Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Сравнительный анализ плюрипотентных свойств эмбриональных стволовых (ES) клеточных линий мыши in vitro и in vivo

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Сравнительный анализ плюрипотентных свойств эмбриональных стволовых (ES) клеточных линий мыши in vitro и in vivo"

Р V Б Oft

.. »1 - ■( >.

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК МЕДИКА-ГЕНЕТИЧЕСКИЙ НАУЧНЫЙ ЦЕНТР

На правах рукописи

УДК 576.536+576.316. 7+575.16+591.3

МИТАЛИПОВ Шухрат Музапарович

СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ ПЛЮРИПОТЕНТНЫХ СВОЙСТВ ЭМБРИОНАЛЬНЫХ СТВОЛОВЫХ (ES) КЛЕТОЧНЫХ ЛИНИЙ МЫШИ IN VITRO И IN VIVO

03.00.15 - Генетика 03.00.23 - Биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученоЯ степени кандидата биологических наук

Москва - 1994

Работа выполнена в лаборатории генетики развития Медико-генетического научного центра РАМН. Директор - член-корреспондент РАМН, профессор В. И. Иванов.

Научные руководители:

член-корреспондент РАМН, профессор В.И.Иванов кандидат биологических наук Л.М.Федоров

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Л. Ф.Курило кандидат биологических наук Е.С.Платонов

Ведущее учреждение: Институт молекулярной генетики РАН

Защита диссертации состоится " "_ 1994Г

в _ часов на заседании специализированного Ученого Совета

(Д.001.16.01) Медико-генетического научного центра РАМН по адресу: Москва. 115478, ул. Москворечье, д. 1

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Медико-генетического научного центра РАМН.

Автореферат разослан " " _ 1994г

Ученый секретарь Специализированного Совета доктор биологических наук, профессор

Л. Ф. Курило '

.. ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. Быстрое развитие биологии в целом и генетики в частности за последние десятилетия явилось прежде всего результатом разработки новых, современных методов. Получение культуры эмбриональных стволовых (ES) клеток, сохраняющих основные свойства ранних эмбриональных клеток представляет собой аовыЯ иьотрумент для решения различных вопросов генетики, биологии развития. медицине и др.

ES клетки мыши способны дифференцироваться In vitro, при этом симулируя нормальное развитие постимплантационного эмбриона. Таким образов, ES клетки могут служить моделью in vitro для изучения процессов дифференцировки и морфогенеза эмбриона в раннем развитии (Doetschman et al..1985*

Введенные в полость нормальной бластоцисты ES клетки включаются в развитие и могут участвовать в формировании любых органов и тканей химерного организма, включая линию зародышевых клеток. Последнее свойство ES клеток позволяет использовать их в качестве носителей для введения чужеродных генов и получения трансгенных мышей новым, непрямым способом (Gossler et al.,1986: Robertson et al.. 1986a).

Наибольший интерес для исследователей представляет возмоя-ность сайт-специфичного мутагенеза ES клеток посредством механизма гомологичней рекомбинации между вновь введенной ДНК и гомологичным регионом в геноме ES клеток (gene targeting). Модификация уже идентифицированных генов у ES клеток путем гомологичной рекомбинации дает возможность изучить Функции этих генов в процессе развития (DeChlara et al.,1990; DeChlara et al.,1991; Soriano et al.. 1991).

Одним из основных вопросов медицинской генетики является изучение патогенеза наследственных аномалий человека, что является

необходимым условней их успешной профилактики и лечения. Изучение механизмов развития наследственных аномалий у человека крайне затруднено в связи с необходимостью получения достаточного материала ранних стадий развития эмбриона и невозможностью в боль-тинстве случаев проведения экспериментального анализа действия гена. Эффективные методы лечения и профилактики имеются только для относительно небольшого числа болезней, механизмы развития которых известны. В то же время патогенез многих наследственных болезней неясен. Для изучения механизмов развития наследственных болезней могут быть использованы мутантные линии мышей, имеющие сходные с человеком аномалии (Конюхов. 1969). В последнее время придается большое значение поискам таких мутантных линий мышей. Последние могут выступать в роли биологических моделей соответствующих наследственных болезней человека

Использование механизма гомологичной рекомбинации и так называемой "ES клеточной технологии" позволяет направленно индуцировать мутации и получать мутантных мышей с целью моделирования наследственных заболеваний человека (Kuehn et al.,1987; Tybule-wicz et al.,1992). Используя подобный подход можно также корректировать мутантные гены ES клеток, что позволяет исправлять наследственные аномалии животных (Koller et al.,1989). Возможность проведения экспериментов такого рода представляет собой идеальную модельную систему генотерапии. что имеет огромное значение для медицинской генетики.

Несмотря на широкое распространение линий ES клеток и интенсивное их использование в научных экспериментах, остается еще ряд проблем ES клеточной технологии. К ним можно отнести убывающую способность ES клеток формировать химер вшьть до полной утраты этой функции, находящейся в прямой зависимости от длительностй пассив звания культуры. •

Однако публикаций в литературе,- посвященных изучению различных факторов, влияющих на способность ES клеток формировать химе-

ры, а в особенности germ-line химеры крайне мало.

Выход химер после инъекции ES клеток в эмбрионы также зг-исит в значительной степени от генотипа и стадии развития эмбриона-реципиента. Однако, исчерпывающий анализ сочетания донор-реципиент дазе по наиболее распространенным линиям ES клеток и линиям мышей еще не сделан.

Цель и задачи исследований. В соответствии с вышеизложенным, целью работы являлся сравнительный анализ плюрипотентных с^йств э: Зриональных стволовых клеточных линий мыши и изучение влияния генетических v средовых факторов на способность ES клеток формировать химеры после инъекции в эмбрионы.

Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:

- освоить технику культивирования ES клеток и методы получения инъекционных химер с использованием ES клеток и клеток ВКМ.

- охарактеризовать в условиях In vitro и In vivo плюрипотент-ные свойства новой ES клеточной линии STR. полученной от мутант-ной линии мышей 14C0S/G1*;

- изучить влияние длительности пассирования и происходящих при этом кариотипических изменений на способность ES клеток линии D3 формировать химерное потомство;

- изучить влияние генотипа эмбриона-реципиента на способность ES клеток продуцировать генеративные химеры;

- разработать простой и наглядный метод предварительного тестирования плюрипотентности ES клеток In vitro, основанный на специфической активности щелочной фосфатазы ES клеток;

Научная новизна. Впервые охарактеризованы в условиях In vitro и In vivo плврипотентные свойства новой ES клеточной линии STR. Впервые показано влияние длительности пассирования и происходящего при этом увеличения доли анеуплоидных клеток на способность ES клеточной линии D3 формировать холерное потомство. .1редлокен простой метод предварительного тестирования плюрипотентности ES клеток in vitro по специфической активности эндогенной щелочной

- е -

фосфатазы.

. Практическая значимость. Полученные данные о влиянии различных факторов на потенции эмбриональных стволовых клеток ln vivo позволяют более эффективно использовать ES клетки l научных экспериментах и получать с высокой частотой химеры и генеративные химеры.

Экспериментальные данные по изучению плврипотентных свойств ES клеток являются новыми для нашей страны и могут представлять практический интерес в методическом аспекте.

Результаты исследования представляют также медико-генетический интерес и могут послужить первым шагом в создании модельных животных, имеющих сходные с человеком наследственные аномалии.

Апробация диссертации. Основные положения диссертации были представлены на отчетной конференции ГНТП "Приоритетные направления генетики" (Москва. 1993), на V научной конференции по генетике соматических клеток в культуре (Черноголовка. 1993). на 4-ой конференции "Геном человека" (Черноголовка. 1994). на научном семинаре лаборатории генетики развития МГНЦ РАМН в марте 1994 года, на научной конференции отдела биотехнологии ВНИИ животноводства РАСХН в апреле 1994 года и на научном семинаре института генетики человека МГНЦ РАМН, состоявшемся в мае 1994 года.

Публикации. По материалам диссертации опубликованы 2 экспериментальные научные статьи. 3 тезиса.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 114 страницах машинописного текста, состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материал и методы, результаты, обсуждение, выводы, список литературы. Указатель литературы содержит 13 отечественных и 135 иностранных библиографических источника. Диссертация иллюстрирована 2 схемами, 12 таблицами, 4 рисунками и 10 фотографиями.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

Работа выполнена по плану НИР лаборатории генетики развития

НГНЦ РАМН в рамках ГНТП "Приоритетные направления генетики" и "Геном человека" (гранты Н06-г93 и N482). На рисунке 1 представлена комплексная схема проведения экспериментов, в результате которых были получены данные по характеристике ES клеток In vitro, их кариологии и способности формировать химеры.

1. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

ES клетки. Два клопа~D3M и D3W ES клеточной линии D3 Ujets-c:.nan et al., 1985) любезно предоставлены соответственно Dr .'G. Brem из ушгверситрта Людвига Максимилиана (Мюнхен, Германия) и Dr.R.Kemler из института иммунобиологии Общества Макса Планка (Фрайбург, Германия). ES-D3 клетки являются муиской линией и получены из бластоцисты мышей линии 129/Тег Sv (окрас агути).

Линия ES клеток STR предоставлена к.б.н. Н.С.Стрельченко (Institut fur Tierzucht und Tierverhalten. Марнснзее, Германия). ES-STR клетки получены из бластоцисты мышей линии 14C0S/G1W. ■ В гомозиготном состоянии (с1400', /сМС08 , мутация albino letale) иш погабазт вскоре после ровдения. Гомозиготы дефицитны по крайней мере по пяти печеночным ферментам: глюкозо-6-фосфатазе, ■пфозш! окшотрансферазе. серин дегидратазе. глютампн синтетазе, Шр-гяггсорошшрансферазе, а таксе характеризуются низким уровнем .печеночного шкросокального цитохрома Р-450 и белков плазмы: альбумина. альфа-фзтопротеина и трансферрина (Green.1981).

Культивирование ES клеток проводили в среде D!îEH. содержащей 15% эмбриональной телячьей сыворотки. 0.1 шМ 2-меркаптоэтанола и 1шМ L-глютамина. . В качестве питающего (фидерного) слоя для ES клеток использовали первичную культуру эмбриональных фиброблас-тов, пролиферация которых была блокирована митомицином С (10 мкг/мл).

Цитохимический тест на специфическую активность шели ¡ной Фос-■ Фатазы ES клеток. ES клетки высевали на покровные стекла с блокированным слоем фидерных клеток. Через сутки клетки фиксировали

СХЕМА ЭКСПЕРИМЕНТА 129/^

гС/т,*

изоляция ЕКЛ блестоцасты

трофектодерка

внутренняя клеточная масса ( ЬКЫ )

Е5-клетьи в культуре

инъекция бластоцист

трансплантация 1

ложнобеременной О — сакке - '

даяференцеровка Е$ -клеток

караотипический анализ К-кдеток

вазэктокировакны! ^ самец

химерное потомство

трансмиссия Рас. I.

охладденным ацетоном (+4° С) в течение 1 мин, затем инкубировали в свежеприготовленном растворе красителя прочный синий ВВ и субстрата AS-BI фосфат в течение 1 часа при 37° С. Раствор красителя и субстрата готовили согласно методике изложенной Лойдом (Лойда и др. 1982).

Препараты метафазных пластинок ES клеток готовили согласно методике, изложенной Робертсон (Robertson 1987);

Получение химерных мышей. Эмбрионы на стадии бластоцисти изв-л^/али из рогов матки самок линий C57BL/6, BALB/c и тетрагибридов CBWA на 3,5 сучи после обнаружения вагинальных пробок.

ES клетки на 2-е сутки после пересева диссоциировали до одноклеточной суспензии, используя раствор трипсин-EDTA и удаляли фидерные клетки. Суспензию ES клеток и эмбрионы переносили в камеру с каплей среды М2 (Hogan et al.,1986), покрытую силиконовым маслом и смонтированную на предметный столик инвертированного микроскопа (Mlkon). 10-15 (либо 35-40) клеток инъецировали в полость бластоцисты. используя инъекционную и придерживающую пипетки соединенные с микроманипуляторами (Narlshlge). как описано нами ранее (Миталипов и др.1993).

После 1-2 часов культивирования в среде М2 при 37° С. прооперированные бластоцисты трансплантировали в матку ложнобеременных самок CBWA. Идентификацию химер проводили визуально, по окрасу шерстного покрова.

В возрасте 8-10 недель химерных мышей скрещивали для выявления животных способных передавать ES генотип потомству. Химер D3-*C57BL/6 подсаживали к мышам линии C57BL/6. Мыши линии 129/Sv (ES-D3) имеют гены окраски шерсти А"А".ВВ.СС. а мыши C57BL/6 -аа.ВВ.СС. Наличие в потомстве мышей с окрасом агути свидетельствует о передаче химерной мышью генотипа ES клеток.

Химер D3-»-BALB/c и D3-»-CBWA -крещивали с мь^-ли AHR-(аа.ЬЬ, сс).

Статистическая обработка результатов. Полученные данные обра-.

батывали при помощи статистических методов, используя критерий X? и.критерий качественных различий, рассчитанный точным методом Фишера.

2. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Тестирование на плюрипотентность ES клеток р систре In vitro Как указывалось выше ES клетки линий STR и D3 культивировались на монослое блокированных митомицином С эмбриональных фибробластов мыши. ES-STR и ES-D3 клетки имели морфологию, характерную для ES клеток, культивируемых на фидерном слое. Колонии ES клеток становились хорошо видимыми на 2-е сутки после пересева.

Клетки STR имели меньшую по сравнению с D3 скорость роста и пересевались с интервалом 3-е суток в соотношении 1:3. Клетки D3 пересевались на 2-е сутки в соотношении 1:5 или 1:7.

Одной из важных характеристик ES клеток является их способность дифференцироваться in vitro в различные типы клеток при культивировании без фидерного слоя. При суспензионной культивировании ES клеток наблюдали образование эмбриоидных тел различное сложности.

Известно, что плюрипотентные клетки эмбриобласта бластоцисты, эпибласта 5-6-дневного эмбриона, первичные половые клетки, линии стволовых клеток тератокарцином и ES клетки обладают высокой активностью эндогенной щелочной фосфатазы (ALP) (Wobua et al.,1984; Дыбан. 1988). Специфическая активность ALP ранних эмбриональных клеток, по мнению Wobus с соавторами (1984). может рассматриваться как биохимический маркер плюрипотентности стволовых клеток. Авторы в этих работах ввделяли клеточные экс.ракты и проводили количественную оценку активности ALP флюориметрическим методом.* При эрм было показано; что активность ALP ранних эмбриональных клеток более чем в 10 раз превосходит таковую у дифференцированных клеток. Однако использовать данный метод выявления ALP в ка-

честве теста на плюрипотентность ES клеток In vitro не представляется возмовным из-за слоаности. Поэтому мы поставили переп собой задачу разработать простой, но вместе с тем достаточно наглядный метод тестирования, основанный на качественной оценке активности ALP ES клеток.

Цитохимическим окрашиванием нами впервые выявлена специфическая активность щелочной фосфатазы ES клеток, которая падает в процессе дифференцировки. ~ Представленные результаты цитохк [чес-к го окрашивания ES клеток и безуспешна попытки окрашивания других культур дифференцированных клеток убездают, что данный метод üosoT служить достаточно наглядны:! и простым тестом на плюрипотентность ES клеток In vitro.

Результата кариотипичрокогр анализа ES клеток. Для выявления карнотипических изменений ES клеток, прошедших различное число гассажей с момента введения в культуру (STR), либо с момента зубклонирования (D3W. D3M). проведен кариотапический анализ дзух слонов ES клоточной линии D3 у линии STR. Отбор кетафазных плас-гсшок, пригодных для подсчета числа хромосом, проводили по критэ-)ияи, прздлоеешип Н. П. Бочковым с соавторами (1972). Было иссле-;овано по 50 кетафазных пластинок каадого образца. Распределение мела хромосом по классам показано в таблице 1.

Как видно из таблицы, с увеличением числа пассагеЯ ES-D3 клеш, меняется и распределение числа хромосом в сторону увеличения" олп клзток с анеуплоиднын набором. У клона D3M, проведшего 42 accasa с момента субклонирования, только 58% клеток имели нор-альнДО эуплоидный (2п - 40) набор хромосом, в то время как у лона D3W (17-й пассаа) 82% клеток имели нормальное число хромо-ом.

У линии ES клеток STR; прошедших к моменту анализа более 20 ассажей, модальный класс хромосом был 39 (6656). Попытки субкло-ировать линию STR. для того чтобы отселектировать и размножить пвтки с нормальным эуплоидным набором хромосом оказались безус-?

Таблица 1

Распределение метафазных пластинок с различным числом осмосом по классам

Линия I Пол I Число I Модальный I Распределение по классам ЕБ клеток I | пассажей! класс (X) I 35|36I37I38139140I41I42<

1Ш ХУ 17 40 (82Х) 3 О 1 3 1. 41 1

БЗМ ХУ 42 40 (5835) 4 2 3 1 4 29 34

5ТЯ ? 20-24 39 (66%) 3 3 1 2 33 2 3 3

пешными. Очевидно утеря хромосомы произошла еще на ранних пассажах клеток БТЯ при изоляции.

Изучение потенций клеток БТР! в системе 1п у!уо. С целы» изучения способности клеток линии БТЙ генерировать химер, нами впервые был проведен эксперимент по инъекции ЕЗ-БТИ клеток в бласто-цисты с последующей трансплантацией их в матку ложнобеременных

Таблица 2.

Сравнительный анализ способности ЕБ клеток БТИ и DЗW продуцировать химер

Линия I Линия |Трансп-| Число I из них дали I Роди- I из них ЕЗ 1 6ласто-|планти-| реципи- I потомство I лось I химер клеток) цист |ровано ( ентов I I мышат I

БТЕ С57В1У6 132 14 5 18 О

БЗИ С57В1У6 91 8 6 29 14

самок. В параллельном эксперименте в качестве контроля использовалась линия ES-D3. Результаты эксперимента суммированы в тр^лицэ 2. Все 18 мышат, родившеся после трансплантации бластоцист STR-*-C57BL/6 оказались черными по окрасу, что соответствует линии C57BL/6. Следует отметить, что у 10 самок-реципиентов (из 14) методом пальпации была обнаружена беременность на 8-9-й день посла операции. В последующие дни у 2-х реципиентов наблюдали спонтанный аборт, а у 3-х резорбцию плодов. И только у 5-ти рецип. жтов э-"Зрионы благополучно развились до роадения.

Из 29 мышей, родившихся,в параллельном эксперименте с ES-D3W клетками. 14 оказались химерными. Соотношение участков шерсти о агути и черной окраской было различным у химер и варьировало от 20 до 90% йгути окраски.

В связи с тем, что линия STR оказалась неспособной формировать химер, исследования были проложены на клетках D3.

Сравнительный анализ способности клонов D3W и D3H генерировать химер. С целью изучение потенций ln vivo двух клонов ES-D3 клеток D3W и D3M. прошедсих различное число пассагеП с момента субклонирования проведен эксперимент по получению химерных мышей.

В таблице 1 показано, что хотя модальный класс хромосом у обоих клонов составляет 40, тем не менее они существенно различаются по дола эуплоидных клеток.

■ В таблице 3 показаны результаты этого эксперимента. В качест-D9 реципиентных при инъекции были использованы бластоцисты линий C57BL/6, BALB/c и тетрагибридов CBWA. Данные таблицы свидетельствуют, что клон D3VÍ, более раннего пассажа, статистически достоверно превосходит клон D3M как по числу химер среди потомства (43 и 93555 соответственно. Р<0,02), так и по процентному содержанию окраса агути (компонент ES-D3 клеток) в шерстном-покрове химер (10-90** и 5-4055* соответственно. Р* 0,022).

Снижение потенций к развитию ES клеток при длительном культивировании кокно объяснить двояко. Первое предположение исходит из

того, что ES клетки не способны полностью сохранять плюрипотент-ныЯ статус при последующих делениях. Каждое новое поколение ES клеток частично теряет шаг шотентность по сравнению. с предыдущим. И через определенное число клеточных делений ES клетки полностью теряют свои качества стволовых клеток.

Таблица 3

Частота формирования химер клоками D3W и D3M

Клон Число Линия Транс- Родилось из них % агути в

пасса- бласто планти- мышей химер верстном покрове

жей цисты ровано (35) <*> .

C57BL/6 51 29 14 90,80.3X70.2X60.

3X50.40.2X30.20

D3W 17 BALB/c 43 И 4 50.2X40.20

CBWA 32 13 5 70.60.30.2X10*«

Итого 126«*» 53(42Х) 23(4335)*

C57BL/6 31 9 0

D3M '42 BALB/C 55 24 5 40.30.20.10.5

CBWA 28 И 4 50.40.10.5**

Итого 114*»« 44(3935) 9(2035)*

* Р(Хг) < 0.02 Ртнв " °'022

Примечание: PtH6 рассчитан по разнице частоты встречаемости химер. полученных от 2-х клонов ES-D3 клеток, с содержанием окраса агути в шерстном покрове 5055 и более.

»*» В учет брали только те эмбрионы, после трансплантации которых самка становилась беременной и рожала живое потомство.

Второе предположение заключается в той. что определенная пропорция клеток из всего мяссива способна полностью передавать статус стволовых клеток при каждом последующем делении дочерним клеткам. Остальная часть клеток не способна полностью копировать свои плюрипотентные качества и формирует популяцию клеток с частично делегированными стволовыми качествами. Эта популяция ES клеток может иметь селективные преимущества перед истинно стволовыми клетками и через определенное число пассажей полностью вытеснить их.

Справедливость второго предположения подтверждается экспериментальными данными, в которых показана возможность восстановления первоначальных плюрипотентных свойств ES клеток путем периодического субклонирования (Hagy et al.,1993; Giles et al.,1992).

Снижение потенций к развитию ES клеток при длительном культивировании нельзя объяснить только "видимыми" кариотипическими изменениями. Hagy с соавтор'ми (1993) наблюдали лишь незначительное снижение доли эуплоидных клеток о 11-го по 33-й пассаж, в то вре-ия как способность формировать химерное потомство при агрегации с тетраплозщшми эмбрионами была утрачена полностью.

Верслтно. наряду с изменениями хромосомного набора происходят такие субмикроскопические хромосомные перестройки и генные мутации. Нельзя исключить аккумулирование эпигенетических изменений в ES клетках. Еырагаюгздеся в изменении процессов метилирования и гаотрзштинга ДНК.

На способность ES клеток участвовать в формировании химерного организма послэ реинтродукции в бластоцисту в немалой степени влияет генотип последнего. В таблице 4 проанализированы результаты экспериментов с целью выявления наилучией сочетаемости ES-D3 клеток с линиями мышей C57BL/6, BALB/c н тетрагибрядаыи США. Наилучшие результаты были получены при сочетании D3-C57BL/6 и D3-CBWA.

Таблица 4

Влг-ше- генотипа бластоцисты-реципиента на формирование химер с ES-D3 клетками

Бластоциста Трансплан- Родилось из них химер- 55 агути в -реципиент тировано потомства химер самцов шерстном бластоцист покрове

82 38(46$) 14(37%) 8 90.80.70.70.70

60.60.50.50,50 40.30.30.20

98 35(363) 9(25.7*) 6 50.40.40,40,30

20.20.10,5

60 24(40%) 9(37.5%) 6 70.60.50.40.30

_ 40.10.10.5

Итого 240 97 (40%) 32(33%) 20

Необходимо отметить, что используя критерий X2. мы не обнаружили статистически достоверных различий в частоте ровдения хдегер при сочетании ES-D3 клеток с мышами C57BL/6. ВА'-В/с и CBWA на основе имеющегося материала. Для более объективного суждения о влиянии генотипа бластоцисты-реципиента на частоту формирования химер с ES клетками необходимо продолжить эксперименты. Однако, необходимо отметить, что генеративная химера была выявлена только в группе химер D3-*-C57BL/6. Сочетание D3 (129/Sv) с тетрагибридаин CBWA не дало генеративных химер, хотя степень химеризма тестированных самцов была достаточно высокой (табл.7).

Влияние числа инъецированных ES клеток и стадии развитая экб-риона-реиипиецте да частоту получения химер. Помимо генетических факторов, влияющих на способность ES клеток давать химер сущест-

C57BL/6

BALB/C CBWA

в уют и другие. Мы провели эксперимент по изучения влияния числа инъецированных ЕЗ клеточ в бластоцисту на эффективность продуцирования и степень химеризма у потомства.

Таблица 5

Частота формирования химер при инъекции различного числа ЕБ клеток в бластоцисту

Линия I Линия -I Число I Число I Родилось I из них

ЕБ клеток|бластоцисты1проопериро-|инъециро-| мышей I химер

1 I ванных I ванных I (%) I (%>

I I бластоцист! клеток I I

D3W США 67 10-15 13 (19.4Х) 5 (38,535)

D3W CBWA "3 35-40 7 (8.1%) 1 (14. IX)

Оптимальным числом ES клеток, инъецируемых в бластоцисту считается 10-15. По экспериментальным данным Robertson и Bindley (1986) при инъекции 3-5 ES клеток в бластоцисту только 28.9Х потомства оказалось химерным. Во второй серии эксперимента при инъекции 10-15 ES клеток 54.8% потомства были химерна«. Логично было предположить, что дальнейшее увеличение чнсяа Енъецнруешх клеток также увеличит частоту химер в патонстгз.

По результатам наших экспериментов (тайп. 5). звеяячеиие числа инъецируемых клеток до 35-40 отрицательно отразилось на пркшвля-еиости трансплантированных эмбрвоаоа (3.13). ЕданстввшыЗ родившийся химерный мышонок лишь на £03 состоял та ES яошоневта. Не наблюдалось такае овдаеиаго угалзкеная степени лтгерлзка.

Ряд публикаций. появжзЕеа сравнительно -кедавво iüssy et al., 1990; lalletnanä & Eralet. 1990) позволяют сделать вывод, что

степень химеризма в значительной мере зависит от стадии развития эмбрион-. Lallemand и Brulet (1990) сравнили степень колонизации ES клетками у 8,5-дневных плодов, полученных после инъекции ES клеток в бластоцисты и морулы. В геном ES клеток предварительно был введен маркерный ген lac-Z. Используя X-gal окрашивание, довольно точно можно было выявить степень участия ES клеток в формировании различных тканей химерного плода. Анализ показал, что степень колонизации ES клеток после инъекции их в морулы значительно выше по сравнению с инъекцией в бластоцисты. Большая часть ES клеток в последнем случае была выявлена в производных трофэк-тодермы и экстраэмбриональной энтодермы. Однако авторы ограничились лишь исследованием 8-10-дневных эмбрионов, не сообщая о рождении живого потомства.

Мы инъецировали ES клетки в поздние морулы на 16-32-клеточной стадии . в которых еще нет полости. Эмбрионы на.,атой стадии (3-й день после обнаружения пробок), проходят место соединения яйцевода с маткой. Поэтому мы промывали не только яйцеводы, но и оба рога матки. Наиболее подходящей для этого эксперимента оказалась линия мышей BALB/c. так как на ранних стадиях эмбрионы у этой линии мышей развиваются более медленно. по сравнению с C57BL/8 и CBWA. После извлечения утром на 3-й сутки (день обнаружения пробок - 0) до 80% эмбрионов находились на стадии поздней (компактной) морулы.

Процедура инъекции была сходной с инъекцией в бластоцисту. за исключением того, что клетки инъецировались не в бластоцель. а в пространство между бластомерами в центр морулы^ Прооперированные эмбрионы трансплантировались в тот же день в матку ложнобереквн-ных самок на 2.5 сутки после обнаружения пробок. Из результатов представленных в таблице 6. видно, что ни одна самка с трансплантированными морулами не стала беременной. Причинами неудачи могут быть две: 1) сильное повреждение эмбрионов при инъекции клеток в центр морулы: 2) несоответствие отадии развития эмбрионов и матки

. - 19 -

ложно'беременных санок (2,5 дня после обнаружения пробок) при трансплантации. В контрольной группе, после инъекции 10-15 клеток в ' полость бластоцисты, родились И мышат, среди которых 4 были химерными по окрасу шерсти.

Таблица 6

Частота формирования химер при инъекции ЕБ клеток в эмбрионы на различной стадии развития

Линия 1 Es клеток 1 1 1 линия шзей 1 Стадия 1 1 развитая 1 1 эмбрионов 1 1 1 Число 1 проопери- 1 ванных 1 эмбрионов 1 1 Родилось 1 мышей 1 (35) 1 1 из них 1 химер 1 (35) 1

D2V/ . (опыт) BALB/c поздняя »«орула 62 0 0

D3W (контроль) BALB/c бластоциста 51 11(22%) 4(3635)

Аттализ химерных мышей на способность передавать генотип ¿5 клеток потомству. 18 из 33 родившихся в экспериментах химер, достигших половозр.елости, были использованы для скрещивания с целью выявления germ-llne хкмер. Из них 13 были самцами и 5 фенотапи-чески нормальными самками.. Химер D3-«-C57BL/6 скрещивали с мышами линии C57BL/S, a D3—BALB/c и D3—CBWA с мышами линии AKR. Рождение в потомстве мышат с окрасом агути свидетельствует о передаче химерами генотипа ES клеток. Результаты суммированы в таблице 7.

Как видно из таблицы один химерный самец D3-C57BL/6 (N 40893-4) дал в потомстве 3 мышат с окрасом агути. . ¿ичем 5 других из его потомства были черными, что свидетельствует о химеризме в

популяции половых клеток.

Таблица 7

Результаты скрещивания химер для выявления 8егга-11пе трансмиссии

Номер 1 Генотип 1 Пол 1 % агути 1 1 Число | 1 Родилось 1 из

химеры 1 1 |в шерстном! пометов 1 1 мышей 1 них

1 1 1 1 1 покрове 1 1 1 1 1 1 1 1 1 агути 1

10493-1 БЗ-С57ВЬ/6 ¥ 70 1 5 0

20493-1 03-С57ВЬ/6 V 40 3 13 0

100893-7 БЗ-С57ВЬ/6 $ 80 1 1 0

110893-7 03-С57ВЬ/6 а" 50 3 8 0

120893-7. 03-С57ВЬ/6 V 50 2 5 0

130893-7 БЗ-С57ВЬ/6 % 30 0 0 0

30893-2 БЗ-С57ВЬ/6 % 60 0 0 0

40893-4 БЗ-С57ВЬ/6 о" 70 2 8 3

50893-5 ЮЗ-СВИА о" 60 4 23 0

70893-5 D3-CBWA о* 10 3 21 0

60893-5 D3-CBWA а" 30 0 0 0

80893-5 D3-CBWA V 5 0 0 0

90893-5 03-СВ1»А V 40 •2 8 0

160993-24 БЗ-ВАЬВ/с Я 30 3 15 0

150993-24 ОЗ-ВАЬВ/С V 10 1 3 0

170893-11 БЗ-ВАЬВ/С о< 40 . 1 2 0

180893-11 ОЗ-ВАЬВ/С . о"*" 30 0 0 0

190893-11 ОЗ-ВАЬВ/С о* 50 2 7 0

При использовании мужских ЕБ клеток обычно наблвдается смеще-

нив соотношения полов химерного потомства от нормального (50:50) в сторону увеличения доли самцов. Это объясняется тем. тго часть химер XY-»-XX развиваются в фенотипических самцов, так как Y хромосома у млекопитающих ответственна за детерминацию пола. Поэтому обычным бывает соотношение 70% самцов и 3035 самок (Robertson & Bradley. 1986). В наших экспериментах 62% химер были самцами.

Как правило, в фенотипических самок развиваются половые мозаики XY-—XX лишь с незначительным участием ES клеток (XY компонент) . Однако бывают пока еще труднообъяснимые исключения. В наших экспериментах три химеры ИМ 30893-2 (60%). 10493-1 (70%) и 100893-7 (80S) оказались фенотипически самками о высокой долей участия ES клеток (табл. 7). причем две последние из них были фер-тилышми. хотя и не было зарегистрировано рождения агути потомства. Этот Факт можно объяснить тем. что на ранних этапах эмбрионального развития у этих животных произовла полная или частичная утеря Y хромосош.

Большинство экспериментаторов ка тестируют хииерных самок на germ-line трансмиссию. Однако имеется ряд публикаций, сообщающих о выявлении химерных самок, способных передавать генотип мужских ES клеток (Sarai et al..l991; Pledrahlta et al..l992: Moot .erts et al.. 1992).

По всей видимости, первичные половые клетки с мужским карио-типоы XY проходят нормальный оогенез в яичниках химерной самки. Такие самки дают два тала гамет X н Y. Экспериментально это было показано ранее у агрегацпонных мозаичных по полу химерных самок (Evans et al..1977). Поэтому ны тестировали наряду с самцами также и химерных самок, которые, к сожалению. • не дали потомства с окрасом агути.

Довольно часто генеративные (germ-line) химеры дают смешанное потомство, причем доля потомства, несувдх генотип ES клеток (агути). может быть очень низкой, от 0.3 до 3% (Roberlзоп. Bradley. 1986). Низкий выход генеративных (germ-line) химер в наших экспе-

риментах поэтому можно объяснить небольшим числом полученного потомстве недостаточного для более объективного суждения о germ-llne трансмиссии.

ВЫВОДЫ

1. Впервые охарактеризована новая ES клеточная линия STR. Плврипотентность ES-STR клеток подтверждена в условиях in vitro тестом на специфическую активность щелочной фосфатазы и способностью образовывать эмбриоидные тела. Основная популяция клеток STR (66%) на момент анализа (20-22-й пассаж) имела анеуплоидный набор хромосом (Мг0-39). Наличие анеуплоидии явилось причиной неспособности клеток STR формировать химерных животных, несмотря на плюрипотентность этих клеток в системе In vitro.

2. Проведен сравнительный анализ двух клонощ. ES-D3 клеток: D3W (17-й пассаж) и D3M (42-й пассаж).. Установлено, что клон D3V7 содержит, значительно большую долю клеток с нормалыш кариотипом М-40 (62%), по сравнению с клоном D3M М-40 (58%).

3. Используя методы оценки lh vitro (способность образовывать эмбриоидные тела, высокая активность щелочной фосфатазы) не удалось выявить каких либо различий в плюрипотентных свойствах ре-ток этих клонов.

4. Изучение потенций In vivo, путем инъекции ES клеток в бластоцисты показало, что клетки D3W (по сравнению с клзтками D3M) обладают большей способностью колонизовать ткани химерных животных, что подтверждено относительно большим количеством химер среди потомства и большим процентным содержанием клеток D3W в тканях химерных животных. В одном случае клетки D3W участвовали в закладке первичных половых клеток, сперматогенезе химеры и дали потомство. Снижение плюрипотентных свойств клеток клона D3M. вероятно, связано с кариотипическими изменениями в течение длительного культивирования.

5. Выявлено, что лучшей комбинацией ES-D3 клеток при получении генеративных химер является сочетание о Оластоцистами мышей C57BL/6 по сравнению о BALB/c и CBWA.

6. Разработан простой метод предварительного тестирования плюрипотентностн ES клеток, основанный на цитохимическом выявлении высокой активности щелочной фосфатазы. Показана корреляция между выявленной данным методом плюрипотентностью ES клеток In vitro и способностью формировать химерное потомство In vivo.

ПОЛОЖЕНИЯ ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ

1. Проведено тестирование плюрипотентных свойств In vitro и In vivo новой ES клеточной линии STR. Основная популяция клеток STR на момент анализа имела анеуплоидный набор хромосом, что явилось причиной неспособности формировать химерное потомство.

2. Установлено, что при длительном культивировании в ES-D3 клетках происходят кариотипические изменения, выраяающиеся в увеличении доли анеуплоидных клеток. При этом наблюдалось также сни-звние потенций ES-D3 клеток in vivo.

5. Разработан простой метод предварительного тестирования плюрипотентностн ES клеток, основанный на цитохимическом выявлении высокой активности щелочной фосфатазы. Показана корреляция мевду выявленной данным методом плюрипотентностью ES клеток in vitro и способностью формировать химерное потомство in vivo.

СПИСОК РАБОТ. ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Ниталипов Ш.И. .Федоров Л.М.. Стрельченко Н.С. Анализ химерных мышей, полученных путем инъекции клеток внутренней клеточной массы в бластоцисту. // Онтогенез.1993.Т.24.N5. С. 5-10.

2. Миталипов Ш.М..Федоров Л. М.. Стрельченко Н.С Инъекционные химеры. // Тез. докл.3-й конференции "Геном человека". 10-12 мар-

та 1993 г.Черноголовка. С. 86.

3. Миталипов Ш. К.. Ииталипова И. И., Федоров Л. И. Изучение плю-рипотентных свойств эмбриональных стволовых клеток мыши In vitro и In vivo. // Тез. докл. 5-ой конференции по генетике соматических клеток в культуре. 22-24 ноября 1993г. Черноголовка. С.42.

4. Неверова М. Е.. Петрова Т. В.. Мамаева Т. В., Миталипов Ш.М..Ииталипова М.М..Иванов В.И..Калинин В.Н. Разработка модельной системы генотерапии на основе синтетического "гена" биологически активного пептида брадикинина. // Тез. докл. 4-ой конференции "Геном человека - 94*. 9-11 карта 1994г. С. 64.

5. Миталипов Ш. М.. Ииталипова Ы. М.. Иванов В. И. Влияние длительности культивирования на плюрипотентность эмбриональных стволовых (ES) клеток мыши in vitro и in vivo. // Онтогенез. 1994. Т.25.Н6.