Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние нитрита натрия на адаптивные реакции лейкоцитов крови

ВАК РФ 03.03.01, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Влияние нитрита натрия на адаптивные реакции лейкоцитов крови"

Петенкова Анастасия Андреевна

ВЛИЯНИЕ НИТРИТА НАТРИЯ НА АДАПТИВНЫЕ РЕАКЦИИ ЛЕЙКОЦИТОВ КРОВИ

03.03.01 - «Физиология»

1 г ДЕК 2013

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург 2013

005543488

005543488

Работа выполнена на кафедре общей физиологии ФГБОУ ВПО «Санкт-Петербургский государственный университет».

Научный руководитель —

доктор биологических наук, академик РАН Ноздрачев Александр Данилович.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Кветная Татьяна Викторовна

Санкт-Петербургский Институт биорегуляции и геронтологии СЗО РАМН;

Ведущая организация - Федеральное государственное бюджетное военное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Военно-медицинская академия имени С. М. Кирова» Министерства обороны Российской Федерации (г. Санкт-Петербург).

Защита состоится 26 декабря 2013 г. в 16.00 час. на заседании Диссертационного совета Д 212.232.10 при ФГБОУ ВПО «Санкт-Петербургский государственный университет» (СПбГУ) по адресу: 199034, Санкт-Петербург, Университетская наб., д. 7/9, ауд. 90.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке им. A.M. Горького

доктор биологических наук, профессор

Полякова Виктория Олеговна

ФГБУ «НИИАГ им. Д.О.Отта» СЗО РАМН.

ФГБОУ ВПО «СПбГУ».

Автореферат разослан 2013

г.

Ученый секретарь Диссертационного совета, доктор биологических наук, профессор

Е.Е. Ляксо

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы. Экзогенные нитриты и нитраты, поступающие в организм человека, являются источниками оксида азота (N0). В течение последних трех десятилетий большое внимание уделялось данной молекуле, ее участию в клеточном сигналинге и биологическим эффектам, в то время как доноры оксида азота, считающиеся инертными или токсичными веществами, оставались в стороне.

N0 является высокореакционной молекулой, что обуславливает его полифункциональность и низкую продолжительность жизни. На сегодняшний день сложилась концепция о том, что анион нитрита (N02 ) является важной молекулой для хранения и доставки к клеткам крови и в разные ткани организма N0 в легко доступной форме, в частности, в ткани сердца (Calvert, Lefer, 2009). В последние годы на различных моделях проводится все больше исследований, связанных с изучением защитной функции этого аниона в условиях ишемических повреждений органов и систем. Доказано, что нитрит оказывает мощное цитопротекторное действие при локальной ишемии/реперфузии сердца (Gonzalez et al., 2008; Doganci et al., 2012), печени (Lang et a!., 2007; Li et al., 2012), головного мозга (Jung et al., 2006) и почек (Kelpke et al., 2012). Появляются работы, показывающие участие самих нитритов в клеточном сигналинге, где мишенями анионов могут выступать в качестве регуляторов клеточного гомеостазиса митохондрии (Shiva, 2010). Несмотря на такое усиленное внимание ученых механизмы влияния нитритов на клеточный иммунитет и адаптивные функции лейкоцитов остаются малоизученными.

В связи с этим целью исследования явилось изучение механизмов влияния нитрита натрия на функциональную активность различных популяций лейкоцитов крови. В рамках исследования поставлены следующие задачи:

1. Оценка влияния различных концентраций нитрита натрия (NaN02) на двигательную активность лейкоцитов, продукцию ими провоспалительных цитокинов и их миграцию в тканевые препараты сердца.

2. Изучение влияния NaNC>2 на базальную и индуцированную цитокин-продуцирующую активность лимфоцитов, а также на микробицидную активность нейтрофилов in vitro.

3. Анализ изменений содержания метаболитов оксида азота в инкубационной среде и в плазме крови на фоне аппликаций и инъекций NaN02.

4. Оценка в динамике нитритной интоксикации миграции нейтрофилов по уровню активности миелопероксидазы (МПО) в тканях сердца, головного мозга, печени с одновременным определением содержания в плазме крови ИЛ-10, ИНФ-у и ФНО-а.

5. Исследование особенностей влияния нитритной интоксикации на миграцию нейтрофилов в ткани сердца, головного мозга, печени и на содержание в плазме крови метаболитов N0, ИЛ-10, ИНФ-у и ФНО-а при стимуляции иммунной системы тимогеном.

Научная новизна работы. В результате проведенных экспериментальных исследований получены новые данные об особенностях влияния нитрита натрия на спонтанную и индуцированную митогенами и нейромедиаторами подвижность клеток крови в условиях in vitro. Впервые изучена зависимость функциональной активности и миграции различных популяций лейкоцитов от уровня содержания в инкубационной среде метаболитов NO. Впервые исследовано влияние нитрита натрия на миграцию отдельных популяций лейкоцитов в ткани в условиях целостного организма в нормальных условиях и при стимуляции иммунной системы тимогеном.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. In vitro NaN02 дозозависимо уменьшает двигательную активность лейкоцитов крови, ослабляет стимулирующее действие норадреналина на продукцию клетками провоспалительных цитокинов и уменьшает в ранние сроки инкубации миграцию лимфоцитов из эксплантатов тканей левого желудочка сердца.

2. NaN02 ослабляет индуцируемую липополисахаридом продукцию

провоспалительных цитокинов В-лимфоцитами и активирует НАДФН-оксидазную систему нейтрофилов.

3. Наибольшее содержание метаболитов N0 в плазме крови наблюдается в первые 30 мин нитритной интоксикации. Нитрит натрия стимулирует продукцию N0 переживающей тканью левого желудочка сердца интенсивнее и быстрее, чем тканью правого желудочка.

4. В ранние сроки после введения №N02 происходит усиление миграции нейтрофилов в ткани головного мозга и правого желудочка сердца с одновременным увеличением содержания ФНО-а и снижением ИНФ-у в плазме крови.

5. При предварительной стимуляции иммунной системы тимогеном нитритная интоксикация в более поздние сроки сопровождается ускорением метаболизма N0, ослаблением миграции нейтрофилов в ткани головного мозга и правого желудочка сердца и уменьшением содержания в плазме крови ИЛ-10.

Теоретическое и практическое значение работы. Проведенные исследования расширяют существующие представления о влиянии метаболитов оксида азота на функциональную активность различных популяций лейкоцитов крови. Впервые установлено, что присутствие низких концентраций нитрита натрия не изменяет способность Т-лимфоцитов продуцировать провоспалительные цитокины в ответ на митогены конканавалин А и фитогемагглютинин. №КЮ2 угнетает двигательную активность лейкоцитов и их чувствительность к регуляторным влияниям катехоламинов и липополисахарида. Выявленный феномен, что нитрит натрия уменьшает миграцию лимфоцитов из эксплантатов тканей левого желудочка сердца, может служить стимулом для дальнейшего исследования иммунной системы самого сердца. Использование в качестве инкубационной среды аутологичной плазмы крови весьма удобно для поддержания жизнедеятельности клеток сердца при их длительном культивировании. Проведение экспериментов на переживающей ткани сердца является перспективной моделью для изучения миграции лейкоцитов и ее роли в регуляции деятельности кардиомиоцитов.

5

Обнаруженное увеличение активности МПО в тканях мозга и правого желудочка сердца в ранние сроки нитритной интоксикации представляет практический интерес для фармакологов и кардиологов, использующих нитраты для коррекции деятельности сердечно-сосудистой системы.

Апробация работы. Основные положения диссертации доложены и обсуждены на: Multidisciplinary International Conference of Biological Psychiatry «Stress and Behavior» (St.Peterburg, 2007), Международной конференции по иммунологии «Физиология и патология иммунной системы» (Москва, 2008), Всероссийской конференции с международным участием «Механизмы адаптации физиологических систем организма к факторам среды», посвященной 85-летию со дня основания Института физиологии им. И.П. Павлова РАН (Санкт-Петербург, 2010), III Съезде физиологов СНГ (Ялта, 2011), XVI International Congress on Rehabilitation in Medicine and Immunorehabilitation (Paris, 2011), Всероссийской конференции с международным участием, посвященной 220-летию со дня рождения академика K.M. Бэра «Механизмы функционирования висцеральных систем» (Санкт-Петербург, 2012), XVI Всероссийской медико-биологической конференции молодых исследователей (с международным участием) «Фундаментальная наука и клиническая медицина - человек и его здоровье» (Санкт-Петербург, 2013).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 23 работы (2 статьи, 1 монография, 20 тезисов).

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, описания методических приемов, четырех глав экспериментальной работы (каждая из которых включает в себя литературную предпосылку, результаты исследования и их обсуждение), заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 129 страницах машинописного текста, содержит 4 таблицы и 28 рисунков. Библиографический указатель содержит 44 отечественных и 100 иностранных источников.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования. Исследования проводились на самцах крыс линии Вистар с массой тела 180-250 г (п=100). В экспериментах in vitro интактных крыс декапитировали, после чего собирали кровь и извлекали ткани правого и левого желудочков сердца. Двигательную активность лейкоцитов определяли в 5-канальных стеклянных капиллярах при 37°С в течение 24 часов. Цитокин-продуцирующую активность лимфоцитов, индуцированную митогенами и нейромедиаторами, определяли по реакции торможения миграции лейкоцитов (PTMJT). О фагоцитирующей активности нейтрофилов судили по лизосомально-катионному тесту (ЛКТ) и тесту восстановления нитросинего тетразолия (НСТ-тест). Миграцию отдельных популяций лейкоцитов изучали на переживающих тканях левого и правого желудочков сердца в ходе 3-часовой инкубации, регистрируя динамику изменений содержания суммарного пула лейкоцитов в среде и определяя лейкоформулу.

В опытах in vivo проводилось две серии экспериментов на наркотизированных золетилом животных. В первой серии подкожно вводили нитрит натрия (3 мг/100 г массы тела) или эквивалентный объем физиологического раствора. Через 30 и 60 мин после инъекции крыс декапитировали, брали кровь, ткани сердца, головного мозга и печени. Во второй серии экспериментов животным предварительно в течение трех дней интраназально инфузировали иммуностимулятор тимоген. Затем проводили аналогичные вышеописанной серии опытов процедуры. Содержание ИЛ-10, ИНФ-у и ФНО-а в плазме крови определяли на анализаторе иммуноферментных реакций «Униплан» АИФР-1 (ЗАО «Пикон», Москва) с помощью коммерческих наборов реагентов («Протеиновый контур», СПб). О накоплении нейтрофилов в тканях сердца, головного мозга и печени судили по способности фермента миелопероксидазы инициировать окисление пероксидом водорода о-дианизидина при длине волны 460 нМ.

В опытах in vitro и in vivo об интенсивности синтеза NO в организме

судили по содержанию нитритов и нитратов в плазме крови с помощью реагента Грисса (Abeam, Великобритания).

Статистическую обработку всех полученных результатов производили с помощью пакета программ "Statistica". Достоверность различий между позициями экспериментов in vitro определяли по критерию Стьюдента, in vivo -по непараметрическому критерию Манна-Уитни.

Результаты исследования и обсуждение

Влияние нитрита натрия на двигательную активность лейкоцитов. В экспериментах in vitro концентрации нитрита натрия, вызывающие достоверное уменьшение, двигательной активности лейкоцитов по сравнению с контролем, находились в диапазоне от 10"8М до 10~5М (рисунок 1).

-i

Л

ufe

rh

Ю 13 líí 11 I<>*° lo" lo" 1 <>■ IO I (t ' H!' 1П '

По оси абсцисс - концентрация нитрита натрия, М. * — различия достоверны по сравнению с контролем (0) при р<0,05.

Рисунок 1 - Влияние различных концентраций ЫаЫОг на подвижность лейкоцитов в 5-канальных капиллярах

Нитрит натрия (10~8М) при сочетанных применениях с норадреналином (10"7М) ослаблял угнетающее влияние последнего на подвижность лейкоцитов (рисунок 2). В свете данных о том, что норадреналин через активацию аденилатциклазы стимулирует продукцию провоспалительных цитокинов, вызывающих торможение двигательной активности лейкоцитов (СНи е1 а1., 2005), можно полагать, что ШТ^СЬ препятствует нейромедиатору стимулировать продукцию цитокинов.

НА(10 «М)+МаМ02 НА(10 *М) Н А(10"7М)+Ыа(ЧО2

* - достоверные (р<0,05) отличия по сравнению с эффектом норадреналина Рисунок 2 - Влияние норадреналина (НА) и НА вместе с Ыа>Ю2 (10"8М) на подвижность лейкоцитов крови в 5-канальных капиллярах

При оценке характера влияния КаИ02 на миграционную активность лейкоцитов в нелимфоидные ткани обнаружено, что нитрит натрия (10~7М) в ходе 1-часовой инкубации достоверно уменьшает миграцию клеток из ткани левого желудочка сердца в инкубационную среду (рисунок 3). Анализ соотношения популяций лейкоцитов показал, что наблюдаемые изменения достоверно связаны с уменьшением миграции лимфоцитов из ткани сердца в среду. При этом NaN02 не оказывает достоверных эффектов на миграцию лейкоцитов из эксплантатов правого желудочка сердца.

Можно полагать, что Ка1\Ю2 (0,01-0,1 мкМ), как и оксид азота, повышает внутриклеточный уровень цГМФ (ВаБкагап е1 а!., 2011), тем самым приводя к уменьшению двигательной активности лейкоцитов и их адгезии. Как показали наши эксперименты, нитрит натрия в большей степени оказывает влияние на миграцию лимфоцитов. С этим согласуется тот факт, что КаЫ02 отменял действие НА, который регулирует функциональную активность лимфоцитов через повышение цАМФ. В то же время ЫаЖ)2 не оказывал влияния на угнетение подвижности клеток, индуцированное ацетилхолином (10"7М).

40 30 20

НА(10 »М)

■ Физиологичесю раствор

- Нитрит натрия (10 М)

По оси абсцисс: время инкубации, мин. * - различия достоверны по сравнению с контролем при р<0,05

Рисунок 3 - Динамика изменения содержания лейкоцитов в ходе 3-часовой инкубации эксплантатов левого (А) и правого (Б) желудочков сердца

Влияние нитрита натрия на функциональную активность отдельных популяций лейкоцитов. Ыа>Ю2 достоверно угнетает стимулированную ЛПС продукцию провоспалительных цитокинов В-клетками, о которой судили по подвижности лейкоцитов в 5-канальных капиллярах (рисунок 4). Можно предполагать, что Ка1чЮ2 подавляет продукцию ИЛ-1, так как он усиливает эффект рецепторного антагониста ИЛ-1 и угнетает секрецию данного интерлейкина.

При этом ЫаЫ02 не оказывал влияния на индуцированную конканавалином А и фитогемагглютинином продукцию провоспалительных цитокинов Т-лимфоцитами.

ИЛ-1р.а.+^ГЧ02

* — достоверные (р<0,05) отличия по сравнению с эффектом липополисахарида ЛПС- липополисахарид (10"12 г); ИЛ-1р.а. -рецепторный антагонист ИЛ-1 (10"п М ).

Рисунок 4 — Влияние нитрита натрия (10"7М) на цитокин-продуцирующую активность В-лимфоцитов в 5-канальных капиллярах

ЫаТчЮ2 (10"8М) в ходе 1-часовой инкубации не оказывает влияния на кислороднезависимое звено бактерицидности нейтрофилов. ЫаТчЮг достоверно (р<0,05) увеличивает активность НАДФН-оксидазы нейтрофилов. Величина среднего цитохимического коэффициента в присутствии Ка1Ч02 в базальном варианте теста составляет 0,27±0,01 у.е., тогда как в контроле 0,20±0,01 у.е. Аналогичный эффект обнаружен в стимулированном зимозаном варианте.

Полученные данные показывают, что ЫаЫ02 (0,01-0,1мкМ) разнонаправленно влияет на функциональную активность отдельных популяций лейкоцитов.

Анализ содержания метаболитов оксида азота на фоне аппликаций и инъекций нитрита натрия. При инкубации эксплантатов ткани левого желудочка сердца через 30 мин после аппликации ЫаЫ02 уровень нитратов и нитритов в среде достоверно возрастает по сравнению с контролем (рисунок 5). В ходе последующей инкубации достоверных изменений содержания этих конечных метаболитов N0 по сравнению с контролем не обнаружено.

Й 80

40 20 о

ЛПС+№Г\Ю, ИЛ-1р.а

I

I

* - различия достоверны по сравнению с соответствующим контролем при р<0,01 # - различия достоверны по сравнению с контролем для нитрата при р<0,05 Рисунок 5 - Влияние аппликации нитрита натрия (10"7М) на содержание в среде нитритов (Ы02~) и нитратов (ИОз") в динамике 3-часовой инкубации фрагментов ткани левого (А) и правого (Б) желудочков сердца крысы

Через 30 мин после внесения ЫаЫ02 в инкубационную среду с эксплантатами ткани правого желудочка достоверно возрастает уровень Ы03 (рисунок 5). Через 60 мин его содержание достигало максимума по сравнению с контролем. Через 90 мин уровень 1чЮ3 в инкубационной среде понижался, достигая контрольных значений через 120 мин. При этом содержание нитритов не претерпевало достоверных изменений в течение всего периода инкубации эксплантатов правого желудочка сердца.

ЗО 60 90 120 180

время имнубации, мин

-Контроль нитрат -Опыт нитрат

Контроль нитрит - Опьп нитрит

ЗОО 2 50

?.оо

150 100 50 С)

зо во «о 120 хво

время инкубации, мин

Контроль нитрат Опыт нитрат Контроль нитрит Опыт нитрит

Можно полагать, что выявленное нами угнетение миграции лимфоцитов из ткани левого желудочка в ранние сроки инкубации (рисунок 3), связано с высоким содержанием метаболитов N0 в среде и быстрой интенсификацией синтеза оксида азота. Не исключено, что данный феномен наиболее выражен для переживающей ткани левого желудочка из-за того, что в миокарде правого желудочка находится меньшая доля кардиомиоцитов и, как следствие, меньшее количество eNOS.

В опытах in vivo через 30 мин после инъекции NaN02 содержание в плазме крови NOx увеличивалось более чем в 1000 раз (таблица 1). Большая часть прироста происходит за счет увеличения образования N03 .

Таблица 1 - Влияние нитритной интоксикации на концентрацию азотсодержащих веществ в плазме крови

Концентрация азотсодержащих веществ в плазме крови, мкМ

30 минут 60 минут

Физ.раствор Нитрит натрия Физ.раствор Нитрит натрия

NOx (суммарное количество метаболитов) 16±1 17611±2417А 13±2 101±10А*

Нитраты 15±2 13243±3051А 9±2 98±11 А»

Нитриты 1,0±0,2 1589±294А 2±1 8±1»

А - достоверно (р<0,05) по сравнению с контролем для данного промежутка времени; • — достоверно (р<0,05) по сравнению с опытной группой (через 30 мин после введения ЫаМСЬ)

Через 60 мин после инъекции наблюдается значительно меньшее увеличение 1МОх и 1\Ю3 , достоверных отличий в содержании N02 в плазме крови крыс не обнаружено. Анализ содержания метаболитов оксида азота в плазме крови позволяет полагать, что через один час после введения №N02 его влияние на иммуноциты уменьшается. Это согласуется с литературными данными о том, что №N02 оказывает наибольшее влияние на состояние системы белой крови в первые 60 мин после инъекции (Цой и др., 2008).

Особенности влияния нитритной интоксикации на миграцию нейтрофилов в ткани и содержание в плазме крови цитокинов. При изучении влияния нитрита натрия на миграцию нейтрофилов из кровеносного русла в ткани сердца, головного мозга и печени обнаружено, что через 30 мин после введения Ыа>Ю2 достоверно по сравнению с контролем увеличивается активность МПО в тканях сердца и мозга, в тканях печени не изменяется (рисунок 6).

* - различия достоверны по сравнению с соответствующим контролем при р<0.01 Рисунок 6 - Изменения активности миелопероксидазы (МПО) в тканях печени, мозга и сердца крысы через 30 минут после однократного подкожного введения ИаЫ02 в дозе Змг/100 г массы тела

При сопоставлении уровня активности МПО в правом и левом желудочках сердца выявлено, что увеличение миграции нейтрофилов в ткани, зарегистрированное через 30 мин после введения ЫаТчЮ2, в большей степени связано с накоплением этих клеток в правом желудочке. Через 60 мин, когда уровень >Ю2 /1Ч03 заметно уменьшается, количество нейтрофилов в правом желудочке, если судить по активности МПО, - достоверно уменьшается. Достоверного изменения активности МПО в тканях печени, мозга и левом желудочке сердца не наблюдается. Известно, что в первые 15 мин при гипоксии происходит перераспределение кровотока в пользу сердца и мозга (Шумилова и

]

др., 2012). Не исключено, что именно с этим обстоятельством связан приток нейтрофилов в головной мозг и правый желудочек сердца.

Через 30 мин после введения ЫаЫСЬ достоверно увеличивается содержание в плазме крови ФНО-а и уменьшается ИНФ-у (рисунок 7). Через 60 мин, когда уровень метаболитов N0 снижается, значимых изменений не наблюдается.

20 15 Ю

Б»«в I

30

ш Фиэ. раствор О Нитрит натрия

60

время после инъекции, мин

И:

шфиз. рпствор О Нитрит натрия

время после инъекции, мин

* - различия достоверны по сравнению с соответствующим контролем при р<0,05 Рисунок 7 - Изменения концентрации ФНО-а (А), ИНФ-у (Б) в плазме крови крыс через 30 и 60 минут после однократного подкожного введения ЫаТЯ02 в дозе 3 мг/100 г массы тела

Таким образом, результаты этой серии экспериментов свидетельствуют о том, что в ранние сроки нитритной интоксикации происходит активация макрофагов и угнетение Т-клеточного звена иммунитета, возможно, связанное с уменьшением функциональной активности Т-хелперов 1.

Влияние нитритной интоксикации на адаптивные реакции лейкоцитов. Во второй серии экспериментов in vivo показано, что через 60 мин после инъекции NaN02 на фоне предварительной интраназальной инфузии тимогена достоверно увеличивается содержание в плазме крови NOx, N03 и N02~ (рисунок 8).

so 70 60 SO 40 ЗО 20 Ю О

вфиз. раствор

о Нитрит натрия

- достоверно (р<0,05) по сравнению с содержанием метаболитов у контрольных животных Рисунок 8 - Концентрация азотсодержащих веществ в плазме крови крыс, предварительно получавших тимоген

Через 60 мин после введения Ка>Ю2 выявлено достоверное увеличение активности МПО в тканях печени и достоверное снижение активности фермента в тканях мозга и правого желудочка сердца. Изменений активности МПО в ткани левого желудочка сердца не обнаружено (рисунок 9).

* - различия достоверны по сравнению с соответствующим контролем при р<0,05 Рисунок 9 - Влияние однократного подкожного введения №N02 через 60 минут на активность миелопероксидазы в тканях печени, мозга, желудочков сердца крыс на фоне предварительной инфузии тимогена

Через 60 мин после инъекции NaN02 на фоне стимуляции иммунной системы обнаружены достоверные изменения (р<0.05) только ИЛ-10. Так, средняя концентрация ИЛ-10 у контрольных животных составляет 11,1±0,2 пг/мл, в то время как у опытных - 10,1±0,6 пг/мл.

Сопоставление данных первой и второй серии опытов позволяет сделать заключение о том, что тимоген ускоряет метаболизм NaN02 и ослабляет угнетающее влияние интоксикации на иммуноциты.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

С использованием набора стандартных и оригинальных иммунологических методов нами получены новые данные о влиянии донора оксида азота нитрита натрия на функциональную активность различных популяций лейкоцитов крови крыс in vitro и in vivo. Эффект NaN02 зависит от способа применения, времени действия и концентрации метаболитов оксида азота.

Впервые показано, что NaN02 в диапазоне концентраций in

vitro вызывает достоверное уменьшение двигательной активности лейкоцитов крови. При дальнейшем увеличении концентраций NaN02 подвижность клеток возрастает, что говорит об их жизнеспособности, возможно, за счет усиления секреции противовоспалительных цитокинов Т-хелперами. Эти данные, а также результаты опытов, в которых показано снижение чувствительности лимфоцитов к НА индуцированное донором NO, свидетельствуют в пользу гипотезы, что NaN02 угнетает Т-клеточное звено иммунитета (Hoffman et al., 2002). Влияние NaN02 на миграционные потоки лейкоцитов из переживающей ткани сердца зависит от изменения концентрации N02 и NO3 в среде. Так, обнаружено, что NaN02 угнетает выход лимфоцитов из эксплантатов левого желудочка сердца.

Известно, что N0 может изменять характер лиганд-рецепторных взаимодействий за счет нитрозилирования тиолов (Faassen et al.„ 2007). В наших экспериментах выявлено, что NaN02 уменьшает чувствительность В-лимфоцитов к ЛПС и различных популяций лейкоцитов к ИЛ-1. Нами не

17

обнаружено, угнетающего влияния NaN02 на функциональную активность нейтрофилов, играющих важную роль во врожденном иммунитете.

В опытах in vivo на фоне высоких уровней нитритов, нитратов и ФНО-а в плазме крови после однократного подкожного введения NaN02 наблюдается увеличение активности миелопероксидазы в тканях головного мозга и сердца, что позволяет предполагать усиление перекисного окисления липидов в тканях в связи с накоплением нейтрофилов (Цой, Коваленко, 2010). По мере снижения концентрации метаболитов N0 в организме, механизмы, ингибирующие клеточное звено иммунитета, задействованы в меньшей степени. В пользу сделанного нами заключения свидетельствуют результаты экспериментов с использованием тимогена. Хорошо известно, что данный иммуномодулятор усиливает Т-клеточное звено иммунитета (Морозов и др., 2000), благодаря чему широко используется для профилактики и лечения вирусных инфекций. На фоне предварительных инфузий тимогена происходит ускорение метаболизма NaN02 и, как следствие, усиление компенсаторно-приспособительных процессов, направленных на снижение миграции активированных нейтрофилов в ткани сердца и головного мозга.

В целом, нитрит натрия, как донор оксида азота, в экспериментах in vitro и in vivo вызывает подавление Т-клеточного звена иммунитета, усиление миграции нейтрофилов в ткани, активацию ПОЛ.

Выводы:

1. Нитрит натрия (0,01-0,1 мкМ) вызывает уменьшение двигательной активности лейкоцитов крови крыс, ослабляет стимулирующее действие норадреналина на продукцию ими провоспалительных цитокинов и уменьшает в ранние сроки инкубации миграцию лимфоцитов из эксплантатов тканей левого желудочка сердца.

2. Нитрит натрия (0,01-0,1 мкМ) ослабляет индуцированную

липополисахаридом продукцию провоспалительных цитокинов

В-лимфоцитами и стимулирует радикал-продуцирующую активность

нейтрофилов. 18

3. Нитрит натрия стимулирует продукцию оксида азота переживающей тканью сердца, усиливая работу NO-синтазных систем в тканях левого желудочка интенсивнее и быстрее, чем в тканях правого. Максимальное содержание метаболитов наблюдается через 30 мин после инъекции нитрита натрия (3 мг/100 г массы тела).

4. В ранние сроки нитритной интоксикации у крыс происходит усиление миграции нейтрофилов в ткани головного мозга и правого желудочка сердца, о чем свидетельствует увеличение активности миелопероксидазы в этих тканях и повышение уровня фактора некроза опухоли-а в плазме крови, причем уровень интерферона-у снижен.

5. На фоне предварительной стимуляции иммунной системы крыс тимогеном в силу ускорения метаболизма нитрита натрия на более поздних сроках интоксикации происходит уменьшение миграции нейтрофилов в ткани мозга и правого желудочка сердца с одновременным понижением содержания интерлейкина-10 в плазме крови.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи:

1. Коваленко Р.И., Петенкова A.A., Цой Е.М., Ноздрачев А.Д. Влияние нитрита натрия на локомоторные функции клеток белой крови // Доклады Академии наук. - 2009. — Т. 427, —№ 1, — С. 126-128.

2. Петенкова A.A., Коваленко Р.И., Ноздрачев А.Д. Нитрит натрия влияет на метаболические превращения оксида азота в переживающих тканях правого и левого желудочков сердца крысы // Доклады Академии наук. - 2013. — Т. 450. -№ 2. - С. 234-236.

Монографии:

1. Петенкова A.A., Коваленко Р.И. Нитриты и иммунореактивность. Моделирование эффектов ксенобиотика. — Saarbrucken (Germany): LAP LAMBERT Academic Publishing GmbH & Co. KG. — 2011. — 73 c.

Тезисы докладов:

1. Tsoy, E.M., Kovalenko, R.I., Petenkova A.A. Functional reserves and

19

reactivity of blood leukocytes during oxidative stress induced by intoxication by nitrogen-containing substances // Thesises of 10-th Jubilee Multidisciplicnary international conference of biological psychiatry "Stress and behavior". St.Peterburg, 2007. -P.65-66.

2. Коваленко Р.И., Цой E.M., Петенкова A.A., Ноздрачев А.Д. Роль лейкоцитов в функционировании висцеральных систем при нитритной интоксикации // Тезисы V Всероссийской конференции с международным участием «Механизмы функционирования висцеральных систем». Санкт-Петербург, 2007. - С.149-150.

3. Петенкова A.A. Влияние различных концентраций нитрита натрия на спонтанную миграцию лейкоцитов крови крыс в условиях in vitro // Тезисы II Международной Пироговской студенческой научной медицинской конференции, Вестник РГМУ, Москва, 2007. - Т.2 , №55. - С.ЗОЗ.

4. Петенкова A.A. Особенности изменения локомоторной активности лейкоцитов под влиянием различных концентраций нитрита натрия // Тезисы Десятой всероссийской медико-биологической конференции молодых исследователей «Фундаментальная наука и клиническая медицина». Санкт-Петербург, 2007. — С.344-345.

5. Петенкова A.A. Влияние нитрита натрия на реактивность лейкоцитов крови к митогенам и нейромедиаторам // Материалы межинститутской конференции молодых ученых «Механизмы регуляции и взаимодействия физиологических систем организма человека и животных в процессах приспособления к условиям среды». Санкт-Петербург, 2007. - С.54.

6. Алхутова И.М., Коваленко Р.И., Петенкова A.A., Цой Е.М. Состояние системы белой крови в динамике развития нитритной интоксикации // Тезисы VI Всероссийской конференции с международным участием «Механизмы функционирования висцеральных систем». Санкт-Петербург, 2008. — С. 7-8.

7. Петенкова A.A., Алхутова И.М., Коваленко Р.И., Цой Е.М. Влияние

нитрита натрия на функциональную активность клеток белой крови in vivo и in

vitro // Тезисы XIII Международного конгресса по реабилитации в медицине и 20

иммунореабилитации, «Аллергология и иммунология». Москва, 2008. — Т.9, №1. — С. 365.

8. Петенкова A.A., Коваленко Р.И., Алхутова И.М., Цой Е.М. Особенности миграции клеток белой крови при нитритной интоксикации // Тезисы VII Съезда аллергологов и иммунологов СНГ и II Всемирного форума по астме и респираторной аллергии, «Аллергология и иммунология». Москва, 2009. — Т. 10, №2. — С. 305.

9. Петенкова A.A. Особенности миграции клеток белой крови в ткани сердца под действием нитрита натрия // Материалы Двенадцатой всероссийской медико-биологической конференции молодых исследователей «Фундаментальная наука и клиническая медицина». Санкт-Петербург, 2009. -С.289-290.

10. Коваленко Р.И., Петенкова A.A., Цой Е.М. Роль катехоламинов в регуляции функциональной активности лейкоцитов при нитритной интоксикации // Тезисы докладов всероссийской конференции с международным участием «Механизмы регуляции физиологических систем организма в процессе адаптации к условиям среды». Санкт-Петербург, 2010. — С. 136-137.

11. Петенкова A.A. Роль лимфоцитов в защитных механизмах доноров оксида азота при повреждении тканей сердца // Тезисы конференции «Механизмы адаптации физиологических систем организма к факторам среды». СПб.:РАН, 2010,—С. 81

12. Petenkova A.A., Kovalenko R.I., Tsoy Е.М. Influence of nitrogen-containing xenobiotics on migratory activity of leukocytes induced by catecholamines // Thesises of IV World asthma & COPD forum and XVI International congress on rehabilitation in medicine and immunorehabilitation. Moscow, 2011. — V. 13(1). — P. 66.

13. Петенкова A.A., Коваленко Р.И. Состояние клеток иммунной системы при избыточном содержании в среде доноров оксида азота // Научные труды III съезда физиологов СНГ. Москва-Ялта, 2011. — С. 171.

14. Petenkova A.A., Kovalenko R.I., Tsoy E.M. Influence of nitrogen-containing xenobiotics on migratory activity of leukocytes induced by catecholamines // International Journal on Immunohabilitation. Moscow, 2011. — V. 13(1) — P. 66

15. ПетенковаА.А., Юсупова Э.Р. Влияние тимогена на метаболизм оксида азота у крыс в норме и при нитритной интоксикации // Тезисы XI Юбилейной всероссийской медико-биологической конференции молодых. СПбГУ, 2012. — С.223-224.

16. Петенкова A.A., Коваленко Р.И., Юсупова Э.Р. Функциональная организация тканевых систем регуляции синтеза оксида азота в правом и левом желудочках сердца // Материалы Международной конференции «Биология -наука XXI века». — РЭУ им. Г.В. Плеханова Москва, 2012. —С. 691-693.

17. Петенкова A.A., Юсупова Э.Р., Коваленко Р.И. Особенности тканевых систем синтеза и регуляции оксида азота в правом и левом желудочках сердца крысы // Тезисы VIII Всероссийской конференции с международным участием, посвященная 220-летию со дня рождения академика K.M. Бэра. СПб.: РАН, 2012.—С. 180.

18. Петенкова A.A., Коваленко Р.И. Особенности миграции лейкоцитов в правый и левый желудочки сердца у крыс при нитритной интоксикации // Сборник тезисов 17-ой Международной Пущинской школы-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века». Пущино, 2013. — С. 443.

19. Петенкова A.A. Динамика активности миелопероксидазы в тканях сердца, головного мозга и печени после инъекции нитрита натрия у крыс// Тезисы XVI Всероссийской медико-биологической конференции молодых исследователей. СПбГУ, 2013, —Т. 16. —С.317-318.

20. Петенкова A.A., Коваленко Р.И., Юсупова Э.Р., Ноздрачев А.Д. Роль метаболитов оксида азота и дефенсина человека HNP-1 в регуляции миграции лейкоцитов // Сборник тезисов XXII Съезда физиологического общества имени И.П. Павлова. Москва-Волгоград, 2013. — С.416.

Подписано в печать 11.11.2013г. Формат А5, цифровая печать. Тираж 100 экз., объем - 1 п.л. Отпечатано в ЦОП «Копировальный Центр Василеостровский» Россия, Санкт-Петербург, В.О., 6-линия, д.29. тел. 702-80-90, факс: 328-61-84 e-mail: vsfficopy.spb.ru

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Петенкова, Анастасия Андреевна, Санкт-Петербург

Министерство образования и науки Российской Федерации

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ»

(ФГБОУ ВПО «СПбГУ»)

На правах рукописи

04201452307

Петенкова Анастасия Андреевна

ВЛИЯНИЕ НИТРИТА НАТРИЯ НА АДАПТИВНЫЕ РЕАКЦИИ ЛЕЙКОЦИТОВ КРОВИ

03.03.01 - «Физиология»

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель -

доктор биологических наук, академик РАН

Ноздрачев Александр Данилович

Санкт-Петербург 2013

Оглавление.......................................................................................2

Список сокращений..............................................................................6

Введение..........................................................................................7

1. ОБЪЕКТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ, А ТАКЖЕ МЕТОДИЧЕСКИЕ ПРИЕМЫ И ИСПОЛЬЗОВАННЫЕ В РАБОТЕ МЕТОДЫ..........................................17

1.1. Постановка экспериментов in vitro и in vivo.......................................17

1.2. Капиллярный метод исследования влияния различных концентраций нитрита натрия на спонтанную подвижность лейкоцитов крови...................19

1.3. Цитохимические методы анализа влияния нитрита натрия на состояние кислородзависимого и кислороднезависимого звеньев бактерицидности нейтрофилов....................................................................................20

1.3.1. Определение базалыюй и стимулированной зимозаном радикал-продуцирующей активности нейтрофильных гранулоцитов по восстановлению нитросинего тетразолия (НСТ-тест).......................................................20

1.3.2. Определение содержания катионных белков и пептидов в нейтрофилах крови с помощью лизосомально-катионного теста (ЛКТ)...........................22

1.4. Оценка влияния нитрита натрия на цитокин-продуцирующую активность лимфоцитов крови при сочетанном применении с митогенами, нейромедиаторами и цитокинами с использованием реакции торможения миграции лейкоцитов (РТМЛ).............................................................23

1.5. Метод исследования влияния нитрита натрия на миграционную активность лейкоцитов при инкубации фрагментов ткани сердца в аутологичной плазме крови крыс......................................................................................26

1.6. Метод оценки влияния нитрита натрия на миграцию гранулоцитов в ткани сердца по изменению активности тканевой миелопероксидазы....................28

1.7. Метод исследования влияния нитрита натрия на содержание нитратов, нитритов и оксида азота в плазме крови крыс с помощью высокочувствительного колориметрического метода.................................29

1.8. Исследование влияния нитрита натрия на содержание ИЛ-10, ИНФу и ФНОа в плазме крови с использованием иммуноферментных методов..........31

1.9. Статистическая обработка результатов............................................35

2. ПОДВИЖНОСТЬ ЛЕЙКОЦИТОВ ПРИ НИТРИТНОЙ ИНТОКСИКАЦИИ КАК ИНТЕГРАЛЬНЫЙ ПОКАЗАТЕЛЬ МИГРАЦИОННОЙ АКТИВНОСТИ КЛЕТОК БЕЛОЙ КРОВИ..................................................................36

2.1. Молекулярно-клеточные и системные механизмы влияния азотсодержащих веществ на миграцию клеток белой крови в организме..............................36

2.2. Результаты исследования и их обсуждение.........................................45

2.2.1. Влияние различных концентраций нитрита натрия на спонтанную подвижность лейкоцитов крови in vitro..................................................46

2.2.2. Влияние нитрита натрия на подвижность лейкоцитов крови при сочетанном применении с норадреналином и ацетилхолином......................48

2.2.3. Влияние нитрита натрия на миграционную активность лейкоцитов при инкубации ткани правого и левого желудочков сердца в аутологичной плазме крови.............................................................................................52

3. ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ АКТИВНОСТЬ ОТДЕЛЬНЫХ ПОПУЛЯЦИЙ ЛЕЙКОЦИТОВ ПРИ НИТРИТНОЙ ИНТОКСИКАЦИИ............................58

3.1. Основные литературные сведения о влиянии азотсодержащих веществ на иммунную систему...........................................................................59

3.2. Результаты исследования и их обсуждение........................................62

3.2.1. Влияние нитрита натрия на цитокин-продуцирующую активность Т-лимфоцитов крови, индуцированную конканавалином А фитогемагглютинином.......................................................................62

3.2.2. Влияние нитрита натрия на цитокин-продуцирующую активность В-лимфоцитов и моноцитов крови при изменении продукции ИЛ-1 с помощью липополисахарида и рецепторного антагониста ИЛ-1................................64

3.2.3. Особенности изменения состояния кислородзависимого и кислороднезависимого звеньев микробицидной активности нейтрофилов крови после аппликации нитрита натрия......................................................67

4. НИТРИШАЯ ИНТОКСИКАЦИЯ И ПРЕВРАЩЕНИЕ АЗОТСОДЕРЖАЩИХ ВЕЩЕСТВ В ОРГАНИЗМЕ..................................72

4.1. Современные представления о существовании цикла оксида азота и механизмах его регуляции...................................................................71

4.2. Результаты исследования и их обсуждение........................................80

4.2.1. Влияние аппликации нитрита натрия на уровень метаболитов оксида азота в инкубационной среде при 3-часовой инкубации тканевых препаратов сердца............................................................................................80

4.2.2. Динамика изменения содержания азотсодержащих веществ в плазме крови крыс после однократной подкожной инъекции нитрита натрия............86

4.2.3. Динамика изменения содержания азотсодержащих веществ в плазме крови после однократной подкожной инъекции нитрита натрия на фоне

предварительной интраназальной инфузии иммуномодулятора тимогена.......88

5. ВЛИЯНИЕ ДОНОРОВ ОКСИДА АЗОТА НА МЕХАНИЗМЫ РЕГУЛЯЦИИ КЛЕТОЧНОГО ЗВЕНА ВРОЖДЕННОГО ИММУНИТЕТА.......................91

5.1. Современные представления о нитрите натрия как молекуле, обеспечивающей гомеостаз N0 и клеточный сигналинг.............................91

5.2. Результаты исследования и их обсуждение.........................................98

5.2.1. Влияние нитритной интоксикации на миграционную активность фагоцитирующих клеток в ткани сердца, головного мозга и печени..............98

5.2.2. Влияние нитритной интоксикации на миграционную активность фагоцитирующих клеток в ткани сердца, головного мозга и печени после предварительной интраназальной инфузии тимогена...............................103

5.2.3. Влияние нитритной интоксикации на содержание ИЛ-10, ИНФу и ФНОа в плазме крови крыс........................................................................104

5.2.4. Влияние нитритной интоксикации на содержание ИЛ-10, ИНФу и ФНОа в плазме крови крыс после предварительной интраназальной инфузии

тимогена.......................................................................................108

Заключение...................................................................................112

ВЫВОДЫ.....................................................................................114

Список использованных источников....................................................115

Список сокращений

АФК активные формы кислорода

АХ ацетилхолин

ИЛ-1 р.а. рецепторный антоганист интерлейкина-1

ИЛ-10 интерлейкин 10

ИНФу интерферон-гамма

КонА конканавалин А

ЛКТ лизосомально-катионный тест

ЛПС липополисахарид

МПО миелопероксидаза

НА норадреналин

НАД(Ф)Н никотинамидадениндинуклеотид (фосфат) восстановленный

нет нитросиний тетразолий

ПОЛ перекисное окисление липидов

ПЯЛ полиморфноядерные лейкоциты

РТМЛ реакция торможения миграции лейкоцитов

ецк средний цитотоксический коэффициент

ФГА фитогемагглютинин

ФНОа фактор некроза опухоли-альфа

цАМФ аденозин-3',5'-монофосфат

цГМФ гуанозин-3',5'-монофосфат

БОР фактор роста фибробластов

НЬ дезоксигемоглобин

МЬ дезоксимиоглобин

МеШЬ метгемоглобин

КаЖ>2 нитрит натрия

N08 синтаза оксида азота

УЕСБ фактор роста эндотелиальных клеток

Введение

Актуальность проблемы. О том, что экзогенные нитриты и нитраты токсичны для организма млекопитающих, известно давно. Бытовое отравление неорганическими нитритами было и остается распространенным явлением. Считается, что токсическое действие этих соединений во многом определяется их способностью эффективно окислять гемоглобин до метгемоглобина, то есть вызывать метгемоглобинемию, приводя к снижению кислородной емкости крови и созданию гипоксии. Хотя тяжесть метгемоглобинемий и их исход зависят от многих обстоятельств, тем не менее, смертельные случаи при нитритной интоксикации далеко не редкость.

Способность нитритов и нитратов окислять гемоглобин и родственные гемопротеиды связана с превращением азотсодержащих веществ в организме с образованием оксида азота (NO), обычно существующего в форме радикала -N0*. С помощью нитритредуктазных систем, в крови и клетках тканей при участии дезоксигемоглобина (Hb) и дезоксимиоглобина (Mb) идет восстановление нитрат-иона (N03~) в нитрит-ион (N02~), а затем уже в митохондриях и микросомах клеток, благодаря НАДФН-оксидазной активности, происходит восстановление ионов N02~ в NO.

Впервые N0 был получен более 300 лет назад независимо друг от друга двумя английскими учеными Р. Бойлем и Р. Куком путем нагревания нитрата калия в отсутствие воздуха. Образующуюся при этом не поддерживающую горение газовую субстанцию назвали «volatile nitre» - «азотный воздух» (Зенков и др., 2001). В 1774 году знаменитый английский ученый Д. Пристли провел и описал другую реакцию, газообразный продукт которой назвал селитряным воздухом (Зеленин, 1997).

В течение нескольких столетий после этого относительно детально изучались физико-химические свойства NO и его различных доноров. Синтез NO в организме млекопитающих и его важная биологическая роль получили

широкое освещение в последние десятилетия XX века. В 1992 году журнал "Science" назвал оксид азота молекулой года, а еще через 6 лет сразу трем ученым - Р. Ферчготту, JI. Игнарро и Ф. Мураду - была вручена Нобелевская премия за 1998 год в области физиологии или медицины за открытие роли "оксида азота как сигнальной молекулы в сердечно-сосудистой системе" (Ноздрачев и др., 2003).

Столь высокая награда была дана ученым за доказательство существования эндотелиального фактора релаксации, играющего важную роль в поддержании тонуса кровеносных сосудов, и демонстрацию что этот фактор представляет собой NO. Синтезируемый эндотелиальными клетками оксид азота попадает в гладкомышечные клетки стенок кровеносных сосудов, где действует на белки, содержащие гемовое железо, что вызывает расслабление гладких мышц сосудов, посредством чего осуществляется локальная ауторегуляция кровотока (Ignarro, 1989).

В связи с обнаружением двойственной роли NO концепция о токсичности попадающих в организм человека экзогенных нитритов и нитратов стала подвергаться критике. Сообщалось, что введение азотсодержащих веществ лабораторным животным ограничивает зону некроза и повышает выживаемость при инфаркте миокарда (Duranski et al., 2005; Doganci et al., 2012), препятствует развитию гипертонии (Pasero et al., 2013), защищает пищеварительную систему от агрессивного действия аспирина (Ricciardolo, 2004).

NO представляет собой 2-атомную свободнорадикальную молекулу массой 28 Да, имеет один электрон с неспаренным спином и является высоко реакционной молекулой с широким спектром биологического действия. В организме млекопитающих образование NO происходит при ферментативном окислении L-аргинина (Зенков и др., 2001; Murad, 2006; Habib, Ali, 2011).

Синтез оксида азота осуществляется с помощью цитохром-Р-450-подобных гемопротеинов - NO-синтаз (NOS). Существует две основные формы NO-синтаз: конститутивная (эндотелиальная и нейрональная) и индуцибельная (iNOS). Все три изоформы NOS для синтеза оксида азота используют

кофакторы НАДФН, ФАД, ФМН, тетрагидробиоптерин и комплекс протопорфирина с двухвалентным железом. Образующийся оксид азота распространяется посредством простой диффузии и действует прямо на внутриклеточные мишени. Значение N0 отнюдь не ограничивается его неоспоримой ролью в регуляции кровяного давления, он является универсальным регулятором внутри- и межклеточных сигнальных систем и эффектором многих процессов жизнедеятельности.

N0, легко проникая через мембраны, диффундирует от нейронов к пресинаптическим мембранам и выступает как нейромедиатор. Его способность активировать растворимую форму гуанилатциклазы является необходимым условием феномена, связанного с функционированием механизмов памяти и формированием устойчивых патологических связей в нервной системе (Болдырев, 2001). С оксидом азота связаны регуляция секреции инсулина (МиЬашшес!, ЬипсЩшз^ 8а1еЫ, 2012) и развитие диабета (Natali е1 а1., 2013), регуляция почечной фильтрации (РШ1 е1 а1., 2012), репаративных процессов в костной и кожной тканях, слизеобразования в кишечном эпителии и многие другие процессы.

В медицинской практике широко используются терапевтические воздействия, направленные на усиление образования N0, например, в пульмонологии при острой респираторной недостаточности, отеке легкого, синдроме шокового легкого. Ингаляция газовой смеси, содержащей N0, снижает уровень легочной гипертонии и предотвращает гипоксию в легких -важнейший фактор в развитии асфиксии новорожденных. Может оказаться полезным и насыщение окисью азота инфузируемых растворов. В эксперименте таким способом удавалось предотвращать развитие ишемической болезни сердца (ЬосЬпег е1 а1., 2009).

Другой положительный пример использования азотсодержащих веществ в медицине - кардиологический препарат нитроглицерин. Нитроглицерин -типичный пример пролекарства. Пролекарство - химически модифицированная форма лекарственного препарата, которая в биосредах в результате

метаболических процессов превращается в само лекарственное средство. Нитроглицерин быстро всасывается клетками слизистых оболочек ротовой полости, стенками желудка и диффундирует в кровяное русло, где легко гидролизуется с образованием нитрит-иона, который в свою очередь при взаимодействии с гемоглобином крови и железосодержащими ферментными системами гладкомышечных клеток сосудистой стенки восстанавливается с образованием оксида азота.

Положительное влияние доноров оксида азота, не отменяет его негативного действия на различные системы организма. Результаты ряда исследований свидетельствуют, что образование свободного радикала в организме в ходе NO-синтазных и нитритредуктазных реакций может выступать как патогенетическое звено в механизмах канцерогенеза и быть причиной появления некоторых видов опухолей (Граник, Григорьев, 2004; Запорожан, 2004; Nakamura et al., 2006; Chen et al., 2008; Rahat, Hemmerlein, 2013). Известно, что избыточная продукция NO чревата немедленными тяжелыми последствиями, реализующимися при эндотоксическом шоке, когда грамотрицательные бактерии вызывают мощное образование NO в гладких мышцах сосудов, падение кровяного давления и развитие других характерных для шока нарушений кровообращения.

В настоящее время проблема механизмов регуляции образования и функционирования NO в организме вышла на одно из первых мест по числу опубликованных работ. Экспериментальных данных об использовании NO-генерирующих соединений и ингибиторов NO-синтаз накопилось достаточно много. Установлено, что в основе биологических эффектов оксида азота лежат три реакции:

- взаимодействие с гемовым и негемовым железом;

- реакции с SH- и NH2- группами;

- участие в свободнорадикальных процессах.

Особенно актуальным является изучение эффектов азотсодержащих веществ в связи с регуляцией иммунной системы. В первую очередь, это

связано с тем, что N0 выступает в качестве одного из основных эффекторов системы клеточного иммунитета, оказывая антимикробное и противоопухолевое действие. Антимикробная активность N0 наблюдается при повышении и длительно поддерживаемой продукции этого агента ¡N08, экспрессия которой наблюдается в макрофагах, кардиомиоцитах, астроглии, гепатоцитах, гладкомышечных клетках.

Цитотоксическое действие N0 проявляется в отношении внеклеточных и внутриклеточных паразитов. N0 быстро диффундирует через клеточную стенку прокариот или клеточную мембрану собственных клеток организма, оказывая на них цитотоксическое или цитостатическое действие. Микробицидное и цитотоксическое действие оксида азота зависит от содержания в среде окислов азота, нитрита, нитрата и пероксинитрита (0Ж>0~). N03" и N02 , как сильные окислители, могут ингибировать ДНК-лигазу, необходимую для восстановления целостности ДНК в процессах транскрипции и репарации. Их цитотоксичность возрастает при низких рН, а также в присутствии перекиси водорода и миелопероксидазы.

Как известно, в очаге воспаления накапливается продукт частичного восстановления кислорода - супероксид-анион. N0 и супероксид-анион подвергаются быстрому радикал-радикальному взаимодействию с образованием высокотоксичного пероксинитрита.

Пероксинитрит способен индуцировать процессы перекисного окисления липидов (ПОЛ) в мембранах, вызывать однонитевые разрывы ДНК и ингибировать митохондриальное дыхание. Этот агрессивный агент может повреждать сосудистый эндотелий, увеличивать агрегацию тромбоцитов и участвовать в процессах эндотоксемии, остром легочном повреждении при респираторном дистресс-синдроме.

При воспалении оксид азота ингибирует активацию нейтрофилов за счет угнетения активности НАДФН-оксида�