Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Роль надпочечников в регуляции метаболизма меди в печени

ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Роль надпочечников в регуляции метаболизма меди в печени"

На правах рукописи

ЗАТУЛОВСКАЯ Юлия Александровна

РОЛЬ НАДПОЧЕЧНИКОВ В РЕГУЛЯЦИИ МЕТАБОЛИЗМА МЕДИ В

ПЕЧЕНИ

03.01.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

¡на

005555280

I п "'712014

САНКТ-ПЕТЕРБУРГ 2014

Работа выполнена в Федеральном государственном автономном образовательном учреждении высшего образования "Санкт-Петербургский государственный политехнический университет" и Федеральном государственном бюджетном учреждении "Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины" Северо-Западного отделения Российской академии медицинских наук

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор Пучкова Людмила Валентиновна

Официальные оппоненты: Шпаков Александр Олегович, доктор биологических

наук, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова Российской академии наук, заведующий лабораторией молекулярной эндокринологии.

Дубинина Елена Ефимовна, доктор медицинских наук, профессор, Федеральное государственное бюджетное учреждение "Санкт-Петербургский научно-исследовательский психоневрологический институт им. В.М. Бехтерева Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации", главный научный сотрудник отделения клинико-диагностических исследований.

Ведущее научное учреждение: Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт цитологии Российской академии наук.

Защита состоится 25 декабря 2014 г. в Шоо часов на заседании Диссертационного совета Д 212.232.10 при Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования "Санкт-Петербургский государственный университет" по адресу: 199034, Санкт-Петербург, Университетская наб., 7/9, ауд. 90.

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке им. A.M. Горького Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования "Санкт-Петербургский государственный университет" (г. Санкт-Петербург, Университетская наб., 7/9) и на сайте www.spbu.ru.

Автореферат разослан « » ноября 2014 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета,

доктор биологических наук, профессор /7 Ляксо Елена Евгеньевна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы исследования

По классификации элементов живого медь входит в группу микроэлементов и является одновременно обязательным компонентом всех организмов и токсическим агентом. Незаменимость меди для млекопитающих обусловлена тем, что она является каталитическим и структурным ко-фактором ферментов, контролирующих базовые метаболические процессы (Tapiero et al., 2003). Осуществление каталитических функций меди связано с изменением состояния окисления Cu(I)<->Cu(II). Активные центры купроэнзимов имеют высоко аффинные сайты связывания атомов меди с большим координационным числом. Они прочно удерживают медь в обоих состояниях окисления (Rubino and Franz, 2012). Вне координационных сфер ионы меди индуцируют образование свободных радикалов кислорода, которые, действуя подобно ионизирующему излучению, вызывают окислительный стресс (Kozlowski et al., 2014). Из внеклеточной среды к местам формирования купроэнзимов медь безопасно доставляется с помощью медь-транспортных белков. Они принадлежат к различным семействам, относятся к интегральным мембранным или растворимым белкам, расположены в плазматической мембране, цитозоле, митохондриях, аппарате Гольджи, лизосомах (Nevitt et al., 2012). Медь-транспортные белки содержат разнообразные Си(1)-связывающие мотивы: с маленьким и большим координационным числом, с высокой и низкой аффинностью, с различной комбинацией лигандов. Каждый из них удерживает атом меди, но при локальном изменении окислительно-восстановительного потенциала или рН среды, в присутствии другого транспортера меди в апо-форме или апо-купроэнзима атом меди может быть легко передан. Передача меди происходит при прямом специфическом взаимодействии транспортеров в направлении снижения энергии связывания. Медь, теряемая в результате врожденных дефектов транспортеров или активных центров купроэнзимов, аккумулируется в клетках и провоцирует развитие онкологических и нейродегенеративных заболеваний (Gaggelli et al., 2006).

Биологическая роль меди не ограничивается участием в биокатализе. Внутриклеточные и внеклеточные локальные изменения концентрации меди контролируют сигнальные пути (Mufti et al., 2007; Turski et al., 2012; Ioannoni et al. 2012; Bartuzi et al., 2013), модулируют работу рецепторов факторов роста, у-аминомасляной кислоты, глутамата, Р-аминобутириловой кислоты и способствуют работе потенциал-управляемого Са(П)-канала (Finney et al., 2007; Gaier et al., 2013). Таким образом, медь можно отнести к сигнальным молекулам. Выполнение этой функции требует двух условий: (1) существование медь-регулируемых сенсоров и (2) наличие пула меди, который аккумулирует и легко освобождает ее. У млекопитающих к медь-регулируемым сенсорам относятся транскрипционный фактор Spl (Liang et al., 2012) и семейство лизилоксидазо-подобных белков (LOXL1-4), дисбаланс функции которых приводит к ускорению роста опухолей (Nishioka et al., 2012). Контроль над локальными изменениями концентрации внутриклеточной меди обеспечивает система

металлотионеин/глутатион/COMMD 1, которая связывает медь и затем распределяет ее между купроэнзимами, депонирует или способствует выведению (Vasak and Meloni, 2011; Fedoseienko et al., 2014). Изменение уровня содержания меди в циркуляции зависит от активности гена церулоплазмина (ЦП) в печени, контролирующего статус меди в крови и обеспечивающего медью клетки других органов. Периферические органы, нуждающиеся в меди, индуцируют ее освобождение из печени в кровоток через транс-факторы, природа которых остается не известной (Kim et al., 2010; Babich et al., 2013). С другой стороны, показано, что медь в надпочечники поступает по механизму, сходному с таковым в печени (Hanson et al., 2001; Zatulovskiy et al., 2012), a адреналэктомия задерживает экскрецию меди в желчь (Gregoriadis and Sourkes, 1970; Prohaska et al., 1988; Fields et al., 1991). Эти факты позволяют предположить, что надпочечники контролируют метаболизм меди в печени, однако сведения о метаболизме меди в самих надпочечниках отсутствуют. Изучение метаболизма меди в них и влияния адреналэктомии на молекулярно-генетические механизмы, контролирующие баланс меди в печени, является вкладом в общее понимание механизма, поддерживающего гомеодинамику меди в организме млекопитающих.

Цель работы

Целью настоящего исследования было изучение влияния надпочечников на метаболизм меди в печени, и особенностей метаболизма меди в печени и надпочечниках в течение постнатального развития.

Задачи исследования

1. Оценить изменение показателей статуса меди в сыворотке крови крыс после проведения адреналэктомии (АЭ).

2. Сравнить метаболизм меди в печени контрольных и АЭ крыс: определить концентрацию и внутриклеточное распределение меди в гепатоцитах, оценить активность генов медьтранспортных белков и купроэнзимов на уровне транскрипции, трансляции и ферментативной активности.

3. Изучить особенности эмбрионального типа метаболизма меди и его переключения на взрослый тип в печени крыс.

4. Охарактеризовать метаболизм меди в надпочечниках крыс на разных сроках онтогенетического развития.

Научная новизна

Охарактеризован метаболизм меди в организме АЭ крыс. Показано, что АЭ не вызывает изменения уровня экспрессии генов, ассоциированных с обменом меди, но приводит к повышению показателей статуса меди в сыворотке крыс, накоплению меди в печени, а также перераспределению меди между клеточными компартментами гепатоцитов (список генов, взятых в рассмотрение, и краткое описание их функций помещены в конце автореферата). Продемонстрировано нарушение металлирования СОД1 и увеличение нагрузки медью металлотионеина (МТ), выполняющего функцию клеточного депо меди. АЭ приводит к изменению митохондриального протеома. Показана неоднородность популяции митохондрий в клетке. Выделена и очищена фракция митохондрий, седиментирующая с ядерной фракцией. В результате АЭ

в данной фракции митохондрий происходит снижение отношения мтДНК/субъединица 4 цитохром-ооксидазы (СОХ4).

В работе показано, что накопление меди в гепатоцитах крыс в период эмбрионального типа метаболизма меди начинается в ядрах, однако после 5-го дня жизни основная часть меди переносится в митохондриальную фракцию. Метаболизм меди в печени новорожденных крыс, по сравнению с взрослыми животными, характеризуется низкой активностью генов Ctrl, Ср, Ces, отсутствием экспрессии гена Atp7b, ген Mil а экспрессируется активно.

В надпочечниках концентрация меди сразу после рождения начинает снижаться, и уже к 5-му дню жизни содержание меди достигает значения, характерного для взрослых животных. Экспрессия генов медьтранспортных белков и купроэнзимов соответствует таковой для клеток негепатоцитарных рядов: и у новорожденных, и у взрослых крыс активен только ген Atpîa, но не Atp7b, активна экспрессия гена Ctrl, ген Ср экспрессируется, но продуцируется лишь мРНК, кодирующая сплайс-изоформу ЦП (ЦП, заякоренный в мембрану через гликозилфосфатидилинозитоловый якорь (ГФИ-ЦП)).

Теоретическая и практическая значимость работы В работе впервые показано, что 1) у млекопитающих надпочечники осуществляют надорганную регуляцию гомеодинамики меди, и 2) как у новорожденных, так и у взрослых млекопитающих метаболизм меди в надпочечниках отличается от метаболизма меди в печени и сходен с таковым в клетках негепатоцитарных рядов. Изучение механизмов, лежащих в основе этих процессов, представляется важной фундаментальной задачей. Даже незначительное нарушение в экспрессии генов медь-связывающих белков приводит к развитию тяжелых заболеваний (опухолевый рост, нейродегенерация, диабет, остеопороз и др.). Знания о метаболизме меди в отдельных органах и его специфическом изменении в течение онтогенеза являются важными для установления этапов, нарушения в которых могут приводить к развитию патологических процессов. Кроме того, полученные данные в дальнейшем могут способствовать выяснению причин повышения концентрации меди в печени и повышения уровня ЦП в крови при некоторых патологических состояниях, например, при росте опухолей.

Методология и методы исследования Исследование выполнено на лабораторных грызунах с применением современных методов биохимии и молекулярной биологии: ОТ-ПЦР, ПЦР, электрофорез в ПААГ и агарозном геле, иммуноэлектрофорез, 20-элсктрофорсз, иммуноблотинг, определение активности ферментов спектрофотометрически и в геле, хроматография, иммунопреципитация, дифференциальное центрифугирование, равновесное ультрацентрифугирование, определение концентрации общего белка и РНК, атомно-абсорбционная спектрометрия. Использованы методы статистического компьютерного анализа.

Положения, выносимые на защиту 1. Надпочечники влияют на метаболизм меди в печени. У АЭ крыс происходит повышение содержания ЦП и уровня его (ферр)оксидазной активности в сыворотке крови. В гепатоцитах увеличивается общая

концентрация меди. Медь аккумулируется в цитозоле в составе МТ и низкомолекулярного комплекса, ее содержание в митохондриях снижается, нарушается металлирование цитозольных и секреторных купроэнзимов, изменяется протеом митохондрий.

2. В период эмбрионального типа метаболизма меди (ЭТММ) медь, аккумулированная в печени, перераспределяется между ядром и митохондриями. Перераспределение меди между органеллами не сопровождается изменением профиля или уровня активности генов, участвующих в обмене меди. У новорожденных металлирование СОД1 осуществляется без участия CCS. Переключение на взрослый тип метаболизма меди (ВТММ) сопровождается изменением профиля и уровня активности генов метаболизма меди: репрессируется ген Atp7a и активируется ген Atp7b, активность генов Ср, Ctrl и Ces повышается, активность гена Mtla понижается.

3. В процессе постнатального онтогенеза профиль и активность генов метаболизма меди в надпочечниках не претерпевает значительных перестроек. Метаболизм меди в них сходен с таковым в клетках негепатоцитарных рядов.

Апробация результатов исследования Результаты исследования были доложены на российских и международных конференциях: 15-ая Пущинская международная школа-конференция молодых ученых "Биология - наука 21 века" (Пущино, 2011), 1 Ith International Symposium of Metal Ions in Biology and Medicine (Кембридж, Великобритания, 2011), 16-ая Пущинская международная школа-конференция молодых ученых "Биология -наука 21 века" (Пущино, 2012), 8th International Copper Meeting "Copper in Biology" (Альгеро, Италия, 2012), International Workshop on Human Disorders of Copper Metabolism: Recent Advances and Main Challenges (Балтимор, США, 2013), Молодежная научная конференция в рамках Политехнического молодежного фестиваля науки (Санкт-Петербург, 2013), 38th FEBS Congress 2013 "Mechanisms in Biology" (Санкт-Петербург, 2013), 42-ая Теоретическая и практическая конференция с международным участием "Неделя науки в СПбГПУ" (Санкт-Петербург, 2013), The FEBS EMBO 2014 Conference (Париж, Франция, 2014), 4-ый Съезд физиологов СНГ "Физиология и здоровье человека" (Сочи - Дагомыс, 2014).

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 13 работ (2 статьи и 11 тезисов докладов).

Структура диссертации

Рукопись содержит главы "Введение", "Обзор литературы", "Материалы и методы", "Результаты и обсуждение|", "Заключение", "Выводы" и "Список литературы". Диссертация изложена на 145 страницах, включая библиографию. Список литературы содержит 236 источников, из которых 12 на русском языке и 224 на английском. Результаты представлены в 9 таблицах и иллюстрированы 53 рисунками.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы

Работа выполнена на крысах линии Вистар, а также их потомстве, полученном в виварии НИИ Экспериментальной медицины. Первым днем беременности считали день обнаружения сперматозоидов в вагинальных мазках.

Животных подвергали двусторонней АЭ под легким эфирным наркозом. После операции АЭ крысы получали без ограничения раствор, содержащий 1% глюкозы, 1% NaCl и 0.5% КС1. Контрольная группа состояла из ложно-оперированных (ЛО) крыс. Забор крови и органов проводили на 10-ый день после операции. С лабораторными животными обращались в соответствии с "Европейской конвенцией о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях" (ETS №123 от 18.03.1986, Страсбург, Франция), а также Поправкой к этой конвенции (ETS №170 от 02.12.2005). Исследования были одобрены Этическим комитетом НИИ Экспериментальной медицины (протокол № 2/13 от 27.06.2013).

В исследовании использованы антитела к следующим белкам, ассоциированным с метаболизмом меди: к церулоплазмину (ЦП) крысы, металлотионеину (МТ), COMMD1, супероксиддисмутазе 1 (СОД1) и субъединице 4 цитохром-с-оксидазы (СОХ4). Выделение тотальной РНК проводили с помощью реактива "TRIzol" в соответствии с инструкцией производителя. Концентрацию РНК определяли спектрофотометрически. Качество используемого препарата РНК проверяли методом электрофореза в агарозном геле и об отсутствии деградации PI IK судили по соотношению 18S и 28S рРНК. Гель-электрофорез ПЦР-продуктов проводили в агарозном геле. Гели окрашивали этидий бромидом. Обратную транскрипцию, сопряженную с ПЦР, проводили со специфическими праймерами (Ilyechova et al., 2014; Клотченко и др., 2008). Для полуколичественной характеристики экспрессии генов использовали соотношение между квазистационарным уровнем мРНК исследуемого гена и мРНК р-актина. Выделение субклеточных фракций из гомогената ткани проводили методом дифференциального центрифугирования (Васин и др., 2005). Очистку полученных фракций проводили методом ультрацентрифугирования в ступенчатом градиенте плотности сахарозы (Zatulovskiy et al., 2012). Содержание мтДНК определяли методом ПЦР анализа со специфическими праймерами в лизатах препаратов митохондрий. Гель-фильтрацию проводили на колонке с Сефадексом G75 (Ilyechova et al., 2014). Электрофорез белков проводили в ПААГ в неденатурирующих условиях, или в присутствии 0.1% додецилсульфата натрия (ДСН) по методу Laemmli (1970). Белки из геля переносили на нитроцеллюлозную мембрану (НЦМ). Иммунные комплексы выявляли после гибридизации со вторыми антителами, конъюгированными с пероксидазой хрена, с помощью метода усиленной хемилюминесценции. При проведении денситометрического анализа белков для нормализации использовали зону, соответствующую примерно 50 кДа, из окрашенной Понсо S НЦМ (Aldridge et al., 2008). Концентрацию ЦП определяли с помощью ракетного количественного иммуноэлектрофореза (Platonova et al., 2007). Оксидазную, ферроксидазную и супероксиддисмутазную активности определяли окрашиванием геля на соответствующие ферменты, используя специфические абиогенные субстраты: орто-дианизидин, система соль Мора/ферроцин и нитротетразолий синий, соответственно (Ilyechova et al., 2014). 2D-злектрофорез проводили в соответствии с протоколом, разработанным Нарыжным С.Н. (Naryzhny and Lee, 2003). Концентрацию металлов измеряли методом атомно-абсорбционной спектрометрии (ААС) с электротермической атомизацией и зеемановской коррекцией неселективного поглощения, либо методом пламенной фотометрии. Концентрацию общего белка в пробах определяли по методу Bradford (1976). Для проведения поиска цис-элементов в промоторных областях генов использовали открытую онлайн базу данных Ensembl (http://www.ensembl.org/index.html) и он-лайн сервис "RSA-tool" (http://rsat.ulb.ac.be/dna-pattern_form.cgi). Статистическую обработку результатов проводили с применением двустороннего критерия Стьюдента, а также дисперсионного анализа. Изменения принимали статистически значимыми при уровне значимости р < 0.05.

Результаты и обсуждение

1. Влияние АЭ на метаболизм меди у крыс

Влияние АЭ на параметры метаболизма меди изучали на молодых половозрелых крысах. Эффективность АЭ контролировали по снижению реабсорбции натрия.

1.1. Изменения статуса меди в сыворотке крови крыс после АЭ

В сыворотках крови животных были определены показатели статуса меди: концентрация общей меди, содержание белка ЦП и его ферментативная активность и концентрация полипептидов МТ. Показано, что АЭ приводит к повышению концентрации меди в сыворотке крови (рисунок 1 А). В результате АЭ повышается содержание иммунореактивных полипептидов ЦП (рисунок 1 Б) и его обеих энзиматических активностей (рисунок 1 Г-Е).

А - концентрация меди (п = 5). Б - ракетный иммуноэлектрофорез, гель окрашен орто-дианизидином. Стандарт - препарат ЦП крысы в количестве 0.56, 0.28, 0.14 мкг/мкл. В -содержание полипептидов МТ по данным иммуноблотинга. Г - оксидазная активность в ПААГ (п = 5), гель окрашен орто-дианизидином. Д - кинетика окисления орто-дианизидина. Черные линии - ЛО, серые линии - АЭ. Е - ферроксидазная активность в ПААГ (п = 3), гель окрашен ферроцином. *р < 0.05; **р< 0.01 Рисунок 1 — Изменения статуса меди в сыворотке крови крыс после АЭ

Пропорциональное и согласованное повышение концентрации меди, уровня оксидазной и ферроксидазной активностей ЦП свидетельствует о том, что большая часть ЦП в сыворотке крови находится в форме холо-фермента. Анализ образцов сыворотки крови методом иммуноблотинга обнаружил в них

присутствие полипептидов МТ и показал, что у АЭ крыс содержание полипептидов МТ выше (рисунок 1 В).

1.2. Изменение концентрации меди в органах и субклеточных фракциях

печени АЭ крыс

Концентрация меди была измерена в печени крыс и сопоставлена с таковой для почек и гипоталамуса. В печени, корковом слое почек и гипоталамусе -органах, характеризующихся интенсивным метаболизмом меди, АЭ приводит к увеличению концентрации меди (рисунок 2 А). В то же время, концентрация меди в мозговом слое почек не изменяется.

П КСП МСП Г я М АГ Ц Я М АГ ц

А - концентрация меди в органах крыс. П - печень, КСП - корковый слой почек, МСП -мозговой слой почек, Г - гипоталамус. Б - концентрация меди в субклеточных фракциях гепатоцитов JIO и АЭ крыс. Я - ядра, М - митохондрии, АГ - аппарат Гольджи, Ц - цитозоль.

В - концентрация меди в субклеточных фракциях гепатоцитов JIO крыс. * р < 0.05 Рисунок 2 - Содержание меди в органах и субклеточных фракциях гепатоцитов

крыс (п = 3)

Измерение концентрации меди во внутриклеточных фракциях гепатоцитов, полученных методом дифференциального центрифугирования показало, что АЭ приводит к снижению концентрации меди в митохондриях и повышению в цитозоле (рисунок 2 Б). Так как 20-часовой диализ не приводит к снижению концентрации меди в исследуемых фракциях (рисунок 2 В), можно считать, что основная часть меди в клетке прочно связана с субстанциями, молекулярная масса которых превышает 800 Да.

1.3. Влияние АЭ на распределение меди в цитозоле гепатоцитов

Фракционирование цитозоля методом гель-фильтрации на колонке с Сефадексом G75 показало, что материал, поглощающий на 280 нм, элюируется четырьмя пиками: мажорные пики I и II, минорный пик III и пик IV (рисунок 3 А). У JIO крыс большая часть меди соответствует мажорным пикам I и II (рисунок 3 Б). В цитозоле АЭ крыс значительная часть меди содержится во фракциях, принадлежащих мажорным пикам, однако ее содержание увеличивается в пиках III и IV.

Как показал анализ методом иммуноблотинга, медь, содержащаяся в пике I, связана с белками сыворотки крови, попавшими во фракции при гомогенизации образцов печени. В соответствии с результатами определения СОД активности в

IV Номер пика

17 18 24 27 30 31 32 53 Номер фракции

Контроль ЛЭ

А - профиль элюции белков цитозоля. I, II, III и IV - номера пиков. Стрелка указывает на элюцию цитохрома с. Врезка - молекулярно-весовой анализ белков (сверху) и содержание ЦП (снизу) во фракциях цитозоля клеток печени АЭ крыс. М - маркеры молекулярных весов. Б -распределение меди по фракциям цитозоля гепатоцитов ЛО и АЭ крыс. Врезка - ДСН-электрофорез фракции #53, соответствующей пику IV, из цитозоля гепатоцитов АЭ крыс. Обработка проб: 1 - ДСН, ß-меркаптоэтанол (МЭ) и нагревание при 95 °С; 2 -ДСН и МЭ; 3 -ДСН и нагревание при 95°С; 4 - ДСН. В - СОД активность во фракциях цитозоля гепатоцитов JIO и АЭ крыс (изображения инвертированы) Рисунок 3 - Характеристика хроматографических фракций цитозоля гепатоцитов ЛО и АЭ крыс

о

1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31 33 35 37 39 41 Номер фракции

1 6 И 16 21 2А 31 36 41. Номер фракции

геле (рисунок 3 В), медь из пика II должна быть связана с цитозольным купроэнзимом СОД1. Активность СОД в пике II контрольных крыс выше, чем у АЭ животных. Во фракциях цитозоля АЭ, но не ЛО, крыс, соответствующих пику IV, выявляется вещество неизвестной природы, обладающее СОД активностью (рисунок 3 В). Денатурирующие и восстанавливающие агенты, а также высокая температура вызывают диссоциацию этой субстанции (рисунок 3 Б, врезка).

АЭ не влияет на содержание иммунореактивных полипептидов СОД1 в общей фракции цитозоля, однако активность СОД1 уменьшается (рисунок 4 А), поэтому соотношение холо-СОД1/апо-СОД1 у АЭ крыс снижено (рисунок 4 Б). Так как включение атомов меди в белок СОД1 происходит при помощи CCS, специального Си(1)-шаперона, который получает медь в межмембранном пространстве митохондрий (Leary et al., 2009), можно думать, что уменьшение

содержания меди в митохондриях, спровоцированное АЭ, приводит к наблюдаемому снижению содержания холо-СОД1.

ло

АЭ

оло

«АЭ

**

I

**

■

содержание СОД1 наивность СОД1 холв-СОД1/1ао-СОД1

А - иммуноблотинг с антителами к СОД1 (сверху); ПААГ, окрашенный нитротетразолием синим для выявления ферментативной активности СОД1 (снизу). Б - денситометрический анализ представленных выше гелей (А) и отношение холо-СОД1/апо-СОД1. **р < 0.01 Рисунок 4 - Содержание и активность СОД1 в цитозоле печени крыс (п = 3)

Содержание полипептидов МТ и СОМ1УШ1 не изменяется в цитозоле гепатоцитов АЭ крыс (рисунок 5 А). В то же время, концентрация меди в иммунопреципитатах, полученных из цитозоля с помощью антител к МТ, после АЭ увеличивается. Это означает, что происходит увеличение нагрузки МТ медью (рисунок 5 Б).

А - иммуноблотинг со специфическими антителами к МТ и СОММБ1 (п = 3). Б — денситометрический анализ представленных выше гелей. В - содержание меди во фракции, ассоциированной с МТ в печени крыс (п = 5). * р < 0.05 Рисунок 5 - Содержание МТ и С0ММ01 в цитозоле печени ЛО и АЭ крыс и концентрация меди во фракции МТ

В митохондриальной фракции в результате АЭ по данным иммуноблотинга не происходит изменения содержания полипептидов СОХ4. Это косвенно указывает на целостность ансамбля цитохром-с-оксидазы (ЦО), так как нарушение первых стадий сборки комплекса, вызванное дефицитом меди, приводит к остановке сборки и подавлению активности ядерных генов, кодирующих субъединицы фермента.

1.4. Анализ митохондриальной фракции клеток печени ЛО и АЭ крыс

Фракции митохондрий, изолированные методом дифференциального центрифугирования, были дополнительно очищены методом равновесного ультрацентрифугирования. Полученные фракции содержат митохондриальную ДНК (мтДНК), зрелые полипептиды СОХ4 и цитохрома с (рисунок 6). В цитозоле присутствует пре-пептид СОХ4, а цитохром с обнаруживается лишь в следовых количествах. Данные показывают, что полученные фракции митохондрий являются высокоочищенными.

А Б

- -

1 2 3 4 5 6 7

1 2 3 СОХ4 цитохром с

А - содержание мтДНК во фракции митохондрий гепатоцитов ЛО (1) и АЭ (2) крыс. 3 -маркеры. Б - содержание полипептидов белков СОХ4 и цитохром с, определенное методом иммуноблотинга. Фракции были выделены из печени ЛО (I, 3, 5, 7) и АЭ (2, 4, 6, 8) крыс. 1, 2, 5,6- митохондрии; 3, 4, 7, 8 - цитозоль; 9 - коммерческий препарат цитохрома с лошади Рисунок 6 - Содержание мтДНК (А) и белков СОХ4 и цитохром с (Б) в митохондриальной фракции гепатоцитов крыс

По данным двумерного электрофореза, общая картина распределения белков в исследуемых фракциях соответствует митохондриальному протеому, однако наблюдаются различия между протеомами фракций АЭ и ЛО крыс: в митохондриях АЭ крыс в областях рН 8.5 - 9.0, молекулярный вес 30 - 35 кДа и рН 3.5 - 4.0, молекулярный вес 10 - 13 кДа утрачивается продукт. В области рН 4.0, молекулярный вес 130 кДа у АЭ животных появляются три пятна, а в области рН 7, молекулярный вес около 200 кДа в мажорной зоне выявляется значительная разница, состоящая в конфигурации зоны.

1.4.1. Влияние АЭ на гетерогенность популяции митохондрий печени крыс Методом дифференциального центрифугирования гомогенат печени ЛО и АЭ крыс был разделен на ядерную и митохондриальную фракции, которые были очищены в градиенте плотности сахарозы. После ультрацентрифугирования ядерной фракции зона на границе 42-45% концентраций сахарозы была собрана в две фракции объемом по 1 мл: Я1 и Я2, соответственно "легкая" и "тяжелая". Материал митохондриальной фракции распределился от 41% до 45% сахарозы, в этом диапазоне было собрано по 12 фракций объемом 1 мл: фракции 1 — 12 (Ф1 - Ф12). Определение содержания общего белка во фракциях показало, что у АЭ животных существенно меньше митохондрий низкой плотности. Во фракции низкоседиментирующих митохондрий тотальное содержание белка у ЛО животных почти в 2 раза выше, чем у АЭ крыс. "Легкая" и "тяжелая" фракции митохондрий у ЛО крыс представлены примерно в одинаковом количестве, в то

Бремя как у АЭ крыс "легкая" фракция превалирует над "тяжелой". Иммуноблотинг с антителами к СОХ4 и ПЦР с праймерами на вариабельный участок мтДНК показал, что все полученные фракции содержат СОХ4 (рисунок 7 А), однако во фракциях Я1 и Я2 АЭ животных мтДНК не обнаружена (рисунок 7Б).

А

ЛО АЭ JIO АЭ ЛО АЭ JIO АЭ

Я1

Я2

Ф1

Ф2

ЛО АЭ ЛО АЭ ЛО АЭ ЛО АЭ

ФЗ

Ф4

Ф5

Ф6

Б

ЛО АЭ ЛО АЭ ЛО АЭ ЛО АЭ ЛО АЭ ЛО АЭ

Ф7

Ф8

Ф9

Ф10

ФИ

Ф12

am mm „

ЛО АЭ ЛО АЭ ЛО АЭ ЛО АЭ M

..... ^^^ шщт

ЛО АЭ ЛО АЭ ЛО АЭ ЛО АЭ M

Я1

Я2

ЛО АЭ ЛО АЭ

Ф1 тт.

-"— ^шш

ЛО АЭ

Ф2

M

mm

ло

ФЗ Ф4

м йм mm

Ф5

Ф6

АЭ ЛО АЭ ЛО АЭ M

Ф7

Ф8 Ф9 Ф10 Ф11 Ф12

М - маркер. Наиболее яркая полоса соответствует 500 п.н. Рисунок 7 - Содержание СОХ4 (А) и мтДНК (Б) во фракциях митохондрий

Результаты настоящего исследования свидетельствуют, что удаление надпочечников приводит к изменениям в соотношении митохондриальных субпопуляций печени, в частности, происходит снижение размеров субпопуляции митохондрий, седиментирующей с ядрами.

1.5. Исследование транскрипционной активности генов, кодирующих белки

МСМ, в печени АЭ крыс Ранее было показано, что введение гормонов надпочечников не отменяет эффекта АЭ на нарушение экскреции меди из печени (Gregoriadis and Sourkes, 1969). В работе проведен компьютерный поиск цис-элементов, регулируемых гормонами надпочечников в промоторных областях генов крысы, кодирующих белки, вовлеченные в метаболизм меди. В рассмотрение взяты следующие группы генов: (1) гены, кодирующие медь-транспортные белки {Ctrl, Ctrl, Atp7a, Atp7b, и Ces), (2) гены, кодирующие купроэнзимы (Ср, ген, продуктами которого являются секреторный ЦП, а также его сплайс-изоформа ГФИ-ЦП, Sodl, Cox4il, Рат), и (3) гены, продукты которых поддерживают внутриклеточный гомеостаз меди (Mtla и Commdl). Катехоламины изменяют активность генов, содержащих в промоторной области CRE-последовательность (cyclic-AMP responsive element). Глюкокортикоиды коры надпочечников изменяют активность генов, содержащих в промоторной области GRE элементы (glucocorticoid-responsive element). Поиск этих последовательностей осуществляли на расстоянии 3000 п. н. upstream от +1 нуклеотида. Для поиска

CRE последовательность TGACGTCA, не было обнаружено ни одного полного совпадения. Полных совпадений с каноническими GRE последовательностями GGTACANNNTGTTCT и AGAACANNNTGTTCT также не было обнаружено.

Экспрессия выше перечисленных генов была оценена методом полуколичественного ОТ-ПЦР анализа. Было показано, что АЭ не приводит к изменению уровней экспрессии генов, кодирующих белки метаболизма меди.

В совокупности, данные, полученные в этом разделе, позволяют считать, что 1) АЭ приводит к задержке экскреции меди из печени, накоплению меди в цитозоле в составе МТ и в субстанции неустановленной природы; 2) АЭ в митохондриях вызывает снижение концентрации меди, не связанной с ЦО, и изменяет соотношение между субпопуляциями митохондрий; 3) протеом митохондрий АЭ крыс отличается от такового у ЛО животных; 4) АЭ снижает уровень металлирования СОД1; 5) формирование холо-ЦП в цистернальном пространстве аппарата Гольджи увеличивается. Ни одно из этих изменений не связано с изменением активности генов, ассоциированных с метаболизмом меди.

2. Характеристика метаболизма меди в надпочечниках

Вторая часть исследования сосредоточена на выявлении особенностей метаболизма меди в надпочечниках и печени крыс на ранних этапах постнатального развития.

2.1. Концентрация меди в печени и надпочечниках крыс в период раннего постнатального развития

Концентрацию меди в печени и надпочечниках определяли у крыс с 1 -го по 15-ый дни жизни, а также в печени крыс в 1 и 4 дни до рождения (рисунок 8 А).

А - концентрация меди в печени крыс. По оси абсцисс: дни жизни до рождения (-4; -1) и после рождения (1-15). Б - концентрация меди в субклеточных фракциях гепатоцитов крыс.

Данные получены совместно с Платоновой H.A. и Самсоновым С.А. По оси абсцисс: дни жизни после рождения. ЭПР - эндоплазматический ретикулум, АГ - аппарат Гольджи. Рисунок 8 - Изменение содержания меди в печени (п = 3) и субклеточных фракциях гепатоцитов крыс в период раннего онтогенетического развития (п=5)

Прогрессивное накопление меди в печени начинается в эмбриональном периоде и продолжается до 12-го дня постнатального развития включительно, после чего концентрация меди резко снижается до уровня, характерного для

взрослых животных. Полученные результаты согласуются с существующей концепцией ЭТММ и ВТММ в печени крыс (Hurley et al., 1980). Определение концентрации меди во внутриклеточных фракциях гепатоцитов, полученных методом дифференциального центрифугирования, показало, что в течение первых дней жизни медь аккумулируется в ядрах, но после 5-го дня происходит снижение концентрации меди в ядерной фракции. В то же время, содержание меди в митохондриях увеличивается, достигая максимального значения к концу периода ЭТММ (рисунок 8 Б). Полученные данные позволяют рассматривать митохондрии как органеллы, депонирующие медь в течение ЭТММ.

В отличие от печени, снижение содержания меди в надпочечниках начинается сразу после рождения (рисунок 9 А).

II

I I I I I I

8 12 13 14 15 дни жнзнн

ДПНялпнн

Рисунок 9 - Изменение концентрации меди в надпочечниках (А) и их массы (Б) у крыс в период раннего онтогенетического развития (п = 3)

К 5-му дню жизни происходит снижение концентрации меди на -40%, после чего она приближается к уровню, характерному для взрослых животных. Сравнение скорости роста надпочечников (рисунок 9 Б) и содержания в них меди позволяет предположить, что снижение концентрации меди может быть следствием увеличения массы самих надпочечников, в то время как абсолютное количество меди в них остается неизменным.

2.2. Статус меди в сыворотке крови крыс в период раннего постнаталъного

развития

Как видно из представленных данных (рисунок 10 А), концентрации ЦП и меди, характерные для ВТММ, достигаются только к 40-му дню жизни. В течение раннего постнатального периода уровни оксидазной и ферроксидазной активностей соответствовали концентрации меди и содержанию полипептидов ЦП. Это позволяет считать, что основная часть сывороточного ЦП представлена холо-ЦП. Из образцов сыворотки крови 6-дневных и взрослых крыс иммунопреципитировали ЦП и в иммунопреципитатах определяли концентрацию меди. Результаты показали, что основная часть сывороточной меди ассоциирована с ЦП, как в период ЭТТМ, так и у взрослых крыс (рисунок 10 Б). В то же время, как видно на рисунке 10 А, содержание меди в ЦП новорожденных крыс почти в 2 раза выше, чем у взрослых.

в

12 15 21 60 дни жнзни

3 дня 180 дней

1»и дней [к

□ Здвя ш 12 дней ■ 180 дней

■

содержание МХ

Си Ъи

А - содержание меди (по данным ААС) и ЦП (по данным иммуноэлектрофореза) в сыворотке

крови крыс в раннем постнатальном онтогенезе (п = 3). Б - содержание меди в сыворотке крови и иммунопреципитированной фракции ЦП (п = 3). В - содержание полипептидов МТ (п = 4). Г - концентрация металлов во фракциях МТ (п = 2). По оси ординат отложен процент от общей концентрации металла в сыворотке крови. *р < 0.05 Рисунок 10 - Характеристика метаболизма меди в сыворотке крови крыс на ранних сроках постнатального развития

Повышенное содержание атомов меди в молекуле ЦП новорожденных ранее было описано у человека и лошади (Окитига й а1., 1998; Жигулева и др., 1999). В сыворотке крови крыс как в период ЭТММ, так и в период ВТММ присутствует МТ (рисунок 10 В). У новорожденных с ним связано около 1% меди и 8% цинка, а у взрослых соответственно 0.5% и 2% (рисунок 10 Г).

2.3. Изменение профиля экспрессии генов, ассоциированных с метаболизмом меди, в течение онтогенеза Были сформированы три группы крыс: 3-дневные крысы, характеризующиеся ранним постнатальным периодом ЭТММ (медь накапливается в ядрах), 12-дневные крысы, поздний срок ЭТММ (медь аккумулируется в митохондриях), и 60-дневные крысы, в печени которых метаболизм меди соответствует взрослому типу. Между данными для 3- и 12-дневных животных значительной разницы выявлено не было, поэтому здесь представлены только данные, полученные на 3- и 60-дневных крысах. У животных была измерена относительная концентрация зрелых транскриптов генов, список которых приведен в разделе 1.5. Полученные данные представлены на рисунке 11. Они показывают, что в течение онтогенеза в печени крыс происходит увеличение экспрессии гена Ср (рисунок 11 А). Из двух

генов, кодирующих медь-транспортные АТФазы, у новорожденных крыс активно экспрессируется А1р7а. После переключения на ВТТМ экспрессия гена А(р7а подавляется, в то же время экспрессия гена А(р7Ь возрастает.

А1'6

0.0

□ Здня ■ 60 двей

Ср rtll-Cp Ctrl Ctrl Atp?t

Atp'b Ces Sodl Sod2 Cox4il Pam Sitla Commâl

1.6 -

1.4 -

1.2 -

1.0 -

О Здня ■ 60 дней

Ï

Cp(2-4) Ср ТФЧ-Ср Ctrl Ctrl ÂtpJa

Ces Sod] Saii2 Cox4il Pam Mtla CommdJ

* р< 0.05; ** р< 0.01; ***р< 0.005 Рисунок 11 - Экспрессия генов, ассоциированных с метаболизмом меди, в печени (А) и надпочечниках (Б) крыс на разных этапах онтогенеза (п = 3)

Экспрессия гена Ctrl почти в 5 раз ниже, чем активность гена Ctrl. Количество мРНК, кодирующей белок CTR1, у взрослых крыс почти в 10 раз больше, чем у новорожденных крыс. Соответствия между экспрессией генов Sodl и Ces в печени 3-дневных крыс обнаружено не было: при активной экспрессии гена Sodl, относительное содержание CCS-мРНК остается очень низким. У взрослых крыс содержание СОД1-мРНК приблизительно на 30% выше (р < 0.05), чем у 3-дневных. В то время как экспрессия гена Ces возрастает почти в 10 раз. В течение ЭТММ экспрессия гена Mtla сохраняется на довольно

высоком уровне, но после переключения на ВТТМ происходит двукратное снижение активности данного гена. Экспрессия гена Commdl в течение онтогенетического развития не изменяется. Содержание СОХ4П-мРНК увеличивается при смене типа метаболизма меди. Как и ожидалось, в печени крыс не происходило экспрессии гена Рат.

В клетках надпочечников крыс в течение развития не обнаруживаются мРНК секреторного ЦП и АТР7В (рисунок 11 Б). В то же время, мРНК изоформы ГФИ-ЦП и АТР7А присутствуют от рождения и у взрослых крыс их содержание увеличивается. В надпочечниках активность гена Ctrl выше у новорожденных крыс, она начинает снижаться перед сменой типа метаболизма меди. Ген Ctr2 экспрессируется на постоянном уровне и этот уровень примерно в 2 раза ниже, чем активность гена Ctrl. Гены Sodl и Ccs экспрессируются на близком уровне и их активность не меняется в течение онтогенеза. У взрослых ген Mtla активнее, чем у новорожденных. Количество мРНК, кодирующей белок COMMD1, снижается у взрослых. Активность гена Сох4И не меняется с возрастом. В отличие от печени, в надпочечниках наблюдалась активная экспрессия гена Рат, которая уменьшается у взрослых крыс.

2.4. Содержание белков, участвующих в метаболизме меди, в печени и надпочечниках крыс в течение раннего онтогенеза

Содержание полипептидов белков, ассоциированных с метаболизмом меди, оценивали по результатам иммуноблотинга. При помощи специфических антител митохондриальный белок СОХ4, а также цитозольные белки МТ, COMMD1 и СОД1 были выявлены в соответствующих субклеточных фракциях (рисунок 12).

Относительная концентрация полипептидов МТ и COMMD1 в надпочечниках выше у взрослых крыс. В печени уровни концентрации МТ и COMMD1 не изменяются при переключении типа метаболизма меди, хотя содержание МТ-мРНК у взрослых животных снижается почти в 2 раза по сравнению с новорожденными крысами. Стоит отметить, что рассогласование между транскриптомом и протеомом характерно для многофункциональных белков, имеющих сложную систему регуляции экспрессии на уровне транскрипции и/или трансляции. Оба белка МТ и COMMD1 являются многофункциональными (de Bie et al., 2005; Vasak and Meloni, 2011). Содержание белков COX4 и СОД1 не изменяется в надпочечниках крыс, в то время как в печени смена типов метаболизма меди сопровождается увеличением концентрации полипептидов этих белков.

В цитозоле печени и надпочечников оценили также уровень ферментативной активности СОД1 (рисунок 13).

Здкя 60 дней Здня 60 дней

СОД1

ь

СЗдвя ■60 днев

Печень *

..I

Надпочечники

В1

□Здня Надпочечники ■бОли«й

*

г!........¡4........dL

!l

МТ СОЛПШ1 СОХ4 СОД!

МТ COMMD1 СОХ4 СОД1

А - иммуноблотинг фракций цитозоля и митохондрий с антителами к МТ, СОММЮ1, СОХ4 и СОД I. Б и В - денситометрический анализ данных иммуноблотинга. * р < 0.05 Рисунок 12 — Содержание белков, связанных с метаболизмом меди в надпочечниках и печени крыс в течение онтогенеза (п = 3)

3 дия 60 дней 3 лпя 60 дней

надпочечники

Надпочечники

А - ПААГ, окрашивание нитротетразолием синим. Б - денситометрический анализ представленных гелей (А). *р < 0.05 Рисунок 13 - Ферментативная активность СОД1 в печени и надпочечниках новорожденных и взрослых крыс (п = 3)

Выше отмечено, что мРНК, кодирующая белок CCS, обнаруживается в печени новорожденных крыс в следовых количествах (рисунок 11 А). Возможно, в течение ЭТТМ металлирование апо-СОД1 осуществляется при помощи иного механизма, не зависящего от CCS, и доставку меди к СОД1 осуществляет глутатион, получивший медь от белка МТ (Carroll et al., 2004).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В работе впервые продемонстрировано существование механизма, контролирующего круговорот меди на межорганном уровне. Показано, что АЭ приводит к повышению концентрации меди в печени, корковом слое почек и

гипоталамусе. В печени АЭ вызывает повышение содержание меди в цитозоле. Здесь концентрация меди в СОД1 снижается, но активность гена и содержание иммунореактивных полипептидов СОД1 не меняется. В цитозоле медь связана с МТ и входит в комплекс низкомолекулярных лигандов меди. Этот комплекс проявляет СОД-активность в системе (нитротетразолий

синий/ТЕМЕД/рибофлавин). Удельное содержание меди в митохондриях снижается, по-видимому, за счет меди, не входящей в состав ЦО. Характеристика протеома, проведенная в митохондриальной фракции гепатоцитов методом двумерного электрофореза, показала, что АЭ вызывает изменение состава протеома. Для идентификации обнаруженных изменений требуются дальнейшие исследования. Профиль и уровень экспрессии генов, связанных с метаболизмом меди, не изменяются в печени АЭ крыс, а сдвиги в распределении не являются результатом дефицита гормонов надпочечников.

Для изучения механизма, лежащего в основе влияния надпочечников на гомеодинамику меди в печени, необходимо понимать особенности метаболизма меди в самих надпочечниках. В литературе данные о метаболизме меди в надпочечниках отсутствуют. В работе проведена сравнительная характеристика метаболизма меди в печени и надпочечниках крыс при ЭТММ и ВТММ. Накопление меди в гепатоцитах в раннем постнатальном онтогенезе начинается в ядре, но после 5-го дня жизни медь аккумулируется в митохондриях, где продолжает накапливаться до 13-го дня жизни, когда происходит резкое падение концентрации меди в печени. В гепатоцитах новорожденных крыс, по сравнению с взрослыми, специфически изменена активность генов, контролирующих поступление меди в цитозоль, и генов, участвующих в металлировании ЦП и СОД1, основных купроэнзимов крови и цитозоля, соответственно. Так, активность гена Ctrl, белковый продукт которого импортирует медь через плазматическую мембрану в цитозоль, репрессирована. Напротив, ген Ctr2, белковый продукт которого переносит медь из лизосомального пространства в цитозоль, активен. Это однозначно указывает на то, что у новорожденных медь поступает в гепатоциты эндоцитозом. В раннем постнатальном периоде из двух медь-транспортных АТФ-аз экспрессируегся в основном ген Atp7a, активность гена Atp7b подавлена. Обе АТФ-азы переносят медь в цистернальное пространство аппарата Гольджи, где металлируются внеклеточные купроэнзимы. Специфическим донором меди для ЦП является АТР7В. В отсутствии его активности, и активность гена ЦП также снижена. Наконец, активность С0Д1, главного клеточного купроэнзима, у новорожденных лишь на 30% ниже, чем у взрослых. Однако активность генов Ctrl и Ces, вместе участвующих в металлировании СОД1, подавлена. Очевидно, что у новорожденных СОД1 металлируется CCS-независимым путем. У новорожденных в печени повышена активность гена Mtla, в белке МТ повышено содержание меди и в кровотоке циркулирует МТ, содержащий медь. Можно предположить, что (Си)МТ печени служит донором меди для других органов.

В клетках надпочечников снижение содержания меди начинается с 1 -го дня жизни, а к 5-му дню концентрация меди достигает уровня, характерного для

взрослых животных. Динамика снижения концентрации меди в надпочечниках обратно пропорциональна увеличению их массы, что, возможно, указывает на то, что абсолютное содержание меди в них не меняется. В надпочечниках крыс не происходит перестройки системы обмена меди при переходе на ВТММ. В результате экспрессии гена Ср продуцируется заякоренная в мембрану изоформа ГФИ-ЦП, количество мРНК данной изоформы увеличивается в течение развития. Ген Ctrl экспрессируется на высоком уровне. Ген, кодирующий АТР7А, активен от рождения, и в течение онтогенеза его активность увеличивается, в то время как экспрессии гена Atp7b не происходит вообще. Гены Sodl и Ces экспрессируются на близком уровне и их активность не меняется при переключении на ВТММ. Очевидной связи между метаболизмом меди в печени и надпочечниках в течение ЭТММ не выявлено, но можно предположить, что в этот период (Си)МТ является донором меди для надпочечников.

ВЫВОДЫ

1. Метаболизм меди в печени зависит от надпочечников: адреналэктомия повышает определяемые печенью показатели статуса меди в крови, вызывает накопление меди в гепатоцитах и перераспределение меди между цитозолем и митохондриями. Адреналэктомия влияет на металлирование СОД1 и церулоплазмина, увеличивает удельное содержание меди в металлотионеине и изменяет протеом митохондрий. Экспрессия генов, связанных с метаболизмом меди, не контролируется гормонами надпочечников.

2. В печени новорожденных крыс в течение эмбрионального типа метаболизма меди происходит внутриклеточное перераспределение аккумулированной меди: после рождения медь накапливается в ядрах и затем перемещается в митохондрии. Перемещение меди не сопровождается изменением профиля экспрессии или активности генов метаболизма меди, взятых в рассмотрение.

3. В печени новорожденных крыс активность генов Ctrl и Ces, участвующих в металлировании СОД1, подавлена и не соответствует содержанию СОД1-мРНК, концентрации иммунореактивных полипептидов СОД1 и ее ферментативной активности. При взрослом типе метаболизма меди активности генов Ctrl, Ces и Sodl соответствуют друг другу. Пути металлирования СОД1, центрального фермента антиоксидантной системы, у новорожденных и взрослых млекопитающих отличаются. У новорожденных крыс, в отличие от взрослых, ген Ctr2, белковый продукт которого импортирует медь из лизосом в цитозоль, активнее гена Ctrl, импортера внеклеточной меди.

4. В надпочечниках нет выраженных эмбрионального и взрослого типов метаболизма меди: медь не аккумулируется у новорожденных, профиль экспрессии генов медьтранспортных белков и уровень их активности практически не меняются. Метаболизм меди в надпочечниках имеет много общего с клетками негепатоцитарных рядов: из генов двух Си(1)-АТФаз экспрессируется только Atp7a, ген Ср активен, но синтезируется только сплайс-изоформа ГФИ-ЦП.

ОСНОВНЫЕ ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Василенко Ю.А., Ильичёва Е.Ю. "Влияние адреналэктомии на метаболизм меди в печени и почках" // Материалы 15ой Пущинской Международной школы-конференции молодых ученых "Биология - наука 21 века", Пущино, Россия, 18-22 апреля, 2011, С.99.

2. Vasilenko Yu.A„ Ifyechova E.Yu., Zatulovskiy E.A., Babich P.S., Tsymbalenko N. V., Puchkova L.V. "Involvement of adrenal glands in copper homeostasis in rats" // Abstracts of 11th International Symposium of Metal Ions in Biology and Medicine, Cambridge, UK, 20-23 June, 2011, P.106.

3. Ilyechova E. Yu„ Skvortsov A.N., Babich P.S., Zatulovskiy E.A., Vasilenko Yu.A„ Petrova E.S., Korzhevskii D.E., Sapronov N.S., Tsymbalenko N.V., Puchkova L.V. "In vivo model for studying the role of copper in the development of the skeletal system of mammals" // Abstracts of 11th International Symposium of Metal Ions in Biology and Medicine, Cambridge, UK, 2023 June, 2011, P.105.

4. Василенко Ю.А. "Онтогенетические изменения метаболизма меди в клетках надпочечников крыс" // Материалы 16ой Пущинской Международной школы-конференции молодых ученых "Биология - наука 21 века", Пущино, Россия, 16-21 апреля, 2012, С. 171.

5. Василенко Ю.А., Ильичёва Е.Ю., Затуловский Е.А., Бабич П.С., Пучкова Л.В. "Изменение обмена меди в печени адреналэктомированных крыс" // Доклады академии наук. 2012. Т.445(5): 597-601.

6. Ilyechova E.Yu., Vasilenko Yu.A., Skvortsov A.N., N Tsymbalenko N.V., Puchkova L.V. "Changes of expression of copper associated genes in adrenal glands during development" // Abstracts of 8th International Copper Meeting "Copper in Biology", Alghero, Sardinia, Italy, September 30 - October 5, 2012, P.59.

7. Vasilenko Yu.A.. Ilyechova E.Yu., Tikhoplav V.Yu., Tsymbalenko N.V., Skvortsov A.N., Puchkova L. V. "Changes of cuproenzymes metallation in the liver of adrenalectomized rats" // Abstracts of International Workshop on Human Disorders of Copper Metabolism: Recent Advances and Main Challenges, Baltimore, MD, USA, 8-9 April, 2013, P.46.

8. Василенко Ю.А.. Тихоплае В.Ю. "Изменение формирования купроэнзимов в печени адреналэктомированных крыс и время зависимые онтогенетические изменения метаболизма меди в печени и надпочечниках" // Материалы молодежной научной конференции в рамках Политехнического молодежного фестиваля науки, Санкт-Петербург, Россия, 23-24 мая, 2013, С.130-131.

9. Vasilenko Yu.A., Tikhoplav V. Yu„ Puchkova L. V. "Formation of copper metabolic system in adrenal glands during development and link between adrenal glands and copper metabolism in liver" // FEBS Journal. 2013. 280 (Suppl 1): 257.

10. Тихоплае В.Ю., Затуловская Ю.А. "Изменение метаболизма меди в надпочечниках крыс в процессе онтогенеза" // Тезисы XLII Теоретической и Практической Конференции с Международным участием «Неделя науки в СПбГПУ», Санкт-Петербург, Россия, 2-7 декабря, 2013.

11. Ilyechova E.Y., Saveliev A.N., Skvortsov A.N., Babich P.S., Zatulovskaia Yu.A.. Pliss M.G., Korzhevskii D.E., Tsymbalenko N. V., Puchkova L. V. The effects of silver ions on copper metabolism in rats // Metallomics. 2014. 6: 1970-1987.

12. Zatulovskaia Yu.A., Puchkova L.V. A study of embryonic type of copper metabolism in rats and its switch to adult type // FEBS Journal. 2014. 281 (Suppl si): 544-545.

13. Пучкова JI.В., Затуловская Ю.А., Тихоплае В.Ю. "Изменение гомеодинамики меди в печени адреналэктомированных животных" // Тезисы IV съезда физиологов СНГ «Физиология и здоровье человека», Сочи - Дагомыс, Россия, 8-12 октября, 2014.

Работа поддержана грантами РФФИ (№12-04-01530-а) и Правительства Санкт-Петербурга

2013 и 2014 годов.

Список генов, активность которых рассмотрена в работе

1. Ген Ctrl кодирует высокоаффинный импортер меди, который локализован на плазматической мембране, переносит Си1+ в цитозоль.

2. Ген Ctr2 кодирует низкоаффинный транспортер меди. Белок CTR2 локализован в ранних эндосомах и лизосомах, участвует в переносе Си1+ из лизосом в цитозоль.

3. Гены Atp7a и Atp7b кодируют Си(1)/Си(Н)-транспортные АТФазы PI типа, локализованные в мембранах аппарата Гольджи и участвующие во встраивании меди в секреторные белки и в ее экскреции.

4. Ген Ces кодирует Си(1)-шаперон для СОД1, который, одновременно связываясь с CTR1 и апо-СОД1, принимает атом меди от CTR1, встраивает его в активный центр апо-СОД1.

5. Ген Ср, продуктами которого являются секреторный ЦП и его заякоренная в мембрану сплайс-изоформа ГФИ-ЦП. Секреторный ЦП сочетает в себе функции медь-транспортного белка, осуществляющего доставку ионов меди к клеткам негепатоцитарных рядов, и (ферр)оксидазы. ГФИ-ЦП участвует в мобилизации железа из клеток и проявляет антиоксидантную активность.

6. Ген Sodl кодирует купроэнзим цитозоля Cu/Zn-супероксиддисмутазу (СОД1), участвующую в системе детоксикации активных радикалов в цитозоле всех типов клеток. В качестве сравнения была также оценена экспрессия гена Sod2, кодирующего митохондриальную медь-независимую Мп-СОД.

7. Ген Сох4И кодирует изоформу 1 субъединицы IV ЦО, купроэнзима, являющегося терминальным звеном цепи переноса электронов в митохондриях. Экспрессия данного гена строго коррелирует со сборкой и функционированием целого комплекса ЦО, поэтому по уровню активности этого гена можно судить об активности всей ЦО.

8. Ген Рат кодирует пептидилглицин а-амидирующую монооксигеназу (РАМ), специфический купроэнзим нейроэндокринной системы и надпочечников, катализирущий а-амидирование нейропептидов и пептидных гормонов.

9. Ген Mtla кодирует изоформу 1а белка МТ, связывающего на 1 молекулу примерно 6-8 атомов Cu(I).

10. Ген Commdl кодирует цитозольный белок COMMD1, координирующий медь в состоянии окисления Cu(II) и участвующий в выведении меди из клетки.

Подписано в печать 24.10.2014 Формат 60x84 'Л6 Цифровая Печ. л. 1.0 Тираж 120 Заказ 28/10 печать

Типография «Фалкон Принт» (197101, г. Санкт-Петербург, ул. Большая Пушкарская, д. 54, офис 2)