Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Роль длинноцепочечных ацил-КоА в регуляции энергетического метаболизма в печени in vivo

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Роль длинноцепочечных ацил-КоА в регуляции энергетического метаболизма в печени in vivo"

л Л *

j V

ЛГСАДКМИЯ медицинских НАУК СССР СИБИРСКОЕ ОТДЕЛЕНИЕ

ИНСТИТУТ БИОХИМИИ

на правах рукописи

СОЛОВЬЕВ Владимир Николаевич

РОЛЬ ДЛИННОЦЕПОЧЕЧНЫХ АЦИЛ -КОД В РЕГУЛЯЦИИ ЭНЕРГЕТИЧБХЖОГО МЕТАБОЛИЗМА В ПЕЧЕНИ in vivo

03. 00. 04 - биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук'

Новосибирск - 1990

i

Работа выполнена в Институте биохимии СО АМН СССР

Научный руководитель - доктор биологических наук

А. В. Панов

Официальные оппоненты - доктор биологических наук

профессор Л С. Ягужинский

кандидат медицинских наук А. Р. Колпаков

Ведущая организация - Институт питания АМН СССР

Защита диссертации состоится "_"_1990 г.

в _ часов на заседании специализированного Ученого Совета

К 001.37.01 Института биохимии СО АМН СССР по адресу: 630117 Новосибирск, ул. Акад. Тимакова, 2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биохимии СО АМН СССР

Автореферат разослан "_"_._1990 г.

Ученый секретарь

специализированного Ученого Совета,

кандидат медицинских наук * Г. 4илатова

Обцая характеристика работы

Актуальность проблема Поскольку большинство энергопрои8-

водяших и энергопотребляющих процессов в клетке разделены внутренней мембраной митохондрий, понятно то большое значение, которое придается переносчику адениннуклеотидов через внутреннюю мембрану митохондрий - адениннуклеотидтранслоказе (АНТ). К настоящему времени установлено, что АНТ играет важнейшую роль в контроле кинетических и термодинамических параметров окислительного фосфорилирования (ОФ).

Возможная роль ацил-КоА в регуляции ОФ на уровне АНТ in vivo предполагалась уже начиная с первой работы Pande, Blan-chaer в 1971 г. , в которой они показали ингибирование ОФ физиологическими концентрациями пальмитоил-КоА на изолированных митохондриях. Позднее ингибирование in vitro митохондри-ального ОФ на уровне АНТ было показано неоднократно и для других длинноцепочечных жирных кислот. Кроме того, при многих физиологических и патологических состояниях накопление в печени д. ц. ацил-КоА сопровождается ингибированием ОФ in vitro и снижением величины энергетических потенциалов системы адениннуклеотидов.

В то же время вопрос о возможности переноса данных, полученных в исследованиях in vitro на состояние in vivo остается спорным. Более того, возможность регуляторной роли ацил-КоА в живой клетке до сих пор не только подвергается сомнению (LaNoue et al. ,1981), но иногда и категорически отрицается (Stubbs, 1981).

В любом случае, для доказательства возможности регуляции ОФ д. ц. ацил-КоА требуются исследования in vivo в комплексе с витральным исследованием конкретных механизмов.

Цель исследования - изучение роли длинноцепочечных ацил-КоА в регуляции окислительного фосфорилирования и энергетических потенциалов системы адениннуклеотидов печени in vivo; изучение универсальности этого механизма и зависимости его проявления от исходного метаболического состояния животного.

Экспериментальные задачи: 1. In vivo изучить изменения содержания в печени д. ц. ацил-КоА и состояния системы АН в ткани в динамике голодания у лабораторных крыс линий Вистар, Август и Ваг;

1 -

2. In vivo и in vitro изучить возможность направленного изменения метаболизма ацил-КоА в модельных экспериментах и влияние этих изменений на состояние окислительного фосфори-лирования и энергетических потенциалов системы АН;

3. In vivo и in vitro изучить влияние исходного метаболического состояния печени на проявление эффектов модельных воздействий на метаболизм ацил -КоА и энергетический метаболизм в печени;

4. In vivo изучить роль Z-белка - специфического белкового переносчика ацил-КоА в клетке на проявление регуляторного влияния ацил-КоА на энергетический обмен печени.

Новизна и научно-практическая значимость результатов.

В диссертации впервые показана возможность направленного изменения in vivo содержания в печени длинноцепочечных ацил-КоА. Установлено, что при введении фенобарбитала отвлечение ацил-КоА в синтез глицеролипидов способствует восстановлению энергетического состояния в печени, сниженному в результате накопления ацил-КоА вследствие увеличенного поступления жирных кислот в печень. Это открывает возможности к фармакологической коррекции многих нарушений метаболизма в печени при искажении диетического и гормонального статуса.

В экспериментах in vivo впервые установлены при голодании сроки перехода митохондриального дыхания на окисление жирных кислот, сопровождающиеся накоплением в печени д. ц. ацил-КоА. Установлено, что для крыс разных линий изменения в динамике голодания имеют существенные различия, связанные с разной доступностью субстратов биологического окисления. В практике экспериментальной биологии это может позволить сравнивать данные по энергетическому метаболизму, полученные на животных разных линий.

Впервые установлено; что в модельных экспериментах наблюдаемые изменения со стороны окислительного фосфорилирования и состояния энергетических потенциалов системы АН, вызванные экспериментальным воздействием, во многом зависят от продолжительности голодания перед забоем. Использование при изучении метаболических моделей двух контролей - до и после перехода животных в "голодное" состояние позволяет четко диффе-

- 2 -

|к,-нциропат1. специфические эффекты модельного воздействия от влиянии голодания. Пто существенно повышает точность и воспроизводимость гжонериментальных исследований, особенно касающихся энергетического метаболизма.

Впервые в экспериментах in vivo показано, что важную роль в проявлении регуляторных свойств ацил-КоА играет внутриклеточный переносчик ацил-КоА - Z-белок, что модет иметь большое значение в понимании механизма регуляции энергетического состояния в клетке длинноцепочечными ацил-КоА.

В целом, научное значение полученных результата sai сличается в том, что они позволяют создать целостное представление об ингибировании окислительного фосфорилирования в печени д. ц. ацил-КоА, как механизме регуляции клеточной энергетики in vivo.

Основные положения диссертации, вкноекмыэ на заднту

1. Накопление длинноцепочечных ацил-КоА in vivo является причиной ингибирования митохондриального окислительного фосфорилирования и снижения величины энергетических потенциалов системы адениннуклеотидов в печени.

2. Для ингибирования ацил-КоА окислительного фосфорилирования принципиальное значение имеет не общее содержание в печени д. ц. ацил-КоА, а количество ацил-КоА, не связанных с внутриклеточным переносчиком - Z-белком.

3. Механизм регуляции внутриклеточной энергетик;! д. ц. ацил-КоА in vivo универсален для разных линий крыс и при разных метаболических состояниях.

4. Выраженность инги&ировэдия окислительного фосфорилирования ацил-КоА зависит от типа энергетического метаболизма экспериментальных животных и от исходного метаболического состояния.

Апробация материалов диссертации

Основные материалы диссертации были доложены на: 10-м съесде FEFC (Ihpwn, 1976); на S и Всесоюзной конференции "АдчпТ'тич ч-лотс-;-,ч } "нкх ,vi:v,iTo г<-и графических и

П|Н5И.»С0Л'-ГЬ»'«НЫХ УСЛОЬйЛл" ( It'fH/CHGhpcK, itlbl); на Всесоюзном симпозиуме "Метаболическая регуляция физиологического состояния" (Пупцшо, 1984); на Всесоюзном симпозиуме "Особен-

ности липидного обменам условиях Сибири и Дальнего Востока с учетом бытовых и пищевых факторов" (Чита, 1987); на Всесоюзной конференции "Цитохром Р-450 и охрана окружающей среды" (Новосибирск, 1987).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 13 печатных работ.

Об'ем и структура диссертации. Диссеретация изложена на 165 страницах, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения и обсуждения полученных результатов, заключения, выводов и списка литературы, содержащего 30 отечественных и 272 иностранных источника. Иллюстрации включают 20 рисунков и 8 таблиц.

Материалы и методы исследвания

В работе использовались самцы крыс линий Вистар (Wistar Sto), Август (August/Lac Sto) и Ваг (WAG/G Sto) массой 150-200 г. для экспериментов in vivo и 150-250 для выделения митохондрий, разделения липидов или цитоплазматических белков. Крыс содержали на сбалансированной диете и кормили дважды в день в течение часа (8,00-9,00 и 20,00-21,00). Виварий освещался с 9,00 до 21,00. Отсчет времени голодания начинали с 9,00.

Ери изучении динамики голодания животных забивали через 4, 8, 12 и 24 часа после кормления. Во всех других экспериментах крысы брались в опыт через 4 ч (сытые) или 12 ч (голодные) после кормления. Для изучения функций митохондрий, исследования состава липидов печени, выделения из печени Z-белка и определения содержания НЭЖК в крови животные забивались декапитацией. При изучении содержания метаболитов в печени крысы подвергались гексеналовому наркозу (20 мг/100 г веса тела), печень быстро удалялась и замораживалась между двумя алюминиевыми блоками, предварительно охлажденными в жидком азоте. От момента перерезания сосудистого пучка до замораживания между блоками проходило йе более 2 секунд.

Введение крысам фенобарбитала (ФБ) и/или масла при исследовании их влияния на липидный и энергетический метаболизм

- 4 -

печени проводили внутрибрюшинно после утреннего кормления. Оливковое масло вводили в дозе 0,5 мл/100 г веса тела. ФБ в дозе 10 мг/100 г веса тела вводили в 0,5 мл физиологического раствора. Масло и ФБ вводили раз в сутки в течение 4 дней.

Содержание адениннуклеотидов, неорганического фосфора и длинноцепочечных ацил-КоА определялось после кислотного фракционирования печени спектрофотометрически или спектроф-люориметрически. Для анализа липидного состава печени и субклеточных частиц применялась тонкослойная хроматография на силикагеле, а для'изучения состояния Z-белка - гель-хроматография на сефадексе S-75. Состояние окислительного фос-форилирования оценивалось полярографически на выделенных митохондриях. Статистическую обработку проводили с использованием t-критерия Стьюдента.

Результаты исследования и их обсуждение

1 Взаимоотношения липидного и энергетического метаболизма в печени. Регуляция длинноцепочечными ацил-КоА энергетического обмена в печени при введении фенобарбитала и масла. 1.1 Выбор моделей.

В качестве модели увеличенного синтеза и накопления д. ц. ацил-КоА (для краткости мы будем писать просто ацил-КоА) в печени мы использовали модель внутрибрюшинного введения растительного масла.

В качестве модели увеличенной утилизации ацил-КоА использовали стимуляцию биосинтетической деятельности в печени при введении фенобарбитала (36), который является известным индуктором пролиферации эндоллазматического ретикулюма и мик-росомального окисления в печени (Ляхович, Цырлов, 1981)". Кино, что фенобарбиталовая индукция приводит к увеличению синтеза триглицеридов (ТГ) и фосфолипидов (ФЛ) в печени крыс (Goldberg et al. ,1981, 1983) , что вполне отвечает поставленной нами задаче.

1.2 Взаимоотношения длинноцепочечных ацил-КЬА и обмена, липидов в печени при введении фенобарбитала и масла

Изменения в составе липидов и их распределении в печёни ■ - 5 -

суммированы на рис.1. Полная величина столбцов диаграммы выражает содержание отдельных липидов в 1 г печени, а заштрихованная часть - суммарное количество липидов, выделяемых из 1 г печени с фракциями митохондрий и микросом. Т. о. , незашт-рихованная часть столбцов отражает количество липидов, не связанных с органеллами клетки.

Видно, что введение масла приводит к увеличению содержания в печени ГЛ, не связанных с мембранами субклеточных частиц, причем ТГ в большей степени, чем ФЛ. Ведение 46, наоборот, вызывает накопление ФЛ и ТГ, связанных с мембранами митохондрий и микросоы. При сое^стном введении Ф5 и масла увеличиваются оба пула ГЛ печени, но достоверная аддитивность эффектов Фб и масла наблюдается только для ФЛ микросо-

Рие. 1 Влияние введения фенобарбитала и масла на внутрик-Н§ леточное распределение липидов ^ в печени.

§ Полная величина столбца -- 3 | содержание липида в печени; с заштрихованная часть - коли-I чество липида, выделенного из

.°§1 г печени с фракциями мито-§ хондрий и микросом (мг/г пече-~ ни) А - неэстерифицированные . ок жирные кислоты, Б - фосфолипи-м ч ды, В - триглицериды, Г - сум-^ма ФЛ и ТГ. 1 - контроль, 2 -введение фенобарбитала, 3 -1234 введение масла, 4 - совместное (Г) введение фенобарбитала и масла

Распределение НЭЖ показвает, что введение масла приводит не только к увеличению общего содержания НЭЖК в печени, но и к почти трехкратному возрастанию содержания цитоплазматичес-ких НЭНК. Введение Фб, наоборот, приводит к некоторому увеличению содержания жирных кислот, связанных с мембранными

- 6 -

мальных мембран.

1234 1234 1234 (А) (Б) (Б)

структурами клетки, что сопровождается практически полным их исчезновением из цитоплазмы. При совместном введении Фб и масла количество НЭЖК, связанных с органеллами клетки возрастает больше, чем при ввведении одного Фб, хотя в обоих случаях величина изменений невелика При совместном введении несколько увеличиваеся, по сравнению с введением одного Фб, и количество НЭЖК в цитоплазме, хотя содержание их и остается много меньше, чем в контроле (а тем более, чем при введении масла). Т.е. введение ©5, одного или совместно с маслом, в любом случае приводит к снижению цитоплазматического пула неэстерифицированных жирных кислот.

Т. о. , введение масла приводит к накоплению в печени ци-топлазматических НЭЖК, повышению уровня д. ц. ацил-КоА и увеличению содержания ГЛ, в основном ТГ, не связанных с мембранными структурами клетки. Причиной увеличения синтеза ГЛ в этих условиях, очевидно, является именно увеличение доступности субстрата, т. е. длинноцепочечных ацил-КоА. Увеличение содержания в печени ГЛ при введении Фб отражает, главным образом, увеличение синтеза липидов мембранных структур, в первую очередь ФЛ При введении Фб, одного или совместно с маслом, возрастание синтеза ГЛ приводит к почти полному исчезновению из цитоплазмы клеток печени НЭЖК, по всей видимости, за счет увеличения активности ферментов синтеза ГЛ. Отвлечение ацил-КоА в синтез ГЛ при совместном введении Фб и масла приводит к полной отмене вызванного введением масла увеличения содержания ацил-КоА и снижению содержания цитоп-лазматичееких НЗЖК ниже контрольного уровня. Т.о., введение Фб и/или растительного масла позволяет искусственно менять содержание в печени длинноцепочечных ацил-КоА, что необходимо нам для исследования взаимоотношений липидного и энергетического обмена в печени

1.3 Взаимоотношения содержания длинноцепочечных ацил-КйА и состояния эгергетического метаболизма в печени крыс при введении фенобарбитала и масла

Наиболее показательными интегральными параметрами -энергетического состояния печени in vivo являются энергетические потенциалы системы АН- фосфатный потенциал АТФ/.( АДФ х Фн) и

- 7 -

r jпотенциал Аткинсона или "энергетический ааряд" системы АН (Atkinson, 1977). Фосфатный потенциал представляет собой выражение константы равновесия для фосфорилирования АДФ и величина его, в первую очередь, зависит от окислительного фосфорилирования (Slater, 1969,1973). В наших модельных состояниях изменения фосфатного потенциала (ФП) в печени противоположны изменениям содержания д. ц. ацил-КоА (табл. 1). Таблица 1. Влияние введения фенобарбитала и растительного масла на фосфатный потенциал, энергетический заряд и на содержание длинноцепочечных ацил .-КоА в печени крыс, голодавших 12 часов.

Контроль Фенобарбитал Масло Фб + масло

ацил-КоА 45,4+10,2 39,8+10,3нд 75,5+10,5*** 46,6+3,2нд

ФП 0,72+0,07 0,88+0,09** 0,42+0,12*** 0,75+0,02нд

ЭЗ 0,77+0,02 0,74+0,02** 0,68+0,03*** 0,76+0,01нд

Примечания: Уровень достоверности по отношению к контролю: нд - недостоверно; * - р < 0,05; ** - р < 0,01; *** - р < 0,001. Число животных в группе -9. Концентрации выражены в нмоль/г веса печени. Значительное накопление ацил-КоА при введении масла сопровождается существенным (на 42%) снижением величины ФП, незначительное снижение содержания ацил-КоА при введении Фб вызывает небольшое увеличение значения фосфатного потенциала. :При совместном введении ®5 и масла оба параметра сравнимы с контрольным уровнем.

Фосфатный потенциал, однако, не учитывает энергопотребля-одих процессов, идущих с образованием АЫФ. Активность такого рода процессов в большей степени отражается величиной "энергетического заряда" (АТФ + 1/2АДФ) /(_АТФ + АДФ + АМФ). Его изменения при введении Фб и масла вполне достоверны, хотя и очень невелики (на 4Х меньше контроля при введении Фб и на 12Х меньше при введении масла). Впрочем, по мнению проф. Ат-

- 8 -

кинсона, который разработал и ввел в практику исследований клеточного метаболизма это понятие, даже небольшие его изменения способны оказывать влияние на кинетику многих ферментативных реакций (Atkinson 1977).

Введение совместно с маслом фенобарбитала устраняет все эффекты масла на окислительное фосфорилирование. По крайней мере, величина энергетических потенциалов системы АН в печени крыс, которым вводились и Фб, и масло, не отличается сколько-нибудь достоверно от контрольных значений, хотя сами по себе Фб и масло значительно' изменяют состояние системы АН Это вполне согласуется с предположением об отвлечении ацил-КоА в синтез сложных липидов при введении Фб вместе с маслом.

Отсутствие при их совместном введении какого-либо снижения ФП по отношению к контролю предполагает, что отвлечение ацил -КоА в синтез липидов приводит к отсутствию ингибирова-ния ими окислительного фосфорилирования на уровне АНТ, которое наблюдается при введении одного масла. Поскольку величина ФП во всех случаях менялась согласованно с содержанием в печени д. ц. ацил-КоА, можно "предположить, что именно ингиби-рование ацил-КоА окислительного фосфорилирования в печени является причиной изменений фосфатного потенциала при исследованных состояниях.

С целью проверки этого предположения нами было предпринято исследование окислительного фосфорилирования на изолированных митохондриях, выделенных из.печени крыс, которым вводились 36 и/или растительное масло, которое показало, что изменения ФП системы АН и изменения ОФ выделенных митохондрий строго параллельны между собой и соответствуют ингибиро-ванию ОФ в митохондриях длинноцепочечными ацил-КоА.

Сопряжение в одной работе исследования свойств выделенных митохондрий и вивального изучения содержания д. ц. ацил-КоА и состояния системы АН позволяет связать в одну логическую цепь изменения в содержании ацил-КоА, ингибирование ими ми-тохондриального окислительного фосфорилирования на уровне АНТ и состояние энергетики системы адениннуклеотидов.

2. Влияккэ исходного метаболического состояния печеш на регуляцию окислительного фосфорилнрования и системы аде-ниннуклеоггидов длинноцепочечнъми ацил-КоА при введении фенобарбитала и масла

В предыдущей главе при введении крысам масла и/или ©5 показано, что содержание д. ц. ацил-КоА выступает в качестве параметра, способного регулировать состояние ОФ системы АН в печени. Опыты проводились на крысах, голодавших перед забоем 12 часов, что было необходимо для качественного выделения субклеточных частиц, поскольку у сытых животных большое количество гликогена в печени мешает выделению макросом. Однако, голодание само по себе приводит к той же перестройке энергетического метаболизма, что и введение масла: накоплению д. ц. ацил-КоА в печени и снижению энергетических потенциалов системы АН (Панов и соавт.,1983).

Нам представляется возможным, что изучение экспериментальных метаболических моделей при двух сроках голодания (4 и 12 час.), отличающихся по гормональному статусу, содержанию метаболитов и уровню энергизации органа, позволит дифференцировать неспецифические эффекты голодания и эффекты изучаемого экспериментального воздействия. В данной главе рассмотрено влияние введения крысам Фб и/или масла на энергетику печени при забое животных через 4 часа после лишения пищи, когда эффекты голодания отсутствуют (табл. 2).

Вообще говоря, изменения в содержании д. ц. ацил-КоА и адениннуклеотидов в печени через 4 и 12 час. после лишения животных пищи одинаковы по типу изменений: накопление ацил-КоА при введении масла приводит к снижению ФП и потенциала Аткинсона. Фб еа!л по себе ничего не меняет, но элиминирует эффекты масла на содержание ацил -КоА, ОФ и систему АН при совместном введении. В то же время, между животными голодавшими 4 или 12 час. наблюдаются существенные различия в количественных характеристиках изменений при изучаемых экспериментальных, воздействиях. Это неудивительно, поскольку 12-часовое голодание само по себе (по сравнению с 4- часовым) вызывает увеличение содержания в печени ацил-КоА более, чем в два раза при соответствующем снижении величины ФП.

- 10 -

Таблица 2. Влияние введения фенобарбитала-и растительного масла на фосфатный потенциал, энергетический заряд и на содержание длинноцепочечных ацил -КоА в печени крыс, голодавших 4 часа

Контроль Фенобарбитал Масло К + масло

29,5+3,0*** 21,6+1,6НД 0,80+0,37*** , 1,53+0,19НД 0,76+0,05*** 0,84+0,02нд

Примечания: Уровень достоверности по отношению к контролю: нд - недостоверно; * - р < 0,05; ** - р < 0,01; *** - р < 0,001. Число животных в группе -6. Концентрации выражены в нмоль/г веса печени.

Сравнение изменений со стороны д. ц. ацид-КоА и АН при введении масла в зависимоти от срока голодания показывает, что 12-час. голодание существенно потенциирует эти изменения, особенно в отношении ацил-КоА. Их содержание; по сравнению с соответствующим контролем, увеличивается при введении масла на 30 нмоль/г печени для крыс, голодавших 12 час., и только на 10 нмоль/г печени для голодавших 4 часа В то аз время при сравнительно небольших изменениях содержания ацил-. КоА в печени животных, голодавших 4 часа, введение масла вызывает значительные изменения со стороны системы АН. У крыс, голодавших 4 часа, величина ФП снижается'при введении масла на 52%, а при 12-час. голодании (невзирая на много более выраженное накопление ацил-КоА) - только на 43%; Это может . -свидетельствовать о том, что на фоне исходного низкого уровня д. ц. ацил-КоА в печени ОФ проявляет более высокую.чувствительность к увеличению содержания ацил-КоА, чей при голодании.

Введение Фб, одного или совместно с маслом, не приводит,к заметным изменениям содержания ацил-КоА или величины.®! по

- 11 -

ацил-КоА

ФП

ЭЗ

19,7+2,1

1,83+0,13

0,87+0,02

19,2+1,9нд 1,70+0,29нд О,85+0,02нд

сравнению с соответствующим контролем ни при 4-часовом, ни при 12-часовом голодании. Это значит, что, хотя голодание и введение масла оказывают одинаковое по направленности влияние на состояние АН, введение Фб способно устранять только эффекты, связанные с введением масла. Закономерно предположить, что механизмы увеличения содержания д. ц. ацил-КоА в печени при этих перестройках метаболизма отличаются друг от друга. Причины и суть различий пока не ясны, хотя и понятно, что увеличение доступности ацилов жирных кислот при введении масла и гормональная перестройка при голодании - это не одно и то же.

Т. о., использование двух сроков голодания не только позволяет отделить эффекты экспериментального воздействия от влияния голодания, но и показывает, что выраженность изменений в системе АН печени зависит от исходного метаболического состояния животного. В принципе, такие же результаты получены и на митохондриях, выделенных из печени голодавших 4 часа крыс, т.е. накопление в печени д. ц. ацил-КоА при введении масла и у сытых, и у голодных животных приводит к ингибиро-ванию ими ОФ на уровне АНТ и снижению в печени энергетических потенциалов системы АН, но выраженность ингибирующего эффекта ацил-КоА на ОФ зависит от исходного метаболического состояния животного.

3 Регуляция энергетического метаболизма длинноцепочечньвш ацил-КоА у крыс линий Вистар, Август и Ваг

В экспериментальной биологии одним из основных объектов исследования являются лабораторные животные, разные линии которых отличаются по биохимичесской и физиологической организации. Для перечисленных, трех линий крыс показаны различия в гормональной организации и адаптации к холоду (Панов и со-авт.,1981). Поскольку эксперименты в разных лабораториях часто проводятся на животных разных линий, то возникает необходимость в сравнении полученных данных, для чего у животных разных линий необходимо знать вклад голодания в общую картину изменений метаболизма В приложении к теме данного исследования и сфере наших интересов это предполагает изучение характера и динамики развития перестройки знергетическо-

- 12 - •

го метаболизма в ходе голодания у крио равных линий. 3.1 Дииамжа изменений основных показателей энергетического мэтгболетма в печени крыс разных линий при голодании

На рис. 2 приведена динамика изменений содержания д. ц. ацил-КоА в печени крыс Вистар, Август и Ваг в течение первых суток голодания. В ходе голодания происходит накопление ацил -КоА у всех трех линий крыс, но, если в печени крыс Вистар основное увеличение содержания ацил-КоА происходит в проме- • жуток от 8 до 12 час. после лишения пищи, то у Август - между 4 и 8 час., а у Ваг постепенное накопление ацил-КоА продолжается в течение всего изучавшегося периода.

Рис. 2 Изменения содержания д. ц. ацил-КоА в печени крыс линий Вистар (1), Август (2) и Ваг (3) в динамике первых суток голодания. В каждой точ ке представлены данные по 4-9 животным.

Изменения в состоянии системы АН, представленные в виде величины фосфатного потенциала в печени крыс Вистар, Август и Ваг показаны на рис. 3 Через 4 часа после кормления все изученные линии имеют совершенно разный уровень фосфорилиро-вания АН в печени. Величина ФП составляет для крыс Вистар, Август и Ваг, соответственно, 1,82; 1,25 и 0,64 мМ-1. Через 12 час. после лишения животных пищи величина ФП для крыс-всех трех линий практически одинакова (О,-51- 0,53 мИ-1) и в дальнейшем меняется мало.

Динамика изменений ФП отражает изменения-содержания , д. ц. ацил-КоА: у Вистар основное снижение приходится на промежуток от 8 до 12 час. после кормления, у Август - от. 4 до 8 час. , а у крыс Ваг исходно более низкая величина ФП досто-

- 13 -

верно снижается только после 24 час. голодания. Во всех случаях снижение величины ФП сопровождает увеличение содержания д. ц. ацил-КоА. Поскольку величина ФП, главным образом, отра-

I—1 »

3ю.

Г

V

о -

СИ

I

Рис. 3 Изменения величины фосфатного потенциала АТФ/( АДФ х Фн) в печени крыс линий Вистар (1), Август (2) и Ваг (3) в динамике первых суток голодания. В каждой точке представлены данные по 4-11 животным.

4 8 12 24

Время голодания (часов)

жает состояние ОФ. а посему более чувствительна к изменениям . функции переносчика АН (Slater et al. ,1973), не вызывает сомнения, что в данном случае наблюдается не случайное совпадение изменений содержания ацил-КоА и состояния системы АН, а вполне определенные причинно-следственные взаимоотношения, описываемые через механизм ингибирования АНТ ацил-КоА Дня крыс Вистар этот механизм показан в работе Панова и со-авт.,1983). Исходя из того, что у крыс Август и Ваг изменения содержания ацил-КоА и величин ФП также строго соответствуют друг другу по динамике и противоположны по направленности, можно полагать,что, хотя крысы разных линий и отличаются по динамике указанных изменений, механизм снижения величины ФП у них один и обусловлен торможением ОФ ацил-КоА. 3.2 Возможныэ причины различий в динамике голодания у

крыс линий Вистар, Август и Ваг. Согласно современным представлениям, перестройка метаболизма при голодании сопровожается сменой основных субстратов окисления с субстратов преимущественно углеводного типа у "сытых" животных на преимущественно лйпидные у "голодных" (Seitz et al. ,1977);

Уровень метаболически доступных углеводов в печени

- 14 -

0)0 piO о с

ко км

определяется содержанием в ней гликогена (БЫкаша еЬ а1. , 1980). Из рис. 4 видно,что для крыс Ваг и Вистар содержание гликогена в печени сытых крыс достаточно велико (63,2 и 44,8 мг/г печени, соответственно) и значительно снижается через 12 час. голодания (до 9-10 мг/г печени). У крыс Август содержание гликогена даже в "сытом" состоянии составляет всего 12,7 иг/ г печени и уже к 8 час. после лишения пиши достигает 9,1 мг/ г печени. Т. е. , у крыс Август изначально низкий уровень содержания гликогена в печени приводит к его быстрому истощению при голодании, чем, возиожно, и обусловлен более ранний переход крыс этой линии на "голп*""*" тип мртябо-3

Рис. 4 Изменения содержания гликогена в печени крыс линий Вистар (1), Август (2) и Ваг (3) в динамике первых суток голодания. В каждой точке представлены данные по 4-5 животным.

1 Б 12 24

„оемя голодания (часов1

и

'—I

Л

ч

3 к

I

га

Рис. 5 Изменения содержания неэстерифицированных жирных кислот в крови крыс линий Вистар (1),. Август (2) и Ваг (3) в динамике первых суток голодания. В каждой точке представлены данные по 4-6 животным.

4 8 12 .24

Зремя голодания (часоБ^

Доступность для п«ч«ни липидоь ь качеотиг- оуОот|к»т<>|. окисления можно оценить но содержанию в крови 1ВЖК. поскольку их содержание в печени пропорционально содержанию ь плаз ме крови (Brass 1978). Из рис. 5 видно, что динамика изменений содержания в крови НЭЖК в ходе голодания полностью соответствует динамике изменений содержания д. ц. ацилКоА в пече -ни (рис. 2). Достоверное увеличение содержания НЭЖК у крыс Вистар происходит между 8 и 12 час. после лишения пищи, у Август - между 4 и 8 час., а у Ваг-НЭЖК постепенно увеличиваются в течение 24 час. голодания. В то же время, содержание НЭЖК в крови крыс Ваг даже через 4 часа после кормления больше 1,0 мкмоль/мл и остается значительно выше, чем у крыс Вистар или Август при всех сроках голодания.

Т. о. , крысы линий Вистар, Август и Ваг значительно отличаются друг от друга в обеспечености глюкозой или жирными кислотами. Разная доступность энергетических субстратов углеводного или липидного ряда может быть конкретной причиной межлинейных различий в реакции энергетического метаболизма на голодание. Важно, что во всех исследованных случаях переключение метаболизма на окисление жирных кислот приводит к накоплению в печени д. ц. ацил-КоА, ингибированию ими ОФ и снижению энергетических потенциалов системы АН

У крыс Вистар и Август изменения в ходе голодания хорошо укладываются в эту схему, отличается только время "переключения" метаболизма: у Вистар между 8 и 12 час. после лишения пиши, а у Август - между 4 и 8 час. Для крыс Ваг невозможно четко определить время такого переключения. Более того, похоже, что уже через 4 часа после кормления животные находятся в "голодном" состоянии, поскольку у голодавших 4 часа крыс Ваг величины ФП и "ЭЗ" мало отличаются от их значений у крыс Вистар или Август,-холодавших 12 час.

3.3 Зависимость регуляторшго эффекта д. ц. ацил-КоА на

энергетический метаболизм от содержания в печени Z-белка Как видно из предыдущей главы, при одинаковом уровне содержания ацил-КоА их эффект на ОФ сильно отличается в печени крыс линий Вистар и Ваг. Это может указывать либо на несостоятельность гипотезы об универсальности механизма регу-

- 16 -

ляции энергетики в печени длинноцепочечными ацил-КоА in vivo, либо на существование какого-то фактора, способного модифицировать ингибирующий эффект ацил-КоА на адениннуклео-тидтранслоказу митохондрий. Таким фактором, на наш взгляд, может быть цитоплазматический Z-белок - "Fatty acid binding protein",способность которого специфически связывать д. ц. ацил-КоА in vitro хорошо известна (для обзора см. Glatz et al. ,1985).

Для оценки содержания Z-белка в биологических препаратах часто используется его способность связывать органические красители (например, бромсульфталеин) с последующим хрома-тографическим разделением белков и определением связанного красителя. Фракция белков цитоплазмы, соответствующая Z-белку, идентифицировалась по выходу цитохрома с, имеющего молекулярный вес, близкий к молекулярному весу Z-белка (12 300 Да). Д. ц. ацил-КоА, однако, имеют на порядок более высокое сродство к Z-белку, чем бромсульфталеин, поэтому с помощью этого красителя можно оценить только содержание 7-белка, свободного от ацил-КоА.

На рис. 6 представлены профили элюции связанных с бром-сульфталеином белков цитоплазмы печени крыс Вистар и Ваг, голодавших 4 и 12 час. Из хроматограмм видно, что только для сытых крыс Вистар наблюдается заметное связывание бромсуль-

фталеина с г-белком. Для супернатантов из печени голодных крыс Вистар, а^ также для голодных и сытых крыс Ваг, связыва-

- 17 -

Рис. 6 Профиль элюции бром-сульфталеина с белками супер-натанта из 1 г. печени крыс, голодавших перед забоем 4 часа (1) или 12 час. (2). (А) -крысы Вистар, (В) - крысы Ваг, (В) - .маркерная хроматография (цитохром с - 5 мг)

ние его с фракцией, соответствующей '/-белку, полностью </г сутствует, т. е. , там нет 2-белка, свободного от ацил- К«А. Поскольку сродство г-белка к ацил-КоА несколько вышо, чем у АНТ, то очевидно, что отсутствие торможения ОФ в печени еы тых крыс Вистар связано с тем, что ацил-КоА полностью связаны с г-белком и недоступны для АНТ. И наоборот: низкий ФП в печени крыс Ват может быть обусловлен отсутствием или недостаточной емкостью мест связывания для для ацил-КоА на этом белке и наличием свободных ацил-КоА, способных ингибироьать АНТ.

Однако, данные, представленные на рис. 6, ничего но говорят о наличии и/или количестве белка в печени крыс Баг, так же, как и об общем его содержании в печени крыс Вистар.

Чтобы ответить на этот вопрос, ацил-КоА и другие гидрофобные лиганды были удалены с г-белка п-бутанолом, после чего делипидированные белки цитоплазмы были разделены гель-фильтрацией с бромсульфталеином. Профили элюции красителя с делипидированными белками приведены на рис. 7. Видно, что у обеих линий бромсульфгалеин связывается с фракцией, соответствующей г-белку, но у крыс Вистар его связывание приблизительно вдвое выше, чем у Ваг, т.е. даже у сытых крыс Ваг места связывания на г-белке полностью заняты каким-то липо-фильным субстратом. Поскольку из известных нам лигандов только д. ц. ацил-КоА имеют достаточно высокое сродство к

8ЙТ в /\

с^о1 - Ч-

г-белку, чтобы не смещаться

Рис. 7 Профиль элюции бром-сульфтзлеина с белками делипч-дированного супернатанта из 1 г. печени крыс, голодавших перед забоем 12 час. (А) - крысы Вистар, (Б) '- крысы Ваг, (В) -маркерная хроматография (ци-тохром с - 5 мг)

добавлением больших количеств 18 -

бромсульфталеина (Ketterer et al. ,1976), и в то же время достаточно хорошо растворимы в бутаноле, чтобы экстрагироваться ими при делипидировании белков (Tubbs, Garland 1964), можно сделать вывод, что даже у сытых крыс Ваг Z-белок полностью занят именно д. ц. Ацил-КоА.

Значительное количество Z-белка, свободного от ацил-КоА, в печени сытых крыс Вистар предполагает, что связаны практически все цитоплазматические ацил-КоА. По-видимому, это не позволяет им ингибировать ОФ и снижать величины ФП, поскольку Kd комплекса пальмитоил-КоА - Z-белок и Ki для АНТ по пальмитоил-КоА сравнимы по величине. В ходе голодания накопление в печени крыс Вистар д. ц. ацил-КоА приводит к тому, что через 12 час. после лишения пищи Z-белок полностью занят ацил-КоА (рис. 6), что вызывает накопление свободных ацил-КоА, ингибирование ими ОФ и снижение величины-ФП

Т. о. , у крыс Вистар, голодавших 12 час. и у крыс Ваг через 4 часа после кормления наблюдается одинаковое состояние энергетической системы в печени, несмотря на различное содержание в печени д. ц. ацил-КоА. Очевидно, что уровень энергетического метаболизма в печени определяется не общим содержанием д. ц. ацилКоА в клетке, а количеством не связанных ацил-КоА, и важную роль в поддержании такого "эффективного содержания" играет наличие в печени Z-белка.

ВЫВОДЫ

Конкретные выводы по полученным результатам изложены в конце каждой главы раздела "Результаты и обсуждение". Здесь представлены общие выводы по проделанной работе:

1. In vivo и in vitro показано, что накопление в печени д. ц. ацил-КоА и у сытых, и у голодных животных вызывает ингибирование ОФ на уровне АНТ и снижение в печени величины энергетических потенциалов системы АН. Выраженность ингиби-рующего эффекта ацил-КоА на ОФ'зависит от исходного метаболического состояния животного.

2. Введением крысам фенобарбитала и/или растительного масла позволяет целенаправленно изменять содержание в печени

- 19 -

длинноцепочечных ацил-КоА, что вызывает соотнетстиующио изменения в окислительном фосфорилировании и содержании адениннуклеотидов.

3. Крысы линий Вистар, Август и Ваг значительно отличаются по их состоянию и динамике изменений содержания ацил-КоА и адениннуклеотидов в печени в ходе первых суток голодания.

4. При сравнительном анализе энергетического метаболизма у крыс Вистар и Ваг показано, что для регуляции энергетики в печени in vivo важно не общее содержание д.ц. ацил-КоА, а концентрация свободных ацил-КоА, не связанных с цитоплазма-тическим переносчиком - Z-белком.

5. Т.о. , ингибирование окислительного фосфорилирования длинноцепочечными ацил-КоА является реальным механизмом регуляции энергетики в клетке печени in vivo, универсальным для многих метаболических состояний у разных линий животных. Выраженность изменений в адениннуклеотидной системе при изменении содержания ацил-КоА зависит от исходного метаболического состояния, конкретной метаболической организации животного и может модулироваться содержанием в печени Z-белка.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Panov А. V. , Konstantinov Y. М. , Solovyov V. N. , Lyakhovich V. V. The possible role of acyl-CoAs in the regulation of energy transformation in mitochondria //Abstracts of 10th FEBS Meeting.-Paris.-1975.-No 1441.

2. Панов A. R , Константинов Ю. M. , Соловьев В. H., Вавилин

В. А., Ляхович Е В. Дыхание митохондрий и состояние фосфорилирования адениннуклеотидов при многократном введении 3-ме-тилхолантрена и фенобарбитала//Бюлл. экспер. биол. мед. -1976. -No 9.-е. 1059-1061.

3. Мошкин Kl П., Соловьев Е Е , Вавилин Е А., Панов А. В. Изменения энергетического метаболизма у крыс разных линий при адаптации к холоду //Адаптация человека в различных кли-мато-географических и производственных условиях: Тез. докл. 3-й Всесоюзн. конференции. -Новосибирск. -1981. -с. 52-54.

4. Панов А. В., Вавилин В. А. , Соловьев В. Н , Ляхович В. В. Ре-

- 20 -

акция на голодание кап основа активных изменений в печени

//там же. -с. 59-00.

5. Панов Л. В. , Вавилин В. А. , Соловьев К К , Ляхович Е К Взаимоотношения между системой адениннуклеотидов и окислительным фосфорилированием в печени в динамике голодания //Биохимия. - 1983. -т. 48. -с. 235-243.

6. Соловьев В. Н., Вавилин К А., Панов А. К Состояние энергетического метаболизма и распределение липидов в печени крыс при введении фенобарбитала и масла //Биохимия. - т. 48. -с. 1149 -1156.

7. Соловьев В. Н., Панов А. В. , Вавилин а А. Влияние разных сроков голодания на характер наблюдаемых изменений энергетического обмена в печени крыс //Вопр. мед. хим. -1984. -т. 30. -с. 139-142.

8. Панов А: В. , Соловьев К Н. , Вавилин К А. Регуляция энёре-гетического метаболизма печени на уровне митохондриального переносчика адениннуклеотидов //Метаболическая регуля,ция метаболического состояния: Тез. Всес. Симп.-Пущино.-1984.-с. 29-31

9. Панов А. В. , Вавилин В. А. , Соловьев В. Н. Ключевая роль

д. ц. ацил-КоА в адаптивных перестройках энергетического обмена //Особенности липидного обмена в условиях Сибири и Дальнего Востока: Тез. Всес. Симп.-Чита.-1978.-с. 141-142.

10. Макарова С. И. , Соловьев К Н. , Панов А. В. Изменения обмена липидов в печени крыс при введении фенобарбитала и масла //там же. -с. 144-146.

11. Соловьев В. Н., Панов А. К Взаимоотношения между ацил-КоА и цитохромом Р-450 в печени крыс содержавшихся на сбалансированной диете при введении фенобарбитала и масла //Цитохром Р-450 и охрана окружающей среды: Тез. Всес. конф.-Новосибирск. - 1987.-с. 108.

12. Панов А. К , Вавилин В. А., Соловьев В. К Адаптивные механизмы в системе адениннуклеотидов в- печени //Анализ регуляции гомеостатических процессов. -Красноярск. -1987. -с. 3-21.

13. Соловьев К К , Вавилин К А. , Панов А. В. Модулирование 1-белком ингибиторного влияния д. ц. ацил-КоА на окислительное фосфорилирование митохондрий печени у крью разных линий // Биохимия.-1989.-Т. 54.-с. 1681-1685. .

- 21 -