных на идентификацию и изоляцию аномальных клеток и повышение безопасности клеточных технологий. На основе результатов анализа динамики роста и дифференцировки плюрипотентных стволовых и тератокарциномных клеток мыши и человека in vivo после трансплантации иммунодефицитным и иммунокомпетентным животным-реципиентам определены ключевые параметры, влияющие на формирование экспериментальных опухолей. Эти данные могут быть применены для разработки стандартизованных методов тестирования онкогенного потенциала производных плюрипотентных стволовых клеток. Результаты исследований механизмов сигнальной регуляции самообновления и дифференцировки клеток в базовом и первичном статусах плюрипотентности, а также нуллипотентного статуса тератокарцином впервые показали, что различия в потенциале клеток связаны с различиями в уровнях эндогенной экспрессии факторов семейства TGFP и их взаимодействиями с другими сигнальными путями. Полученные результаты могут быть использованы для разработки новых эффективных методов лечения тератокарцином. В ходе исследования ранних стадий дифференцировки плюрипотентных стволовых клеток в ЗО-системах in vitro была разработана стандартизованная модель раннего развития млекопитающих, определены ключевые факторы, влияющие на динамические параметры модели. Полученные результаты могут быть использованы при создании новых тест-систем для фармакологических и токсикологических исследований новых лекарств и химических веществ. Полученные результаты расширили представления о фундаментальных закономерностях биологии плюрипотентных и опухолевых клеток и позволили разработать основы для практического применения результатов в разработках клеточных технологий и фармакологии.
выводы
1. Паттерны экспрессии генов, специфических для линии половых клеток, коррелируют с потенциалом к дифференцировке плюрипотентных стволовых клеток млекопитающих в базовом (ground state) и первичном (primed state) статусе плюрипотентности. Уровни экспрессии генов Oct4/OCT4, и Ddx4/DDX4 могут служить индикаторами удаленности от базового статуса плюрипотентности (ground state). Статусы малигнизированных тератокарциномных клеток мыши и человека представляют собой неопределенные устойчивые состояния с частичной аналогией статусам плюрипотентных клеток.
2. Плюрипотентные стволовые клетки человека и мыши имеют сходные профили экспрессии раково-тестикулярных антигенов семейств MAGE-A, MAGE-B и MAGE-D. Экспрессия генов MAGE стадиеспецифична и тканеспецифична и снижается в процессе дифференцировки плюрипотентных стволовых клеток. На основе различий в специфических профилях раково-тестикулярных антигенов в плюрипотентных стволовых клетках и их опухолевых клетках-аналогах могут быть выявлены трансформированные клетки в культивируемых популяциях in vitro.
3. Регуляция самообновления клеток в базовом и первичном статусах плюрипотентности значительно различается вследствие различий в уровнях эндогенной экспрессии факторов TGF/31, BMP4 и ActivinA, а также FGF2, активирующих соответствующие сигнальные пути. В ЭСК человека усиление ActivinA/Nodal/Lefty/Smad2/3-CHrHaimHra с помощью экзогенных факторов является необходимым для ослабления влияния BMP/Smadl/5/8-сигнальных путей, стимулирующих дифференцировку.
4. Различный потенциал к дифференцировке у плюрипотентных ЭСК и нуллипотентных ЭТК мыши и человека обусловлен снижением активности ActivinA/Nodal/Lefty/Smad2/3-CHrHaiTbHbix каскадов. Дисбаланс пролиферативных и антипролиферативных сигналов в ЭТК человека, приводящий к нарушению дифференцировки, обусловлен снижением активности эндогенных сигнальных путей факторов семейства TGFp и усилением активности PI3K/Akt и MEK/ERK-сигнальных путей.
5. Динамика роста и дифференцировки плюрипотентных стволовых клеток мыши и человека после трансплантации их в различные ткани иммунодефицитных и иммунокомпетентных мышей зависит от статуса иммунной системы животных-реципиентов и статуса плюрипотентности трансплантируемой клеточной линии.
6. Скорость роста и дифференцировки плюрипотентных стволовых клеток млекопитающих в ЗО-системах in vitro зависит от происхождения линии клеток, состава среды и, в меньшей степени, от исходного числа клеток, формирующих эмбриоидные тела. Устойчивость эмбриоидных тел к
повреждающему действию различных токсических веществ обеспечивается их ЗО-структурой и развитой внезародышевой энтодермой. Разработанные ЗО-модели на основе линий плюрипотентных стволовых клеток млекопитающих могут быть использованы для оценки эмбриотоксичности веществ для ранних эмбрионов млекопитающих и имеют преимущества по сравнению с традиционными тест-системами.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
1. Гордеева О.Ф., Мануйлова Е.С., Гривенников И.А, Гуляев Д.В., Смирнова Ю.А., Зиновьева Р.Д, Хрущов Н.Г. Характеристика плюрипотентной популяции на начальных стадиях дифференцировки эмбриональных стволовых клеток в культуре// Доклады Академии наук. 2002. Т. 386. №3. С.555-558.
2. Гордеева О.Ф., Мануйлова Е.С., Паюшина О.В., Никонова Т.М., Гривенников И.А., Хрущов Н.Г. Изучение дифференцировки плюрипотентных эмбриональных стволовых клеток в перитонеальной полости облученных мышей// Известия АН. Сер. Биол. 2003. №3. С. 371374.
3. Гордеева О.Ф., Мануйлова Е.С., Гривенников И.А., Смирнова Ю.А., Красникова Н.Ю., Зиновьева Р.Д., Хрущов Н.Г. Экспрессия регуляторных генов Oct-4, Pax-б, Prox-I, Ptx-2 на начальных стадиях дифференцировки эмбриональных стволовых клеток in vitro// Онтогенез. 2003. Т. 34. №3. С. 176-184.
4. Gordeeva О., Zinovieva R., Smirnova Yu., Payushina O., Nikonova T., Khrushchov N. Differentiation or embryonic stem cells after transplantation into peritoneal cavity of irradiated mice and expression of specific germ cell genes in pluripotent cells//Transpl. Proc. 2005. V. 37 №1. P. 295-298.
5. Гордеева О.Ф., Красникова Н.Ю., Ларионова A.B. Сравнительные исследования транскрипционных профилей эмбриональных стволовых клеток для разработки клеточных тест-систем нового поколения. Вестник биотехнологии и физико-химической биологии// 2005. Т. 1. №1. С. 79-84.
6. Гордеева О.Ф. Эмбриональные стволовые клетки: фундаментальная наука и новые клеточные технологии// Труды II съезда Общества биотехнологов России. 2005. Москва: "Дельта". С. 129-132.
7. Гордеева О.Ф., Красникова Н.Ю., Ларионова A.B., Крылова Т.А., Полянская Г.Г., Зиновьева Р.Д., Гуляев Д.В., Прыжкова М.В., Никольский H.H., Хрущов Н.Г. Анализ экспрессии генов, специфических для плюрипотентных и первичных половых клеток, в линиях эмбриональных стволовых клеток человека и мыши// ДАН. 2006. Т. 406. №6. С. 835-839.
8. Красникова Н.Ю., Гордеева О.Ф. Сравнительный анализ экспрессии факторов семейства TGFß и их рецепторов в эмбриональных стволовых и эмбриональных тератокарциномных клетках мыши// Онтогенез. 2007. Т. 38. №2. С. 126-135.
9. Гордеева О.Ф. Создание высокотехнологичных тест систем на основе эмбриональных стволовых клеток для изучения фармакологических и токсикологических эффектов новых лекарственных препаратов// Информационный бюллетень "Клеточные культуры". 2007. № 22. С. 1621.
10. Гордеева О.Ф., Миталипов Ш.М. Плюрипотентные стволовые клетки: поддержание генетической и эпигенетической стабильности и перспективы клеточных технологий// Онтогенез. 2008. Т. 39. №6. С. 405419.
И. Гордеева О.Ф., Лифанцева Н.В., Никонова Т.М. Регуляция in vitro и in vivo дифференцировки эмбриональных стволовых, эмбриональных герминативных и тератокарциномных клеток мыши факторами семейства TGFß// Онтогенез. 2009. Т. 40. №6. С. 403-418.
12. Крылова Т.А., Кольцова A.M., Зенин В.В., Гордеева О.Ф., Мусорина A.C., Горячая Т.С., Шлыкова С.А., Каменецкая Ю.К., Пинаев Г.П., Полянская Г.Г. Характеристики и специфические особенности новых линий эмбриональных стволовых клеток человека// Цитология. 2009. Т. 51. №7. С. 565-575.
13. Крылова Т.А., Кольцова A.M., Гордеева О.Ф., Мусорина A.C., Горячая Т.С., Пинаев Г.П., Полянская Г.Г. Выделение, идентификация и специфические особенности новых постоянных линий эмбриональных стволовых клеток человека. Сб. "Аутологичные стволовые клетки. Экспериментальные исследования и перспективы клинического применения". 2009. Москва: Изд-во Литгерра. С. 23-42.
14. Кольцова A.M., Гордеева О.Ф., Крылова Т.А., Лифанцева Н.В., Мусорина A.C., Яковлева Т.К., Полянская Г.Г. Сравнительные характеристики новых линий эмбриональных стволовых клеток человека SC5, SC6, SC7 и SC3a// Онтогенез. 2011. Т. 42. №4. С. 249-263.
15. N. Lifantseva, A. Koltsova, T. Krylova, T. Yakovleva, G. Poljanskaya, О. Gordeeva. Expression Patterns of Cancer-Testis Antigens in Human Embryonic Stem Cells and Their Cell Derivatives Indicate Lineage Tracks// Stem Cell Intern. 2011. V. 2011. ID 795239. doi:10.4061/2011/795239.
16. Gordeeva O. F. Pluripotent cells in embryogenesis and in teratoma formation// J Stem Cells. 2011. V. 6. №1. P. 51-63.
17. Gordeeva O. F. Normal and Pathological Development of Pluripotent Stem Cells// J Stem Cells. 2011. V. 6. №3. P. 129-154.
18. Гордеева О.Ф., Лифанцева H.B., Хайдуков C.B. Паттерны экспрессии генов, специфических для линии половых клеток, в плюрипотентных стволовых клетках мыши и человека связаны с регуляцией базового и первичного статусов плюрипотентности// Онтогенез. 2011. Т. 42. №6. С. 403-424.
19. Гордеева О.Ф. Технологии оценки биобезопасности фармакологических веществ и клеточных технологий с использованием моделей плюрипотентных стволовых клеток. "Клеточные технологии для
регенеративной медицины". Ред. Г.П. Пинаева, М.С. Богдановой, A.M. Кольцовой. 2011. Санкт-Петербург: Изд-во Политехи. Ун-та. С. 44-61.
20. Гордеева О. Ф. Антипролиферативные и цитотоксические эффекты различных типов цитостатиков на плюрипотентные стволовые клетки и клетки тератокарциномы мыши // Онтогенез. 2012. Т. 43. №4. С. 268-277.
21. Кольцова A.M., Воронкина И.В., Гордеева О.Ф., Зенин В.В., Лифанцева
H.В., Мусорина А.С., Смагина Л.В., Яковлева Т. К., Полянская Г. Г. Разработка новой бесфидерной системы и характеристика полученных в ней линий эмбриональных стволовых клеток человека при аутогенном и аллогенном культивировании// Цитология. 2012. Т. 54. №8. С. 637- 651.
22. Gordeeva O.F., Nikonova Т.М. Development of Experimental Tumors Formed by Mouse and Human Embryonic Stem and Teratocarcinoma Cells after Subcutaneous and Intraperitoneal Transplantations into Immunodeficient and Immunocompetent Mice// Cell Transplant. 2013. V.22. №10. P. 1901-1914.
23. Лифанцева H.B., Кольцова A.M., Полянская Г.Г., Гордеева О.Ф. Экспрессия факторов семейства TGF0 и фактора роста фибробластов FGF2 в эмбриональных стволовых клетках мыши и человека, поддерживаемых в разных системах культивирования// Онтогенез. 2013. Т. 44. №1. С. 357-365.
24. Гордеева О. Ф. Цитотоксические эффекты этопозида на разных стадиях дифференцировки эмбриоидных тел, сформированных эмбриональными стволовыми клетками мыши// Онтогенез. 2013. Т. 44. №6. С.381-388.
25. Гордеева О. Ф. Низкая экспрессия активина А в нуллипотентных эмбриональных тератокарциномных клетках мыши и человека// Онтогенез. 2014. Т. 45. №4. С.272-279.
Избранные тезисы докладов
1. Gordeeva Olga, Gulyaev Dmitriy, Khrushchov Nikolai. Expression of osteopontin at the initial stage of embryonic stem cells differentiation correlates with pattern of expression of adherens junction proteins E-cadherin and desmocollin 1 in pluripotent populations. 30™ FEBS Congress -9th IUBMB Conference "The Protein World Proteins and Peptides: Structure, Function and Organization". Budapest, Hungary, 2-7 July, 2005. FEBS. 2005.V.272. Suppl.
I. P.268-269.
2. Gordeeva O. F., Larionova A.V., Krasnikova N.Y., Nikonova T.M. Expression of germ line specific genes during in vitro and in vivo differentiation of embryonic stem cells and embryonic germ cells. 4th Annual Meeting of the International Society for Stem Cell Research. Toronto, Canada. June 29- July 1, 2006. Abstract book. P. 149.
3. Krasnikova N.Y., Gordeeva O.F. Nodal signaling in the regulation of pluripotent state of human and mouse ES and EC cells. 31st FEBS Congress. Istanbul, Turkey. June, 2006. FEBS.V.273.Suppl.l P. 126.
4. Gordeeva O.F., Krasnikova N.Y., Nikonova T.M., Golub A.Y., Lifantzeva N.V. Embryonic stem cells and embryonal teratocarcinoma cells: signal pathways regulated by TGFP superfamily factors and differentiation potential in
vitro and in vivo. 5th Annual Meeting of the International Society for Stem Cell Research. Australia, Cairns, June 17-20,2007. Abstract book. P.86-87.
5. Gordeeva O.F., Krasnikova N.Y. "Regulation of the cell fate determination in embryonic stem cells, embryonic germ cells and teratocarcinoma cells by TGFb family signaling pathways in course of spontaneous and retinoic acid-induced differentiation". 6th Annual Meeting of the International Society for Stem Cell Research. USA, Philadelphia, June 11-14,2008. Abstract book. P. 352-353.
6. Gordeeva O.F. Differentiation of pluripotent cells in vitro and after transplantation into immune-dificient mice: evaluation of safety for stem cell therapy. World Congress Regenerative Medicine and Stem Cells. China, Foshan, 2-4 December, 2008. Abstract book. P. 113.
7. Gordeeva O.F. Development of evaluation platform based on embryonic stem cells for toxicity and biosafety testing of new pharmaceuticals and cell therapy products. 14th European Congress on Biotechnology "Symbiosis: Science, Industry & Society", Spain, Barcellona, September 13-16, 2009. Abstract book. P.7-8.
8. Gordeeva O. F. Development of New High-tech Test-systems Based on Embryonic Stem Cells for Assessment of Developmental Toxicity of New Drugs and Pharmaceuticals. 14th International Biotechnology Symposium and Exibition Biotechnology for the Sustainability of Human Society. 14-18 September 2010, Rimini, Italy. Journal of Biotechnology. 2010. V.150. Supl. P. 533.
9. Gordeeva O.F, Krasnikova N. Inactivation of Activin/Nodal and GDF3 signaling pathways contribute to imbalance of proliferation and differentiation in nullipotent human teratocarcinoma cells. Keystone Symposium "Stem Cells, Cancer and Metastasis". Keystone, Colorado, USA. March 6 -11, 2011. Abstract book. P. 81.
10. Gordeeva O.F., Lifantseva N. V. High rate self-renewal of human teratocarcinoma PA-1 cells is ensured by both ERK/MAPK- and PI3K/AKT-signaling pathways. International Conference "Stem Cells in Development and Disease". Berlin, Germany. September 11-14, 2011. Abstract book. P. 215.
11. Gordeeva O.F. 3D-Modeling of embryoid bodies formed by mouse pluripotent stem cells in different cell culture systems. 10th Annual Meeting of the International Society for Stem Cell Research. Japan, Yokohama, June 13-16, 2012. Abstract book. P. 148.
12. Gordeeva O.F. Differentiation dynamics and tumorigenic potentials of mouse embryonic stem c and embryonic teratocarcinoma cells are governed by different TGFp signaling regulation. Regional Forum of International Society for Stem Cell Research, "Stem Cells in Translation". Florence, Italy. 15-18 September, 2013. Abstract book. P. 57-58.
13. Gordeeva O.F. Rearrangements of PI3K/AKT, MEK/ERK and TGFbeta signaling pathways in human teratocarcinoma PA-1 cells resulted in deregulation of self-renewal and differentiation. Keystone Symposium "Stem Cells in Homeostasis and Disease". Banff, Alberta, Canada. February 24-March 1,2013. Abstract book. P. 55.
СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ
1. Гордеева и др. (2006) ДАН406: 835-839.
2. Гордеева. (2013) Онтогенез 44: 381-388.
3. Кольцова и др. (2011) Онтогенез 42: 249-263.
4. Кольцова и др. (2012) Цитология 54: 637- 651.
5. Beattie et al. (2005) Stem Cells 23: 489-495.
6. Cao et al. (2007) Stem Cells Dev. 16: 883-891.
7. Cauffman et al. (2005) Mol Hum. Reprod 11: 405411.
8. Clark et al. (2004) Hum. Mol. Genet. 13: 727-739.
9. Cook et al. (2006) Stem Cells Dev. 15: 254-259.
10. Doetschman etal. (1985)7. Embryol. Exp. Morphol. 87:27-45
11. Dreesen, BrivanJou. (2007) Stem Cell Rev. 3: 7-17.
12. Dressel (2011) Semin. Immunopathol. 33: 573-591.
13. Eiselleova et al. (2008) Int. J. Dev. Biol 52: 353363.
14. Eiselleova et al. (2009) Stem Cells 27: 1847-1857.
15. Evans, Kaufman (1981) Nature 292: 154-156.
16. Evseenko et al. (2009) Stem Cells Dev. 18: 919928.
17. Greber et al (2007) Stem Cells 25: 455-464.
18. Han etal. (2010) Cell 143: 617-627.
19. Hanna et al. (2010) PNAS USA 107: 9222-9227.
20. Harkany etal. (2004)7. Neurochem. 88: 12291239.
21. Hentze et al. (2009) Stem Cell Res. 2: 198-210.
22. Hilbner et al. (2003) Science 300: 1251-1256.
23. Kee etal. (2006)Stem CellsDevel. 15: 831-837.
24. Kooreman, Wu. (2010)7. R. Soc. Interface 7 Suppl 6: S753-763.
25. Lacham-Kaplan (2004) Reproduction 128: 147-
152.
26. Laurent et al.. (2011) Cell Stem Cell 8: 106-118.
27. Lawrenz et at. (2004) Cytotherapy 6: 212-222.
28. Lee et al. (2009) Cell Cycle 8: 2608-2612.
29. Lund etal. (2012)Nat. Rev.Genet. 13: 732-744.
30. Martin. (1981) PNAS USA. 78: 7634-7638.
31. Mercado et al. (2011) Curr. Opin. Pharmacol 11: 23-28.
32. Montes et al. (2009) Cell Res. 19: 698-709.
33. Na et al. (2010) Stem Cell Research 5: 157-169.
34. Nayernia et al. (2006) Devel. Cell 11: 125-132.
35. Nichols, Smith. (2009) Cell Stem Cell 4: 487-492.
36. Ohinata etal. (2005) Nature 436: 207-213.
37. Pesce, Scholer. (2001) Stem Cells 19: 271-278.
38. Prokhorova et al. (2009) Stem Cells Dev. 18: 4754.
39. Reynolds et al. (2005) Hum. Mol. Genet. 14: 38993909.
40. Reynolds et al. (2№1)RNA 13: 974-981.
41. Reynolds, Cooke (2005) Reprod. Biomed. Online 10: 72-80.
42. Saitou et al. (2002) Nature 418: 293-300
43. Shibata et al. (2006) Stem Cells 24: 1450-1457.
44. Shih etal. (2007) Stem Cells Dev. 16: 893-902.
45. Silva et al. (2008) PLoS Biol. 6: e253.
46. Smith et al. (1988) Nature 336: 688-690.
47. Sundberg et al. (2011) Cell Transplant. 20: 177191.
48. Tainsky et al. (1984) Science 225: 643-645.
49. Takahashi et al. (2003) Nature 423: 541-545.
50. Tanaka et al (2000) Genes Devel. 14: 841-853.
51. Tanaka et al. (2008) Stem Cells Dev. 17: 367-381.
52. Tilgner et al. (2008) Stem Cells 26: 3075-3085.
53. Toyooka etal. (2000) Mech. Devel. 93: 139-149.
54. Toyooka et al. (2003) PNAS USA 100: 1145711462.
55. Vallier etal. (2005)7. Cell. Sci. 118: 4495-4509.
56. Xiao et al. (2006) Stem Cells 24: 1476-1486.
57. Xu et al. (2001) Nat. Biotechnol. 19: 971-974.
58. Xu etal. (2002) Nat. Biotechnol. 20. P. 12611264.
59. Xu etal. (2005) Nat. Methods2: 185-190.
60. Ying et al. (2008) Nature 453: 519-523.
61. Zeuthen et al. (1980) Int. J. Cancer 25: 19-32.
62. Zhang et al. (2007) Stem Cells Devel. 16:605-613.
Напечатано с готового оригинал-макета
ООО «МОСПРИНТ» Подписано к печати 09.12.14 г. Формат 148x210. Тираж 100 экз. Заказ № 0294 Тел.: +7 (495) 660 30 44, uno@unopress.ru 117461, г. Москва, ул. Каховка д. 30 www.unopress.ru
-
Гордеева, Ольга Федоровна
-
доктора биологических наук
-
Москва, 2014
-
ВАК 03.03.04
- Получение и характеристика трофобластных стволовых клеток обыкновенных полевок рода Microtus
- Репрограммирование клеток дермальной папиллы волосяного фолликула человека до плюрипотентного состояния
- Активация АТМ/ATR-сигнального пути в эмбриональных стволовых клетках после повреждения ДНК
- Сравнительный анализ плюрипотентных свойств эмбриональных стволовых (ES) клеточных линий мыши in vitro и in vivo
- Сравнительный анализ плюрипотентных свойств эмбриональных стволовых (ES) клеточных линий мыши in vitro и in vivo
