Исследование механизмов острых токсических эффектов ацилкарнитинов

Бережнов, Алексей Валерьевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Исследование механизмов острых токсических эффектов ацилкарнитинов
ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Исследование механизмов острых токсических эффектов ацилкарнитинов"

Бережное Алексей Валерьевич

ИССЛЕДОВАНИЕ МЕХАНИЗМОВ ОСТРЫХ ТОКСИЧЕСКИХ ЭФФЕКТОВ АЦИЛКАРНИТИНОВ

03.00.02-Биофизика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Пущино - 2009

003486093

Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Институте биофизики клетки РАН г. Пущино, Россия

Научные руководители:

Доктор биологических наук, профессор, зав. лаб. Внутриклеточной сигнализации ИБКРАН

Кандидат физико-математических наук

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Института теоретической и

экспериментальной биофизики РАН

доктор биологических наук, зав. Лаб. общей физиологии им. Х.С.Коштоянца Института биологии развития им. Н.К.Кольцова РАН

Ведущая организация: Московский государственный университет Институт физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского

Защита диссертации состоится «/¿» декабря 2009 г. в/? ч/^мин. на заседании Диссертационного совета Д002.038.01 при Институте биофизики клетки РАН по адресу: 142290, г. Пущино, ул. Институтская, д. 3.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биофизики клетки РАН.

Автореферат разослан «/£» ноября 2009 г.

Валерий Петрович Зинченко

Владимир Владимирович Дынник

Евгений Ильич Маевский

Павел Владимирович Авдонин

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Хроническое увеличение уровня циркулирующих в крови липидов и свободных жирных кислот (ЖК) является одним из основных риск-факторов развития ожирения, диабета 2 типа и ряда сердечно-сосудистых заболеваний (Desvergne el al, 2004, McGavock et al, 2006). При микровезикулярном стеатозе в печени срочная мобилизация ЖК может быть причиной гибели клеток мозга (печеночные энцефалопатии, синдром Рейе и Рейе-подобные заболевания). В остром варианте при переходе от ишемии пораженного участка к его реперфузии при инфаркте или инсульте, резкое накопление ЖК и их производных - ацил-КоА и ацилкарнитинов -рассматривается как один из главных механизмов поражения клеток сердца и мозга (Katz, 1982 Corr et al, 1984, Liedtke, 1988 Weiss et al, 2003., Phillis et al., 2002).

К числу наиболее токсичных жирных кислот относятся насыщенные -миристиновая (С14:0), пальмитиновая (С16:0) и ненасыщенные - олеиновая (С18:1), арахидоновая (С20:4) кислоты.

Хорошо известны протонофорные эффекты насыщенных ЖК, а также способность ЖК стимулировать формирование митохондриальной поры (тРТР) (Wojtczak et al., 1998, Bernardi et al, 2002). Также имеются данные, что апоптоз клеток, вызванный длинноцепочечными ЖК, опосредован действием их активированных производных (El-Assaadet al., 2003, Hardy et al, 2003).

Накопление Ca2+ в митохондриях (MX), в присутствии избытка ЖК, с последующей деполяризацией MX, возникновением тРТР и выбросом Са2+, НАДН и цитохрома С, рассматривается как основной механизм дисфункции MX, обуславливающий гибель клеток вследствие некроза или апоптоза СBernardi, 2002, Trost and Lemasters, 1996, 1997, Penzo et al, 2002). Другие авторы (Abdul-Ghani, et al, 2008, Tominaga et al, 2008) постулируют первичную роль дисфункции митохондрий при избытке не только свободных ЖК, но и длинноцепочечных ацилкарниитинов и ацил-КоА.

Регуляция системы [3-окисления ЖК устроена таким образом, что при избыточной мобилизации ЖК в системе может возникать феномен автоингибирования (Dynniket al., 1984). В результате ингибирования ключевых реакций производными лекарственных препаратов может усиливаться феномен автоингибирования р-окисления ЖК с накоплением КоА-производных, с последующим каскадом ингибирования и других метаболических и сигнальных систем печени, сердца и мозга Щынник и др., 2005). Помимо митохондриальных ферментов мишенью производных длинноцепочечных ЖК являются почти все Са2+-транспортирующие системы клетки. Показано, что ацилкарнитины длинноцепочечных ЖК могут ингибировать или непосредственно активировать Са2+-каналы плазмалеммы (Spedding and Mir, 1987, Wu and Corr, 1992). Ацил-КоА или их комплексы с буферным белком АСВР, а также ацилкарнитины' способны активировать Са2+-каналы саркоэндоплазматического (СР/ЭР) ретикулума: рианодиновые каналы (RyR) (Fulceri et al., 1994, Dumonteil et al,

1994, el-Hayek et al, 1993, Yantada et al., 1994) и ^-чувствительные каналы (IP3R) (Fulceri et al., 1993). В зависимости от концентрации, ацилкарнитины могут стимулировать или подавлять активность Са2+-транспортирующих АТФаз (Adams et al., 1979, Dumonteil et al., 1994). В некоторых работах показано, что длинноцепочечные ацилкарнитины способны вызывать кальциевую перегрузку клеток (Netticadan et al, 1999).

Таким образом, в литературе имеются данные, указывающие на потенциальные мишени действия ЖК и их производных при накоплении в клетках. Но сведения о временной организации этих процессов, и о том, какие из них являются первостепенными и критическими, фрагментарны. Отчасти это может быть связано с широким использованием модельных систем (исследования на микросомах, суспензиях митохондрий, пермеабилизованных клетках). По нашим представлениям, такой упрощенный подход накладывает ограничения на возможность перенесения результатов исследований на уровень целой клетки.

Цель исследования. Целью данной работы является выяснение механизмов токсического действия патофизиологических доз длинноцепочечных ацилкарнитинов на культуры клеток различных типов.

Основные задачи исследования.

1. Выявление причин увеличения концентрации ионов кальция в цитозоле клеток при действии патофизиологических доз ацилкарнитинов.

2. Установление роли митохондрий в процессе развития токсического эффекта длинноцепочечных ацилкарнитинов.

3. Определение механизмов возникновения неспецифической проницаемости плазмалеммы клеток при действии токсичных доз ацилкарниитнов.

Научная новизна работы. В настоящей работе показано, что длинноцепочечные ацилкарнитины - пальмитоилкарнитин (PC) и миристоилкарнитин (МС) в концентрациях 10-50мкМ приводят к дестабилизации кальциевого гомеостаза возбудимых и невозбудимых клеток за счет активации кальциевых каналов саркоэндоплазматического ретикулума (СР/ЭР) с последующим нарушением проницаемости плазмалеммы. В кардиомиоцитах ацилкарнитины вызывают рост [Ca2+]¡ после лаг-фазы, сопровождающийся развитием гиперконтрактуры и последующим возникновением неспецифической проницаемости плазмалеммы для ионов Са2+, Na+ и молекул флуоресцентного зонда. В невозбудимых клетках (АКЭ, НЕр-2, астроциты) увеличение [Ca2+]¡ происходит без лаг-фазы и усиливается за счет входа Са2+ га внеклеточной среды через SOC-каналы. Наиболее резистентными к воздействию ацилкарнитинов являются гепатоциты. Наблюдаемый токсический эффект специфичен для PC и МС и не возникает при действии соответствующих ЖК, а также ацилкарнитинов с меньшей длиной углеродной цепи.

При действии ацилкарнитинов не происходит гиперпродукции АФК в клетках. Роль потенциал-зависимых Са2+-каналов, а также реверсии Na+/Ca2+-обменника сарколеммы кардиомиоцитов и нейронов в увеличении [Ca2+]¡ является минорной.

Впервые показано перераспределение Са2+ из CP в МХ сразу после добавления ацилкарнитинов во время лаг-фазы в кардиомиоцитах. При этом МХ ограничивают рост [Ca2+]¡, исполняя роль Са2+-буфера, а истощение Сабвуферной емкости МХ приводит к увеличению [Ca2+]¡.

На суспензиях МХ показано, что ацилкарнитины оказывают бифазный эффект на энергетику МХ - малые дозы ацилкарнитинов оказывают стимулирующий субстратный эффект, а большие дозы РС или МС приводят к деэнергизации МХ. Нами впервые показано, что эти эффекты воспроизводятся на целых клетках.

Показано, что формирование митохондриальной поры (шРТР) не имеет решающего значения в развитии некроза клеток при действии патофизиологических доз РС или МС: присутствие циклоспорина А не влияет на наблюдаемый эффект, а МХ сохраняют высокие значения мембранного потенциала (МП), по крайней мере, до нарушения целостности плазмалеммы.

Впервые показано, что длинноцепочечные ацилкарнитины стимулируют образование микродоменов с высоким содержанием Са2+ в кардиомиоцитах, которые могут способствовать возникновению автокаталитического цикла активации Са2+ -зависимых фосфолипаз (cPLA2, PLC, PLD), с последующим истощением структурных фосфолипидов мембран, возможным накоплением токсичных продуктов фосфолипаз и развитием неспецифической проницаемости плазмалеммы. Показано, что подавление активности фосфолипаз cPLA2 и PLC предотвращает нарушения целостности плазматической мембраны клеток, вызванные ацилкарнитинами.

Научно-практическая ценность. Полученные результаты позволяют глубже понять процессы, связанные с развитием острых токсических эффектов длинноцепочечных ЖК и их активированных производных при синдроме Рейе и Рейе-подобных заболеваниях, а также при реперфузии тканей в постинфарктный или постинсультный период. Кроме того, результаты данной работы могут расширить круг потенциальных мишеней для действия фармакологических препаратов при указанных расстройствах.

Апробация диссертации. Материалы диссертации были представлены на международных конференциях «Рецепция и внутриклеточная сигнализация» (Пущино, 2007, 2009), на конференции «Фундаментальная наука и клиническая медицина» (Санкт-Петербург, 2008), на XII и XIII международных Пущинских школах-конференциях молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2008, 2009), а также на международном симпозиуме «Биологическая подвижность» (Пущино, 2008).

Публикации. Основные материалы диссертации опубликованы в 13 печатных работах, из них 2 статьи в реферируемых журналах, 5 статей в сборниках и 6 тезисов докладов.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на ''¿^-страницах с использованием уГ^-фисунков 3 таблиц и включает: введение, обзор литературы, материалы и методы исследования, собственные экспериментальные данные и их обсуждение, заключение и выводы. Список литературы содержшх52Г ссылок.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Выделение кардиомиоцитов. Изолированные кардиомиоциты были получены из сердец линейных крыс породы Spraque Dowley (300-350г) по методу описанному ранее (Alekseev, et al., 1994). Сердце перфузировали раствором с проназой Е, нарезали и диспергировали в растворе с проназой и коллагеназой. Культивирование клеток НЕр-2. Культуру НЕр-2, любезно предоставленную Корыстовым Ю.Н., выращивали на флаконах в среде DMEM с добавлением FBS и глутамина в С02-инкубаторе. За сутки до эксперимента клетки высевали на покровные стекла, диаметром 25мм, Культура нейронов и астроцитов. Нейроны гиппокампа выращивали в смешанной нейронально-глиальной первичной культуре как описано в (Vergun et al., 1999). Клетки выделяли из новорожденных (2-4 дня) линейных крыс Spraque Dawley. Суспензию клеток получали с использованием трипсина. Клетки наносили на покровные стекла диаметром 25мМ, покрытые полиэтиленимином и культивировали в среде Neurobasal A+Supplement В27 в С02-инкубаторе 7-14 дней. Асцитиую карциному Эрлиха индуцировали у белых мышей-самцов NMRI введением внутрибрюшинно по 106 клеток диплоидного штамма клеток АКЭ. Клетки АКЭ изолировались из мышей на 7-й день трансплантации (Arslan et al., 1985), отмывались и ресуспендировались растворе Хенкса. Затем суспензию помещали на 25мм покровные стекла, покрытые полилизином. Для получения гепатоцитов использовали крыс-самцов линии Sprague Dawley (200-ЗООг), анестезированных тиопенталом натрия (60 мг/кг). Суспензию гепатоцитов получали методом рециркуляторной перфузии с коллагеназой in situ. Готовая суспензия содержала 85-95% живых клеток. Гепатоциты (120 ООО клеток/см2) культивировали на круглых покровных стеклах, покрытых коллагеном 3 суток перед экспериментом в среде DMEM с добавлением FBS, инсулина, дексаметазона, глюкагона.

Выделение митохондрий сердца. Суспензии MX сердца крыс были любезно предоставлены Е.А. Гришиной. Рабочая среда содержала гексокиназу, 5 мм а-КГ и 1мМ малата в качестве субстратов.

Флуоресцентная микроскопия. Эксперименты проводили с помощью флуоресцентной станции на базе Axiovert 200М, с использованием камеры AxioCam HSM (Carl Zeiss, Германия) и системой высокоскоростной смены возбуждающих светофильтров Ludí МАС5000, и наборами светофильтров для

регистрации флуоресценции. Fluo-3,4, Fura-2, TMRM, Sodium Green. Получали серии изображений кардиомиоцитов с интервалом 5 секунд. Обработку изображений проводили с помощью программы ImageJ. Построение графиков и количественный анализ проводили в программе OriginPro7.C). Регистрацию [Ca2+]j проводили с использованием зондов Fura-2, Fluo-3, Fluo-4. Культуры клеток на покровных стеклах нагружали 5мкМ эфира Fura-2AM, Fluo-3 AM, Fluo-4. После предварительного вычитания фонового сигнала рассчитывали отношение интенсивности флуоресценции Fura-2 при возбуждении в 340 и 380 нм (Fura-2 340/380). Изменения флуоресценции Fluo-3,4 представлены как AF/F0, где AF = F-F0. В некоторых экспериментах использовали нормировку на максимальный сигнал. Для регистрации [Na+]j. использовали SodiumGreen. Клетки нагружали ЮмкМ SodiumGreen (40 мин при 37°С). [Na+]i регистрировали, как и [Са2+];. Для измерения ЛТт культуры клеток нагружали 2мкМ TMRM. При гиперполяризации MX флуоресценция TMRM уменьшается (концентрационное тушение). При деполяризации увеличивается. Для регистрации АФК использовали MitoSOX Red (5мкМ, 20мин).

Конфокальная микроскопия. Эксперименты проводили с помощью Leica TCS SP5, на базе DMI 6000В. Для обработки изобаржений использовали ImageJ (http://rsbvveb.nih.gov/ii/). Регистрация Са2+-волн и спарков. Получали изображения кардиомиоцитов, нагруженных Fluo-4, в режиме XT. Измерение [Ca2+]sr. проводили с помощью зонда mag-Fluo-4. Для направленной доставки mag-Fluo-4 в структуры саркоплазматического ретикулума использовали протокол холодной загрузки (Trollinger et al., 2000). Для одновременной визуализации CP и MX совместно применяли TMRM (20нМ) и magFluo-4. Изменение [Са2+]ш. Кардиомиоциты нагружали 5мкМ Rhod-2AM с использованием протокола как для mag-Fluo-4. В контрольных экспериментах добавление к клеткам 50мМ KCl вызывало увеличение флуоресценции Rhod-2, последующее (через 1 мин) добавление 1мкМ пронофора FCCP возвращало интенсивность флуоресценции.

Все экперименты проводили при температуре 27-28°С. Используемый в работе раствор Хенкса содержал (в Мм): 138 NaCl, 1,3 СаС12, 0,4 MgS04, 0,5 MgCl2, 5,3 KCl, 0,45 КН2Р04, 4 NaHC03, 0,3 Na2HP04, 10 глюкозы, 10 HEPES (pH = 7.4), Для получения бескальциевой среды СаС12 заменяли 0,5 мМ ЭГТА. Для получения среды с низким (<100нМ) содержанием ионов кальция к раствору Хенкса, содержащему 1,3 мМ СаС12 добавляли 2мМ ЭГТА (http://brneurosci.org/egta.html'). Во время экспериментов растворы, содержащие двукратную концентрацию вносимых действующих веществ, подавались в камеру микропипеткой в объеме равном объему среды в камере до добавки. Нейроны в культуре выявляли по наличию транзитного кальциевого ответа на кратковременное добавление KCl (15 сек, за 10 мин до начала эксперимента).

Регистрация кальциевых токов методом перфорированного пэтч-клампа. Ионные токи измерялись при фиксации потенциала на мембране. Измеряемые токи регистрировали при помощи усилителя СКБ "Биоприбор". Использовали оригинальный пакет программ «BioQuest», разработанный Алексеевым А.Е. и

Кокозом Ю.М. Для построения графиков использовали значения пиковой амплитуды кальциевого тока.

Измерения в суспензии митохондрий. Эксперименты выполнены на установке (.Холмухамедов Э.Л. и др., 1980), представляющей собой комплекс микроспектрофлуориметра с высокоаппертурным контактным объективом и термостатируемой ячейки со встроенным электродом Кларка и мешалкой. Регистрация сигналов осуществлялась при помощи ЯесопЗ 4. Скорость потребления 02 митохондриями измеряли полярографически с использованием закрытого электрода типа Кларка. Измерение ДЧ'т проводили с использованием 1мкМ Шю<1атше 123 (Етат е( а!., 1986). Флуоресценцию НАДН возбуждали в 365нМ, регистрировали в 465нм.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Токсические эффекты ацилкарнитинов. Общая характеристика.

В экспериментах использовали культуры кардиомиоцитов, гепатоцитов, нейронов и астроцитов гиппокампа, асцитной карциномы Эрлиха (АКЭ), НЕр-2. Изменения флуоресценции Са2+-чувствительных зондов (Р1ио-3,4, Рига-2) регистрировали с помощью конфокального микроскопа или системы анализа изображений.

На рис.1 представлены графики изменения [Са2+]| при действии патофизиологических доз пальмитоилкарнитина (РС) в кардиомиоцитах, нейронах, клетках НЕр-2. Добавление ацилкарнитинов приводит к высокоамплитудному и быстрому росту [Са2+]| в клетках. Рост [Са2+]; в большинстве клеток возникал после лаг-фазы. При действии 50мкМ РС продолжительность лаг-фазы составляла: в тимоцитах 2-8 мин, в кардиомиоцитах 2-4мин, в нейронах 7-10мин. Клетки НЕр-2 и АКЭ отвечали увеличением [Са2+], без лаг-фазы после добавления РС или МС. В культуре гепатоцитов добавление 50-100мкМ РС приводило лишь к небольшому увеличению [Са2+]|, хотя в некоторых единичных гепатоцитах такие концентрации РС вызывали кальциевый сигнал, подобно сигналу в нейронах. Это свидетельствует о большей резистентности гепатоцитов к РС, чем других клеток. В кардиомиоцитах и клетках АКЭ при добавлении одинаковых концентраций РС или МС лаг-период более выражен при действии МС. Это может быть связано с большей активностью РС, чем МС (предполагая возможность дестабилизизации цикла ацилирование-деацилирование белков в присутствии избытка активированных производных ЖК, РС должен приводить к более эффективной активации белков-мишений, чем МС); с другой стороны - в экспериментах использовали пальмитоил-Ь-карнитин, а МС был представлен миристоил-ОЬ-карнитином.

Как правило, начало роста уровня [Са2+], в различных клетках в одной культуре не является синхронным. Для клеток характерна различная скорость накопления [Са2+]ь максимальная амплитуда роста [Са2+]; и время до начала утечки флуоресцентного зонда после добавления ацилкарнитинов. Тем не менее, среднее значение амплитуды роста [Са2+][ в нескольких клетках воспроизводимо

при повторениях. Исключением являются кардиомиоциты. В этих клетках продолжительность лаг-фазы при действии одинаковых концентраций ацилкарнитинов была одинаковой для кардиомиоцитов, выделенных из одного и того же животного, а для разных животных варьировала в пределах 4-8 мин при действии 50мкМ МС. В течение одного экспериментального дня, промежуток времени от добавки МС или РС до начала высокоамплитудного роста [Са2+]; в кардиомиоцитах воспроизводился с высокой точностью (рис.1 А).

РС, ЮмкМ

300 400 Время, сек

й а

Я 4 сГ

0 30 Время, сек

РС, 50мкМ

0 30 40 Время, мин

Рис.1. Изменение [Са ], в кардиомиоцитах (А), нейронах (Б), клетках НЕр-2 (В) в ответ на добавление РС. Каждая кривая показывает сигнал в отдельной клетке.

В кардиомиоцитах на протяжении лаг-фазы не наблюдается заметного увеличения [Са2+]|. После фазы увеличения возникает быстрое падение флуоресценции. Это особенно заметно при использовании одноволновых кальциевых зондов. Фаза роста [Са сопровождается развитием гиперсокращения кардиомиоцитов. Через некоторое время после сокращения наблюдается увеличение флуоресцентного сигнала вокруг клетки с одновременным уменьшением сигнала в области сокращенного кардиомиоцита (рис.2).

Рис.2. Последовательные

изображения кардиомиоцита. Указано время в секундах после начала эксперимента. Добавка 50мкММС на 100 сек.

Очевидно, что при этом происходит утечка зонда из клетки вследствие нарушения барьерной функции плазматической мембраны (ПМ), по сути гибели клетки. В других типах клеток также наблюдалось нарушение проницаемости ПМ через некоторое время после добавления РС или МС. На графиках на рис.1 это проявляется в резком падении интенсивности флуоресценции после высокоамплитудного роста [Са2+]|.

В нейронах добавление 10-100мкМ РС приводило, после лаг-фазы, к возникновению колебаний [Са2+]; различной частоты и амплитуды с постепенным увеличением среднего уровня [Са2+];. Затем колебания прекращались, и наблюдался дальнейший рост [Са2+];. Таким образом, в нейронах наблюдалось двухфазное увеличение [Са ];. При высоких дозах добавленного РС (ЮОмкМ) после увеличения [Са2+]; в большинстве клеток (до 80%) наблюдалась утечка зонда в течение 20 мин.

В глиальных клетках характер ответов был похож на поведение нейронов, средняя скорость накопления [Са2+]; была выше. В некоторых (1020%) глиальных клетках РС в концентрации 50мкМ вызывал транзитный кальциевый сигнал непосредственно после добавления.

Клетки НЕр-2 отвечали на добавление РС или МС с лаг-периодом в несколько секунд или без него. В некоторых клетках (20-30%) имел место транзитный кальциевый сигнал, сменяющийся кратковременным падением среднего значения [Са2+];, с последующим неконтролируемым ростом. При этом наблюдалась дозозависимость среднего ответа клеток НЕр-2 от концентрации добавленного РС (рис.3). В отдельных клетках (20-30%) наблюдались колебания [Са2+]| после добавления РС.

Причиной разной чувствительности клеток к ацилкарнитинам могут быть различия в составе клеточных мембран, различные свойствами буферных систем клеток, ограничивающих избыточное накопление свободных ЖК и их метаболитов в цитозоле, количество МХ в клетках, различная скорость утилизации накапливающихся ЖК и ряд других факторов.

Рис.3. Увеличение [Ca2+]j в клетках НЕр-2 при действии 2-50мкМ PC. Исходный сигнал принят за 0, максимальный сигнал после добавления 2мкМ иономицина (Iono) - за 1. Каждая кривая - среднее значение ответов 120-160 клеток из трех экспериментов. Исключены клетки, теряющие флуоресцентный зонд в процессе эксперимента, а также отвечающие транзитным увеличением [Са2+], на добавку PC.

Свободные ЖК (С14-С16) в концентрациях 200-1000мкМ не вызывали резкого увеличения [Са2+]; в кардиомиоцитах и клетках НЕр-2 на промежутке времени до 70 мин. Свободные ЖК (в присутствии 0,2% БСА) в отдельных клетках вызывали медленное увеличение [Са2+} небольшой амплитуды и не вызвали гиперсокращения кардиомиоцитов.

В работах (El-Assaad et al., 2003, Hardy et al., 2003) было показано, что апоптоз клеток, вызванный длительной (4-6ч.) инкубицией клеток с избытком пальмитата, предотвращается при подавлении активации ЖК до ацил-КоА. Поэтому наблюдаемые нами эффекты свободных ЖК могут быть частично опосредованы образующимися активированными ЖК.

Ацилкарнитины с меньшей длиной углеродной цепи (С6-С10) неспособны вызвать увеличение [Ca2+]i в концентрациях до ЗООмкМ. Это согласуется с данными других авторов о том, что в ряду ацилкарнитинов насыщенных ЖК наибольшей токсичность обладают производные длинноцепочечных ЖК. Карнитин в концентрации 1-2мМ не вызывал кальциевых сигналов в кардиомиоцитах, клетках АКЭ и НЕр-2.

Наблюдаемые эффекты не связаны с детергетными свойствами ацилкарнитинов (на исследованных промежутках времени): как будет показано далее, нарушение целостности ПМ возникает вследствие активации фосфолипаз.

Гиперпродукция АФК после добавления ацилкарнитинов также не наблюдается. Используя в качестве объекта исследования культуру нервных клеток, прокрашенных флуоресцентным зондом MitoSox Red нами было показано, что при действии 50мкМ PC не происходит достоверного увеличения скорости продукции АФК в клетках (рис.4). Более того, можно говорить о тенденции к уменьшению продукции АФК в присуствии ацилкарнитина. Инкубация клеток в среде с 1мМ аскорбата не влияет на эффект МС или PC.

Время, сек

—•—контроль -.-PC, SO^M

Рис.4. Изменение продукции АФК в культуре клеток гиппокампа крысы при действии 50мкМ PC (*), по сравнению с контролем |Ц измеренное по флуоресценции MitoSox Red. Для каждой представлено среднее значение 30 клеток (по 10 из 3-х независимых экспериментов) ±SD.

10 1S Время, мин

Токсические эффекты аннлкарннтннов. Источники увеличения [Са2+||

На следующем этапе была предпринята попытка выяснить источник увеличения [Са2+], в клетках при действии ацилкарнитинов.

Вклад входа кальция снаружи клеток и опустошения Са2+-депо. В бескальциевой среде (раствор Хенкса -СаС12, +0.5мМ ЭГТА), РС и МС также вызывали увеличение [Са2+];. Амплитуда этого увеличения в ответ на 20мкМ РС была заметной и составляла до 30% от контрольной, если перед добавкой РС клетки инкубировались 2-3 мин в бескальциевой среде. Если предынкубация в бескальциевой среде продолжалась 20 мин, амплитуда ответа составляла не более 10%, по сравнению с контролем. Таким образом, вход ионов кальция в кардиомиоциты из внеклеточной среды имеет место, хотя и не определяет

Рис.5. Изменения [Са2+], в кардиомиоцитах в ответ на добавление 20мкМ РС. Контроль - клетки инкубировались в среде содержащей 1,3мМ Са2+. 2 и 20 мин Са2+-й-ее -клетки инкубировались в бескальциевой среде 2 и 20 минут перед добавкой РС, соответственно. Показаны средние значения изменений [Са2+]| в 5-8 клетках для каждой кривой.

Использование кратковременной инкубации клеток в бескальциевой среде не предотвращало развитие гиперконтрактуры кардиомиоцитов и нарушение проницаемости ПМ для зонда (хотя оно наступало на 2-5 мин позже, чем в контроле при действии 20мкМ РС). Наблюдаемое увеличение [Са2+]1 в бескальциевой среде предшествовало началу сокращения клеток, как и в экспериментах с 1,ЗмМ Са2+ в среде инкубации. При длительной инкубации клеток в бескальциевой среде гиперконтрактура и утечка зонда не возникали (до 20 мин) при действии 20мкМ РС.

полностью увеличение [Са2+],.

Время,сек

В культуре клеток гиппокампа вклад входа кальция снаружи был больше чем, в миоцитах и составлял до 90% от общего среднего увеличения [Са2+];. В клетках НЕр-2 в среде с низким содержанием Са2+ (<100нМ) РС и МС вызывали незначительное увеличение [Са2+]; (не более 10% от среднего значения, измеренного в полной среде Хенкса).

Таким образом, в остром токсическом эффекте ацилкарнитинов в первую очередь имеет место мобилизация Са2+ в цитозоль из внутриклеточных запасов. Можно предположить, что эта мобилизация является первичной по отношению к входу Са2+ в из внеклеточной среды и способна приводить к нарушению проницаемости ПМ.

Следует отметить, что количественная оценка амплитуды увеличения [Са2+]1 затруднительна. Это связано с нелинейной зависимостью между интенсивностью измеренной флуоресценции зонда в области высоких концентраций ионов кальция, превышающих 10хдля данного зонда (ТакаИаяЫ еГ а1, 1999). Очевидно, что когда нарушается целостность ПМ, уровень [Са2+^ становится равным внеклеточному (1,3мМ Са2+), а это на порядки превышает К^ для Рига-2 (около 224нМ) и Р1ио-3,4 (около 400нМ). Утечка зонда из клеток также затрудняет измерение амплитуды роста [Са2+];.

Добавление к кардиомиоцитам 1-10мкМ тапсигаргина (ТО) - ингибитора ЗЕЯСА - перед введением РС оказывает защитное действие на клетки (рис.5) При этом наблюдается увеличение продолжительности лаг-фазы, и ограничивается максимальный уровень [Са2+]„ однако не предотвращается гиперконтрактура кардиомиоцитов. Предварительное опустошение СР 1 мМ кофеина (в присутствии ЮмкМ Тй для предотвращения футильного цикла закачки и выброса Са2+ из СР) вызывает такой же защитный эффект на клетки. Предынкубация кардиомиоцитов с ТО и кофеином полностью предотвращает возникновение неспецифической проницаемости плазмалеммы для Са2+-зонда.

Время, мин

Рис.6. Изменение [Са2+]; в кардиомиоцитах в ответ на добавление 50мкМ РС на фоне 1мкМ (1мкМ ТС), ЮмкМ (ЮмкМ ТС) тапсигаргина и одновременно 1мМ кофеина и ЮмкМ Тв (ЮмкМ ТС+1 тМ СаО- Каждая кривая - среднее значение сигнала Бига-2 в 8-12 клетках.

Рис.7. Изменение [Са2+]] при действии 25мкМ МС в клетках НЕр-2 в контроле (черная кривая) и на фоне ТС (серая кривая). Каждая кривая - среднее значение флуоресценции Р1ио-4 в 60 клетках из двух экспериментов.

В клетках НЕр-2 предварительное опустошение Са +-депо 2мкМ Тв полностью предотвращало накопление [Са2*], в ответ на 25мкМ МС (рис. 6, красная кривая) и возникновение неспецифической проницаемости ПМ. В другом случае, добавление ТО на фоне действующего МС (до потери флуоресцентного красителя), не приводило к дополнительному увеличению [Са2+^ (рис. 6, черная кривая). В контроле 6% клеток теряли кальциевый зонд в течение Юмин после добавления 25мкМ МС. При добавлении МС на фоне ТО в течение Юмин ни в одной из клеток не наблюдалось неспецифической проницаемости ПМ.

В кардиомиоцитах применение блокаторов Са2+-каналов Ь-типа не оказывало влияния на развитие эффектов МС и РС. Методом перфорированного пэтч-клампа показано, что ацилкарнитины после кратковременной активации вызывают ингибирование Са2+-тока Ь-типа.

Предынкубация клеток НЕр-2 с блокатором 1Р3Я ксестоспонгином С (ХБ, ЮмкМ) обеспечивает защитный эффект при действии 25-50мкМ МС (рис.8). При этом возникает лаг-фаза, предшествующая накоплению [Са2+]|. Количество клеток, в которых возникает утечка кальциевого зонда в первые 10 мин после добавки 50мкМ МС составляла 46+/-7% (по 90 клеткам из 3-х экспериментов). В присутствии ЮмкМ Х8 ни в одной клетке не наблюдалось утечки зонда не только после добавки 50мкМ МС, но также и в течение 10 мин после начала увеличения среднего уровня [Са2+],. Эти результаты свидетельствуют о первостепенной роли опустошения Са2+-депо в наблюдаемом эффекте ацилкарнитинов. Следует учитывать, что на представленном графике (рис.8 черная кривая) амплитуда увеличения [Са2+]] в клетках сильно занижена из-за ограниченного диапазона чувствительности кальциевого зонда, а также из-за асинхронного ответа отдельных клеток - когда часть клеток еще накапливают [Са2+]|, другие уже теряют флуоресцентный зонд (см. рис.1 В).

2,0 й:" 1.5

и.

|1.с

" 0,5 0,0

О 5 10 15 20 25 30 Время, мин

Рис.8. Изменения [Са2+]; в клетках НЕр-2, измеренные по флуоресценции Р1ио-4. При предварительной инкубации клеток с ЮмкМ ксестоспонгина (ХЭ, серая кривая) увеличивается лаг-фаза при действии 50мкМ МС.

6 8 10 12 14 16 18 Время, мин

Рис.9. Изменение уровня [Са2+]| в клетках НЕр-2, измеренное по флуоресценции Р1ио-4 в контроле после добавления 25мкМ МС (контроль) и на фоне 1 (1мкМ 0(13+) и ЮмкМ (ЮмкМ Ос13+) гадолиния. Представлены средние значения по 90 клеткам (по 30 из 3-х экспериментов).

В невозбудимых клетках опустошение ЭР может приводить к активации 50С-каналов на ПМ и увеличения амплитуды Са2+-сигнала в цитозоле. С использованием гадолиния (Ос13+) в качестве блокатора 80С-каналов мы показали уменьшение амплитуды роста [Са2+]! в клетках НЕр-2 (рис.9), и появление лаг-фазы, предшествующей накоплению [Са2+]1, по сравнению с контрольным экспериментом. При действии 50мкМ МС нарушение проницаемости ПМ в течение 10 мин после добавки МС наблюдалось у 9 клеток из 300 (в трех экспериментах). В присутствии 1мкМ Ос13+ проницаемость для зонда возникала лишь у 1 клетки из 300, а в присутствии ЮмкМ Сс13+ в течение Юмин после добавки МС ни одна клетка не теряла флуоресцентный зонд.

Результаты этих экспериментов показывают первостепенное значение мобилизации Са2+ из СР/ЭР в развитии нарушений целостности ПМ. При этом в кардиомиоцитах выброс Са2+ из СР способен обеспечить развитие проницаемости ПМ для Са2+ и флуоресцентного зонда, а в невозбудимых клетках токсический эффект ацилкарнитина усиливается за счет депо-зависимого входа Са2+ снаружи клеток.

Вклад митохондрий. Предварительная инкубация кардиомицитов с ротеноном и олигомицином вызывала исчезновение лаг-фазы после добавления РС и МС, а скорость увеличения [Са2+]; возрастала пропорционально концентрации МС (рис.10). Этот эффект не связан с входом Са2+ снаружи клеток: на фоне ротенона и олигомицина исчезновение лаг-фазы также наблюдалось и в среде с низким содержанием Са2+ (<100нМ) (рис.11)!

1,0

п.-

и: 0,8 <

1 0,6 С 0.4 0.2 0,0

О 100 200 300 400 600 МО Время, сек

Рис.10. Изменение уровня [Са2+^ в кардиомиоцитах по флуоресценции Р1ио-4. При добавлении различных доз МС на фоне 1мкг/мл. ротенона 2мкг/мл олигомицина рост [Са2+]; происходит без лаг-периода. Нормировано на максимальный сигнал после добавления 2мкМ иономицина(1опо).

400 600 800 1000 1200 Время, сек

Рис.11. Изменение [Са ], в кардиомиоцитах, измеренное по флуоресценции Р1ио-4 при действии 50мкМ МС в контроле (контроль) и на фоне 5мин предынкубации клеток с 1мкг/мл ротенона и 2мкг/мл олигомицина (Рот+Олиг) в среде, содержащей 1,ЗмМ СаС12 и 2мМ ЭГТА.

Эти результаты указывают на то, что в течение лаг-фазы в кардиомиоцитах может происходить перераспределение ионов кальция из СР в МХ. При этом МХ, по-видимому, выполняют роль буфера Са2+. Возможность

такого перераспределения обеспечивается тесной колокализацией цистерн CP и MX, которая показана в ряде работ {Popov at al., 2003, Sharma et al., 2004, Shkryl and Shirokova, 2006, Ogata and Yamasaki, 1987) и в наших экспериментах с помощью конфокальной микроскопии при одновременной визуализации Са2+-запасающего CP и MX.

Чтобы показать перераспределение Са2+ из CP в MX в отдельных экспериментах измеряли уровень Са2+ в CP и в MX при действии 5мкМ PC (рис.12). Добавляли низкие дозы PC (2-5мкМ), чтобы избежать возможных артефактов, связанных с движением клеток.

о 25

г- 24

Рис.12. Изменения [Са ]ж (черная кривая) и [Са2+]т (серая кривая) в кардиомиоцитах, измеренные по флуоресценции п^-Пио-4 и Ююс1-2, соответственно, при действии 5мкМ РС. Кривые получены в отдельных экспериментах.

200 300 400 Время,сек

S00 600 700

Зависимость продолжительности лаг-фазы от кальций-буферной емкости MX. Известно, что кальций может запасаться в MX при физиологических значениях рН в матриксе MX в виде малорастворимого фосфата кальция в комплексе с липопротеинами мембраны (Nicholls and Chalmers, 2004; Сурин, 2007), что ограничивает концентрацию свободных ионов кальция в матриксе MX и определяет Са2+-буферную емкость MX.

Считается, что при истощении кальциевой емкости MX происходит образование (тРТР) и выброс Са2+ в цитозоль, что может приводить к развитию апоптоза или некроза клеток (Bernardi, 2002).

Рис.13. Изменения [Ca2+]j в кардиомиоцитах при различных концентрациях Pi в среде инкубации Лаг-«м период после добавления 50мкМ МС зависит от количества Pi. Приведены средние значения по 8-10 клеткам в экспериментах, проведенных на кардиомиоцитах, выделенных из одного животного.

4.0'

6" 3.5-

| 2.5

| 3.0

& 1,0

% ..

100 200 300 400 500 600 Время, сок

В кардиомиоцитах фаза быстрого увеличения уровня [Са2+]; может быть вызвана исчерпанием кальций-буферной емкости МХ (с образованием тРТР или без него). Для проверки этого нами были проведены эксперименты с

разными количествами фосфата (Pi) в среде инкубации кардиомиоцитов. Такой подход ранее был описан для нейронов (Сурин и др., 2007). Было выявлено, что увеличение Pi в среде инкубации кардиомиоцитов от 0,4мМ до 4мМ приводит к увеличению длительности лаг-фазы после добавления 50мкМ МС (Рис.13). В клетках НЕр-2 увеличение Pi приводило к ограничению амплитуды роста [Са2+];.

Вклад SERCA в поддержание лаг-фазы. В поддержании низкого уровня цитозольного кальция в течение лаг-фазы, помимо MX, которые, в этих условиях, являются главной Са2+-буферной системой, могут участвовать также SERCA и РМСА. Однако по данным ряда авторов в кардиомиоцитах вклад РМСА в поддержание низкого уровня [Са2+]; в физиологических условиях невелик (Oceandy et.al., 2007, Choi and Eisner, 1999).

Нами показано, что частичное подавление активности SERCA с помощью 100 нМ тапсигаргина (TG), не приводит к резкому росту [Са2+];, но вызывает медленное увеличение флуоресценции Fluo-4 сразу после добавления МС. Таким образом, SERCA участвует в поддержании лаг-фазы. Другая роль SERCA может быть связана с образованием футильного цикла: активация выброса кальция из CP ацилкарнитинами провоцирует активацию SERCA. Это может приводить к снижению концентрации клеточного АТФ. Накопление ацил-КоА в цитоплазме также способно приводить к активации SERCA (Dumonteil et al., 1994). Накопление ацил-КоА в митохондриях может уменьшать производство АТФ в MX (Дынник и др., 2005). В итоге происходит снижение концентрации клеточного АТФ. Однако полное истощение АТФ в экспериментах in situ представляется маловероятным ввиду наличия обратных связей — ингибированию клеточных АТФ-аз своими продуктами.

Таким образом, на протяжении наблюдаемого лаг-периода низкий уровень [Са2+]| после активации RyR ацилкарнитинами поддерживается согласованной работой систем удаления ионов кальция из цитозоля - митохондриями и SERCA. Также возможно участие РМСА и Ыа+/Са2+-обменика ПМ. Последующее накопление [Ca2+]j происходит вследствие истощения Са2+-буферной емкости MX. Это может сопровождаться формированием шРТР.

Реверсия №+/Са2+-обменника плазмалеммы. Увеличение [Na+]j. Перед возникновением проницаемости ПМ для флуоресцентных зондов мы наблюдали увеличение уровня Na+ в цитозоле клеток ([Na+]|). Увеличение [Na+]i всегда происходило после накопления [Ca2+]j. Таким образом, возможная реверсия Ыа+/Са2+-обменника ПМ (Ruiz-Meana et al., 1996) не является причиной роста [Са2+]; в кардиомиоцитах. Нами отмечено набухание невозбудимых клеток (НЕр-2, АКЭ) сопровождающееся образованием вздутий на ПМ после фазы увеличения [Са2+]|. Это может быть связано с нарушением работы Na+/K+-АТФазы и/или с возникновением неспецифической проницаемости ПМ для Na+.

Исследование поведения митохондриалыюго потенцила (АТ^) при действии ЖК и их карнитиновых производных.

При измерении митохондриального потенциала можно предполагать различную реакцию клеток на добавление ЖК и их карнитиновых производных на клеточном уровне: 1) Рост митохондриального потенциала за счет субстратного эффекта и активации (3-окисления ЖК. 2) Падение ДЧ'т за счет протонофорного эффекта свободных жирных кислот. 3) Падение ДЧ'т за счет входа кальция в митохондрии. 4) Снижение ДЧ'т за счет подавления ферментов ЦТК СоА-производными ЖК или угнетения электронно-транспортной цепи.

Исследования на изолированных митохондриях. 5 работе анализировали эффекты свободных ЖК и ацилкарнитинов на скорость дыхания МХ, уровень Д*Рт, флуоресценцию НАДН.

РС и МС оказывают бифазные эффекты на МХ: до 20 мкМ МС и РС за счет субстратного эффекта приводят к активации дыхания МХ, увеличению Д(1'т, активации продукции НАДН; при больших концентрациях происходит деэнергизация МХ - падение МП, уменьшение скорости потребление 02, окисление НАДН (рис.14). Ингибирующие эффекты ацилкарнитинов были обратимы на малых временах 2-Змин и необратимы на больших. Подобные эффекты наблюдались и при действии пальмитата и миристата. Но для достижения ингибирующего эффекта требовались большие концентрации ЖК (>100мкМ).

А Б

Рис.14. Влияние последовательных добавок РС на Ду, измеренный по флуоресценции Шю(1атше 123, и скорость дыхания МХ сердца крысы (А), а также на интенсивность флуоресценции ЫА1ЭН (Б, измерено в параллельном эксперименте). Среда содержала гексокиназу, 5мМ а-КГ и 1мМ малата

Результаты экспериментов, проведенных Е.В. Гришиной показывают (Дынник и др., 2008), что в присутствии Са2+, при ингибировании дыхания МХ и падении ДЧ'т при последовательных добавках РС (по ЮмкМ) имеет место градуальный выход и, затем (п|ж суммарной концентраии РС - 50мкМ) -высокоамплитудный выброс Са2 из МХ. Наличие СэА в среде увеличивает время удержания Са2+ в митохондриях на 15-20%, но не устраняет наблюдаемый эффект.

Таким образом, предполагаемое рядом авторов образование тРТР не является главной причиной дисфункции МХ при избытке ЖК и их метаболитов. В митохондриях наблюдается субстратный и ингибирующий эффекты ацилкарнитинов и свободных ЖК. Концентрации ацилкарнитинов при которых наблюдается деэнергизация МХ превосходят концентрации, вызывающие гибель клеток.

Исследования мембранного потенциала митохондрий на уровне клеток. С использованием кардиомиоцитов, прокрашенных ТМЯМ было показано, что после добавления 10-50мкМ МС или РС наблюдается общая тенденция к деполяризации на уровне целой клетки (по-видимому за счет входа Са2+). Тем не менее, отдельные митохондрии или кластеры МХ отвечают увеличением ДЧ^ в первые минуты после добавки ацилкарнитина. Эта гиперполяризация иногда сменяется деполяризацией МХ до исходного уровня или ниже (рис.15). До начала сокращения кардиомиоцитов обычно не наблюдается скачкообразной деполяризации МХ. Во время сокращения анализ изменений ДЧ^ затруднен, ввиду движения клетки. Однако способность протонофора РССР вызывать мощную деполяризацию МХ после окончания сокращения клеток свидетельствует о том, что глобальная деполяризация МХ при действии РС не происходит и не может являться причиной клеточной гибели. Наличие СэА (5-20мкМ) в среде не влияет на наблюдаемый эффект.

О 100 200 300 «00 500 600 700 Время, см

Рис.15. Гиперполяризация и деполяризация МХ при действии ацилкарнитинов. После добавления 20мкМ РС на фоне общей деполяризации клетки (серая кривая и белая область выделения) имеются области гиперполяризации (черная кривая и область выделения). После первоначальной гиперполяризации, через некоторое время в МХ кардиомиоцитов приоисходит снижение ДЧ'щ. Добавление протонофора FCCP вызывает полное падение ДЧ1,,, и увеличение флуоресценции TMRM как до, так и после сокращения. Графики перевернуты — падению А1?™ соответствуют более отрицательные значения шкалы. На рисунках деполяризация - усиление флуоресценции. Время сокращения верхней клетки отмечено прямоугольником.

Добавление 20мкМ CsA к клеткам, предшествующее введению МС или PC, не вносит изменений в характер увеличения [Ca2+]j в кардиомиоцитах, нагруженных Fluo-4.

Таким образом, из двух возможных вариантов поведения MX в присутствии избытка ацилкарнитинов и Са2+ - формирование шРТР или прекращение транспорта Са2+ в MX (и соответствующее увеличение [Са2+]|) без образования высокопроводящих пор - экспериментальные данные указывают на второй вариант, хотя и не исключают возможность образования тРТР в отдельных кластерах MX. Длинноцепочечные ацил-КоА в концентрациях до 5мкМ способны блокировать транслокатор адениновых нуклеотидов (Paulson and Shug, 1984 Ciapaite et al, 2006) - один из ключевых компонентов mPTP, что в условиях избытка Са2+ может предотвращать формирование поры. Одновременно может происходить ингибирование Са2+-унипортера MX при высоких [Ca2+]j(Moreau et al., 2006, 2008)

Свободные ЖК - пальмитат и миристат в концентрациях 100-500 мкМ приводили к дозозависимому снижению Д*Рт. По-видимому, в случае свободных ЖК протонофорный эффект маскирует субстратный, а в случае ацилкарнитинов, не обладающих разобщающими свойствами, можно наблюдать все предполагаемые типы ответов - гиперполяризацию и деполяризацию MX.

Токсические эффекты ацилкарнитинов. Локальные кальциевые сигналы и вклад фосфолипаз

Влияние ацилкарнитинов на локальные Са2+ сигналы.

На рис.16 представлены результаты экспериментов по регистрации [Ca2+]i с помощью конфокального микроскопа в режиме XT в кардиомиоцитах.

1с II BiN Юс ...... ' Щ •». 2 90S Рис.16. Влияние РС на частоту возникновения Са2+-спарков в кардиомиоцитах. Представлены конфокальные изображения в режиме ХТ через 10 (слева) и 250 сек (справа) после добавления 20мкМ РС. По горизонтали - время, по вертикали - продольная ось кардиомиоцита.

1с I* ■ см 60с 4 *:: « Щ Ш' ..... : ' ' <Я>Ш:-

Рис.17. Формирование микродоменов с высоким содержанием Са2+ в кардиомиоцитах после добавления 20мкМ РС. По горизонтали - время, по вертикали - продольная ось кардиомиоцита. Указано время после добавления РС.

Через 3 мин после добавления 20мкМ РС, наблюдается значительное увеличение частоты Са2+-спарков. На фоне общего увеличения частоты спарков после добавления РС в кардиомиоцитах возникают серии Са2+-спарков, наблюдаемых в одном и том же месте. Такие серии спарков можно возникают при действии даже малых доз (2-5мкМ) ацилкарнитина. При больших концентрациях РС (более 5мкМ) возникают микрообласти с повышенным содержанием Са2+ в местах появления спарков - кальциевые микродомены (рис. 17). Такие микродомены сохраняются, по крайней мере, до начала сокращения клетки.

Участие фосфолипаз в токсическом действии ацилкарнитинов.

Возникновение неспецифической проводимости ПМ может быть связано с активацией Са2+-зависимых фосфолипаз (сРЬА2, РЬБ2, РЬСру) с последующим гидролизом структурных фосфолипидов ПМ (Беп е1 а!., 1988), а также с накоплением токсических метаболитов - арахидоновой кислоты (АА) и продуктов ее окисления. На рисунке 9 представлены возможные механизмы регуляции фосфолипаз сРЬА2, Р1ЛЭ2, РЬСр,у, обеспечивающие возникновение «порочного круга» (автокаталитического цикла) активации этих ферментов в присутствии избытка Са2+.

Рис.18. Механизмы

*............ регуляции фосфолипаз,

\ способные обеспечить /рш р1_о ! автокаталитический

цикл активации этих ._.-;Ь»г* ферментов. Описание в

"»•М-/л-fi ............. + ...........................' /

пал —-— »■pa ; ч **' * ^ / тексте

илй,...рАр.-НА1 . -'-.ркс C.MKII !

pla2 pla;

Активирующие регуляции показаны пунктирными стрелками. Активация такого цикла может происходить за счет увеличения [Ca2+]¡ в конце лаг-фазы при действии ацилкарнитина, а также за счет формирования устойчивых во времени микродоменов с высоким содержанием Са +.

Наряду с реакциями, катализируемыми фосфолипазами на схеме представлены: активируемая Са2+ церамидкиназа (СК) (Mitsutake and Igarashi, 2005), продукт которой церамид-1-фосфат (С1Р) является активатором cPLA2; активируемые DAG и Са+ различные изоформы протеинкиназы С (РКС), обеспечивающие ковалентную модификацию и активацию фосфолипаз; реакции обмена DAG и фосфатидной кислоты (РА), катализируемые ферментами -диацилглицеролкиназой (DK) и фосфатидилфосфатазой (РАР). Субстраты этих ферментов - DAG и РА - являются активаторами фосфолипаз.

Утилизация АА по липоксигеназному пути может приводить также к образованию токсичных эйкосаноидов. (Kwon et al., 2005).

Согласно нашим представлениям, схема, представленная на рисунке 18, указывает на ключевую роль Са2+ в активации всех трех фосфолипаз. Имеет место прямая активация cPLA2 (Muthalif et al., 2001; Qiu et al., 1998; Das et al., 2003), PLCP/y (Ochocka and Pawelczyk, 2003; Litosch, 2002), РКСаДу и CK (Lamour and Chalfant, 2005) посредством CaCaM (Са2+-кальмодулина). Кроме того, возможна опосредованная Са2+-активация этих ферментов за счет ковалентной модификации с участием СаМКП (в случае cPLA2) и различных форм РКС (в случае cPLA2, PLD2, PLCp.y) [Muthalif et al., 2001; Qiu et al, 1998; Huang et al., 1998; Das et al., 2003; Ochocka and Pawelczyk, 2003; Litosch, 2002; Cockcroft, 2001; Farooqui and Horrocks, 2005).

Увеличение скоростей перечисленных реакций в присутствии избытка Са2+ и ЖК должно приводить к накоплению: церамид-1-фосфата (С1Р) -активатора cPLA2 (Huang et al., 1998); AA - активатора PLD2 (Cockcroft, 2001) и субстрата 5-LOG; DAG - активаторов различных форм РКС; фосфатидной кислоты (РА) - активатора PLCp,8 (Ochocka and Pawelczyk, 2003; Litosch, 2002).

Накопление указанных продуктов может способствовать еще большей активации фосфолипаз и накоплению С1Р, DAG, РА, АА. Таким образом, в отсутствии внешних сигналов, при избытке ЖК, МС, PC и Са2+, «порочный круг» активации фосфолипаз (cPLA2, PLD2, PLC(},y) замыкается и становится автокаталитическим. Одновременный гидролиз мембранного фосфатидилхолина (PhC) с участием cPLA2 и PLD2, а также фосфатидилинозитола (PIP2) с участием PLC в этих условиях может приводить к образованию неспецифической проводимости плазмалеммы для ионов Na+ и Са2+ (поры).

Рис.19. Изменение [Са2+]; в кардиомиоцитах крысы при действии 20мкМ РС в контроле и в присутствии ингибиторов РЬА2 и СаМКП: 1 -ЮОмкМ аристолохиевой кислоты, 2 -20мкМ КЫ933 - 20мкМ, 3 - К№3 + ЮОмкМ аристолохиевой кислоты.

Рис.20. Изменение [Ca2+]j в нейронах при действии 50мкМ PC в контроле и в присутствии ингибиторов PLA2 и PLC: 1 -ЮОмкМ аристолохиевой кислоты, 2 -ЮОмкМ арист.+ЮмкМ U73122

На рисунках 19, 20 показано, что ингибиторы фосфолипаз cPLA2 и PLC и Са2+ -кальмодулин-зависимой киназы (СаМКП), способной активировать cPLA2 {Muthalif et al, 2001; Qiu et al., 1998), заметно уменьшают токсический эффект PC или MC на кардиомиоциты и культуру нервных клеток. Предынкубация кардиомиоцитов с ЮОмкМ аристолохиевой кислоты - ингибитором cPLA2 (К|=40мкМ) - значительно увеличивает лаг-фазу, предшествующую резкому накоплению [Ca2f], в клетках, а также снижает максимальное значение [Ca2+]i в ответ на 20мкМ PC, по сравнению с контролем. При этом гибель клеток не наблюдается в течение 20мин и более после добавки 20мкМ PC в кардиомиоцитах. В контроле за это время гибнут все клетки. В нейронах подавление активности cPLA2 аристолохиевой кислотой приводит также к уменьшению амплитуды увеличения [Са2+]; (рис.20). Нейроны менее чувствительны к действию ацилкарнитинов, чем кардиомиоциты. 50мкМ PC вызывает гибель 12-18% нейронов в течение 20 мин. Но так же, как и в кардиомиоцитах, подавление активности cPLA2 полностью предотвращает гибель нейронов в течение 35 мин регистрации.

Использование ЮмкМ селективного блокатора Са2+-независимой изоформы фосфолипазы А2 (iPLA2) — BEL — не выявило его защитного действия на развитие PC-индуцированного некроза кардиомиоцитов и нервных клеток.

Наряду с гидролизом PCh с участием cPLA2 возможен другой путь образования АА, который опосредован активацией PLC (с участием DAG и MAG липаз). Неспецифический ингибитор PLC - U73122 в концентрации ЮмкМ также как и аристолохиевая кислота снижает максимальный уровень [Ca2 ]; при действии 50мкМ МС в кардиомиоцитах. Одновременная добавка ингибиторов PLC и cPLA2 препятствует избыточному накоплению [Са2+]„ причем действие ингибиторов аддитивно. В этих условиях не более 1% нейронов и глиальных клеток теряют флуресцентный зонд на протяжении 35 мин после добавки ацилкарнитина.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Большинство исследований в области выяснения повреждающих механизмов при ишемии/реперфузии, а также при острых расстройствах метаболизма липидов, сосредоточено на рассмотрении формирования тРТР, как ключевого механизма, приводящего к гибели клеток. При этом считается, что образование поры происходит вследствие кальциевой перегрузки митохондрий и цитозоля клеток. Однако вопрос о механизмах возникновения этой перегрузки во многих случаях остается без ответа. Литературные данные свидетельствуют о возможности дестабилизации ионного и энергетического гомеостаза клеток в присутствии накапливающихся длинноцепочечных ЖК и их метаболитов в таких патологических условиях. Это накопление может быть связано, как с увеличением ЖК и их производных, циркулирующих в плазме крови, так и эндогенно - в клетках (за счет экстренной активации липолиза). Результаты данной работы показывают, что многие из обнаруженных ранее эффектов на уровне клеток (кальциевая перегрузка митохондрий, гиперсокращение

кардиомиоцитов, коллапс митохондриальной энергетики) могут быть воспроизведены добавлением к клеткам патофизиологических доз ацилкарнитинов длинноцепочечных ЖК. Проникая в клетки, эти соединения могут легко транформироваться в ацил-КоА. Ацил-КоА и ацилкарнитины являются активными метаболитами, способными вызывать множество различных эффектов на уровне клеток. В данной работе показано, что подавление энергетики митохондрий в присутствии ацилкарнитинов, хотя и имеет место, не является первичным и ключевым механизмом токсического действия активированных производных ЖК на клетки. Главным механизмом, запускающим необратимые изменения в клетках, является дестабилизация кальциевого гомеостаза клеток, вызванная активацией выброса ионов кальция из внутриклеточных запасов.

В заключении приведем основные достигнутые в работе результаты в виде предполагаемой схемы процессов, приводящих к гибели клеток при действии ацилкарнитинов длинноцепочечных ЖК.

В условиях резкого накопления токсических метаболитов ЖК и свободных длинноцепочечных ЖК в плазме крови и внутри клеток происходит гибель кардиомиоцитов, клеток мозга и др. клеток. По-видимому, ключевую роль в этом процессе играют активированные производные ЖК и ацил-КоА и ацилкарнитины, способные вызывать высвобождение Са2+ из запасов СР/ЭР. Мобилизация Са2+ из внутриклеточных пулов приводит к кальциевой перегрузке митохондрий, а в большинстве типов клеток (невозбудимых) также и к запуску входа Са2+ из внеклеточной среды посредством активации БОС-каналов. Избыточное накопление Са2+ в матриксе МХ с одновременным подавлением энергетики МХ в присутствии избытка активированных ЖК приводит росту [Сапо механизму, не связанному с формированием СэА-зависимой митохондриальной поры, либо к перераспределению Са2+ из СР в цитозоль непосредственно, без поступления в МХ. Одновременная активация Са2+-чувствительных фосфолипаз при неконтролируемом накоплении [Са2+],, при локальном образовании Са2+-микродоменов, способствует истощению запаса мембранных фосфолипидов, что может приводить к возникновению неспецифической проницаемости плазмалеммы для катионов (Са2+, Ыа2+) и для молекул флуоресцентных зондов, (вставить механизмы исчерпания АТР футильного цикла БЕЯСА)

Таким образом, прогрессирующая дестабилизация ионного и энергетического гомеостаза вызывает необратимые нарушения в клетках и их гибель. Защиты клеток от такого токсического эффекта можно достичь подавлением образования арахидоновой кислоты (и, возможно, ее метаболитов), а также путем предотвращения избыточного накопления ионов кальция в клетках. Полученные результаты позволят глубже понять процессы, связанные с возникновением острых токсических эффектов ЖК и их производных при синдроме Рейе и Рейе-подобных заболеваниях, а также при инфаркте или инсульте. Результаты данной работы могут расширить круг мишеней действия фармакологических препаратов при указанных расстройствах.

выводы

1. Длинноцепочечные ацилкарнитины - пальмитоилкарнитин (РС) и миристоилкарнитин (МС) - в концентрациях 10-50мкМ активируют выброс Са2+ из внутриклеточных депо, что приводит к избыточному накоплению [Са2+]; и возникновению неспецифической проницаемости плазмалеммы. Этот эффект специфичен для длинноцепочечных ацилкарнитинов и не наблюдается при действии соответствующих жирных кислот или ацилкарнитинов с меньшей длиной углеродной цепи.

2. В клетках, где главным каналом выброса Са2+ из внутриклеточных запасов является 1Р3К - первичная активация выброса Са2+ из депо при действии ацилкарнитинов приводит к активации входа Са2+ в клетки и дополнительному увеличению [Са2+]| через БОС-каналы.

3. В кардиомиоцитах увеличению [Са2+]: при действии РС или МС предшествует лаг-период, в течение которого происходит перераспределение Са2+ из саркоплазматического в митохондрии (МХ). Са2+-буферная емкость МХ определяет длительность лаг-периода. Низкий уровень [Са2+]( в течение лаг-периода также поддерживается за счет работы Са2+-АТФазы СР.

4. РС и МС оказывают бифазное действие на энергетику МХ - малые дозы ацилкарнитинов оказывают стимулирующий субстратный эффект, а большие дозы РС или МС приводят к деэнергизации МХ. Эти эффекты наблюдаются как в суспензиях митохондрий, так и на уровне целых клеток. Тем не менее, деэнергизация МХ, а также возможное образование шРТР, не являются первопричиной токсических эффектов ацилкарнитинов на интактные клетки.

5. Нарушение проницаемости плазматической мембраны не связано с образованием АФК. При действии ацилкарнитинов не происходит увеличения продукции АФК, присутствие антиоксидантов не влияет на развитие токсического эффекта.

6. Развитие неспецифической проницаемости плазматической мембраны в присутствии длинноцепочечных ацилкарнитинов обусловлено возникновением устойчивых во времени локальных микродоменов с высоким содержанием Са2+, приводящих к возникновению автокаталитического цикла активации фосфолипаз.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Статьи в журналах

1. A.B. Бережное. Е.И. Федотова, М.Н. Ненов, Ю.М. Кокоз, В.П. Зинченко, В.В. Дынник. Дестабилизация уровня цитозольного кальция и гибель кардиомиоцитов в присутствии производных длинноцепочечных Жирных кислот. Биофизика, 2008 Т. 53(6): 1025-32.

2. A.B. Бережное, Е.И. Федотова, М.Н. Ненов, В. П. Зинченко, В.В. Дынник Кальциевая перезагрузка и гибель кардиомиоцитоы в присутствии активированных производных жирных кислот. Вклад фосфолипаз. Биологические мембраны, 2010. Т. 27(1):1-9.

Статьи в сборниках

1. Бережное A.B.. Федотова Е.И., Ненов М.Н., Грушин КС., Зинченко В.П., Кокоз Ю.М., Дынник В.В. Дестабилизация Са2+-гомеостаза возбудимых и невозбудимых клеток в присутствии жирных кислот. Вклад Са2+-транспортирующих систем ретикулума, плазмалеммы и митохондрий. Материалы международной конференции «Рецепция и внутриклеточная сигнализация», Пущино 2007 (5-7 июня) изд. ОНТИ ПНЦ РАН, стр.9-12.

2. Гришина Е.В., Касымое В.А., Ненов М.Н., Бережное А.В.,Федотова Е.И., Грушин КС., Долгачева Л.П., Кокоз Ю.М., Зинченко В.П., Дынник В.В. Ингибирование энергетики митохондрий производными кофермента А (СоА). токсические эффекты насыщенных жирных кислот. Материалы международной конференции «Рецепция и внутриклеточная сигнализация», Пущино 2007 (5-7 июня) изд. ОНТИ ПНЦ РАН, с.215-218.

3. Бережное A.B.. Федотова Е.И., Ненов М.Н., Зинченко В.П., Дынник В.В. Токсические эффекты жирных кислот. Роль фосфолипаз. Международная конференция «Рецепция и внутриклеточная сигнализация», Пущино 2009. (2-4 июня) 1, стр. 15-19.

4. Дынник В.В., Бережное A.B., Федотова Е.И., Ненов М.Н. Каталитические матрицы фосфоинозитидов. Возможные механизмы регуляции. Международная конференция «Рецепция и внутриклеточная сигнализация», Пущино 2009. (2-4 июня) 1, стр. 36-42.

5. Зинченко В.П., Бережное A.B.. Федотова Е.И. Локальные и периодические кальциевые сигналы. Механизмы генерации, регуляция и функции. Международная конференция «Рецепция и внутриклеточная сигнализация», Пущино 2009. (2-4 июня) 1, стр. 273-278. Учебные пособия

1. Бережное A.B., Зинченко В.П., Федотова Е.И, Яшин В.А. Применение флуоресцентной микросокпии в исследованиях динамики Са2+ в клетках. Учебно-методическое пособие. Пущино 2009. изд. ИРДПО, Москва. 76 стр. Тезисы докладов

1. A.B. Бережное. Е.И. Федотова. Механизмы дестабилизации Са2+-гомеостаза возбудимых и невозбудимых клеток жирными кислотами. Материалы конференции «Фундаментальная наука и клиническая медицина», Санкт-Петербург 2008. стр. 35-36.

2. Е.И. Федотова, A.B. Бережное. Дестабилизация уровня цитозольного кальция в присутствии жирных кислот и их производных. 12-я международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология - наука XXI века», Пущино 2008. (12-15 октября), стр.188.

3. А. V. Berezhnov. E.I. Fedotova, M.N. Nenov, V.P. Zinchenko, Yu.M. Kokoz, V.V. Dynnik. Destabilization of cells Ca2+ homeostasis by fatty acids derivatives. Materials of the of the Symposium "Biological Motility", Pushchino 2008.1, pp. 142-144.

4. V. V. Dynnik, A. V. Berezhnov, M.N. Nenov, E.I. Fedotova, K.S. Grushin, V.P. Zinchenko, Yu.M. Kokoz. Accute and chonic toxic effects of fatty acids. Materials of the of the Symposium "Biological Motility", Pushchino 2008. 2, pp. 299-301.

5. A.B. Бережное. Е.И. Федотова, М.Н. Ненов, Ю.М. Кокоз, В.П. Зинченко, В.В. Дынник Острые токсические эффекты жирных кислот. Научные труды II съезда физиологов СНГ. Физиология и здоровье человека, Кишинэу, Молдова 2008. (29-31 октября), стр. 35-36.

6. Федотова Е.И., Бережное A.B.. Зинченко В.П., Дынник В.В. Токсические эффекты жирных кислот. Роль фосфолипаз. 13-я международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология - наука XXI века», Пущино 2009. (28 сентября-2 октября), стр. 149-150.

Подписано в печать:

12.11.2009

Заказ № 3 031 Тираж - 100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Бережнов, Алексей Валерьевич

ВВЕДЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ГЛАВА 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР 8 1.1 Патологические состояния, связанные с нарушениями метаболизма жирных кислот

1.1.1 Хронические патологические состояния, связанные с избыточным накоплением жирных кислот

1.1.1.1 Инсулиновая резистентность

1.1.1.2 Диабет 2-го типа

1.1.1.3 Ожирение

1.1.1.4 Метаболический синдром

1.1.2 Острые патологические состояния, связанные с избыточным накоплением жирных кислот

1.1.2.1 Печеночные энцефалопатии. Синдром Рейе

1.1.2.2 Ишемия - реперфузия 15 1.2. Механизмы транспорта жирных кислот в клетки и митохондрии

1.2.1 Транспорт жирных кислот в плазме крови

1.2.2 Транспорт жирных кислот через плазмалемму 17 1.2.2.1 Пассивная диффузия 17 1.2.2.1 Транспорт с участием белков

1.2.3 Транспорт жирных кислот в митохондрии

1.2.4 Белки, связывающие жирные кислоты

1.2.5 Концентрации ацил-КоА и ацилкарнитинов в клетках

1.3 Мишени жирных кислот и их производных

1.3.1 Свободные жирные кислоты как естественные разобщители

1.3.2 Ацилирование белков '

1.3.3 Регуляция каналов и рецепторов жирными кислотами и их активированными производными

1.3.4 Регуляция (3-окисления активированными жирными кислотами

1.3.5 Ингибирование цикла трикарбоновых кислот (ЦТК) активированными жирными кислотами

1.3.6 Рецепторы жирных кислот

1.3.7 Взаимодействие активированных жирных кислот с мембранами. Детергентные свойства

1.4 Избыток жирных кислот и активация фосфолипаз

1.4.1 Арахидоновая кислота и нарушения клеточного гомеостаза

1.4.2 Избыток активированных жирных кислот и активация фосфолипаз

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1 Выделение и культивирование клеток

2.2 Выделение митохондрий сердца

2.3 Флуоресцентная микроскопия

2.4 Конфокальная микроскопия

2.5 Обработка цифровых изображений и графические построения

2.6 Регистрация кальциевых токов

2.7 Измерения в суспензии митохондрий

2.8 Использованные реактивы

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ

3.1 Токсические эффекты ацилкарнитинов.

Общая характеристика клеточного ответа

3.2 Участие АФК в токсическом действии ацилкарнитинов

3.3 Детергентные свойства ацилкарнитинов в развитии токсического эффекта

3.4 Токсические эффекты ацилкарнитинов.

Источники увеличения [Са2+], в клетках

3.4.1 Вклад входа кальция снаружи клеток

3.4.2 Вклад мобилизации Са2+ из внутриклеточных запасов

3.4.3 Участие каналов входа кальция в клетки

3.4.4 Участие потенциал-зависимых кальциевых каналов (VDCC)

3.5 Вклад систем удаления Са2+ из цитозоля в поддержание лаг-фазы

3.5.1 Вклад митохондрий в поддержание лаг-фазы

3.5.2 Зависимость продолжительности лаг-фазы от

Са2+-буферной емкости митохондрий

3.5.3 Вклад SERCA в поддержание лаг-фазы

3.5.4 Вклад Na /Са -обменника ПМ в поддержание лаг-фазы.

Увеличение проницаемости для Na+

3.6 Токсические эффекты ацилкарнитинов.

Влияние на энергетику митохондрий

3.6.1 Исследования на изолированных митохондриях.

3.6.2 Исследования ДЧ'щ на уровне клеток

3.7 Токсические эффекты ацилкарнитинов.

Влияние на локальные кальциевые сигналы и активность фосфолипаз

3.7.1 Влияние ацилкарнитинов на локальные

Са2+ сигналы

Введение Диссертация по биологии, на тему "Исследование механизмов острых токсических эффектов ацилкарнитинов"

Актуальность проблемы. Хроническое увеличение уровня циркулирующих в крови липидов и свободных жирных кислот (ЖК) является одним из основных факторов риска развития ожирения, диабета 2 типа и ряда сердечно-сосудистых заболеваний (Desvergne et al., 2004; McGavock et al., 2006). При микровезикулярном стеатозе в печени срочная мобилизация ЖК может быть причиной гибели клеток мозга (печеночные энцефалопатии, синдром Рейе и Рейе-подобные заболевания). В остром варианте при переходе от ишемии пораженного участка к его реперфузии при инфаркте или инсульте, резкое накопление ЖК и их производных - ацил-КоА и ацилкарнитинов — рассматривается как один из главных механизмов поражения клеток сердца и мозга (Katz, 1982; Corr et al., 1984; Liedtke, 1988; Weiss et al., 2003; Phillis et al., 2002).

К числу наиболее токсичных жирных кислот относятся насыщенные — миристиновая (С14:0), пальмитиновая (С16:0) и ненасыщенные - олеиновая (С18:1), арахидоновая (С20:4) кислоты.

Хорошо известны протонофорные эффекты насыщенных ЖК, а также способность ЖК стимулировать формирование митохондриальной поры (mPTP) {Wojtczak et al., 1998; Bernardi et al., 2002). Также имеются данные, что апоптоз клеток, вызванный длинноцепочечными ЖК, опосредован действием их активированных производных (Е1-Assaad et al., 2003; Hardy et al., 2003).

Накопление Ca в митохондриях (MX), в присутствии избытка ЖК, с последующей деполяризацией MX, возникновением шРТР и выбросом Са2+, НАДН и цитохрома С, рассматривается как основной механизм дисфункции MX, обуславливающий гибель клеток вследствие некроза или апоптоза (Bernardi, 2002; Trost and Lemasters, 1996; Trost and Lemasters 1997; Penzo et al, 2002). Другие авторы (Abdnl-Ghani, et al., 2008; Tominaga et al., 2008) постулируют первичную роль дисфункции митохондрий при избытке не только свободных ЖК, но и длинноцепочечных ацилкарниитинов и ацил-КоА.

Регуляция системы Р-окисления ЖК устроена таким образом, что при избыточной мобилизации ЖК в системе может возникать феномен автоингибирования (Dynnik et al., 1984). В результате ингибирования ключевых реакций производными лекарственных препаратов может усиливаться феномен автоингибирования Р-окисления ЖК с накоплением КоА-производных, с последующим каскадом ингибирования и других метаболических и сигнальных систем печени, сердца и мозга (Дынник и др., 2005). Помимо митохондриальных ферментов мишенью производных длинноцепочечных ЖК являются почти все Са -транспортирующие системы клетки. Показано, что ацилкарнитины длинноцепочечных ЖК могут ингибировать или непосредственно активировать Са2+-каналы плазмалеммы (Spedding and Mir, 1987; Wu and Corr, 1992). Ацил-КоА или их комплексы с буферным белком АСВР, а также ацилкарнитины способны активировать Са2+-каналы саркоэндоплазматического (СР/ЭР) ретикулума: рианодиновые каналы (RyR) {Fulceri et ah, 1994; Dumonteil et al., 1994; el-Hayek et ah, 1993; Yamada et ah, 1994) и 1Рз-чувствительные каналы (IP3R) (Fulceri et ah, 1993). В зависимости от концентрации, ацилкарнитины могут стимулировать или подавлять активность Са2+-транспортирующих АТФаз {Adams et ah, 1979; Dumonteil et ah, 1994). В некоторых работах показано, что длинноцепочечные ацилкарнитины способны вызывать кальциевую перегрузку клеток (Netticadan et ah, 1999).

Основные задачи исследования.

2. Установление роли митохондрий в процессе развития токсического эффекта длинноцепочечных ацилкарнитинов.

Са , Na' и молекул флуоресцентного зонда. В невозбудимых клетках (АКЭ, НЕр-2, астроциты) увеличение [Са ]i происходит без лаг-фазы и опосредовано входом Са из внеклеточной среды через SOC-каналы. Наиболее резистентными к воздействию ацилкарнитинов являются гепатоциты. Наблюдаемый токсический эффект специфичен для PC и МС и не возникает при действии соответствующих ЖК, а также ацилкарнитинов с меньшей длиной углеродной цепи.

При действии ацилкарнитинов не происходит гиперпродукции АФК в клетках. Роль потенциал-зависимых Са2+-каналов, а также реверсии №+/Са2+-обменника сарколеммы

2+ кардиомиоцитов и нейронов в увеличении [Са ]; является минорной.

Впервые показано перераспределение Са2+ из CP в MX сразу после добавления ацилкарнитинов во время лаг-фазы в кардиомиоцитах. При этом MX ограничивают рост [Ca2+]i, а истощение Са2+-буферной емкости MX приводит к увеличению [Ca2+]j.

На суспензиях MX показано, что ацилкарнитины оказывают бифазный эффект на энергетику MX - малые дозы ацилкарнитинов оказывают стимулирующий субстратный эффект, а большие дозы PC или МС приводят к деэнергизации MX. Эффекты воспроизводятся на целых клетках.

Показано, что формирование митохондриальной поры (шРТР) не имеет решающего значения в развитии некроза клеток при действии патофизиологических доз PC или МС: присутствие циклоспорина А не влияет на эффект, a MX сохраняют высокие значения мембранного потенциала (МП), по крайней мере, до нарушения целостности плазмалеммы

Впервые показано, что длинноцепочечные ацилкарнитины стимулируют образование микродоменов с высоким содержанием Са2+ в кардиомиоцитах, которые

2+ могут способствовать возникновению автокаталитического цикла активации Са -зависимых фосфолипаз (сРЬАг, PLC, PLD), с последующим истощением структурных фосфолипидов мембран, возможным накоплением токсичных продуктов фосфолипаз и развитием неспецифической проницаемости плазмалеммы.

Впервые показано, что подавление активности фосфолипаз сРЬАг и PLC предотвращает нарушения целостности плазматической мембраны клеток, вызванные ацилкарнитинами.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АМФ - аденозин-монофосфорная кислота

АДФ - аденозин-дифосфорная кислота

АТФ - аденозинтрифосфорная кислота

АКЭ — асцитная карцинома Эрлиха

АФК - актиные формы кислорода

ЖК - жирные кислоты

КоА - коэнзим А (Со А)

MB С - микровезикулярный стетоз

НАД - никотинамидадениндинуклеотид

ОПЭ - острые печеночные энцефалопатии

ГЩГ - пируват дегидрогеназа

ПМ - плазматическая мембрана

ПЭ - печеночные энцефалопатии

CP - саркоплазматический ретикулум

ФАД - флавинадениндинуклеотид

ЦТК - цикл трикарбоновых кислот

ЭГТА — этиленгликоль-тетраацетат

ЭР - эндоплазматический ретикулум

АА - арахидоновая кислота (Arachidonic acid)

Akt (РКВ) - протеинкиназа В

АСВР - белок, связывающий АцилСоА производные жирных кислот (AcylCoA binding protein)

BSA - бычий сывороточный альбумин (Bovine serum albumin) СаМ — кальмодулин

САМКИ — кальмодулин-зависимая протеин киназа II

СК - церамид киназа

CsA - циклоспорин А

С1Р - церамид-1-фосфат

СРТ - карнитин-пальмитоилтрансфераза

D AG — диацилглицерол

DK- диацилглицеролкиназа

FABP — белок, связывающий жирные кислоты (fatty acids binding protein) FABPpm - белок, связывающий жирные кислоты плазматической мембраны

FAT - транслоказа жирных кислот (fatty acid translocase)

FATP - белок, транспортирующих жирные кислоты (fatty-acid transport protein) FCCP - carbonyl cyanide p-trifluoromethoxyphenyl hydrazone IP3 — инозитол-1,4,5-трифосфат IP3R —рецептор IP3

MC - миристоил карнитин (Myristoyl-DL-carnitine) mPTP - неспецифическая митохондриальная пора (mitochondrial permeability transition pore)

PA — фосфатидная кислота

PAP - фосфатидилфосфатаза

PC - пальмитоил карнитин (Palmitoyl-L-carnitine)

PCh - фосфатидилхолин

PDK - фосфоинозитид-зависимая киназа

Pi - неорганический фосфат

PIP2 (Р1Р4,5) - фосфатидилинозитол-4,5-бисфосфат Р1Рз - фосфатидилинозитол-1,4,5-трифосфат РКС - протеинкиназа С cPLA2 — цитозольная изоформа фосфолипазы Аг PLC - фосфолипаза С PLD - фосфолипаза D

РМСА — кальциевая АТФаза плазматической мембраны RR - рутениевый красный (Ruthenium Red) RyR - рианодиновый рецептор

SERCA — кальциевая АТФаза сарко- и эндоплазматического ретикулума SOC - запас-управляемые каналы (store-operated channels) SOCE — депо-управляемый вход Са2+ TG - тапсигаргин (Thapsigargin)

TMRM - метиловый эфир тетраметилродамина (Tetramethylrhodamine methyl ester) VDCC — потенциал-зависимые Са2+-каналы (voltage-dependent Ca2+-channels) ДЧ'т - митохондриальный потенциал [Ca2+]i — концентрация ионов кальция в цитозоле

Ca2+]sR - концентрация ионов кальция в саркоплазматическом ретикулуме 2+

Са ]щ — концентрация ионов кальция в митохондриях

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Бережнов, Алексей Валерьевич

выводы

1. Длинноцепочечные ацилкарнитины — пальмитоилкарнитин (PC) и миристоилкарнитин (МС) — в концентрациях 10-50мкМ активируют выброс Са из внутриклеточных депо, что приводит к избыточному накоплению [Ca2+]j и возникновению неспецифической проницаемости плазмалеммы. Этот эффект специфичен для длинноцепочечных ацилкарнитинов и не наблюдается при действии соответствующих жирных кислот или ацилкарнитинов с меньшей длиной углеродной цепи.

О+

2. В клетках, где главным каналом выброса Са из внутриклеточных запасов является IP3R — первичная активация выброса Са2+ из депо при действии ацилкарнитинов приводит к активации входа Са2+ в клетки и дополнительному увеличению [Ca2+]i через SOC-каналы.

3. В кардиомиоцитах увеличению [Са2+]; при действии PC или МС предшествует лаг-период, в течение которого происходит перераспределение Са2+ из саркоплазматического ретикулума (CP) в митохондрии (MX). Са2+-буферная емкость MX определяет длительность лаг-периода. Низкий уровень [Ca2+]i в течение лаг-периода также поддерживается за счет работы Са2+-АТФазы СР.

4. PC и МС оказывают бифазное действие на энергетику MX — малые дозы ацилкарнитинов оказывают стимулирующий субстратный эффект, а большие дозы PC или МС приводят к деэнергизации MX. Эти эффекты наблюдаются как в суспензиях митохондрий, так и на уровне целых клеток. Тем не менее, деэнергизация MX, а также возможное образование тРТР, не являются первопричиной токсических эффектов ацилкарнитинов на интактные клетки.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Большинство исследований в области выяснения повреждающих механизмов при ишсмии/реперфузии, а также при острых расстройствах метаболизма липидов, сосредоточено на рассмотрении формирования тРТР, как ключевого механизма, приводящего к гибели клеток. При этом считается, что образование поры происходит вследствие кальциевой перегрузки митохондрий и цитозоля клеток. Однако вопрос о механизмах возникновения этой перегрузки во многих случаях остается без ответа. Литературные данные свидетельствуют о возможности дестабилизации ионного и энергетического гомеостаза клеток в присутствии накапливающихся длинноцепочечных ЖК и их метаболитов в таких патологических условиях. Это накопление может быть связано, как с увеличением ЖК и их производных, циркулирующих в плазме крови, так и эндогенно - в клетках (за счет экстренной активации липолиза). Результаты данной работы показывают, что многие из обнаруженных ранее эффектов на уровне клеток (кальциевая перегрузка митохондрий, гиперсокращение кардиомиоцитов, коллапс митохондриальной энергетики) могут быть воспроизведены добавлением к клеткам патофизиологических доз ацилкарнитинов длинноцепочечных ЖК. Проникая в клетки, эти соединения могут легко транформироваться в ацил-КоА. Ацил-КоА и ацилкарнитины являются активными метаболитами, способными вызывать множество различных эффектов на уровне клеток. В данной работе показано, что подавление энергетики митохондрий в присутствии ацилкарнитинов, хотя и имеет место, не является первичным и ключевым механизмом токсического действия активированных производных ЖК на клетки. Главным механизмом, запускающим необратимые изменения в клетках, является дестабилизация кальциевого гомеостаза клеток, вызванная активацией выброса ионов кальция из внутриклеточных запасов.

Л I посредством активации SOC-каиалов. Избыточное накопление Са в матриксе MX с одновременным подавлением энергетики MX в присутствии избытка активированных ЖК приводит росту [Са2+], по механизму, не связанному с формированием CsA-зависимой митохондриальной поры, либо к перераспределению Са из CP в цитозоль непосредственно, без поступления в MX. Одновременная активация Са -чувствительных фосфолипаз при неконтролируемом накоплении [Са2+];, при локальном образовании Са2+-микродоменов, способствует истощению запаса мембранных фосфолипидов, что может приводить к возникновению неспецифической проницаемости плазмалеммы для катионов (Са2+, Na2+) и для молекул флуоресцентных зондов.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Бережнов, Алексей Валерьевич, Пущино

1.Е., Jovanovic A., Lopez J.R. and Terzic A. Adenosine slows the rate of K+-induced membrane depolarization in ventricular cardiomyocytes: possible implication in hyperkalemic cardioplegia. J. Mol. Cell. Cardiol., 1996. 28: 1193-1202.

2. Armoni M., Harel C., Bar-Yoseph F., Milo S., Karnieli E. Free fatty acids repress the GLUT4 gene expression in cardiac muscle via novel response elements. J. Biol. Chem., 2005. 280 (41): 34786-34795

3. Asch A.S., Barnwell J., Silverstein R.L., Nachman R.L. Isolation of the thrombospondin membrane receptor. J. Clin. Invest., 1987. 79, 1054-1061.

4. Banhegyi G., Csala M., Mandl J., Burchell A., Burchell В., Marcolongo P., Fulceri R., Benedetti A. Fatty acyl-CoA esters and the permeability of rat liver microsomal vesicles. Biochem. J., 1996. 320 (1): 343-344.

5. Barbour R.L., Chan S.H. Regulation of palmitoyl-CoA inhibition of mitochondrial adenine nucleotide transport by cytosolic fatty acid binding protein. Biochem. Biophys. Res. Commun., 1979. 89 (4): 1168-1177.

6. Berger J., Truppe C., Neumann H., Forss-Petter S. cDNA cloning and mRNA distribution of a mouse very long-chain acyl-CoA synthetase. FEBS Lett., 1998. 425: 305-309.

7. Bernardi P., Penzo D., Wojtczak L. Mitochondrial energy dissipation by fatty acids. Mechanisms and implications for cell death. Vitam. Horm., 2002. 65: 97-126.

8. Berthiaume L., Tolan D.R., Sygusch J. Differential usage of the carboxyl-terminal region among aldolase isozymes. J. Biol. Chem., 1993. 268 (15): 10826-10835.

9. Bjorntorp P., Bergman H., Varnauskas E. Plasma free fatty acid turnover in obesity. Acta Med. Scand., 1969.185 (4): 351-356.

10. Black P.N., DiRusso C.C. Transmembrane movement of exogenous long-chain fatty acids: proteins, enzymes, and vectorial esterification. Microbiol. Mol. Biol. Rev., 2003. 67 (3): 454-472.

11. Boden G. Obesity and free fatty acids. Endocrinol. Metab. Clin. North Am., 2008. 37 (3): 635-646.

12. Boden G. Role of fatty acids in the pathogenesis of insulin resistance and NIDDM. Diabetes, 1997. 46 (1): 3-10.

13. Boden G., Chen X., Ruiz J., White J.V., Rossetti L. Mechanisms of fatty acid-induced inhibition of glucose uptake. J. Clin. Invest., 1994. 93 (6): 2438-2446.

14. Boden G., Cheung P., Stein T.P., Kresge K., Mozzoli M. FFA cause hepatic insulin resistance by inhibiting insulin suppression of glycogenolysis. Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab., 2002. 283 (1): E12-19.

15. Boden G., Jadali F., White J., Liang Y., Mozzoli M., Chen X., Coleman E., Smith C. Effects of fat on insulin-stimulated carbohydrate metabolism in normal men. J. Clin. Invest., 1991. 88 (3): 960-966.

16. Boden G., Lebed В., Schatz M., Homko C., Lemieux S. Effects of acute changes of plasma free fatty acids on intramyocellular fat content and insulin resistance in healthy subjects. Diabetes, 2001. 50 (7): 1612-1617.

17. Boden G., She P., Mozzoli M., Cheung P., Gumireddy K., Reddy P., Xiang X., Luo Z., Ruderman N. Free fatty acids produce insulin resistance and activate the proinflammatory nuclear factor-kappaB pathway in rat liver. Diabetes, 2005. 54 (12): 34583465.

18. Bonz A., Siegmund В., Ladilov Y., Vahl C.F., Piper H.M. Metabolic recovery of isolated adult rat cardiomyocytes after energy depletion: existence of an ATP threshold? J. Mol. Cell Cardiol., 1998. 30 (10): 2111-2119.

19. Bordewick U., Heese M., Borchers Т., Robenek H., Spener F. Compartmentation of hepatic fatty-acid-binding protein in liver cells and its effect on microsomal phosphatidic acid biosynthesis. Biol.Chem. Hoppe-Seyler, 1985. 370 (3): 229-238.

20. Bortz W.M., Lynen F. The inhibition of acetyl CoA carboxylase by long chain acyl CoA derivates. Biochem. Z., 1963. 337: 505-509.

21. Boss O., Hagen Т., Lowell B.B. Uncoupling proteins 2 and 3: potential regulators of mitochondrial energy metabolism. Diabetes, 2000. 49 (2): 143-156.

22. Bovolin P., Schlichting J., Miyata M., Ferrarese C., Guidotti A., Alho H. Distribution and characterization of diazepam binding inhibitor (DBI) in peripheral tissues of rat. Regul. Peptides, 1990. 29 (2-3): 267-281.

23. Boylan J.G., Hamilton J A. Interactions of acyl-coenzyme A with phosphatidylcholine bilayers and serum albumin. Biochemistry, 1992. 31 (2): 557-567.

24. Brady P.S., Ramsay R.R., Brady L.J. Regulation of the long-chain carnitine acyltransferases. FASEB J., 1993. 7 (11): 1039-1044.

25. Brooks S.L., Rothwell N.J., Stock M.J., Goodbody A.E., Trayhurn P. Increased proton conductance pathway in brown adipose tissue mitochondria of rats exhibiting diet-induced thermogenesis. Nature, 1980. 286 (5770): 274-276.

26. Brunetti A., Manfioletti G., Chiefari E., Goldfine I.D., Foti D. Transcriptional regulation of human insulin receptor gene by the high-mobility group protein HMGI(Y). FASEB J., 2001. 15 (2): 492-500.

27. Burnett D.A., Lysenko N., Manning J.A., Ockner R.K. Utilization of long chain fatty acids by rat liver: studies of the role of fatty acid binding protein. Gastroenterology, 1979. 77 (2): 241-249.

28. Burner R.E., Mansson C.R., Brecher P. Biochim. Binding of acyl-CoA to liver fatty acid binding protein: effect on acyl-CoA synthesis. Biophys. Acta, 1987. 919 (3): 221-230.

29. Chalmers S., Nicholls D.G. The relationship between free and total calcium concentrations in matrix of liver and brain mitochondria J. Biol. Chem., 2003. 278: 1906219070.

30. Chavez J.A., Summers S.A. Characterizing the effects of saturated fatty acids on insulin signaling and ceramide and diacylglycerol accumulation in 3T3-L1 adipocytes and C2C12 myotubes. Arch. Biochem. Biophys., 2003. 419 (2): 101-109.

31. Chien K.R., Abrams J., Serroni A., Martin J.T., Farber J.L. Accelerated phospholipid degradation and associated membrane dysfunction in irreversible, ischemic liver cell injury. J. Biol. Chem., 1978. 253 (13): 4809-4817.

32. Chien K.R., Sherman S.C., Mittnacht SJr., Farber J.L. Microsomal membrane structure and function subsequent to calcium activation of an endogenous phospholipase. Arch. Biochem. Biophys., 1980. 205 (2):614-622.

33. Chinopoulos C., Staxkov A.A., Grigoriev S., Dejean L.M., Kinnally K.W., Liu X., Ambudkar I.S., Fiskum G. Diacylglycerols activate mitochondrial cationic channel(s) and release sequestered Ca(2+). J. Bioenerg. Biomembr., 2005. 37 (4): 237-247.

34. Chitturi S., Farrell G.C. Etiopathogenesis of nonalcoholic steatohepatitis. Semin. Liver Dis., 2000. 21 (1): 27-41.

35. Choi H.S., Eisner D.A. The role of sarcolemmal Ca2+-ATPase in the regulation of resting calcium concentration in rat ventricular myocytes. J. Physiol., 1999. 515 (Pt 1): 109118.

36. Clarke A.L., Petrou S., Walsh J.V. Jr., Singer J.J. Site of action of fatty acids and other charged lipids on BKCa channels from arterial smooth muscle cells. Am. J. Physiol. Cell Physiol., 2003. 284 (3): 607-619.

37. Cocco Т., Di Paola M., Papa S., Lorusso M. Arachidonic acid interaction with the mitochondrial electron transport chain promotes reactive oxygen species generation. Free Radic Biol. Med., 1999. 27 (1-2): 51-59.

38. Cockcroft S. Signalling roles of mammalian phospholipase Dl and D2. Cell Mol. Life Sci., 2001. 58 (11): 1674-1687.

39. Constantinides P.P., Stein J.M. Physical properties of acyl-CoA critical micellar concentration and micellar size and shape. J. Biol. Chem., 1985. 260: 7573-7580.

40. Corr P.B., Gross R.W., Sobel B.E. Amphipathic metabolites and membrane dysfunction in ischemic myocardium. Circ. Res., 1984. 55 (2): 135-154.

41. Corr P.B., Saffitz J.E., Sobel B.E. Lysophospholipids, long chain acylcarnitines and membrane dysfunction in the ischaemic heart. Basic Res. Cardiol., 1987. 82 (Suppl 1): 199208.

42. Das S„ Rafter J.D., Kim K.P., Gygi S.P., Cho W. Mechanism of group IVA cytosolic phospholipase A(2) activation by phosphorylation J. Biol. Chem., 2003. 278 (42): 41431-41442.

43. Deeney J.T., Tornheim K., Korchak H.M., Prentki M., Corkey B.E. Acyl-CoA esters modulate intracellular Ca2+ handling by permeabilized clonal pancreatic beta-cells. J. Biol. Chem., 1992. 267 (28): 19840-19845.

44. Desvergne В., Michalik L., Wahli W. Be fit or be sick: peroxisome proliferator-activated receptors are down the road. Mol. Endocrinol., 2004. 18 (6): 1321-1332.

45. Dirusso C.C., Connell E.J., Faergeman N.J., Knudsen J., Hansen J.K. Black P.N. Murine FATP alleviates growth and biochemical deficiencies of yeast fatlDelta strains. Eur. J. Biochem., 2000. 267:4422-4433.

46. Dumonteil E., Barre H., Meissner G. Effects of palmitoyl carnitine and related metabolites on the avian Ca2+-ATPase and Ca2+ release channel. J. Physiol., 1994. 479 (1): 2939.

47. Dynnik V.V., Djafarov R.H. Regulation of the tricarboxylic acid cycle and beta~ oxidation by excess substrates. Biochem. Int., 1986. 12 (6): 795-805.

48. Dynnik V.V., Maevskii E.I., Grigorenko E.V., Kim Iu.V. Substrate inhibition in the tricarboxylic acid cycle. Biofizika, 1984. 29 (6): 954-958.

49. Eaton S., Bartlett K., Pourfarzam M. Mammalian mitochondrial beta-oxidation. Biochem. J., 1996. 320 (Pt 2): 345-357.

50. Echabe I., Requero M.A., Goni F.M., Arrondo J.L., Alonso A. An infrared investigation of palmitoyl-coenzyme A and palmitoylcarnitine interaction with perdeuterated-chain phospholipid bilayers. Eur. J. Biochem., 1995. 231 (1): 199-203.

51. Emaus R.K., Grunwald R., Lemasters J.J. Rhodamine 123 as a probe of transmembrane potential in isolated rat-liver mitochondria: spectral and metabolic properties. В В A, 1986. 850: 436-448.

52. Eroglu Y., Byrne W.J. Hepatic encephalopathy. Emerg. Med. Clin. North. Am., 2009. 27 (3): 401-414.

53. Faergeman N.J., Knudsen J. Role of long-chain fatty acyl-CoA esters in the regulation of metabolism and in cell signalling. Biochem. J., 1997. 323 (1): 1-12.

54. Faergeman N.J., Sigurskjold B.W., Kragelund B.B., Andersen K.V. Knudsen J. Thermodynamics of ligand binding to acyl-coenzyme A binding protein studied by titration calorimetry. Biochemistry, 1996. 35 (45): 14118-14126.

55. Fang K.M., Chang W.L., Wang S.M., Su M.J., Wu M.L. Arachidonic acid induces both Na+ and Ca2+ entry resulting in apoptosis. J. Neurochem., 2008a. 104 (5): 1177-1189.

56. Fang K.M., Lee A.S., Su M.J., Lin C.L., Chien C.L., Wu M.L. Free fatty acids act as endogenous ionophores, resulting in Na+ and Ca2+ influx and myocyte apoptosis. Cardiovasc. Res., 2008b. 78 (3): 533-545.

57. Farooqu A.A., Horrocks L.A. Signaling and interplay mediated by phospholipases A2, C, and D in LA-N-1 cell nuclei. Reprod. Nutr. Dev., 2005. 45 (5): 613-631.

58. Fleury C., Sanchis D. The mitochondrial uncoupling protein-2: current status. Int. J. Biochem. Cell Biol., 1999. 31 (11): 1261-1278.

59. Frohnert B.I., Bernlohr D.A. Regulation of fatty acid transporters in mammalian cells. Prog. Lipid Res., 2000. 39 (1): 83-107.

60. Fulceri R., Gamberucci A., Bellomo G., Giunti R., Benedetti A. CoA and fatty acyl-CoA derivatives mobilize calcium from a liver reticular pool. Biochem J., 1993. 295 (3): 663-669.

61. Fulceri R., Knudsen J., Giunti R., Yolpe P., Nori A., Benedetti A. Fatty acyl-CoA-acyl-CoA-binding protein complexes activate the Ca2+ realese channel of skeletal muscle sarcoplasmic reticulum. Biochem. J., 1997. 325: 423-428.

62. Fulceri R., Nori A., Gamberucci A., Volpe P., Giunti R., Benedetti A. Fatty acyl-CoA esters induce calcium release from terminal cisternae of skeletal muscle. Cell Calcium, 1994. 15 (2): 109-116.

63. Furuno Т., Kanno Т., Arita К., Asami M., Utsumi Т., Doi Y., Inoue M., Utsumi K. Roles of long chain fatty acids and carnitine in mitochondrial membrane permeability transition. Biochem. Pharmacol., 2001. 62 (8): 1037-1046.

64. Garlid K.D., Orosz D.E., Modriansky M., Vassanelli S., Jezek P. On the mechanism of fatty acid-induced proton transport by mitochondrial uncoupling protein. J. Biol. Chem., 1996. 271 (5): 2615-2620.

65. Gill R.Q., Sterling R.K. Acute liver failure. J. Clin. Gastroenterol., 2001. 33 (3): 191-198.

66. Goni F.M., Requero M.A., Alonso A. Palmitoylcarnitine, a surface-active metabolite. FEBS Lett., 1996. 390 (1): 1-5.

67. Greenwalt D.E., Scheck S.H., Rhinehart-Jones T. Heart CD36 expression is increased in murine models of diabetes and in mice fed a high fat diet. J. Clin. Invest., 1995. 96: 1382-1388.

68. Grinstead G.F., Trzakos J.M., Billheimer J.T., Gaylor J.L. Cytosolic modulators of activities of microsomal enzymes of cholesterol biosynthesis. Effects of Acyl-CoA inhibition and cytosolic Z-protein. Biochim. Biophys. Acta, 1983. 751 (1): 41-51.

69. Grundy S.M. Obesity, metabolic syndrome, and cardiovascular disease. J. Clin. Endocrinol. Metab., 2004. 89 (6): 2595-2600.

70. Hailing D.B., Aracena-Parks P., Hamilton S.L. Regulation of voltage-gated Ca2+ channels by calmodulin. Sci. STKE, 2006. 2006 (318): erl.

71. Hamilton J.A. Fatty acid transport: difficult or easy? J. Lipid Res., 1998. 39 (3): 467-481.

72. Haq R.U., Tsao F., Shrago E. J. Relation of lung fatty acid binding protein to the biosynthesis of pulmonary phosphatidic acid and phosphatidylcholine. Lipid Res., 1987. 28 (2): 216-220.

73. Hardy S., El-Assaad W., Przybytkowski E., Joly E., Prentki M., Langelier Y. Saturated fatty acid-induced apoptosis in MDA-MB-231 breast cancer cells. A role for cardiolipin. J. Biol. Chem., 2003. 278 (34): 31861-31870.

74. Harmon C.M., Abumrad N.A. Binding of sulfosuccinimidyl fatty acids to adipocyte membrane proteins: isolation and amino-terminal sequence of an 88-kD protein implicated in transport of long-chain fatty acids. J. Membr. Biol., 1993. 133: 43-49.

75. Hickson-Bick D.L., Sparagna G.C., Buja L.M., McMillin J.B. Palmitate-induced apoptosis in neonatal cardiomyocytes is not dependent on the generation of ROS. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol., 2002. 282 (2): H656-664.

76. Hirasawa А., Нага Т., Katsuma S., Adachi Т., Tsujimoto G. Free fatty acid receptors and drug discovery. Biol. Pharm. Bull., 2008. 31 (10): 1847-1851.

77. Hirsch D., Stahl A., Lodish H.F. A family of fatty acid transporters conserved from mycobacterium to man. Proc. Natl. Acad. Sci., 1998. 95: 8625-8629.

78. Hotamisligil G.S. Role of endoplasmic reticulum stress and c-Jun NH2-terminal kinase pathways in inflammation and origin of obesity and diabetes. Diabetes, 2005. 54 (2): S73-78.

79. Hu D.D., Eftink M.R. Thermodynamic studies of the interaction of trp aporepressor with tryptophan analogs. Biophys. Chem., 1994. 49 (3): 233-239.

80. Huang H.W., Goldberg E.M., Zidovetzki R. Ceramides perturb the structure of phosphatidylcholine bilayers and modulate the activity of phospholipase A2. Eur. Biophys. J., 1998. 27 (4): 361-366.

81. Idell-Wenger J.A., Grotyohann L.W., Neely J.R. Coenzyme A and carnitine distribution in normal and ischemic hearts. J. Biol. Chem., 1978. 253 (12): 4310-4318.

82. Iritani N., Fukuda E., Inoguchi K. A possible role of Z protein in dietary control of hepatic triacylglycerol synthesis. J. Nutr. Sci. Vitaminol., 1980. 26 (3): 271-277.

83. Itani S.I., Ruderman N.B., Schmieder F., Boden G. Lipid-induced insulin resistance in human muscle is associated with changes in diacylglycerol, protein kinase C, and IkappaB-alpha. Diabetes, 2002. 51 (7): 2005-2011.

84. Jensen M.D., Haymond M.W., Rizza R.A., Cryer P.E., Miles J.M. Influence of body fat distribution on free fatty acid metabolism in obesity. J. Clin. Invest., 1989. 83 (4): 11681173.

85. Katz A.M. Membrane-derived lipids and the pathogenesis of ischemic myocardial damage. J. Mol. Cell Cardiol., 1982. 14 (11): 627-632.

86. Kiens В., Kristiansen S., Jensen P., Richter E.A., Turcotte L.P. Membrane associated fatty acid binding protein (FABPpm) in human skeletal muscle is increased by endurance training. Biochem. Biophys. Res. Commun., 1997. 231: 463-465.

87. Klingenberg M. Uncoupling protein-a useful energy dissipator. J. Bioenerg. Biomembr., 1999. 31 (5): 419-430.

88. Knight M.M., Roberts S.R., Lee D.A., Bader D.L. Live cell imaging using confocal microscopy induces intracellular calcium transients and cell death. Am. J. Physiol. Cell Physiol., 2003. 284 (4): C1083-1089.

89. Kobayashi A., Fujisawa S. Effect of L-carnitine on mitochondrial acyl CoA esters in the ischemic dog heart. J. Mol. Cell Cardiol., 1994. 26 (4): 499-508.

90. Kobayashi A., Watanabe H., Fujisawa S., Yamamoto Т., Yamazaki N. Effects of L-carnitine and palmitoylcarnitine on membrane fluidity of human erythrocytes. Biochim. Biophys. Acta, 1989. 986 (1): 83-88.

91. Kolmer M., Roos C., Tirronen M., Myohanen S., Alho H. Tissue-specific expression of the diazepam-binding inhibitor in Drosophila melanogaster: cloning, structure, and localization of the gene. Mol. Cell. Biol., 1994. 14 (10): 6983-6995.

92. Korge P., Goldhaber J.I., Weiss J.N. Phenylarsine oxide induces mitochondrial permeability transition, hypercontracture, and cardiac cell death. Am. J. Physiol. Heart. Circ. Physiol., 2001. 280: H2203-H2213.

93. Kragelund B.B., Hujrup P., Jensen M.S., Schjerling C.K., Juul E., Knudsen J., Poulsen F.M. Fast and one-step folding of closely and distantly related homologous proteins of a four-helix bundle family. J. Mol. Biol., 1996. 256 (1): 187-200.

94. Kwon K.J., Jung Y.S., Lee S.H., Moon C.H., Baik E.J. Arachidonic acid induces neuronal death through lipoxygenase and cytochrome P450 rather than cyclooxygenase. J. Neurosci. Res., 2005. 81 (1): 73-84.

95. Lai J.C., Liang B.B., Jarvi E.J., Cooper A.J., Lu D.R. Differential effects of fatty acyl coenzyme A derivatives on citrate synthase and glutamate dehydrogenase. Res. Commun. Chem. Pathol. Pharmacol., 1993. 82 (3): 331-338.

96. Lamour N.F., Chalfant C.E. Ceramide-1 -phosphate: the "missing" link in eicosanoid biosynthesis and inflammation. Mol. Interv., 2005. 5 (6): 358-367.

97. Leaf A., Xiao Y.F., Kang J.X. Interactions of n-3 fatty acids with ion channels in excitable tissues. Prostaglandins Leukot. Essent. Fatty Acids, 2002. 67 (2-3): 113-120.

98. Lemasters J J., Theruvath T.P., Zhong Z., Nieminen A.L. Mitochondrial calcium and the permeability transition in cell death. Biochim. Biophys. Acta, 2009. 1787 (11): 13951401.

99. Levitsky D.O., Skulachev V.P. Carnitine: the carrier transporting fatty acyls into mitochondria by means of an electrochemical gradient of H+. Biochim. Biophys. Acta, 1972. 275 (1): 33-50.

100. Lewis S.E., Listenberger L.L., Ory D.S., Schaffer J.E. Membrane topology of the murine fatty acid transport protein 1. J. Biol. Chem., 2001. 276: 37042-37050.

101. Liedtke A.J. Lipid burden in ischemic myocardium. J. Mol. Cell Cardiol., 1988. 20 (Suppl 2): 65-74.

102. Linnemann C.C.Jr., Shea L., Kauffinan C.A., Schiff G.M., Partin J.C., Schubert W.K. Association of Reye's syndrome with viral infection. Lancet., 1974. 2 (7874): 179-182.

103. Litosch I. Novel mechanisms for feedback regulation of phospholipase C-beta activity. IUBMB Life, 2002. 54 (5): 253-260.

104. Long S.D., Pekala P.H. Regulation of GLUT4 gene expression by arachidonic acid. Evidence for multiple pathways, one of which requires oxidation to prostaglandin E2. J. Biol. Chem., 1996.271 (2): 1138-1144.

105. Luiken J.J., Arumugam Y., Dyck D.J., Bell R.C., Pelsers M.M., Turcotte L.P., Tandon N.N., Glatz, J.F., Bonen A. Increased rates of fatty acid uptake and plasmalemmal fatty acid transporters in obese Zucker rats. J. Biol. Chem., 2001. 276: 40567-40573.

106. Luiken J.J., Turcotte L.P., Bonen A. Protein-mediated palmitate uptake and expression of fatty acid transport proteins in heart giant vesicles. J. Lipid. Res., 1999. 40, 10071016.

107. Lunzer M.A., Manning J.A., Ockner R.K. Inhibition of rat liver acetyl coenzyme A carboxylase by long chain acyl coenzyme A and fatty acid. Modulation by fatty acid-binding protein. J. Biol. Chem., 1977. 252 (15): 5483-5487.

108. Man M.Z., Hui T.Y., Schaffer J.E., Lodish H.F., Bernlohr D.A. Regulation of the murine adipocyte fatty acid transporter gene by insulin. Mol. Endocrinol., 1996. 10: 1021-1028.

109. Martin G., Schoonjans K., Lefebvre A.M., Staels В., Auwerx J. Coordinate regulation of the expression of the fatty acid transport protein and acyl-CoA synthetase genes by PPARa and PPARc activators. J. Biol. Chem., 1997. 272: 28210-28217.

110. Martin S., Millar C.A., Lyttle C.T., Meerloo Т., Marsh B.J., Gould G.W., James D.E. Effects of insulin on intracellular GLUT4 vesicles in adipocytes: evidence for a secretory mode of regulation. J. Cell Sci., 2000.113 (Pt 19): 3427-3438.

111. McGavock J.M., Victor R.G., Unger R.H., Szczepaniak L.S. Adiposity of the heart, revisited. Ann. Intern. Med., 2006. 144 (7): 517-524.

112. McHowat J., Yamada K.A., Saffitz J.E., Corr P.B. Subcellular distribution of endogenous long chain acylcarnitines during hypoxia in adult canine myocytes. Cardiovasc. Res., 1993. 27 (7): 1237-1243.

113. Mitsutake S., Igarashi Y. Calmodulin is involved in the Ca2+-dependent activation of ceramide kinase as a calcium sensor. J. Biol. Chem., 2005. 280 (49): 40436-40441.

114. Mogensen I.B., Schulenberg H., Hansen H.O., Spener F., Knudsen J. A novel acyl-CoA-binding protein from bovine liver. Effect on fatty acid synthesis. Biochem. J., 1987. 241 (1): 189-192.

115. Moore K.H., Dandurand D.M., Kiechle F.L. Fasting induced alterations in mitochondrial palmitoyl-CoA metabolism may inhibit adipocyte pyruvate dehydrogenase activity. Int. J. Biochem., 1992. 24 (5): 809-814.

116. Muralikrishna Adibhatla R., Hatcher J.F. Phospholipase A2, reactive oxygen species, and lipid peroxidation in cerebral ischemia. Free Radic. Biol. Med., 2006. 40 (3): 376387.

117. Negre-Salvayre A., Hirtz C., Carrera G., Cazenave R., Troly M., Salvayre R., Penicaud L., Casteilla L. A role for uncoupling protein-2 as a regulator of mitochondrial hydrogen peroxide generation. FASEB J., 1997. 11 (10): 809-815.

118. Nelson D.B., Hurwitz E.S., Sullivan-Bolyai J.Z., Morens D.M., Schonberger L.B. Reye's syndrome in the United States in 1977-1978, a non-influenza В virus year. J. Infect. Dis., 1979. 140 (3): 436-439.

119. Netticadan Т., Yu L., Dhalla N.S., Panagia V. Palmitoyl carnitine increases intracellular calcium in adult rat cardiomyocytes. Mol. Cell Cardiol., 1999. 31: 1357-1367.-Ill

120. Nicholls D.G., Chalmers S. The integration of mitochondrial calcium transport and storage. J. Bioenerg. Biomembr., 2004. 36 (4): 277-281.

121. Nicholls D.G., Locke R.M. Thermogenic mechanisms in brown fat. Physiol. Rev., 1984. 64(1): 1-64.

122. Novgorodov S.A., Gudz T.I., Obeid L.M. Long-chain ceramide is a potent inhibitor of the mitochondrial permeability transition pore. J. Biol. Chem., 2008. 283 (36): 24707-24717.

123. Oceandy D., Stanley P.J., Cartwright E.J., Neyses L. The regulatory function of plasma-membrane Ca(2+)-ATPase (PMCA) in the heart. Biochem. Soc. Trans., 2007. 35 (Pt 5): 927-930.

124. Ochocka A.M., Pawelczyk T. Isozymes delta of phosphoinositide-specific phospholipase С and their role in signal transduction in the cell. Acta Biochim. Pol., 2003. 50 (4): 1097-1110.

125. O'Doherty P.J., Kuksis A. Stimulation of triacylglycerol synthesis by Z protein in rat liver and intestinal mucosa. FEBS Lett., 1975. 60 (2): 256-258.

126. Ogata Т., Yamasaki Y. High-resolution scanning electron-microscopic studies on the three-dimensional structure of mitochondria and sarcoplasmic reticulum in the different twitch muscle fibers of the frog. Cell Tissue Res., 1987. 250 (3): 489-497.

127. Olofsson C.S., Salehi A., Holm C., Rorsman P. Palmitate increases L-type Ca2+ currents and the size of the readily releasable granule pool in mouse pancreatic beta-cells. J. Physiol., 2004. 557 (Pt 3): 935-948.

128. Ordway R.W., Singer J.J., Walsh J.V.Jr. Direct regulation of ion channels by fatty acids. Trends Neurosci., 1991. 14 (3): 96-100.

129. Overduin M., Cheever M.L., Kutateladze T.G. Signaling with phosphoinositides: better than binary. Mol. Interv., 2001. 1 (3): 150-159.

130. Pande S.V. Reversal by CoA of palmityl-CoA inhibition of long chain acyl-CoA synthetase activity. Biochim. Biophys. Acta., 1973. 306 (1): 15-20.

131. Pande S.V. Uneven distribution of palmitoyl carnitine in solutions because of migration to air/water interphase. Biochim. Biophys. Acta, 1981. 663 (3): 669-673.

132. Paulson D.J., Shug A.L. Inhibition of the adenine nucleotide translocator by matrix-localized palmityl-CoA in rat heart mitochondria. Biochim. Biophys. Acta., 1984. 766 (1): 70-76.

133. Paulussen R.J., van der Logt C.P., Veerkamp J.H. Characterization and binding properties of fatty acid-binding proteins from human, pig, and rat heart. Arch. Biochem. Biophys., 1988. 264 (2): 533-545.

134. Paulussen R.J., Veerkamp J.H. Intracellular fatty-acid-binding proteins. Characteristics and function. Subcell. Biochem., 1990. 16:175-226.

135. Peitzsch R.M., McLaughlin S. Binding of acylated peptides and fatty acids to phospholipid vesicles: pertinence to myristoylated proteins. Biochemistry, 1993. 32 (39): 1043610443.

136. Penzo D., Tagliapietra C., Colonna R., Petronilli V., Bernardi P. Effects of fatty acids on mitochondria: implications for cell death. Biochim. Biophys. Acta., 2002. 1555 (1-3): 160-165.

137. Pessayre D., Berson A., Fromenty В., Mansouri A. Mitochondria in steatohepatitis. Semin. Liver Dis., 2001. 21 (1): 57-69.

138. Pessin J.E., Saltiel A.R. Signaling pathways in insulin action: molecular targets of insulin resistance. J. Clin. Invest. 2000. 106 (2): 165-169.

139. Pessin J.E., Thurmond D.C., Elmendorf J.S., Coker K.J., Okada S. Molecular basis of insulin-stimulated GLUT4 vesicle trafficking. Location! Location! Location! J. Biol. Chem., 1999. 274 (5): 2593-2596.

140. Powell G.L., Grothusen J.R., Zimmerman J.K., Evans C.A., Fish W.W. A reexamination of some properties of fatty acyl-CoA micelles. J. Biol. Chem., 1981. 256 (24): 12740-12747.

141. Putney J.W., Thomas A.P. Calcium Signaling: Double Duty for Calcium at the Mitochondrial Uniporter. Curr. Biol., 2006. 16 (18): R812-815.

142. Qiu Z.H., Gijon M.A., de Carvalho M.S., Spencer D.M., Leslie C.C. The role of calcium and phosphorylation of cytosolic phospholipase A2 in regulating arachidonic acid release in macrophages. J. Biol. Chem., 1998. 273 (14): 8203-8211.

143. Rangel-Guerra R.A., Martinez H.R., Marfil A., Bosques Padilla F., Cavazos R. Reye's syndrome in an adult. Review of pathogenic mechanisms. Rev. Invest. Clin., 1994. 46 (5): 417-420.

144. Rasmussen J.T., Faergeman N.J., Kristiansen K., Knudsen J. Acyl-CoA-binding protein (ACBP) can mediate intermembrane acyl-CoA transport and donate acyl-CoA for beta-oxidation and glycerolipid synthesis. Biochem. J., 1994. 299 (1): 165-170.

145. Rasmussen J.T., Rosendal J., Knudsen J. Interaction of acyl-CoA binding protein (ACBP) on processes for which acyl-CoA is a substrate, product or inhibitor. Biochem. J., 1993. 292 (3): 907-913.

146. Reaven G.M. Banting lecture 1988. Role of insulin resistance in human disease. Diabetes,1988. 37 (12): 1595-1607.

147. Reed K.C., Bygrave F.L. The inhibition of mitochondrial calcium transport by lanthanides and ruthenium red. Biochem. J., 1974. 140 (2): 143-155.

148. Requero M.A., Goni F.M., Alonso A. The membrane-perturbing properties of palmitoyl-coenzyme A and palmitoylcarnitine. A comparative study. Biochemistry, 1995a. 34 (33): 10400-10405.

149. Requero M.A., Gonzalez M., Goni F.M., Alonso A., Fidelio G. Differential penetration of fatty acyl-coenzyme A and fatty acylcarnitines into phospholipid monolayers. FEBS Lett., 1995b. 357 (1): 75-78.

150. Resh M.D. Myristylation and palmitylation of Src family members: the fats of the matter. Cell, 1994. 76 (3): 411-413.

151. Ricquier D., Bouillaud F. The uncoupling protein homologues: UCP1, UCP2, UCP3, StUCP and AtUCP. Biochem. J., 2000. 345 (Pt 2): 161-179.

152. Riedel M.J., Baczko I., Searle G.J., Webster N., Fercho M., Jones L., Lang J., Lytton J., Dyck J.R., Light P.E. Metabolic regulation of sodium-calcium exchange by intracellular acyl CoAs. EMBO J., 2006. 25 (19): 4605-4614.

153. Rizzuto R., Bernardi P., Pozzan Т. Mitochondria as all-round players of the calcium game. J. Physiol., 2000. 529 (Pt 1): 37-47.

154. Rizzuto R., Duchen M.R., Pozzan T. Flirting in little space: the ER/mitochondria Ca2+ liaison. Sci STKE, 2004. 2004 (215):rel.

155. Rolf В., Oudenampsen-Kruger E., Borchers Т., Faergeman N.J., Knudsen J., Lezius A., Spener F. Analysis of the ligand binding properties of recombinant bovine liver-type fatty acid binding protein. Biochim. Biophys. Acta, 1995. 1259 (3): 245-253.

156. Rosen O.M. After insulin binds. Science, 1987. 237 (4821): 1452-1458.

157. Rosendal J., Ertberg P., Knudsen J. Characterization of ligand binding to acyl-CoA-binding protein. Biochem. J., 1993. 290 (2): 321-326.

158. Rustenbeck I., Lenzen S. Effects of lysophosphatidylcholine and arachidonic acid on the regulation of intracellular Ca2+ transport. Naunyn Schmiedebergs Arch. Pharmacol., 1989b. 339 (1-2): 37-41.

159. Rustenbeck I., Lenzen S. Regulation of transmembrane ion transport by reaction products of phospholipase A2. II. Effects of arachidonic acid and other fatty acids on mitochondrial Ca2+ transport. Biochim. Biophys. Acta, 1989a. 982 (1): 147-155.

160. Rustenbeck I., Munster W., Lenzen S. Relation between accumulation of phospholipase A2 reaction products and Ca2+ release in isolated liver mitochondria. Biochim. Biophys. Acta, 1996. 1304 (2): 129-138.

161. Saltiel A.R., Kahn C.R. Insulin signalling and the regulation of glucose and lipid metabolism. Nature, 2001. 414 (6865): 799-806.

162. Samartsev V.N. Fatty acids as uncouplers of oxidative phosphorylation. Biochemistry (Mosc), 2000. 65 (9): 991-1005.

163. Scallen T.J., Noland B.J., Gavey K.L., Bass N.M., Ockner R.K., Chanderbhan R., Vahouny G.V. Sterol carrier protein 2 and fatty acid-binding protein. Separate and distinct physiological functions. Biol. Chem., 1985. 260 (8): 4733-4739.

164. Schaap F.G., Hamers L., van der Vusse G.J., Glatz J.F. Molecular cloning of fatty acid-transport protein cDNA from rat. Biochim. Biophys. Acta, 1997. 1354: 29-34.

165. Schmidt M.F. Fatty acylation of proteins. Biochim. Biophys. Acta, 1989. 988 (3): 411-426.

166. Sethi J.K., Vidal-Puig A J. Thematic review series: adipocyte biology. Adipose tissue function and plasticity orchestrate nutritional adaptation. J. Lipid Res., 2007. 48 (6): 12531262.

167. Sharma V.K., Ramesh V., Franzini-Armstrong C., Sheu S.S. Transport of Ca2+ from sarcoplasmic reticulum to mitochondria in rat ventricular myocytes. J. Bioenerg. Biomembr., 2000. 32 (1): 97-104.

168. Shi H., Kokoeva M.V., Inouye K., Tzameli I., Yin H., Flier J.S. TLR4 links innate immunity and fatty acid-induced insulin resistance. J. Clin. Invest., 2006. 116 (11): 3015-3025.

169. Shkryl V.M., Shirokova N. Transfer and tunneling of Ca2+ from sarcoplasmic reticulum to mitochondria in skeletal muscle. J. Biol. Chem., 2006.281 (3): 1547-1554.

170. Sigurskjold B.W., Berland C.R., Svensson B. Thermodynamics of inhibitor binding to the catalytic site of glucoamylase from Aspergillus niger determined by displacement titration calorimetry. Biochemistry, 1994. 33 (33): 10191-10199.

171. Skulachev V.P. Fatty acid circuit as a physiological mechanism of uncoupling of oxidative phosphorylation. FEBS Lett., 1991. 294 (3): 158-162.

172. Skulachev V.P. Uncoupling: new approaches to an old problem of bioenergetics. Biochim. Biophys. Acta., 1998. 1363 (2): 100-124.

173. Soboll S., Stucki J. Regulation of the degree of coupling of oxidative phosphorylation in intact rat liver. Biochim. Biophys. Acta. 1985. 807 (3): 245-254.

174. Soupene E., Kuypers F.A. Mammalian long-chain acyl-CoA synthetases. Exp. Biol. Med., 2008. 233 (5): 507-521.

175. Spedding M., Mir A.K. Direct activation of Ca2+ channels by palmitoyl carnitine, a putative endogenous ligand. Br. J. Pharmacol., 1987. 92 (2): 457-468.

176. Stahl A., Evans J.G., Pattel S., Hirsch D., Lodish H.F. Insulin causes fatty acid transport protein translocation and enhanced fatty acid uptake in adipocytes. Dev. Cell, 2002. 2: 477-488.

177. Steinberg H.O., Tarshoby M., Monestel R., Hook G., Cronin J., Johnson A., Bayazeed В., Baron A.D. Elevated circulating free fatty acid levels impair endothelium-dependent vasodilation. J. Clin. Invest., 1997. 100 (5): 1230-1239.

178. Stremmel W., Strohmeyer G., Borchard F., Kochwa S., Berk P.D. Isolation and partial characterization of a fatty acid binding protein in rat liver plasma membranes. Proc. Natl. Acad. Sci., 1985. 82: 4-8.

179. Stuhlsatz-Krouper S.M., Bennett N.E. Schaffer J.E. Molecular aspects of fatty acid transport : mutations in the IYTSGTTGXPK motif impair fatty acid transport protein function. Prostaglandins Leukotrienes Essent. Fatty Acids, 1999. 60: 285-289.

180. Stuhlsatz-Krouper S.M., Bennett N.E., Schaffer J.E. Substitution of alanine for serine 250 in the murine fatty acid transport protein inhibits long chain fatty acid transport. J. Biol. Chem., 1998. 273: 28642-28650.

181. Stump D.D., Zhou S.L., Berk P.D. Comparison of plasma membrane FABP and mitochondrial isoform of aspartate aminotransferase from rat liver. Am. J. Physiol., 1993. 265: G894-902.

182. Takahashi A., Camacho P., Lechleiter J.D., Herman B. Measurement of intracellular calcium. Physiol. Rev. 1999. 79(4): 1089-125.

183. Targos B, Baranska J, Pomorski P. Store-operated calcium entry in physiology and pathology of mammalian cells. Acta Biochim Pol., 2005. 52 (2): 397-409.

184. Trollinger D.R., Cascio W.E., Lemasters J.J. Mitochondrial calcium transients in adult rabbit cardiac myocytes: inhibition by ruthenium red and artifacts caused by lysosomal loading of Ca(2+)-indicating fluorophores. Biophys. J., 2000. 79 (1): 39-50.

185. Trost L.C., Lemasters J.J. Role of the mitochondrial permeability transition in salicylate toxicity to cultured rat hepatocytes: implications for the pathogenesis of Reye's syndrome. Toxicol. Appl. Pharmacol., 1997. 147 (2): 431-441.

186. Trost L.C., Lemasters J.J. The mitochondrial permeability transition: A new pathophysiological mechanism for Reye's syndrome and toxic liver injury. J. Pharmacol. Exp. Ther., 1996. 278: 1000-1005.

187. Turcotte L.P., Srivastava A.K., Chiasson J.L. Fasting increases plasma membrane fatty acid-binding protein FABP(PM). in red skeletal muscle. Mol. Cell. Biochem., 1997. 166: 153-158.

188. Uchiyama A., Aoyama Т., Kamijo K., Uchida Y., Kondo N., Orii Т., Hashimoto T. Molecular cloning of cDNA encoding rat very long-chain acyl-CoA synthetase. J. Biol. Chem., 1996. 271: 30360-30365.

189. Utsunomiya A., Owada Y., Yoshimoto Т., Kondo H. Localization of mRNA for fatty acid transport protein in developing and mature brain of rats. Brain Res. Mol. Brain Res., 1997. 46: 217-222.

190. Van Bilsen M., Engels W., van der Yusse G.J., Reneman R.S. Significance of myocardial eicosanoid production. Mol. Cell Biochem., 1989. 88 (1-2): 113-121.

191. Van der Yusse G.J., Cornelussen R.N., Roemen Т.Н., Snoeckx L.H. Heat stress pretreatment mitigates postischemic arachidonic acid accumulation in rat heart. Mol. Cell Biochem., 1998. 185 (1-2): 205-211.

192. Van der Yusse G.J., Glatz J.F., Stam H.C., Reneman R.S. Fatty acid homeostasis in the normoxic and ischemic heart. Physiol. Rev., 1992. 72 (4): 881-940.

193. Vergun O., Keelan J., Khodorov B.I. and Duchen M.R. Glutamate-induced mitochondrial depolarisation and perturbation of calcium homeostasis in cultured rat hippocampal neurones. J. Physiology, 1999. 519.2.: 451-466.

194. Virally M., Blickle J.F., Girard J., Halimi S., Simon D., Guillausseau P.J. Type 2 diabetes mellitus: epidemiology, pathophysiology, unmet needs and therapeutical perspectives. Diabetes Metab., 2007. 33 (4): 231-244.

195. Virally M., Blickle J.F., Girard J., Halimi S., Simon D., Guillausseau P.J. Type 2 diabetes mellitus: epidemiology, pathophysiology, unmet needs and therapeutical perspectives. Diabetes Metab., 2007. 33 (4): 231-244.

196. Vork M.M., Glatz J.F., van der Vusse G.J. Release of fatty acid-binding protein and long chain fatty acids from isolated rat heart after ischemia and subsequent calcium paradox. Mol. Cell Biochem., 1993. 123 (1-2): 175-184.

197. Ward M.R. Reye's syndrome: an update. Nurse Pract., 1997. 22 (12): 45-46, 4950,52-53.

198. Watanabe H., Kobayashi A., Hayashi H., Yamazaki N. Effects of long-chain acyl carnitine on membrane fluidity of human erythrocytes. Biochim Biophys. Acta, 1989. 980 (3): 315-318.

199. Weiss J.N., Korge P., Honda H.M., Ping P. Role of the mitochondrial permeability transition in myocardial disease. Circ. Res., 2003. 93 (4): 292-301.

200. White M.F. The IRS-signalling system: a network of docking proteins that mediate insulin action. Mol. Cell Biochem., 1998. 182 (1-2): 3-11.

201. Whitmer J.T., Idell-Wenger J.A., Rovetto MJ., Neely J.R. Control of fatty acid metabolism in ischemic and hypoxic hearts. J. Biol. Chem., 1978. 253 (12): 4305-4309.

202. Wojtczak L. Effect of long-chain fatty acids and acyl-CoA on mitochondrial permeability, transport, and energy-coupling processes. J. Bioenerg. Biomembr., 1976. 8 (6): 293-311.

203. Wojtczak L., Schonfeld P. Effect of fatty acids on energy coupling processes in mitochondria. Biochim. Biophys. Acta., 1993. 1183 (1): 41-57.

204. Wojtczak L., Wieckowski M.R. The mechanisms of fatty acid-induced proton permeability of the inner mitochondrial membrane. J. Bioenerg. Biomembr., 1999. 31 (5): 447455.

205. Wojtczak L., Wieckowski M.R., Schonfeld P. Protonophoric activity of fatty acid analogs and derivatives in the inner mitochondrial membrane: a further argument for the fatty acid cycling model. Arch Biochem. Biophys., 1998. 357 (1): 76-84.

206. Wu J., Corr P.B. Influence of long-chain acylcarnitines on voltage-dependent calcium current in adult ventricular myocytes. Am. J. Physiol., 1992. 263 (2 Pt 2): H410-417.

207. Yamada J., Furihata Т., Tamura H., Watanabe Т., Suga T. Long-chain acyl-CoA hydrolase from rat brain cytosol: purification, characterization, and immunohistochemical localization. Arch. Biochem. Biophys., 1996. 326 (1): 106-114.

208. Yamada K.A., Kanter E.M., Newatia A. Long-chain acylcarnitine induces Ca2+ efflux from the sarcoplasmic reticulum. J. Cardiovasc. Pharmacol., 2000. 36 (1): 14-21.

209. Yamada K.A., McHowat J., Yan G.X., Donahue K., Peirick J., Kleber A.G., Corr P.В. Cellular uncoupling induced by accumulation of long-chain acylcarnitine during ischemia. С ire Res., 1994. 74 (1): 83-95.

210. Yamagishi S., Okamoto Т., Amano S., Inagaki Y., Koga K., Koga M,. Choei H., Sasaki N., Kikuchi S., Takeuchi M., Makita Z. Palmitate-induced apoptosis of microvascular endothelial cells and pericytes. Mol. Med., 2002. 8 (4): 179-184.

211. Yang S.Y., He X.Y., Schulz H. Fatty acid oxidation in rat brain is limited by the low activity of 3-ketoacyl-coenzyme A thiolase. J. Biol. Chem., 1987. 262 (27): 13027-13032.

212. Yenush L., Zanella C., Uchida Т., Bernal D., White M.F. The pleckstrin homology and phosphotyrosine binding domains of insulin receptor substrate 1 mediate inhibition of apoptosis by insulin. Mol. Cell Biol., 1998. 18 (11): 6784-6794.

213. Zhou S.L., Stump D., Isola L., Berk P.D. Constitutive expression of a saturable transport system for non-esterified fatty acids in Xenopus laevis oocytes. Biochem. J., 1994. 297: 315-319.

214. Zhou S.L., Stump D., Sorrentino D., Potter B.J., Berk P.D. Adipocyte differentiation of 3T3-L1 cells involves augmented expression of a 43-kDa plasma membrane fatty acid-binding protein. J. Biol. Chem., 1992. 267: 14456-14461.

215. Zou Y., Kim D.H., Jung K.J., Heo H.S., Kim C.H., Baik H.S., Yu B.P., Yokozawa Т., Chung H.Y. Lysophosphatidylcholine enhances oxidative stress via the 5-lipoxygenase pathway in rat aorta during aging. Rejuvenation Res., 2009. 12 (1): 15-24.

216. Бережное A.B., Федотова Е.И., Ненов M.H., Зинченко В.П., Дынник В.В. Кальциевая перезагрузка и гибель кардиомиоцитов в присутствии активированных производных жирных кислот. Биофизика,2010. 27 (1): 1-9.

217. Гришина Е.В., Касымов В.А., Ненов М.Н., Бережнов А.В., Федотова Е.И., Грушин К.С., Долгачева Л.П., Кокоз Ю.М., Зинченко В.П., Дынник В.В. Материалы междунар. конф. «Рецепция и внутриклеточная сигнализация». Пущино, 2007. с.215-218.

218. Джафаров Р.Х. Теоретическое исследование механизмов ингибирования цикла трикарбоновых кислот избытком субстратов. Кандид.диссерт., Пущино, 1988.

219. Каган В.Е., Азизова О.А., Архипенко Ю.В. и соавт. Взаимосвязь структурных и функциональных перестроек в мембранах саркоплазматического ретикулума при перекисном окислении липидов. Биофизика, 1977. 22 (4): 625-630.

220. Крутецкая З.И., Лебедев О.Е. Модуляция активности ионных каналов клеток арахидоновой кислотой, продуктами ее метаболизма и другими жирными кислотами. Цитология, 1995. 37 (1/2): 5-65.

221. Крутецкая З.И., Лебедев О.Е. Структурно-функциональная организация сигнальных систем в клетках. Цитология, 2000. 42 (9): 844-874.

222. Холмухамедов Э.Л., Зинченко В.П., Евтодиенко Ю.В. Автоколебания потоков ионов и редокс состояния дыхательной цепи в митохондриях. Биофизика, 1980. 25: 124-128.

223. СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ1. Статьи в журналах

224. А.В. Бережное. Е.И. Федотова, М.Н. Ненов, Ю.М. Кокоз, В.П. Зинченко, В.В. Дынник. Дестабилизация уровня цитозольного кальция и гибель кардиомиоцитов в присутствии производных длинноцепочечных Жирных кислот. Биофизика, 2008 Т. 53(6):1025-32.

225. Бережное А.В. Федотова Е.И, Ненов М.Н., Зинченко В.П., Дынник В.В. Токсические эффекты жирных кислот. Роль фосфолипаз. Международная конференция «Рецепция и внутриклеточная сигнализация», Пущино 2009. (2-4 июня) 1, стр. 15-19.

226. Дынник В.В., Бережное А.В. Федотова Е.И, Ненов М.Н. Каталитические матрицы фосфоинозитидов. Возможные механизмы регуляции. Международная конференция «Рецепция и внутриклеточная сигнализация», Пущино 2009. (2-4 июня) 1, стр.36-42.

227. Бережное А.В., Зинченко В.П., Федотова Е.И, Яшин В.А. Применение флуоресцентной микросокпии в исследованиях динамики Са в клетках. Учебно-методическое пособие. Пущино 2009. изд. ИРДПО, Москва. 76 стр.1. Тезисы докладов2+

228. А.В, Бережное, Е.И Федотова. Механизмы дестабилизации Са -гомеостаза возбудимых и невозбудимых клеток жирными кислотами. Материалы конференции «Фундаментальная наука и клиническая медицина», Санкт-Петербург 2008. стр. 35-36.

229. Е.И. Федотова, А.В. Бережное. Дестабилизация уровня цитозольного кальция в присутствии жирных кислот и их производных. 12-я международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология наука XXI века», Пущино 2008. (12-15 октября), стр .188.

230. А.V. Berezhnov. E.I. Fedotova, M.N. Nenov, V.P. Zinchenko, Yu.M. Kokoz, V.V. Dynnik. Destabilization of cells Ca2+ homeostasis by fatty acids derivatives. Materials of the of the Symposium "Biological Motility", Pushchino 2008. 1, pp. 142-144.

231. V.V. Dynnik, A.V. Berezhnov. M.N. Nenov, E.I. Fedotova, K.S. Grushin, V.P. Zinchenko, Yu.M. Kokoz. Accute and chonic toxic effects of fatty acids. Materials of the of the Symposium "Biological Motility", Pushchino 2008. 2, pp. 299-301.

232. A.B. Бережное, Е.И. Федотова, M.H. Ненов, Ю.М. Кокоз, В.П. Зинченко, В.В. Дынник Острые токсические эффекты жирных кислот. Научные труды II съезда физиологов СНГ. Физиология и здоровье человека, Кишинэу, Молдова 2008. (29-31 октября), стр. 35-36.

233. Федотова Е.И., Бережное А.В., Зинченко В.П., Дынник В.В. Токсические эффекты жирных кислот. Роль фосфолипаз. 13-я международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология наука XXI века», Пущино 2009. (28 сентября-2 октября), стр. 149-150.

Информация о работе

Бережнов, Алексей Валерьевич
кандидата биологических наук
Пущино, 2009
ВАК 03.00.02

Диссертация

Исследование механизмов острых токсических эффектов ацилкарнитинов - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы