Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование условий реализации тканеспецифического контроля дыхания и окислительного фосфорилирования митохондрий из печени крысы

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Исследование условий реализации тканеспецифического контроля дыхания и окислительного фосфорилирования митохондрий из печени крысы"

Форма 3.3

ЕРЕВАНСКИЙ ОРДЕНА ТГ/ДСВОГЭ КРАСНОГО 3!1АМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

На правах рукописи

ЭЛБАКИДЗЕ Ирина Михайловна

ИССЛЕДОВАНИЕ УСЛОЗИЛ РЕАЛИЗАЦИИ тКЕСПЕЩЖ-ЕСКОГО КОНТРОЛЯ ДЫХАНИЯ И ОКИСЛИТЕЛЬНОГО '¿ОС'ЗОРИЛИРОВАНИЯ МИТОХОНДРИЯ ИЗ ПЕЧЕНИ КРЫСЫ

( 03.00.02 - Биофизика )

Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

ЕРЕВАН - 1990

Работа выполнена в лаборатории биофизических испытаний Научно-исследовательского института технологии и 'безопасности лекарственных средств.

'Научный руководитель: кандидат биологических наук

Г.М.ЭЛЕАКИЛЗЕ

Официальные оппоненты: член-корреспондент АН Армении,

доктор биологических наук, профессор С.С.ОГАНЕСЯН

доктор биологических наук С.А.Ш2ИНЯН

Ведущая организация: Институт Биофизики АН СССР

Защита диссертации состоится "J?fl " kjQA$flSL 1990 г. в час. на заседании специализированного Совета К 055.01.08 по присужден;:*) ученой степени кандидата биологических наук при Ереванском Ордена Трудового Красного Знамени Государственном Унпварслгете /37504Э, Ереван, ул.Мраэяна, 1, Ереванский Университет, биологический факультет, кафедра биофизики/.

С диссертацией кохно ознакомиться в библиотеке Университета.

Автореферат разослан

О1990 г.

Ученый секретарь специализированного Совета, кандидат биологических наук Л.Г.АНАНЯН

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ .

Актуальность темы. Физиологически активные соединения природного происхождения широко применяются в медицине в,качестве средств для коррекции функционального состояния органов и тканей. В связи с этим поиск и изучение свойств эндогенных регуляторов метаболизма представляет не только теоретический, но и практический интерес. В последние годы большое внимание уделяется исследованию эффекторов внутритканевых межклеточных взаимодействий, к которым относятся кейлоны (виНоидЬ ,и>игепсе ,1960; уег1у ,1976), контактины (Маленков с соавт., 1977) и комутоны (Элбакидзе, Миронова, Кондрашова, 1974; Элбакидзе, Ливанова, 1977). Общим свойством этих регуляторов является тканевая специфичность действия в отношении регулируемых ими процессов. Показано, что кейлоны и контактины тормозят рост вырабатывающих их тканей, подавляя синтез ДНК в ядрах клеток. Было обнаружено, что комутоны тканеспецифически стимулируют -дыхание митохондрий в среде с субстратом и разобщают окислительное фосфорнлнроваппе митохондрий из гомологичной ткани (Элбакидзе, Ливанова, 1977; Элбакидзе, Духин, 1984). Существование комутонов было показано в печени, почке, сердце, легком и тимусе крысы (Элбакидзе, 1979), а также в печени других животных (Ливанова, Элбакидзе, 1980).

Механизмы, определяющие характер эффектов комутона в отношении гомологичных митохондрий, а также условия активации кому-тонной регуляции оставались неизученными. Их исследование способствовало бы более полному пониманию места этой регуляции в системе механизмов внутритканевой интеграции клеток.

Цель исследования. Изучение условий реализации комутонной регуляции дыхания и окислительного фосфорилирования митохондрий из печени крысы.

Задачи исследования. I. Изучение факторов, влияющих на характер действия комутона печени в отношении дыхания и окислительного фосфорилирования гомологичных митохондрий. 2. Изучение условий активации комутонной регуляции в печени крысы "ин виво". 3. Изучение некоторых физико-химических свойств комутона и его действия на мптохопцриалыше процессы.

Научная новизна. В работе впервые показано, что лимитированный транспорт ионов Са в митохондрии, а также активация

перекисного окисления липидов в митохондриальной мембране может изменять характер комутонной рефляции, что выражается в дополнении тканеснецифической стимуляции скорости тканеспецифи-ческим разобщением окислительного фосфорилирования.

Впервые обнаружено, что активация комутонной регуляции в печени происходит при повышении нагрузки на специальные функции этого органа, а также после повреждения её клеток. Установлено, что комутон, образующийся в печени в этих условиях, термостабилен. Фракционирование комутона, активирующегося в печени крысы, под действием продигиозана показало, что этот регулятор является низкомолекулярным соединением, отрицательно заряженным при щелочном рН. Высокоочищенный препарат термостабильного комутона тканеспецифически стимулирует дыхание митохондрий в среде с субстратом у^тактных митохондрий и вызывает разобщение окислительного фосфорнлирования у митохондрий, преинкубированных с ионами Са . Он не влияет на отношение Са^+/0, но усиливает высокоамплитудное набухание митохондрий, индуцированное ионами Са2+ и Н^РО^. ( '

Практическая ценность. Разработка методов, позволяющих значительно увэличивать активность комутона в печени,^а также выявление условий, влияющих на характер проявления этой активности в отношении ОФ,' представляет практический интерес. Полученные результаты могут быть использрваны в лабораториях, занимающихся исследованием механизмов внутритканевых резуляций и проблемами биоэнергетики. .

Апробация работы и публикации. Материалы диссертации доложены на Международном симпозиуме по 'биологической регуляции клеточной пролиферации (9-ой кейлонной конференции), Милан, 1986 г., на I и П Всесоюзных Школах-семинарах "Регуляция тканевого гомеостаза. Нетоксическая профилактика и терапия хронических патологий", Тбилиси, 1987 г. и 1989 г. По теме диссертации опубликовано 10 работ.

Структура диссертации. Диссертация состоит из введения, 6 глав, выводов и списка литературы, включающего 215 наименований. Текст изложен на 154 страницах и иллюстрирован 46 рисунками.

Введенные сокращения. МХ - митохондрии; Ой - окислительное фосфоршшрование; ПОЛ - перекисное окисление липидов; ВАН -высокоамплитудное набухание; БЦФ - безмитохондриальная цитоплаз-матическая фракция; РФК - растворимая фаза клеток;' РК - рутений

красный. . .

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Обзор литературы содержит сведения об основных принципах организации и регуляторннх механизмах ОФ МХ, а также данные о синтетических и эндогенных разобщителях. Рассмотрено современное состояние проблемы механизмов внутритканевых регуляций.

Методы исследования изложены во 2-й главе диссертации.

Препаративнне методы. МХ из печени и почки крыс выделяли методом Шнейдера в кодификации (Мосолова с соавт., 1975). Среда выделения МХ печени содержала 280 мМ сахарозы и 10 мМ трис-буфе-ра, рН 7,4. В среду выделения МХ почки вместо трис-буфера вводили 5 мМ ЭДТА, рН 7,4. Комутонсодержащую БЦФ из печени крысы получали методом (Элбакидзе, Устинов, 1984). Среда выделения состояла из 280 мМ сахарозы и 20 мМ трис-буфера, рН 9,0. БЦФ отделяли от ядерной и митохонцриальной фракций посредством их одновременного осаждения из гомогената центрифугированием при 10000x9, 20 мин. Комутонсодоржапу'гз РФХ из печени получали методом Зрнсте-ра и Джонса в модификации (Элбакидзе, Ливанова, 1977). Гомогенат печени, приготовленный па среде выделения БЦФ подвергали ультрацентрифугированию при 105000х д в течение I часа для одновременного осаждения всех клеточных органелл. Супернатант (РФК) хранили при 0°С, рН 9,0. '

Температурное фракционирование комутонсодержащей ЩФ проводили при рН 7,0 (20°С) посредством её прогрева при 90°С в течение 10 мин.

Гель-фильтрацию термостабилъной ЕЦФ проводили на колонке сефадекса с -25 (грубый) размерами 530x35 мм.

Комутонсодержащий элюат, полученный в результате гель-фильтрации, использовали для колоночной хроматографии и рехрома-тографии на ДЭАЭ-целлюлозе (ДЕ-52) на колонке размерами 35x20 глм. Элгоированпе проводили 50 мМ КС1 с 10 мМ трис-буфера, рН 9,0. Комутоноодержащий элюат использовали-для рехроматографии на той же колонке. В ходе этой процедуры нанесенный материал, предварительно разведенный в 10 раз, 10 мМ трис-буфером, рН 9,0, элюиро-вали ступенчато раствором КС1 в интервале концентраций от 15 до 100 мМ с 10 мМ трис-буфера, рН 9,0.

Ионообменную хроматографию на колонке с Тойоперяом-650М размерами 180x15 мм в градиенте концентраций КС1 проводили с использованием комутонсодержащего элюата после ионообменной хрома-

тографии на ДЕ-52. Первоначально нанесенный материал,предварительно разведенный в 10 раз 2 Л трис-буфером, эЛюировали 2 мМ трис-буфером pH 7,0, затем 5 мМ KCl в том не буфере, после чего продолжали элшрование в градиенте концентраций KCl от 5 до 15 мМ; На колонку с Дауэксом 1x4 размерами 180x10 мм наносили кому-тонсодержащуго фракцию после гель-фильтрации на сефадексе g-25. Затем проводили ступенчатое элюирование раствором KCl на 2 мМ трис-буфере, pH 9,0 в интервале концентраций KCl от 30 до 100 мМ, после чего создавали градиент KCl в интервале от 100 до 250 Mlvf KCl на том же буферном растворе.

Аналитические методы. Оценку активности комутона печени проводили по величине тканеспецифических эффектов этого регулятора в отношении дыхания и ОФ MX из гомологичной ткани. Для выявления тканевой специфичности упомянутых эффектов сравнивали действие фракций из печени на параметры дыхания и ОФ MX печени и почки, регистрируемых полярографическим методом. Измерения дыхания и ОФ MX проводили,в закрытой термостатируемой'при 28°С ячейке объемом I ш о вращающимся платиновым электродом и ртутно-каломельным электродом сравнения.' Среда инкубации с учетом добавления инградиентов комутонсодержащей фракции в пропорции 1:1 состояла из 280 мМ оахарозы, 3 мМ ЭДТА, 3 мМ КН^РО^, 5 мМ сукци-ната и 10 мМ трис-буфера, pH 7,0. Суспензию MX (2 мг белка/мл) добавляли в ячейку после введения в неё комутонсодержащей фракции и начинали регистрацию дыхания в состояниях 4' , 3 и 4, вплоть до полного исчерпания кислорода в ячейкб.

Затем рассчитывали количество кислорода, потребленного MX в активном метаболическом состоянии ( Д0акт) и время фосфорилирования АДФ ( добавленного в среду инкубации. За единицу активности комутона было пронято тканеспецифическое увеличение скорости v4. у интактных MX печени в-,2 раза под действием комутонсодержащей фракции в стандартных условиях эксперимента.

С целью определения отношения Са^+/0 полярографическим методом измеряли количество кислорода, поглощенного в ходе транспорта Са^+ в матрикс этих- органам. Среда инкубации состояла из 280 мМ сахарозы, 0,7 мМ KHgPO^ 5 мМ сукцината и 10 мМ трис-бу-фера pH 7,0. Через 1-1,5 мин после начала регистрации Дыхания в среду добавляли 200 мкМ CaCIg и продолжали регистрацию дыхания вплоть до полного исчерпания кислорода в ячейке.

Йзмерение кальциевой емкости MX проводили рН-электродом в

открытой ячейке объемом 3 мл, термостатируемой при 28°С при непрерывном перемешивании среды инкубации, содержавшей 280 мМ сахарозы, 3 мМ трис-буфера, рН 7,5, 3 мМ КН^РО^ I мМ Мдс12 , 5 мМ сукцината, 50 мкМ АДФ, 4 мкг ротенона и 4 мкг олигомицина, в которую добавляли МХ (2 мг балка/мл).

ВАН регистрировали путем измерения оптической плотности суспензии этих органелл на 520 нм в кювете объемом 1,5 мл и длиной оптического пути в 0,5 см на спектрофотометре СФ-26. Среда инкубации содержала 150 мМ сахарозы, 50 мМ КС1, 10 мМ трис-буфера, рН 7,0.

Количество белка в препарате МХ определяли'по методу Лоури. Содержание белка в комутонсодержащих фракциях оценивали по поглощению раствора на 280 нм на спектрофотометре СФ-26, а также по Лоури.

Приведенные результаты являются средними по 3-5 экспериментам. При статистической обработке данных применяли метод вычисления ошибки генерального среднего.

Результаты экспериментов изложены в 3-5 главах диссертации. В предыдущих исследованиях было' показайо, что характер действия комутона из печени на гомологичные МХ зависит от степени интант-ности этих органелл (Элбакидзе, Духин, 1984). В процессе их старения тканеспецифическая стимуляция , наблюдаемая под действием комутона, не снимаемая олигомицином, дополнялась у МХ тканеспецифическкм разобщением ОФ. Причины изменения характера комутонной регуляции оставались неизвестными. С целью исследования этого вопроса нами было изучено влияние кратковременной пре-инкубации МХ с ионами Са^+ в различных концентрациях. Преинкуба-цию проводили в полярографической ячейке в присутствии комутонсо держащей фракции и -без нее. Затем ионы связывали добавлением ЭДТА и проводили регистрацию цнхания МХ в состояниях "4' ", "3" и "4". Эксперименты провопили в условиях "лимитированного" и "массивного" транспорта ионов Са^+ в МХ. Было установлено, что в обоих случаях характер действия комутона печени в отношении гомологичных МХ изменяется единообразно. Преинкубация МХ с более низкими концентрациями Са^+ вызывала тканеспецифическое увеличение Д0акт , не чувствительное к ротенону. При повышении концентрации ионов Са тканеспецифический разобщающий эффект наблюдался лишь в присутствии ротенона в среде инкубации. Преинкубация с ионами Са МХ печени и почки в отсутствие комутонсодер-

жащей ЕЦФ печени, а также МХ почки в присутствии.упомянутой фракции не влияла на сопряжение' их ОФ во всем диапазоне испытанных концентраций Са^+.

Наблюдавшаяся на интактных МХ тканеспецифическая стимуляция у4> , не снимаемая олигомицином, получила название с* -состояния комутонной регуляции. Тканеспецифическое разобщение ОФ МХ, не чувствительное к ротенону.и ротенон-зависимый разобщающий эффекты комутона были названы у4 - и ¿--состояниями комутонной регуляция, соответственно.

Показано, что РК обладает способностью ингибировать транспорт ионов Са из наружного пространства в матрикс МХ (УавЗ-пд-

гогг а1 ,1972). Добавление этого ингибитора в среду инкубации

о.

перед введением в нее ионов Са в наших экспериментах полностью блокировало индутада р> - и ^-состояний комутонной регуляции. РК усиливал также тканеспецифическую и нетканеспецифическую компоненты скоростей ^д. при концентрациях ионов Са^+, индуцирующих /3-й ¿"-состояния исследуемой регуляции. Между тем РК, введенный по окончании преинкубадии МХ с ионами Са^+ на индукцию этих состояний влияния не оказывал (рис.1). Действующие концентрации РК не оказывали влияния на параметры дыхания печени и почки в отсутствие ^омутонсодержащей фракции.

Было исследовано также влияние хлорпромазина - ингибитора МХ-фосфолипазы А - на индукцию р> - и $ -состояний комутонной регуляции ионами Са2+ (МасЬЬаиг ег а1д972). Добавление в среду инкубации МХ хлорпромазина перед их преинкубацией с ионами Са^+ предотвращало индукцию р>-состояния комутонной регуляции.

Нами было изучено влияние ионов Рв3+ на ¿ндукцию ¡ь - я ^ -состояний комутонной регуляции. Как известно, эти ионы обладают способностью активировать ПОЛ' в МХ-мембране (Кудзина с со-авт., 1979). Преинкубацию МХ из печени и почки с Рв2<Б04^з проводили в полярографической ячейке в присутствии РФК из печени и без этой фракции. Затем в среду добавляли 3 мМ ЭДТА для связывания ионов Ре3+ . Одновременно вводили 5 мМ сукцината в качестве субстрата и через 30 сек добавляли АДФ. Было установлено, что преинкубация МХ печени с 0,6-0,8 Ш Ре3+ в присутствии комутонсодержащей фракции приводит к индукции р> -состояния комутонной регуляции. При I мМ этих ионов было индуцировано ^ -состояние комутонной регуляции (рис.2).

Как известно, ПОЛ можно ингибировать добавлением ионола-

(Эмануэль, Лясковская, 1961) и сукцината (Кудзина с соавт., 1979). Было установлено, что как ионол, так и сукцинат, добав-

цоо-

300-

2QQ-

100

1

23456789

<0

Рис.1. Влияние FK, ионов К+ и хлорпромазина на индукцию /з-состояния- комутонной регуляции ионами Ордината - величина лОакт.У MX печени (бадые столбики) и почки (заштрихованные столбики) з присутствии РФК печени, в процентах от их значений у интактных MX. 1-6 - среда инкубации без фосфата; 1-4 - в среде 4р мМ KCl,- 5,6 - в среде 6 мМ KCI;0I - MX без преинкуоации с 2-6 - преинкубация с Саг+; 3,4 - добавление PK (10 нМ/мг белка Ж); 4,6 -добавлен ротенон (0,5 мкг/мг белка MX); 7-10 - среда с 3 мМ фосфата; 7 -JAX без пюеинкубации с Са^+; 8-10 -преинкубация с 9,10 - добавление хлорпромазина (0,6 мы); 10 -. добавлен ротенон (0,5 мкг/мг белка MX).

ленные в среду инкубации перед преинкубацией MX с ионами Fe3+ предотвращают индукцию fi> -состояния комутонной регуляции. Введение их после завершения преинкубации не влияло на этот процесс.

Рис.2. Влияние ионола, сукцината и ионов К+ на индукцию л-состояния ко-музюнной регуляции ионами Fe . Ордината и обозначения - те же, что и на рис.1. I - без преинкубации с Fe , 2-8 -МХ-дреинкубировали с Fe-3^ ; 1-6 — в среде 40 мМ KCl; 7,8 - в среде 6 мМ KCl; 3,4 - добавлен ионол (2 мМ); 5,6 - добавлен сукцинат; 4,6,8 -добавлен ротенон (0,5 мкг/мг белка Ж).

Воздействие на MX ионами Са'"+, равно как и актизация ПОЛ в МХ-

мембране могут приводить к появлению неспецифической проницае-

цоо-

500-

200-

100

EL 1

ига

из

3

- 10 - •' . мостя этой мембраны для моновалентных катионов. В связи с этим было изучено влияние ионов КГ1" на индукцию р -состояния комутоя-ной регуляции ионами Са2+ и Ре3*. Оказалось, что понижение концентрации К4" с 40 до 6 мМ предотвращает индукцию р -состояния комутонной резуляции упомянутыми ионами, вне зависимости от присутствия ротенона е'среде инкубации. Далее было показано, что при 42 мМ К*" в среде инкубации максимальное по величине ткаяе-сдецифическое разобщение ОФ МХ печени гомологичным Комутоном происходило после преиннубации МХ с 0,2 мМ Са2+. Между тем, при 6 мМ К1" действующая концентрация Са2+ лри индукции р> -состояния комутонной регуляции повышалась до 1,8 мМ Са2+ (рлс.3).

Рис. 3. Индукция /з -состояния комутонной регуляции у МХ печени, ионами Саг+ в условиях лимитированного транспорта этих ионов в МХ, в присутствии комутрнсодержащей РФК печени при различных концентрациях ионов К4" в среде инкубация Абсцисса - концентрация Са^+ при преинкубации с МХ; ордината -&0акг V МХ в присутствии РФК печени, в % от величины этих параметров у интактных МХ. 1,2 - в среде 40 мМ КС1; 3,4 - з среде 6 мМ КС1; 1,3 - МХ печени, 2,4 -МХ почки.

Ранее было показано, что тканеспецифическое разобщение ОФ под действием РФК печени происходит при' повышении концентрации неорганического фосфата в среде инкубации (Ливанова, Злбакидзе, 1980). Нами было установлено, что понижение концентрации.ионов К1" с 40 до 6 мМ и в этом случае предотвращает тканеспецифическое разобщение ОФ МХ печени комутоном.

Нами бшго проведено исследование условий активации номутон ной регуляции в печени крысы "ин виео". В этой серии экспериментов для тестирования активности комутона использовали МХ печени почки тех же сроков после воздействия, что и комутонсодержащие фракции.

Наш было изучено влияние иятрагастральноЛ. инфузии глкыозы её сочетания с внутрибрюшинным введением инсулина, а танки ин-трагастральной инфузии растительного масла и фенобарбитала крысам, голодавшим в течение I суток, на активность комутона в печени.

'Установлено, что тканеспецифнческая стимуляция и v4

наблюдается в печени через 3 ч. после введения глюкозы. Она резко возрастает на 5-ый и практически отсутствует на 7 и 13 ч. после этого воздействия. Тканеспецифическое увеличение имеет место на 5-6 ч. после янфузии и полностью исчезает на 13 ч. (рис.4). Добавление ротенона в среду инкубации не влияло на характер влияния номутонсодержащей фракции на регистрируемые процессы.

(00-

50-

<0 <2 й <6 О

Рис.4. Влияние штрагастраль-ной инфузии глюкозы (1,2) и раститального масла (3,4) на активность комутона в печени крысы. Абсцисса - время после инфузии (часы), ордината -скорость дыхания и ЛОакт. У МХ печени в присутствии гомологичной ЕЦФ за вычетом влияния этой фракции на МХ почки (в % от величин параметров у МХ печени и почки в отсутствие этой фракции). 1,3 - V, 2,4 - Л0от,т

4'

При сочетанном воздействий инсулином и глюкозой с I по 5 ч. после введения глюкозы у МХ печени в присутствии гомологичной ЕЦФ наблюдается лишь тканеспецифическая стимуляция . Разобщающий эффект комутона отсутствовал и в опытах, проведенных на среде инкубации с ротеноном. После инфузии растительного масла тканеспецифическая стимуляция и У МХ печени в присутствии гомологичной ЕЦФ появляется через 8 ч., сохраняется до 14 ч. и исчезает к 18 ч. после этого воздействия. Тканеспецифическое разобщение ОФ МХ в этих экспериментах также отсутствовало как в среде без ротенона, так и при добавлении этого ингибитора (рис.4).

Под действием фенобарбитала тканеспецифическая стимуляция дыхания МХ печени в среде с субстратом в присутствии гомологичной РЖ достигала максимума утке через 2 ч. после его инфузии, затем понижалась' на "4-6"ч. и полностью исче'зала на 8 ч. Тканеспецифи-ческие изменения ОФ в рассматриваемых экспериментах полностью отсутствовали (рис.5). Добавление ротенона не отражалось на характере эффектов комутона. Были проведены эксперименты по измерению активности комутона в печени после интрагастральной инфузии СС14, внутрибрюшинного введения продигиозана и в опытах с продолжительным голоданием животных.

- 12 -

Введение СС14 вызывает тканеспецифическую стимуляцию дыхания МХ печени в состояниях "4' " и "4" в присутствии гомологичной ЕЦФ уже через 2 ч. после этого воздействия. Она достигает максимума на 4-6 ч. и остается на высоком уровне вплоть до окончания измерений на 8 ч. эксперимента (рис.5). Тканеспецифический разобщающий эффект комутона не наблюдался как в отсутствие роте-нона в среде инкубации, так и при добавлении в неё этого ингибитора.

Рис.5. Влияние интрагастраль-ной инфузии фенобарбитала (1,2) и ОСЬ (3,4) на активность комутона в печени крысы, Абсцисса и ордината - те же, что и на рис.4.

При изучении влияния продигиозана на активность комутона в печени крысы было установлено, что тканеспецифическая стимуляция дыхания МХ в среде с субстратом в присутствии гомологичной ЕЦФ наблюдается под действием всех испытанных, концентраций этого ■ эндотоксина. Наиболее эффективным оказалось,введение продигиозана в концентрации 500 мкг/кг массы.(рис.6). Тканеспецифическое разобщение ОФ МХ в описываемых экспериментах отсутствовало как в среде без ротенона, так и при добавлении этого ингибитора.

Рис.6. Влияние парэнтерального введения продигиозана на скорость дыхания V.. у МХ из печени (I) и почки (2) крысы в присутствии РЖ печени. Абсцисса - дозы продигиозана (мкг/кг веса животного), ордината - скорость дыхания (в % от её величины в отсутствие РЖ печени).

Исследование динамики активности комутона печени у крыс в ходе продолжительного голодания показало, что в течение первых суток происходит резкое понижение этой активности, выражающееся в уменьшении тканеспецифической стимуляции скоростей ч4. и при отсутствии эффектов комутона в отношении Оф. На'2-е сутки ■

активность комутона в печени крысы полностью отсутствовала. Тканеспецифическая стимуляция у4 вновь появлялась на 3-й сутки и достигала максимума по величине на 4-е сутки голодания. Затем она понижалась на 5-е сутки и полностью исчезала на 6-е сутки. Тканеспецифический разобщающий эффект комутона наблюдался на 4-е сутки голодания и сохранялся на 5-е сутки. Добавление в среду инкубации ротенона не оказывало действия на величины эффектов комутона в отношении дыхания и ОФ МХ.

Был исследован вопрос о возможном вкладе функционального состояния МХ в реализацию комутонной регуляции в печени после инфузии животным глюкозы. С этой целью активность комутона в печени крыс, которым проводили инфузшо глюкозы, тестировали на Ж из печени и почки интактных животных. Тканеспецифический эффект ЕЦФ в отношении дыхания МХ печени полностью отсутствовал в среде без ротенона и при его добавлении..Тканеспецифическое разобщение ОФ МХ, усиливающееся ротеноном под действием ЕЦФ, имело место через I ч. после инфузии глюкозы. На 2 ч. разобщающий эффект комутона уменьшался по величине,и добавление ротенона не приводило к его увеличению.

Были проведены эксперименты по тестированию активности комутона в печени крысы после интрагастральной инфузии глюкозы в сочетании с инъекцией инсулина на МХ, полученных из печени и почки интактных животных. Крысы в этой серии опытов содержались на зерновой диете. РФК из печени интактных крыс не влияла на дыхание и ОФ МХ в среде с' ротеноном и без него. Между тем, РФК, полученная из печени через 0,5-2 ч. после введения глюкозы, вызывала у гомологичных МХ в среде с ротеноном тканеспецифическуга стимуляцию , а через 1ч.- тканеспецифическое увеличение

л0акт.

Были проведены эксперименты по изучению основных физико-химических свойств комутона, активируемого в печени крысы под влиянием различных воздействий. Комутонсодёржащие ЕЦФ, полученные после интрагастральной инфузии глюкозы, фенобарбитала, четы-реххлористого углерода, а также в результате внутрибрюшинного введения продигиозана, подвергали прогреву при 90°С в течение •20 мин. Было установлено, что прогрев не влиял- на величину ткане-специфической стимуляции скорости дыхания Ж в среде с субстратом в присутствии этих фракций. Оказалось, что активность комутона, полученная в результате перечисленных воздействий, устойчи-

ва я к аэрированию в течение 60 минут. Для дальнейшего фракционирования использовали комутонсодержащую термостабильную ЕЦФ, полученную из печени животных, которым предварительно вводили пррдЕгиозан. В результате гель-фильтрации на колонке с сефадексом- с -25 (грубый) материал разделялся на три пика. Активность комутона была зарегистрирована в Ш пике (рис.7).

Рис.7. Профиль элюции термостабильной ЕЦФ печени при гель-фильтрации на колонке с сефадексом Б -25 (грубый). Абсцисса - № пробирок, левая ордината - логло-щение проб при 280 нм, правая ордината - тканеспецисБическая стимуляция дыхания У4.*умх печени в присутствии ЕЦФ, в %. от величины этого параметра у интактных МХ. Сплошная линия - Ё280^ пунктир - тканеспецифпческие изменения V.. у МХ печени в присутствии элюата.

Было показано, что при щелочном рН молекулы комутона не • взаимодействуют с КМ-целлшозой, но сорбируются на ДЭАЭ-целлило-зе. В связи с этим дальнейшее фракционирование проводилось на колонке с ДЭАЭ-цаллшозой. Нанесенный на эту колонку материал разделился на два пика. Активность комутона элюировалась с колонки вместе со П пиком. Далее, комутонсодержащий элюат был использован для рехроматографии на той же колонке, но уже в условиях ступенчатого элюирования повышающимися концентрациями КС1. Нанесенная на колонат фракция в результате описанной процедуры была разделена на два пика, причем активность комутона присутствовала в I пике. Было проведено также фракционирование комутонсодержащей фракции, полученной путем гель-фильтрации термостабильной ЕЦФ на колонке с сефадексом в-25 (грубый), на колонке с Тойоперлом. марки "ДЕАЕ-650М". Фракционируемый материал в этом эксперименте разделился на три пика.

Было осуществлено фракционирование комутонсодержащей фракции, полученной после гель-фильтрации на колонке с сефадексом в-25 (грубый) на колонке с ионообменной смолой марки Дауэкс -1x4. Ступенчатое элюирование нанесенного материала раствором КС1 с последующим градиентом раствора этой соли позволило разделить комутонсодержащую фракцию на 4 пика. Активность комутона присутствовала в 4-ом пике элюированного материала (рис.8).

Нами было изучено влияние ВОЖ из печени крысы на некоторые МХ-процессы. Для получения ВОФК была использована комутон-

содержащая Р<Ж из печени крысы, которой предварительно вводили продигиозан. Фракционирование РФК осуществляли сочетанием гель-фильтрации с обратнофазовой высокоэффективной жидкостной хроматографией на колонке С-18.

Рис.8. Профиль алюции термостабильной комутонсодержащей фракции, полученной в результате гель-фильтрация на колонне с се-фадексом g -25 (грубый), при ступенчатой элюции на колон-

• ке с ионообменной смолой ДАУЗКС - 1x4. Абсцисса, ординаты и обозначения - те же, что и на рис.7. Под абсциссой приведены концентрации KCl в ходе ступенчатого элюирова-ния нанесенного материала.

Добавление ВОФК из печени к иятактным гомологичным МХ вызывало тканеспецифическую стимуляцию их дыхания в среде с субстратом, не снимаемую олигомицином. Далее было установлено, что преиянубация МХ печени с ионами Са2+ а неорганическим фосфатом способствует тканеспецифяческому разобщению их ОФ до^ действием ВОФК, не чувствительному к'ротенону.

• Повышение концентрации ионов Са"4" до величины, индуцирующей ротенон-стимулируемый разобщающий эффект комутона в экспериментах с неочищенной-комутонсодержащей фракцией,'не приводило к реализации этого эффекта под действием ВОФК.

Было проведено исследование влияния ВОФК из печени на эффективность транспорта ионов в МХ печени и почки. Оказалось, что при использовании ВОФК в концентрации, вызывающей у гомологичных МХ выраженную тканеспецифическую стимуляцию дыхания в среде с субстратом, изменений величины отношения Са^+/0 у МХ из упомянутых тканей не наблюдалось.

- 16 -

Изучалось влияние ВОФК из печени на кальциевую емкость MX из печени и почки крысы. Было установлено, что добавление этой фракции к MX, осуществляющим "массивный" транспорт ионов Са^+, не влияет на величины кальциевой емкости у обоих препаратов MX.

Было изучено также влияние ВОФК из печени на ВАН MX из печени и почки, индуцированное добавлением в среду инкубации ионов

и неорганического фосфата. Введение в среду ВОФК вызывало ускорение понижения оптической плотности суспензии MX печени при 520 нм, что свидетельствовало об ускорении набухания этих орга-нелл. Добавление ВОФК к MX почки но влияло на скорость их пабуха-. ния (рис.9). . '

Рис.9. Влияние высокоочшценной комутонсодержащей фракции на ВАН МХ печени и почки крысы, индуцированное совместным действием ионов Са^+ и Ф . Ордината г 0П 520 нм, абсцисса -время (мин). Сплошная линия - набухание МХ в присутствии фракции, пунктир - набухание без добавления фракции. Стрелками указаны моменты введения I - МХ печени, Са -26 мкг/мг белка Ж, 2 - МХ печени, Са - 13 мкг/мг белка МХ; 3 - Ж почки, Са - 26 мкг/мг белка МХ.

Обсуждение результатов содержится в 6 главе диссертации. На основании данных экспериментов по индукции /з - и / -состояний номутонной регуляции посредством преинкубации МХ с ионами Са^+ и проведенного ингибиторного анализа этого процесса можно представить себе следующую последовательность событий, приводящих к активации комутонного контроля ОФ. Поступление ионов Са^+ в матрикс Ж и их рециклинг на внутренней мембране активирует Ж-фосфолипа-зу А, вследствие чего индуцируется проницаемость упомянутой мембраны для ионов К4'. Необходимость .этой проницаемости .для реализации комутонного контроля ОФ была подтверждена в экспериментах по индукции р> - и $ -состояний комутонной регуляции валиномицином (Злбакидзе, Федоров, 1985). В связи с тем, что р> -состояние комутонной регуляции удается индуцировать также добавлением в среду низких концентраций 2,4-ДНФ или малоната (Челидзе, Злбакидзе,

<

1989), мотаю полагать, что вклад ионов К+ в активацию комутон-ного контроля ОФ носит неспецифический характер и обусловлен деэнергизацией МХ.

Ввиду того, что индукция /1 -состояния комутонной регуляции ионами ре ингибировалась ионолом и сукцинатом, было сделано заключение об участии ПОЛ в активации комутоннЬй регуляции ОФ. Ингибирование индукции р> -состояния этой регуляции в среде без К+ позволяет предположить, что и в рассматриваемом случае активация комутонной регуляции ОФ осуществляется посредством повышения неспецифической катионной проницаемости у внутренней мембраны МХ. Стимуляция разобщающего эффекта комутона в присутствии ротенона в % -состоянии комутонной регуляции свидетельствует о том, что при определенных величинах К+-проницаемости МХ-мембраны активация комутонного контроля ОФ может ингибироваться с участием митохондриального пула НАДН.

Таким образом, на основе полученных результатов можно заключить, что пусковыми механизмами активации комутонного контроля ОФ является перераспределение ионов Са^+ между гиалоплазмой и матриксом МХ, сопровождающееся активацией МХ-фосфолипазы А1, или снижение антиоксидантной активности клетки с последующей активизацией ПОЛ во внутренней мембране МХ.

Наличие активности комутона в печени крысы после янтрагас-тральных инфузий глюкозы, растительного масла, фенобарбитала, СС1^, а также инъекции продигиозана следует-объяснять активацией этого регулятора, т.к. все описываемые опыты проводились на животных, голодавших 24 ч. Между тем показано, что комутонная регуляция полностью инактивируется в этом органе уже к 12 ч. после прекращения кормления животного (Элбакицзе, Духин, 1$84). Ввиду того, что повышение нагрузки на функцию печени по аккумуляции глюкозы, жировая нагрузка, а также нагрузка на детоксикационную функцию этого органа вызывают активацию в нем комутонной регуляции, можно полагать, что причиной активации комутонного контроля дыхания и ОФ в регенерирующей печени (Элбакидзе, Челидзе, Духин, 1984) может являться повышение функциональной нагрузки на неудаленную после частичной гепатэктомии дольку этого органа. Эксперименты с повреждением клеток печени посредством введения крысе СС1^, продигиозана и в ходе продолжительного голодания показали, что комутонная регуляция активируется в этом органе вне зависимости от способа их повреждения. Тот факт, что комутонная регуля-

ция активируется в ответ на самые разнообразные воздействия на печень, свидетельствует о неспецифическом механизме её активации. Следует отметить, что общим последствием всех рассмотренных воздействий для метаболизма клеток печени является создание дополнительной нагрузки на их энергообеспечивающие механизмы. В связи с этим можно предположить, что активация комутонной регуляции происходит в ответ на повышение нагрузки на энергетический гомео-стаз клетки.

Активированная в печени комутонная регуляция в основном находилась в <* -состоянии-. Лишь в опытах с инфузией глюкозы и после продолжительного голодания наблюдалось р -состояние комутонной регуляции. Было показано, что введение крысе инсулина модулирует комутонную регуляцию, т.к. в этом случае происходила индукция -состояния комутонной регуляции, в то время как под действием одной лишь глюкозы имело место -состояние комутонной регуляции. Таким образом состояния комутонной регуляции, описанные в экспериментах "ин витро", были выявлены нами и в опытах "ин виво". Возможность модуляции эффектов комутона посредством изменения функционального состояния МХ была продемонстрирована и в экспериментах, где для тестирования активности комутона в печени крыс, получавших глюкозу с инсулином, использовали МХ из печени интактных животных.

Эксперименты по прогреву и аэрированию комутонсодержащих фракций, полученных из печени животных после нагрузочных и повреждающих воздействий, показали, что в этих условиях активируется термостабильный и устойчивый к кислороду комутон. В ходе дальнейшего фракционирования комутона, активированного введением продигиозана, было установлено, что он представляет собой низкомолекулярное соединение с молекулярной массой менее 5000, отрицательно заряженное при щелочных значениях рН. Проведенное хрома-тографическое разделение комутонсодержащей фракции после гель-фильтрации на сефадексе с -25 с использованием различных ионо- -обменников и режимов элюирования позволило очистить комутон примерно в 100 раз по белку.

Способность ВОФК из печени тканеспецифически стимулировать дыхание гомологичных МХ в среде с сукцинатом и олигомицином, тканеспецифически разобщать их ОФ после преинкубации с ионами Са^+, а также ускорять ВАН этих органелл, индуцированное Са^+ и фосфатом, свидетельствует о деэнергизующем воздействии комутона

на МХ. Однако отсутствие влияния комутона на отношение Са/0 и на кальциевую емкость гомологичных МХ свидетельствует о слабой деэнергизации МХ этим регулятором.

Общеизвестно, что разобщение ОФ МХ сопровождается активацией аэробного гликолиза. Такое изменение в энергообеспечивающих механизмах клетки описано в условиях повреждения клеток (Браун, Булычев, Ганелина, 1967), а также при резком повышении нагрузки на их специальные функции (Меерсон, 1973). При этом возрастает устойчивость клеток к другим повреждающим воздействиям (Браун, Моженок, 1987). В связи с этим можно*полагать, что активация ко-мутонного механизма внутритканевых межклеточных взаимодействий в таких условиях вносит вклад в адаптацию ткани к нагрузочным и повреждающим воздействиям.

ВЫВОДЫ

1. Установлено, что преинкубация МХ печени с ионами Са^+ в среде без фосфата активирует не чувствительное к ротенону тканеспецифическое разоощение ОФ комутоном. Добавление РК перед преинкубацией ингибирует этот эффект. Не реализуется он и в среде без ионов К+. В результате преинкубации МХ с более высокими концентрациями ионов Са^+ активируется ротенон-стимулируемое разобщение ОФ МХ печени гомологичным комутоном.

2. Преинкубация МХ печени с ионами Са^+ в среде с фосфатом также приводит к активации ротенон-независимого и ротенон-стимулируемого тканеспецифического разобщения ОФ комутоном. Разобщающий эффект комутона ингибируется хлорпромазином и в среде с низким содержанием ионов К+.

3. Преинкубация МХ печени с ионами Ре3+ активирует роте-нон-независимое и ротенон-стимулируемое тканеспецифическое разобщение ОФ комутоном. Ингибиторы ПОЛ - ионол и сукцинат, а также снижение концентрации ионов К+ в среде инкубации ингибируют этот эффект.

4. Впервые показано, что комутонная регуляция в печени крысы активируется в результате повышения нагрузки на специальные Функции этого органа, а также в результате повреждения его клеток.

5. Установлено, что активность комутона, регистрируемая в печени после нагрузочных воздействий на функции этого органа или введения продигиозана, выдерживает прогрев при 90°С. Термоста-

бильный комутон печени, активируемый продигиозаном,' является низкомолекулярным соединением с молекулярной массой менее 5000 и суммарным отрицательным зарядом при,щелочных значениях рН.

6. Высокоочищенный термостабильный комутон из печени крысы вызывает у интактных гомологичных MX стимуляцию дыхания в среде

с сукцинатом, которая дополняется тканеспецифическим разобщением •ОФ после преинкубации MX с ионами Са2+.

7. Высокоочищенный термостабильный комутон из печени крысы не влияет на величину отношения Са2+/0 и кальциевую емкость MX печени в условиях "массивного" транспорта Са~+.

8. Высокоочищенный термостабильянй комутон из печени крысы тканеспецифически усиливает ВАН гомологичных MX, индуцированное ионами фосфата и Са2+.

По теме диссертации опубликованы следующие работы: -I. Элбакидзе Г.М., Злбакидзе И.М., Гачечиладзе А.Г. , -Рогова Н.С. Индукция yi - и (f -состояний комутонной регуляции окислительного фосфорилирования митохондрий печени крысы при активации перекисного окисления липидов митохондриальной мембраны // Доклады АН СССР. - 1985. - Т.282, Ш. - С.729-731.

2. Элбакидзе Г.М., Элбакидзе И.М., Гачечиладзе А.Г. Влияние рутения красного на индукцию р> - и ^ -состояний комутонной регуляции дыхания и окислительного фосфорилирования митохондрий ионами Са2+ // Бшл.эксп.биол.мец. - 1986. - F7. - С. 36-38.

3. Элбакидзе Г.М., Федоров В.П., Элбакидзе И.М. Индукция р> - и ¿С -состояний комутонной регуляции дыхания и окислительного фосфорилирования митохондрий из печени и почки крысы ионами кальция // Известия АН СССР, сер.биол. - 1986. - J'3. -

С.400-409.

4. Элбакидзе Г.М., Элбакидзе И.М. Активация внутритканевого контроля энергетического метаболизма,в печени при усилении нагрузки на специальные функции и её повреждении гепатотоксином // Доклады АН СССР. - 1986. - Т.291, JP3. - С.719-723.

5. Elbakidze G.М.,Elbakidze I.M., Chelidze М.А. Some basic principles of the intratissue Control of energetic metabolism in rat liver. Comuton concept .//Internatl. Symp. of Biol. Regulation of Cell Proliferation, 9-th Chaljjne Conference.-Milan, 1986.-P.23.

6. Elbakidze G.M.,Elbakidze I.M., Rogova U.S.Lipid peroxide oxi-

- 21 -

dation and calcium ions regulate the character of comuton control of energetic metabolism in rat liver and kidney.// Internatl. Symp. of Biol. Regulation of Cell Proliferation. 9-th Chalone Conference.-Milan,1986.-P.24.

7. Элбакидзе Г.М., Челидзе M.A., Элбакидзе И.М. Нарушение внутритканевого контроля энергетического метаболизма.печени, как возможная причина диабета // Доклады на 1-ой школе-семинаре "Регуляция тканевого гомеостаза. Нетоксическая профилактика и терапия хронических патологий". - Тбилиси, 1987. - С.178-185. .

8. Элбакидзе Г.М., Федоров В.П., Рогова Н.С., Элбакидзе И.М. Индукция f> - и ^-состояний комутонной регуляции дыхания и окислительного фосфорилирования митохондрий печени и почки крысы неорганическим фосфатом // Известия АН СССР, сер.биол. - 1988. - A3. - С.133-136. .

9. Элбакидзе Г.М., Челидзе М.А., Элбакидзе И.М. Влияние однократного введения фенобарбитала и четыреххлористого углерода на активность комутона в печени крысы // Известия АН СССР,

4 сер.биол. - 1989. - Ji5. - С.666-673.

10. Элбакидзе Г.М., Челидзе М.А., Элбакидзе И.М., Гачечиладзе А.Г. Физико-химические свойства комутона, активируемого в печени продигиозаном // Доклады на 2-ой школе-семинаре "Регуляция тканевого гомеостаза. Нетоксическая профилактика и терапия хронических патологий". - Тбилиси, 1989. - С.77-78.

I

№4-