Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Роль тандемной масс-спектрометрии в неонатальном скрининге наследственных болезней обмена веществ

ВАК РФ 03.02.07, Генетика

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата медицинских наук, Антонец, Анна Валерьевна, Белгород

Государственное бюджетное образовательное учреждение

высшего профессионального образования «Ростовский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации

На правах рукописи

04201357337

Антонец Анна Валерьевна

РОЛЬ ТАНДЕМ НОЙ МАСС-СНЕКТРОМЕТРИИ В НЕОНАТАЛЬНОМ СКРИНИНГЕ НАСЛЕДСТВЕННЫХ БОЛЕЗНЕЙ ОБМЕНА ВЕЩЕСТВ

03.02.07 — генетика

Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Научный руководитель: доктор медицинских наук Куцев Сергей Иванович

Белгород 2013

СОДЕРЖАНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ............................................................ 5

ВВЕДЕНИЕ...............................................................................7

ГЛАВА 1. СОВРЕМЕННЫЕ ПРЕДСТАВЛЕНИЯ О НЕОНАТАЛЬНОМ СКРИНИНГЕ МЕТОДОМ ТАНДЕМНОЙ МАСС-СПЕКТРОМЕТРИИ (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ).............................................................. 13

1.1. Общие аспекты генетического скрининга............................. 13

1.2. Метод тандемной масс-спектрометрии в диагностике наследственных болезней обмена веществ..........................................20

1.3. Основные заболевания, диагностируемые методом тандемной масс-спектрометрии..............................................25

1.3.1. Аминоацидопатиии................................................25

1.3.1.1. Фенилкетонурия..........................................26

1.3.1.2. Дефекты цикла мочевины............................. 27

1.3.1.3. Болезнь с запахом «кленового сиропа» мочи......29

1.3.1.4. Гомоцистинурия.........................................29

1.3.1.5. Некетотическая гиперглицинемия...................30

1.3.1.6. Тирозинемия............................................. 30

1.3.2. Дефекты |3-окисления жирных кислот в митохондриях.. 31

1.3.2.1. Дефицит карнитинпальмитоилтрасферазы I

типа..................................................................32

1.3.2.2. Дефицит карнитинпальмитоилтрансферазы II типа.................................................................. 32

1.3.2.3. Системный дефицит карнитина......................33

1.3.2.4. Дефицит карнитин-ацилкарнитин транслоказы... 34

1.3.2.5. Дефицит очень длинноцепочечной ацил-КоА-дегидрогеназы жирных кислот.................................34

1.3.2.6. Дефицит митохондриального

трифункционального белка.....................................35

1.3.2.7. Дефицит среднецепочечной ацил-КоА-дегидрогеназы жирных кислот.................................36

1.3.2.8. Дефицит короткоцепочечной

ацил-КоА-дегидрогеназы жирных кислот...................37

1.3.2.9. Глутаровая ацидурия II типа..........................38

1.3.3. Органические ацидурии..........................................39

1.3.3.1. Метилмалоновая ацидурия............................40

1.3.3.2. Малоновая ацидурия....................................43

1.3.3.3. Изовалериановая ацидурия........................... 43

1.3.3.4. Пропионовая ацидурия.................................44

1.3.3.5. Глутаровая ацидурия I типа...........................45

1.3.3.6. Дефицит р-кетотиолазы............................... 47

1.3.3.7. Множественная карбоксилазная недостаточность................................................................. 48

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ....................50

2.1. Материалы исследования..................................................50

2.2. Методы исследования......................................................52

ГЛАВА 3. ОПРЕДЕЛЕНИЕ РЕФЕРЕНСНЫХ ЗНАЧЕНИЙ КОНЦЕНТРАЦИЙ АМИНОКИСЛОТ И АЦИЛКАРНИТИНОВ............. 58

3.1 Определение референсных значений концентраций аминокислот

в периферической крови у новорожденных.................................58

3.2 Определение референсных значений концентраций ацилкарни-тинов в периферической крови у новорожденных........................70

ГЛАВА 4. МАССОВОЕ ОБСЛЕДОВАНИЕ НОВОРОЖДЕННЫХ НА НАСЛЕДСТВЕННЫЕ НАРУШЕНИЯ ОБМЕНА АМИНОКИСЛОТ, ОРГАНИЧЕСКИХ КИСЛОТ И ДЕФЕКТЫ МИТОХОНДРИАЛЬНОГО

Р-ОКИСЛЕНИЯ ЖИРНЫХ КИСЛОТ.............................................. 95

4Л. Апробация референсных значений концентраций аминокислот и ацилкарнитинов в массовом обследовании кислот новорожденных.................................................................. 95

4.2. Исследование концентраций аминокислот и ацилкарнитинов в периферической крови у доношенных и недоношенных новорожденных..............................................................................105

4.3. Исследование концентраций аминокислот и ацилкарнитинов в периферической крови у новорожденных при гипоксии................ 114

ГЛАВА 5. РЕТРОСПЕКТИВНОЕ ОБСЛЕДОВАНИЕ ДЕТЕЙ, УМЕРШИХ НА ПЕРВОМ ГОДУ ЖИЗНИ, НА АМИНОАЦИДОПАТИИ, ОРГАНИЧЕСКИЕ АЦИДУРИИ И ДЕФЕКТЫ МИТОХОНДРИАЛЬНОГО

(3-ОКИСЛЕНИЯ ЖИРНЫХ КИСЛОТ................................................121

ЗАКЛЮЧЕНИЕ...........................................................................133

ВЫВОДЫ..................................................................................141

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ..............................................142

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.............................................................. 144

ПРИЛОЖЕНИЕ.......................................................................... 165

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВПР - врожденные пороки развития

мс/мс - тандемная масс-спектрометрия

ГБУЗ - государственное бюджетное учреждение здравоохранения

ДККБ - детская краевая клиническая больница

МВПР - множественные врожденные пороки развития

МГК - медико-генетическая консультация

НБО - наследственные болезни обмена веществ

ЦНС - центральная нервная система

ЦРБ - центральная районная больница

ЧД - частота дыхания

чсс - частота сокращений сердца

А1а -аланин

Asp - аспарагиновая кислота

Glu - глутаминовая кислота

Xle - лейцин+изолейцин

Met - метионин

Phe - фенилаланин

Туг - тирозин

Val -валин

Arg - аргинин

Cit - цитруллин

Gly - глицин

Orn - орнитин

CO - свободный карнитин

C2 - ацетилкарнитин

C3 - пропионилкарнитин

C3DC - малонилкарнитин

С4 - бутирилкарнтин

С40Н - гидроксибутирлкарнитин

C4CD - метилмалонилкарнитин

С5 - изовалерилкарнтин

C5DC - глутарилкарнитин

С5:1 - 3 -метилкротонилкарнтин

С50Н - 3-гидроксиизовалерилкарнитин

С6 - гексаноилкарнитин

С8 - октаноилкарнитин

С8:1 - октеноилкарнитин

СЮ - деканоилкарнитин

СЮ: 1 -децено ил карнитин

С12 - додеканоилкарнитин

С14 - миристилкарнитин

С14:1 - тетр ад еценои л карнитин

С 14:2 - тетр ад ецино и л карнитин

С140Н - гидроксимиристилкарнтин

С16 - пал ьмито и л карнитин

С16:1 - гексадеденоилкарнитин

С16:1 ОН - гидроксигексадеценоилкарнитин

Cl60Н - гидроксипальмитоилкарнитин

С18 - стеароилкарнитин

Cl8:1 - олеоилкарнитин

С180Н - гидроксистеароилкарнитин

С18:1 ОН - гидроксиолеоилкарнитин

С18:20Н- гидроксилиноилкарнитин

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность исследования

Наследственные болезни обмена веществ (НБО) - обширный класс заболеваний, обусловленных мутациями структурных генов, под контролем которых осуществляется синтез белков, выполняющих различные функции: структурные, транспортные, ферментного катализа, иммунной защиты (Краснопольская К.Д., 2005).

Широкий спектр неспецифических клинических проявлений НБО в зависимости от нозологии затрудняет их адекватную клиническую диагностику. Без применения специальных методов лабораторной диагностики врожденные нарушения обмена веществ зачастую остаются не диагностированными, в то время как своевременно установленный диагноз и предпринятые лечебные мероприятия могут предотвратить тяжелые системные поражения, приводящие детей к инвалидизации и летальному исходу. Как правило, НБО манифестируют в раннем возрасте, поэтому одним из решающих факторов прогноза становится качество клинико-диагностического подхода, позволяющее не допустить прогрессирования метаболических изменений у пациентов. Массовое обследование новорожденных на фенилкетонурию по методу Роберта Гатри, внедренное в практику в середине XX века, является классическим примером программы неонатального скрининга на НБО (Wilson J.M.G. et al„ 1968).

С развитием методов лабораторной диагностики существенно расширился перечень заболеваний, на которые проводится массовое обследование; описана большая часть известных НБО. Настоящим прорывом в лабораторной диагностике ряда НБО стала технология тандемной масс-спектрометрии, с помощью которой возможно быстрое определение концентраций десятков различных метаболитов в минимальном количестве биологического материала одновременно. Применение данного метода для неонатального скрининга впервые описано в 1990 г. Millington D.S. et al.

Мировой опыт использования технологии тандемной масс-спектрометрии свидетельствует об эффективности, экономической рентабельности как для неонатального скрининга на НБО, так и для проведения подтверждающей диагностики {ХуХко\\сг Т.Н. & а1., 2001; Wilcken В. е1 а1., 2003; Рапёог А. е1 а1., 2004). Ввиду того, что выявление НБО на доклиническом этапе несоизмеримо важнее, чем констатация диагноза при некурабель-ном состоянии пациента, основное медико-социальное значение тандемной масс-спектрометрии как метода диагностики заключается именно в массовом обследовании новорожденных. Одной из ключевых проблем диагностики НБО методом тандемной масс-спектрометрии является определение региональных референсных значений физиологических концентраций исследуемых метаболитов. Несмотря на эффективный мировой опыт использования метода тандемной масс-спектрометрии при проведении неонатального скрининга на НБО, в Российской Федерации массовое обследование новорожденных на НБО с помощью данной технологии пока не внедрено, что обусловлено рядом причин. В первую очередь необходимо определить региональные референсные значения определяемых аналитов для популяции, в которой организуется скрининг. Необходимо отметить, что без знания возможных факторов, влияющих на результаты тестов, концепция диагностики методом тандемной масс-спектрометрии остается неполной. Таким образом, пилотное массовое обследование новорожденных детей на НБО методом тандемной масс-спектрометрии является актуальным.

Цель исследования:

Разработать научные основы внедрения массового обследования новорожденных детей на наследственные болезни обмена веществ (аминоацидо-патии, органические ацидурии и дефекты митохондриального (3-окисления жирных кислот) методом тандемной масс-спектрометрии на региональном уровне в Российской Федерации.

Задачи исследования:

1. Определить референсные значения физиологических концентраций аминокислот и ацилкарнитинов в периферической крови у новорожденных Юга России.

2. Провести пилотное массовое обследование новорожденных детей четырех районов Ростовской области на аминоацидопатии, органические ацидурии и дефекты митохондриального (3-окисления жирных кислот методом тандемной масс-спектрометрии.

3. Выявить особенности профиля концентраций аминокислот и ацилкарнитинов в периферической крови у недоношенных новорожденных.

4. Проанализировать изменение профиля аминокислот и ацилкарнитинов в периферической крови у новорожденных в зависимости от состояния гипоксии на момент рождения.

5. Ретроспективно исследовать содержание аминокислот и ацилкарнитинов в периферической крови у детей, умерших на первом году жизни.

Научная новизна

Впервые определены референсные значения физиологических концентраций аминокислот и ацилкарнитинов в периферической крови у новорожденных детей Юга России.

Впервые проведено массовое обследование новорожденных, родившихся на определенной административной территории Юга России в течение ограниченного периода времени на аминоацидопатии, органические ацидурии и дефекты митохондриального Р-окисления жирных кислот методом тандемной масс-спектрометрии.

Определена зависимость концентраций ряда аминокислот и ацилкарнитинов от физиологической зрелости новорожденного и гипоксических состояний при рождении.

На примере ретроспективного посмертного обследования детей первого года жизни показана необходимость использования метода тандемной масс-спектрометрии для массового скрининга аминоацидопатий, органических ацидурий и дефектов митохондриального ß-окисления жирных кислот. Практическая значимость

Рассчитанные значения концентраций аминокислот и ацилкарнитинов в периферической крови у новорожденных Юга России могут быть использованы в качестве референсных физиологических норм при организации массового скрининга на аминоацидопатии, органические ацидурии и дефекты митохондриального ß-окисления жирных кислот методом МС/МС. Предложен алгоритм диагностики НБО у новорожденных при проведении неона-тального скрининга методом тандемной масс-спектрометрии. Разработана карта дополнительного обследования новорожденных с повышенными концентрациями аминокислот и ацилкарнитинов в периферической крови, выявленными при проведении неонатального скрининга. Доказана необходимость учета состояния физиологической зрелости и гипоксии у новорожденных на момент рождения при проведении исследования концентраций аминокислот и ацилкарнитинов в периферической крови методом МС/МС. Основные положения, выносимые на защиту:

1. Референсные значения концентраций аминокислот и ацилкарнитинов в периферической крови у новорожденных, используемых в массовом обследовании на НБО методом МС/МС, должны быть определены в популяции, для которой организуется неонатальный скрининг.

2. При интерпретации результатов исследования концентраций аминокислот и ацилкарнитинов в периферической крови у новорожденных методом МС/МС следует учитывать состояние доношенности, массу тела ребенка и гипоксические состояния.

3. Применение МС/МС в массовом обследовании новорожденных может быть рекомендовано в качестве эффективного метода ранней диагно-

стики аминоацидопатий, органических ацидурий и дефектов митохон-дриального р-окисления жирных кислот. Апробация работы

Материалы диссертации доложены на третьей международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы биологии, нанотехноло-гий и медицины», 2009, г. Ростов-на-Дону; на VI съезде Российского общества медицинских генетиков, 2010; на X научной сессии молодых ученых «Современное решение актуальных научных проблем в медицине», г. Нижний Новгород, 2011; на II Всероссийской конференции по редким заболеваниям и редко применяемым медицинским технологиям «Дорога жизни» с международным участием, г. Санкт-Петербург, 2011; на международной научно-практической конференции «Эпигенетические заболевания», г. Харьков, Украина, 2011; на XVI конгрессе педиатров России, 2012. Внедрение в практику здравоохранения Полученные данные используются при чтении лекций и проведения семинаров на курсе медицинской" генетики факультета повышения квалификации и профессиональной переподготовки специалистов кафедры гематологии и трансфузиологии с курсами клинической лабораторной диагностики, генетики и лабораторной генетики ГБОУ ВПО «Ростовский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации. Результаты работы внедрены в работу лаборатории медицинской генетики ГБОУ ВПО «Ростовский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации. Личный вклад диссертанта

Автор принимала непосредственное участие как на этапе планирования диссертационного исследования, изучения данных отечественной и зарубежной литературы, так и при проведении лабораторного исследования биологического материала, статистической обработки, анализа и обобщения результатов в виде рукописи.

Публикации

По результатам диссертации опубликовано 12 печатных работ соискателя, в том числе 3 статьи в журналах, рекомендованных ВАК МОН РФ для соискателей ученой степени кандидата медицинских наук. Подготовлено 1 учебно-методическое пособие для врачей.

Структура и объём диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы и глав, посвященных описанию материалов и методов исследования, изложению полученных результатов и их обсуждения, содержит заключение и выводы. Работа изложена на 166 страницах машинописного текста, содержит 13 таблиц, 71 рисунок и 1 приложение. Библиографический указатель включает 162 наименования, из них 51 отечественных и 111 иностранных источников.

ГЛАВА 1. СОВРЕМЕННЫЕ ПРЕДСТАВЛЕНИЯ О НЕОНАТАЛЬНОМ СКРИНИНГЕ МЕТОДОМ ТАНДЕМНОЙ МАСС-СПЕКТРОМЕТРИИ (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ)

1.1. Общие аспекты генетического скрининга

Термин «скрининг» (от английского screening - просеивание) определен в официальном документе Всемирной организации здравоохранения как процесс выявления не диагностированной ранее болезни или дефекта с помощью тестов, обследований или других процедур, дающих быстрый ответ (Wilson J.M.G.etal., 1968).

Скрининговые программы характеризуются массовым характером обследования, профилактической направленностью, двухэтапным подходом к диагностике. Скрининговые программы подразделяются на массовые, при которых объектом просеивания является видимо здоровая популяции, и селективные, когда объектом просеивания являются определенные континген-ты лиц, среди которых ожидается накопление данного заболевания (Матуле-вич С.А., 2009; Hoffmann G., 2003).

Программы массового обследования на наследственные болезни, поддающиеся профилактическому лечению, могут учреждаться в рамках федерального или регионального здравоохранения. Экономические затраты, связанные с их организацией, в общегосударственном масштабе компенсируются за счет уменьшения числа инвалидов детства и снижения детской смертности. Многочисленные исследования, проведенные в разных странах, показали, что по затратам на просеивающи