Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Метаболические изменения при токсическом поражении печени и возможности их коррекции (экспериментальное исследование)

ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Метаболические изменения при токсическом поражении печени и возможности их коррекции (экспериментальное исследование)"

005049105 Яа правах пукописи

і ¿У

Хильчук Максим Александрович

МЕТАБОЛИЧЕСКИЕ ИЗМЕНЕНИЯ ПРИ ТОКСИЧЕСКОМ ПОРАЖЕНИИ ПЕЧЕНИ И ВОЗМОЖНОСТИ ИХ КОРРЕКЦИИ

(экспериментальное исследование)

03.01.04 - биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

7 ФЕВ ?013

Краснодар - 2013

005049105

Работа выполнена в государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Кубанский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации (ГБОУ ВПО КубГМУ Минздрава России)

Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор

Быков Илья Михайлович

Официальные оппоненты:

Курзанов Анатолий Николаевич - доктор медицинских наук, профессор, государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Кубанский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации, кафедра клинической фармакологии и функциональной диагностики ФПК и ППС, профессор кафедры;

Бородулин Владимир Борисович, доктор медицинских наук, профессор, государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Саратовский государственный медицинский университет имени В.И. Разумовского» Министерства здравоохранения Российской Федерации, кафедра биохимии, заведующий кафедрой.

Ведущая организация:

Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научно-исследовательский институт питания» Российской академии медицинских наук (г.Москва).

Защита состоится » февраля 2013 года в часов на заседании

диссертационного совета Д 208.038.02 на базе ГБОУ ВПО КубГМУ Минздрава России (350063, г. Краснодар, ул. Седина, 4, тел. (861) 262-73-75).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГБОУ ВПО КубГМУ Минздрава России

Автореферат разослан «У<Г» 2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета Д 208.038.02 профессор

Скорикова Людмила Анатольевна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность исследования. В настоящее время заболевания, связанные с токсическими поражениями печени, занимают ведущее место среди патологий, вызывающих необратимые нарушения в функционировании всех систем организма. Это связано с тем, что печень является не только органом, в котором протекают центральные звенья обмена белков, липидов и углеводов, но и барьером на пути всех чужеродных веществ, попадающих в организм человека [И.В.Калинин, Н.А.Петрук, 2011; С.В.Оковитый и соавт., 2012]. Изменение активности печеночных ферментов ведет к снижению детоксикационной функции печени. На этом фоне ряд веществ различной химической природы могут оказывать значительное воздействие не только на печень, но и на другие органы (например, поджелудочную железу), приводящее к формированию их токсического поражения [Э.Ф.Аглетдинов, А.А.Никоноров, Ф.Х.Камилов, 2009].

Особое место в профилактике и лечении гепатитов занимает использование фосфолипидных концентратов и растительных масел (например, эссенциале, фосфоглив, эссливер, льняное масло, пальмовое масло), обогащенных ненасыщенными жирными кислотами и жирорастворимыми витаминами [И.В.Шилова и соавт., 2008; В.В.Амосов и соакг., 2009].

Однако, как известные соединения, широко применяющиеся в настоящее время в медицине, так и менее распространенные на российском рынке препараты, изучены не в полной мере. В этой связи представляется актуальным исследование по уточнению биохимических механизмов, лежащих в основе токсического поражения печени, а также поиск и изучение механизма действия новых, наиболее эффективных гепатопротекторов, с выраженными шполипидемическими и антиоксидантными свойствами.

Цель псследованпя: изучить особенности изменения липидного и белкового спектров крови, активности пищеварительных протеиназ при токсическом поражении печени у лабораторных животных и разработать возможные пути их коррекции.

В связи с поставленной целью необходимо решить следующие задачи: 1) Дать биохимическую характеристику выраженности цитолитического синдрома, а также патологии белкового и липидного обменов, изменения активности пищеварительных протеиназ, возникающих у экспериментальных

животных (крыс) при создании токсического поражения печени, вызванного воздействием четыреххлористош углерода.

2) Провести сравнительное изучение химического состава и физико-химических свойств различных липофильных продуктов растительного происхождения с известными и предполагаемыми гепатопротективными, гаполшшдемическими и антиоксидантными свойствами, используя современные методы количественного анализа.

3) Оценить в искусственно созданных модельных тест-системах in vitro интенсивность гидролиза липидов, входящих в состав исследуемых продуктов под влиянием ферментов слизистой оболочки кишечника, изучить их антиоксидангную и антирадикальную активность.

4) Изучить выраженность гепатопротективных свойств исследуемых растительных продуктов у экспериментальных животных, подвергнутых интоксикации четыреххлористым углеродом.

5) Оценить состояние ферментов антирадикальной защиты, активность процессов перекиснош окисления липидов, направленность изменений липиднош и белкового спектров сыворотки крови при экспериментальном токсическом гепатите на фоне приема тестируемых растительных продуктов.

6) Проанализировать изменение активности протеиназ желудочно-кишечного тракта крыс, подвергнутых воздействию четыреххлористого углерода, при введении исследуемых продуктов растительного происхождения.

7) С учетом полученных данных дать рекомендации по эффективному использованию исследуемых продуктов растительного происхождения, обладающих гепатопротективными свойствами, для коррекции метаболических нарушений, возникающих при токсическом поражении печени.

Научная повпзна. В рамках представленного исследования впервые проведено сравнительное изучение липидного состава и физико-химических свойств новых и хорошо известных продуктов растительного происхождения (масло черного и грецкого ореха, льняное, подсолнечное, кукурузное, оливковое масла) и гепатопротекторов (фосфоглив, эссенциале, эссливер).

С использованием модельных тест-систем in vitro дана сравнительная характеристика выраженности про-/антиоксидантных свойств и атакуемости

липолитическими пищеварительными ферментами различных растительных масел и гепатопротекторов.

Проведен анализ выраженности нарушений липидного и белкового обменов, а также системы про-/антиоксидангы, активности протеолитических ферментов желудка и поджелудочной железы, изменений морфологической структуры печени, возникающих у экспериментальных животных, при моделировании токсического поражения печени вызванного четыреххлористым углеродом.

Впервые на большом экспериментальном материале с использованием интегральных методов диагностики проведено сравнительное изучение гепатопротективных свойств, антиоксидантной активности и пшолипидемических эффектов исследованных продуктов растительного происхождения на доклиническом этапе с применением модели токсического поражения печени.

Научно-практпческая шачнмость работы. В ходе проведенного исследования изучены растительные масла, обладающие выраженными гепатопротективными свойствами, описан их химический состав и основные метаболические эффекты, что позволяет рекомендовать их для клинических исследований возможности применения в комплексном лечении токсического поражения печени у человека.

Осповные положения, выносимые на защиту

1. Введение в организм крыс четыреххлористого углерода вызывает выраженное повреждение мембран гепатоцитов, способствует активации процессов лииопероксидации, дисбалансу в работе ферментативного звена антиоксидантной системы организма, снижению образования пищеварительных протеиназ, нарушению метаболизма липидов и белков.

2. Первичный скрининг липофильных продуктов растительного происхождения, основанный на анализе их химического состава, способности гидролизоваться под действием лшюлитических пищеварительных ферментов и антирадикальной активности в опытах in vitro, является эффективным инструментом для поиска новых гепатопротекторов.

3. Использование льняного масла, масел черного и грецкого орехов, а также препарата фосфоглив для лечения токсического поражения печени в эксперименте способствует снижению интенсивности процессов липопероксидации, нормализации работы ферментов антирадикальной защиты и протеиназ желудка и

поджелудочной железы, восстанавливает нарушения липиднош и белкового обменов, что позволяет рекомендовать исследуемые продукты для комплексного лечения токсических поражений печени.

Апробация результатов исследования. Материалы диссертации были представлены и обсуждались на Ш съезде физиологов СНГ (Ялта, Украина, 2011); XVII Международном конгрессе «Гепатологая сегодня» (Москва, 2012); XVIII Российской гастроэнтерологической неделе (Москва, 2012).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 12 научных работ, в том числе 4 статьи в центральной медицинской печати, рекомендованной ВАК Министерства образования и науки Российской Федерации.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 144 страницах компьютерного текста, иллюстрирована 32 рисунками, содержит 18 таблиц. Список литературы включает 254 источника, из них 219 отечественных и 35 иностранных.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Для выполнения работы была разработана поэтапная схема исследования (рис.

1).

Рпс. 1. Поэтапная схема исследования

6

В экспериментах использовано 175 белых беспородных крыс самцов весом 150200 г. В каждой опытной и контрольной группе животные были одного возраста и веса. Они содержались в стандартных условиях, с соблюдением всех правил и международных рекомендаций Европейской конвенции о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях [1986].

Для проведения исследований in vivo по влиянию на метаболические процессы и функцию печени крыс, на основании модельных экспериментов, были отобраны четыре наиболее перспективных продукта (масла льна, черного и грецкого орехов, препарат фосфоглив). В связи с чем опытные животные были распределены на следующие группы. Первая группа (25 крыс) - интактные животные. Вторая группа (25 крыс) - животные с моделью токсического поражения печени, вызванного введением СС14, исследование биохимических параметров у которых производилось на 7 сутки после начала эксперимента. Третья группа (25 крыс) -животные с моделью токсического поражения печени вызванного введением CCI4, исследование биохимических параметров у которых производилось на 30 сутки после начала эксперимента. Четвертая группа (100 крыс) - животные с предварительно созданным экспериментальным токсическим поражением печени, которым по гастралыюму зонду вводили изучаемые гепатопротекторъг. масло черного ореха - подгруппа IVa (п=25), масло грецкого ореха - подгруппа IVе (п=25), фосфоглив - подгруппа IVB (п=25), льняное масло - подгруппа IVr (п=25).

Для создания модели острого токсического поражения печени крысам подкожно вводили 50% масляный раствор CCU из расчета 0,5 мл на 100 г массы тела животного один раз в сутки в течение трех суток. Забор крови и внутренних органов (печени, желудка, поджелудочной железы) для исследования у животных опытных и контрольной групп проводили на 7 и на 30 сутки после начала эксперимента сразу после декагпггации под нембуталовым наркозом (35 мг/кг). Забой крыс производили после их 14 часового голодания, в утренние часы, согласно принятым на этот счет инструкциям и законодательным актам. Все исследования были выполнены в день забора крови и внутренних органов.

Для морфологического подтверждения развития моделируемого патологического процесса проводили патогистологическое исследование печени опытных животных с окраской гематоксилином и эозином по общепринятой методике [Д.Э. Коржевский, 2005].

Биохимическое исследование крови крыс проводилось с использованием готовых наборов реагентов фирмы «Vital Diagnostics SPb», а также по методикам, описанным B.C. Камышниковым [2009] и включало определение активности ряда индикаторных (аланинаминотрансферазы (АЛТ) и аспартатаминотрансферазы (ACT)) и экскреторных (у-глутамилтранспептидазы (у-ГТП) и щелочной фосфатазы (ЩФ)) ферментов печени, содержания общего билирубина и его фракций в сыворотке крови. Изучение показателей белкового обмена включало определение: общего белка, альбумина, а-, у-глобулинов; липидного - общего холестерина (ОХС), холестерина липопротеидов высокой (ХС ЛПВП), низкой (ХС ЛПНП) и очень низкой (ХС ЛПОНП) плотности, эфиров холестерина (ЭХС), неэтерифищфованного холестерина (НЭХС), триацилглицеринов (ТАГ) в сыворотке крови. Об активности процессов перекисного окисления липидов (ПОЛ) судили по количеству вторичных продуктов липопероксидации, вступающих в реакцию с тиобарбшуровой кислотой (ТБК-РП) [И.Д.Стальная, 1977; В.С.Камышников, 2009]. Активность супероксиддисмутазы (СОД) в гемолизате эритрощггов оценивали по методу В.А. Костюка и соавт. [1990], каталазы - по М.А. Королюку и соавт. [1988]. Содержание гемоглобина (НЬ) в гемолизате эритроцитов определяли гемиглобинцианидным методом. Исследование активности пепсина в гомогенатах слизистой оболочки желудка проводили экспресс-методом Н.П. Пятницкого [1968]. Для изучения активности трипсина в гомогенатах поджелудочной железы использовали метод Эрлангера - Шатерникова [А.А. Покровский, 1969], а для определения активности химотрипсина - методику Н.П. Пятницкого, М.Т. Проскурякова [1969].

Методы извлечения и изучения химических свойств липидов из продуктов растительного происхождения с предполагаемыми гепатопротективными свойствами включали: получение липидных экстрактов, определение йодного числа, массовой доли неомыляемых липидов, жирнокислотного состава липидных экстрактов методом газожидкостной хроматографии [Лабораторный практикум по химии жиров, 2004].

Изучение антиоксидантной активности липофильных продуктов растительного происхождения проводили в экспериментах in vitro с использованием в качестве субстрата ПОЛ мелких моноламеллярных липосом, полученных из яичного фосфатидилхолина методом инжекции этанольнош раствора лшшда в водную фазу.

Уровень ПОЛ в суспензии липосом оценивали по нарастанию ТБК-РП [В.Г. Зайцев, 2001].

Для оценки метаболической доступности исследуемых продуктов растительного происхождения был проведен их ферментативный липолиз in vitro с использованием гидролизной установки П.Г. Сторожука [Свидетельство на полезную модель №17757, 2000]. Количество жирных кислот определяли титрованием 0,05н раствором NaOH в присутствии 0,5% спиртового раствора фенолфталеина [О.Д. Кушманова, Г.М. Ивченко, 1983; Н.Н. Чернова, 2009].

В работе был произведен анализ 10 растительных продуктов, полученных как экспериментально, так и входящих в состав лекарственных препаратов, с целью отбора наиболее перспективных для использования в качестве гепатопротекторов и антиоксидантов: масло черного ореха (Juglans nigra), масло грецкого ореха (Juglans regia), масло льняное (производство «ИП Цыпляков А.Н.», Россия. Сертификат соответствия № РОСС RU.AI044.B03616), масло оливковое («LOWARI», Италия), масло подсолнечное (производство ООО «Родник-98», Россия. ГОСТ 1129-93), масло кукурузное (производство ООО «Кубанская долина», Россия. ГОСТ 88082000), Эссенциале форте H (A. Nattermann & Cie. GmbH, Германия), Эссливер форте (Nabros Pharma, Индия). Фосфоглив (ОАО «Фармстандарт-УфаВИТА», Россия), Ретинола ацетат (АЙ СИ ЭН Октябрь, Россия).

Статистическую обработку экспериментального материала проводили в соответствии с методами, принятыми в вариационной статистике [А.Н. Герасимов, 2007]. За достоверные различия в сравнении средних величин в парных сравнениях брали t-критерий Стыодента при р<0,05. Статистический анализ результатов исследования был проведен с использованием программ: «STATISTIKA 6.0 for Windows» фирмы «Stat Soft, Inc.» и «Microsoft Office Excel 2007».

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ В условиях повреждающего действия СС14 на 7 сутки эксперимента в паренхиме печени крыс на микроскопическом уровне наблюдались следующие патологические процессы (рис. 2Б): дискомплексация печеночных балок, жировая дистрофия гепатоцитов, очаговые некрозы по типу лизиса, кариолизис и кариопикноз гепатоцитов, острая венозная гиперемия междольковых капилляров, лимфостаз и гемостаз, отек стенок кровеносных сосудов, эритродиапедез, местный

гемосидероз, периваскулярные инфильтраты из полиморфных лейкоцитов, набухание и десквамация эндотелия сосудов.

Рис. 2. Микроскопическая картина печени интактных крыс (А) и подвергнутых интоксикации CCI4: 7 сутки эксперимента (Б), 30 сутки эксперимента (В). (Окраска гематоксилин-эозин; объектив ano- 40х, окуляр

КЮх)

На 30 сутки эксперимента микроструктура печени оставалась неоднородной (рис. 2В). Нарушения гемодинамики и экссудативные процессы на 30 сутки эксперимента, по сравнению с 7 сутками, были выражены слабее, и проявлялись преимущественно в виде хронической венозной гиперемии, не так ярко была выражена дезинтеграция гепатоцитов в печеночных балках, преобладали процессы хронического альтернативного воспаления, преимущественно в виде зернистой и гидропической дистрофии, и атрофии гепатоцитов, а также цианотической и бурой индурации, цирроза.

Для диагностики степени тяжести и глубины повреждения печени в исследовании было использовано определение активности ферментов АЛТ, ACT, ЩФ, у-ГТП в крови крыс (табл. 1). Так на 7 сутки после введения токсина в сыворотке крови животных отмечалось резкое увеличение активности ACT, АЛТ, у-ГТП и ЩФ в среднем в 3,7 (р<0,001), 6,2 раза (р<0,001), 8,3 (р<0,001) и 1,2 раза (р<0,001) соответственно, по сравнению с данными, полученными в группе интактных крыс. На 30 сутки после введения СС14 наблюдалась тенденция к снижению активности ACT, АЛТ, у-ГТП и ЩФ в сыворотке крови животных, однако активность ни одного из изучаемых ферментов не достигала значений, сопоставимых с группой здоровых крыс.

Как показали исследования, у крыс с токсическим поражением печени наблюдалось увеличение содержания билирубина в крови. Так, на 7 сутки эксперимента содержание общего билирубина в сыворотке крови животных составило 20,80±0,25 мкмоль/л, что превышало данный показатель в группе

10

интактных крыс в 2,3 раза (р<0,001). Увеличение содержания билирубина в крови животных происходило за счет его прямой фракции (концентрация конъюгированного билирубина в 5,7 раза (р<0,001) превышала контрольные величины). Тогда как уровень непрямого билирубина статистически не отличался от контроля (р>0,5). На 30 сутки эксперимента концентрация общего билирубина в крови крыс III экспериментальной группы снизилась на 14,5% (р<0,001), а прямого -на 28,8% (р<0,001) по сравнению с данными, полученными во II группе, однако была выше уровня общего и прямого билирубина в 1,9 (р<0,001) и 4,0 раза (р<0,001) соответственно по сравнению с контролем.

Таблица 1

Активность некоторых ферментов сыворотки крови крыс при моделировании токсического поражения печени, вызванного введением четыреххлористого

углерода (М±ш)

Исследуемый показатель Группы животных

I (контрольная) п=25 II (7 суток от начала эксперимента) п=25 III (30 суток от начала эксперимента) п=25

ACT, U/л 8,78±0,27 32,37±0,39 р,,.,<0,001 24,06±0,68 р„,<0,001 ;р,„.„<0,001

АЛТ, U/л 8,62±0,25 53,62+0,50 Pn-i <0,001 41,19±0,44 Рим <0,001; рш-п <0,001

ACT/AJ1T, усл. ед. 1,02±0,01 0,60±0,01 Р„1 <0,001 0,59±0,02 Рим <0,001; рШ-и >0,5

у-ГТП, U/л 16,60+0,48 137,36±1,85 р,,., <0,001 108,67±1,02 Рп,-, <0,001; Рш-п <0,001

ЩФ, U/л 87,51+0,49 102,22±0,72 рп., <0,001 91,21 ±0,46 Рп,-, <0,001; рп, ,, <0,001

Повышение активности трансаминаз в сыворотке крови животных, подвергнутых интоксикации CCU, свидетельствует о повреждении мембран гепатоцитов, повышении их проницаемости, а также гибели клеток печени, вследствие чего наблюдается выход внутриклеточных субстанций в кровь. Преимущественное увеличение активности AJ1T - цитоплазматического фермента, в отличие от ACT, имеющего митохондриально - цитоплазматическую локализацию, свидетельствует о преимущественном повреждении внешних мембран гепатоцитов под действием ССЦ. Увеличение активности у-ГТП и ТТТФ в крови лабораторных животных также указывает на массивный некроз гепатоцитов, возникающий под воздействием на организм крыс ССЦ. Однако повышение концентрации билирубина,

11

преимущественно за счет его прямой фракции, на фоне высокой активности у-ГТП и ЩФ указывает не только на формирование синдрома цитолиза у подопытных животных, но и на развитие синдрома внутрипеченочного холестаза, а также позволяет диагностировать паренхиматозный тип желтухи.

Одним из наиболее вероятных механизмов, позволяющих объяснить биохимические изменения в крови подопытных животных, является активация процессов ПОЛ, что нашло подтверждение в наших исследованиях. Согласно полученным данным, при интоксикации ССЦ, в крови животных наблюдалась накопление вторичных продуктов липодароксидации, реагирующих с ТБК (рис. 3). Свободные радикалы, образующиеся из ССЦ, способствуют повреждению мембран клеток, модуляции апоптоза, развитию окислительного стресса.

токсического поражения печени, вызванного введением четыреххлористого углерода Примечание: * - р<0,001 в сравнении с контрольной группой В ходе проведенных исследований установлено, что у животных П и III опытных групп на момент обследования наблюдался значительный дисбаланс в работе ферментативного звена антиоксидантной системы (АОС) крови. В гемолизате эритроцитов крыс П группы (7 суток от начала эксперимента), по сравнению с группой интактных животных, наблюдалось снижение активности как СОД (на 37,2%, р<0,001), так и каталазы (на 57,1%, р<0,001). Вследствие более выраженного ингибирования каталазы, значение коэффициента каталаза/СОД во II группе было ниже на 30,3% (р<0,001) по сравнению с контролем. В крови животных больньк III группы (30 суток от начала эксперимента) активность СОД снижалась на 56,2% (р<0,001) по сравнению с данными в контрольной группе и на 30,2% (р<0,01) по сравнению с показателями во II группе. Изменения активности каталазы

12

носили однонаправленный характер по отношению к СОД. Так, в гемолизате эритроцитов крыс Ш группы активность каталазы снижалась на 60,2% (р<0,001) по сравнению с данными в контрольной группе и на 7,0% (р<0,001) по сравнению с показателями во II группе. Значение коэффициента каталаза/СОД в Ш экспериментальной группе составило 2,75+0,08 усл.ед., что на 8,3% (р<0,02) ниже по сравнению с данными в контрольной группе (3,00±0,06 усл.ед.) и на 36,1% (р<0,001) выше по сравнению с данными во П группе (2,09±0,08 усл.ед.).

Снижение активности СОД и каталазы в крови животных с моделью острого токсического поражения печени, по-видимому, связано с окислительной модификацией функциональных групп ферментов, возникающей под действием избыточного количества активных форм кислорода и свободных радикалов. Образующиеся при этом конформационные перестройки молекулы фермента, диссоциация белков на субъединицы, а также увеличение скорости их деградации может быть причиной наблюдаемого нами явления. Увеличение коэффициента каталаза/СОД в Ш группе животных по сравнению со П группой, по нашему мнению, следует рассматривать как положительную тенденцию, направленную на восстановление сбалансированной работы ферментов первой (СОД) и второй (каталаза) линии антирадикальной защиты организма.

Исследование состояния липидного обмена на фоне интоксикации СС14 (II и Ш группы) показало увеличение содержания ОХС и ХС ЛПНП, снижение концентрации ХС ЛПВП и ТАГ, а также угнетение процесса этерификащш ХС (табл. 2). Следовательно, у подопытных животных наблюдалась выраженная гиперхолестеринемия, которая была связана с увеличением содержания ХС в проатерогенной фракции ЛПНП, при одновременном снижении его содержания в атгиатерогенной фракции ЛПВП, что свидетельствует о формировании у лабораторных животных вторичной дислипопротеидемии Па типа по D.S.Fredrickson [1967]. Вследствие того, что основная масса эфиров ХС образуется в крови под действием фермента лецитинхолестеринацилтрансфераза (ЛХАТ), то по соотношению ЭХС/НЭХС можно судить об активности данного фермента. Низкая активность ЛХАТ обуславливает накопление НЭХС в ЛП частицах крови, изменяя их физико-химические свойства. Так, НЭХС, накапливаясь в ЛПВП, значительно снижает их холестеринакцепторные свойства, а также нарушает обмен ЭХС между ЛП частицами, вследствие чего в комплексе ЛПНП+ЛПОНП возрастает

относительное содержание НЭХС [В.С.Камышников, 2009]. Данные процессы нарушают «обратный» транспорт ХС, тем самым, задерживая его в организме животного. Снижение концентрации ТАГ в сыворотке крови подопытных животных, по-видимому, связано с блокированием синтеза эндогенных ТАГ в печени, возникающих при введении токсина в организм. Данное предположение подтверждает также факт снижения концентрации ХС ЛПОНП во II и Ш опытных группах. Так как ЛПОНП синтезируются в печени, и в их состав входит значительное количество ТАГ, то блокирование синтеза ТАГ приводит к уменьшению образования ЛПОНП.

Таблица 2.

Биохимические показатели липидного обмена в сыворотке кровп крыс

при острой интоксикации четыреххлорпстым углеродом (М±т)

Исследуемый показатель Группы животных

I (контрольная) п=25 П (7 суток от начала эксперимента) п=25 ш (30 суток от начала эксперимента п=25

ТАГ, ммоль/л 1,29±0,07 0,55±0,02 рп.г <0,001 0,43±0,02 Рт-т <0,001; рт-п <0.001

ОХС, ммоль/л 2,90±0,08 3,12+0,05 Рп-7 <0,02 3,77±0,06 Рт.г <0,001; рт.„ <0,001

ХС ЛПВП, ммоль/л 0,91+0,04 0,68±0,02 Рп_, <0,001 0,50±0,02 р,„-г <0,001; рт.„ <0,001

ХС ЛПОНП, ммоль/л 0,59+0,03 0,25±0,01 Рп-1 <0,001 0,20±0,01 Рт-г <0,001; Рт-п <0,001

ХС ЛПНП, ммоль/л 1,40±0,08 2,18+0,06 р„_, <0,001 3,08±0,07 Рт-1 <0,001 ;рт_п <0,001

эхе, ммоль/л 1,79±0,03 1,39±0,02 Рил <0,001 1,23+0,01 Рт-1 <0,001; Рт-п <0,001

НЭХС, ммоль/л 1,11±0,08 1,73±0,05 р„, <0,001 2,54±0,06 Рт.1 <0,001; рт-п <0,001

ЭХС/НЭХС, усл. ед. 1,81±0,14 0,82±0,03 Рп.г <0,001 0,49+0,01 р,„-1 <0.001; рт-п <0,001

Согласно результатам проведенного исследования у крыс II и Ш опытных групп

имело место значительное нарушение в метаболизме белков. Так, на 7 сутки эксперимента в сыворотке крови животных, подвергнутых токсическому воздействию ССЦ, наблюдалось снижение концентрации общего белка на 20,9% (р<0,001) и альбумина на 24,4% (р<0,001) по сравнению с контролем. На 30 сутки эксперимента содержание общего белка и альбумина увеличилось на 9,6% (р<0,001) и на 15,4% (р<0,001) соответственно по сравнению с результатами, полученными во

14

II группе, но было ниже (на 13,3%, р<0,001 и на 12,8%, р<0,001) контрольных значений. Обращает также на себя внимание снижение концентрации глобулинов в сыворотке крови крыс II и Ш групп на 19,5% (р<0,001) и 15,2% (р<0,001) соответственно относительно контроля.

Таким образом, при токсическим воздействии СС14 на печень крыс, у животных возникала гипопротеинемия, связанная с непосредственным повреждением гепатоцитов свободными радикалами.

При изучении содержания отдельных фракции глобулинов в сыворотке крови животных опытных групп было обнаружено наличие диспротеинемии, о чем свидетельствовало снижение фракции а-глобулинов во П группе на 51,4% (р<0,001) и в Ш - на 72,2% (р<0,001) по сравнению с данными, полученными в группе интактных животных; возрастание фракции Р-глобулинов на 7 сутки эксперимента на 37,0% (р<0,001) и на 30 сутки - на 45,3% (р<0,001) относительно контроля; а также снижение содержания у-глобулинов в сыворотке крови животных II группы на 32,7% (р<0,001) по сравнению с контрольными значениями (в Ш опытной группе данный показатель статистически не отличался (р<0,5) от данных, полученных в группе интактных крыс).

Снижение фракций а- и у-глобулинов, по-видимому, отражает общую тенденцию к ингибированию синтеза белков печенью под действием ССЦ Относительное возрастание фракции р-глобулинов, по нашему мнению, связано с описанным выше нарушением катаболизма ЛПНП (Р-липопротеидов), их задержки в кровеносном русле вследствие окисления и снижения аффинности аполипопротеина Вюо к клеточным рецепторам. Увеличение содержания рассматриваемых метаболитов в крови крыс в динамике, по-видимому, следует рассматривать как положительный прогностический признак, направленный на восстановление белоксинтезирующей функции печени.

Как показали результаты исследования (табл. 3), под действием ССЦ в организме крыс наблюдалось снижение образования протеолитических ферментов желудка и поджелудочной железы.

На 7 сутки от начала эксперимента активность пепсина снизилась на 51% (р<0,001), трипсина - на 77,9% (р<0,001), химотрипсина - на 69,9% (р<0,001) по сравнению с данными, полученными в контрольной группе. На 30 сутки от начала эксперимента наблюдалось увеличение активности протеиназ по сравнению с

данными, полученными во П опытной группе. Так, активность пепсина в III группе была выше соответствующего параметра во П на 62% (р<0,001), трипсина — на 54,2% (р<0,001), химотрипсина - на 114,6% (р<0,001). Однако активность всех изучаемых протеиназ в Ш экспериментальной группе была ниже контрольных значений.

Таблица 3

Активность протеолптпческих ферментов слизистой оболочки желудка и ткани поджелудочной железы крыс при острой интоксикации четыреххлористым

углеродом (М±т)

Исследуемый показатель Группы животных

I (контрольная) п=25 П (7 суток от начала эксперимента) п=25 ІП (30 суток от начала эксперимента) п=25

Пенсии, мг/г 1,45±0,0б 0,71±0,02 р„_, <0,001 1,15±0,02 Рт-г <0,001; рт.„ <0,001

Трипсин, мг/г 22,68±0,22 5,02±0,08 Рп-і <0,001 7,74±0,09 ртл <0,001; Рт-п <0,001

Химотрписин, ед/г 1,3б±0,04 0,41+0,01 р„, <0,001 0,88±0,01 Рт-г <0,001; рт-г, <0,001

Наиболее вероятной причиной снижения выработки протеолитических ферментов, по нашему мнению, также является свободнорадикальное повреждение органов пищеварительной системы.

Острая интоксикация ССЦ приводила к значительному изменению структуры и функции гепатоцитов, что требовало коррекции. Рядом экспериментальных и клинических работ было показано, что количество и состав липидов крови, а также клеточных мембран определяется количеством и качеством принятых с пищей жирных кислот, входящих в состав продуктов растительного и животного происхождения.

Проведенный анализ жирнокислотного состава изучаемых масел показал, что масла кукурузы и подсолнечника из насыщенных жирных кислот содержат пальмитиновую и стеариновую кислоты. Из ненасыщенных жирных кислот в данных маслах были обнаружены в наибольшем количестве олеиновая и линолевая кислоты. Оливковое масло содержало преимущественно олеиновую жирную кислоту (до 83%). Другие жирные кислоты ненасыщенные - линолевая, линоленовая, пальмитолеиновая и насыщенные - пальмитиновая, стеариновая, арахиновая были представлены в незначительных количествах. Особенностью жирнокислотного состава льняного масла явилось наличие большого количества со-6

16

жирных кислот. В некоторых образцах этих масел содержание триеновой а-линоленовой жирной кислоты достигало 57,5%. Особый интерес представляет анализ жирнокислотного состава ранее практически не изученных масел черного и грецкого орехов. К особенностям их состава следует отнести высокое содержание линолевой кислоты (более 60%). Масло черного ореха, по сравнению с маслом грецкого ореха, содержало больше олеиновой жирной кислоты. В отличие от оливкового, масла черного и грецкого орехов содержали в значительно большем количестве полиненасыщенные линолевую и линоленовую кислоты, и значительно уступали в доле мононенасыщенной олеиновой кислоте. По содержанию линолевой жирной кислоты масла черного и грецкого орехов также превосходили масла подсолнечника и кукурузы. Основу используемых в данном исследовании фосфолипидные концентраты (эссенциале форте, эссливер форте, фосфоглив) составляли ФЛ (преимущественно ФХ), получаемые из сои. Их жирнокислотный состав представлен полиненасыщенными жирными кислотами, в основном линолевой кислотой (около 70%).

Изучение особенностей влияния на интенсивность ПОЛ, отобранных для исследования растительных масел и лекарственных препаратов, показало наличие у них антиоксидантних свойств. Исследуемые продукты достоверно снижали содержание ТБК-РП в липосомах в течение первых 12 часов окисления, но при большей длительности процесса ПОЛ выраженность антиоксидантного действия заметно снижалась, а у ретинола проявлялись прооксидантные свойства. Высокая антиоксидантная активность исследуемых продуктов на начальном этапе ПОЛ связана с наличием в структуре их компонентов ненасыщенных связей, которые перехватывают свободные радикалы - инициаторы ПОЛ, конкурируя за них с мембранными липидами и тем самым защищая последние от интенсивного окисления. По-видимому, отсутствие у растительных масел и фосфолипидных концентратов прооксидантных свойств было обусловлено наличием в их составе различных компонентов, обладающих антиоксидантными своіїствами. В целом, по величине антиоксидантного эффекта исследуемые продукты можно расположить следующим образом: ретинола ацетат < оливковое масло < кукурузное масло < подсолнечное масло < эссливер форте < эссенциале форте < масло грецкого ореха < фосфоглив < масло черного ореха < льняное масло.

В связи с описанными выше особенностями метаболизма изучаемых продуктов, а также обнаружением у экспериментальных животных, подвергнутых интоксикации СС14, снижения продукции пищеварительных ферментов, возникла необходимость в изучении способности фосфолипидных и триглицеридных концентратов подвергаться гидролизу под действием липолитических ферментов пищеварительной системы. К концу третьего часа по количеству высвободившихся свободных жирных кислот исследуемые растительные масла расположились следующим образом: кукурузное масло < подсолнечное масло < оливковое масло < масло грецкого ореха = масло черного ореха < льняное масло; фосфолипидные концентраты: эссливер форте < эссенциале форте < фосфоглив.

На основании изучения антиоксиданных свойств in vitro, а также способности исследуемых продуктов гидролизоваться под действием липолитических ферментов пищеварительной системы для дальнейших исследований in vivo были отобраны четыре наиболее перспективных продукта (льняное масло, масла черного и грецкого орехов, фосфоглив), обладающие наиболее выраженными антиоксидантными свойствами и наибольшей доступностью липолизу и соответственно большей способностью включаться в метаболические процессы.

Согласно проведенным исследованиям, во всех группах животных, получавших лечение растительными маслами и препаратом фосфоглив, наблюдалась положительная динамика морфологической картины печени по сравнению крысами, у которых лечение не проводилось (III опытная группа) (рис. 4).

«ШшИ^И^И мыщ

нШшВНННННкш

А Б В Г

Рис. 4. Восстановление балочной структуры печени крысы, подвергнутой интоксикации CCI4 под действием масла черного (А), грецкого (Б) орехов, льняного масла (В) и препарата фосфоглив (Г). Окраска гематоксилином и

эозином, х400

Согласно проведенному нами исследованию, на фоне лечебного введения экспериментальным животным изучаемых растительных продуктов, наблюдалась общая тенденция к уменьшению активности индикаторных и экскреторных

ферментов печени в сыворотке крови. Несмотря на значительное уменьшение гиперферментемии, обнаруженное во всех группах крыс, получавших лечение изучаемыми продуктами, на 30 сутки эксперимента активность ферментов крови не достигала контрольных значений.

У животных на фоне введения растительных масел и препарата фосфоглив наблюдалось снижение содержания общего билирубина в сыворотке крови преимущественно за счет его прямой фракции. Так, у животных IVA группы концентрация общего билирубина была ниже показателей III группы на 19,3% (р<0,001); IVе - на 15,9% (р<0,001); IVB - на 36,2% (р<0,001); IVr - на 28,8% (р<0,001).

Таким образом, все исследуемые масла (черного и грецкого орехов, льна), а также препарат фосфоглив проявили выраженные гепатопротективные свойства, способствовали уменьшению выраженности цитолитического, холестатического и токсического синдромов у лабораторных животных. По степени выраженности гепатопротективных свойств растительные продукты можно расположить в следующем порядке: фосфоглив > льняное масло > масло черного ореха = масло грецкого ореха.

Согласно полученным данным, в сыворотке крови наиболее выраженное снижение содержания ТБК-РП относительно группы сравнения было зарегистрировано в IVr группе (на 34,9%, р<0,001). В IVA уровень ТБК-РП снизился на 17,6% (р<0,001), в IVе - на 21,9% (р<0,001), в IVB - на 11,1% (р<0,001) по сравнению с данными, полученными у крыс III группы. Изменение активности ферментов антирадикальной защиты эритроцитов в группах, IVA, IVе, IVb, IVr носили однонаправленный характер: наблюдалось выраженное увеличение активности как СОД, так и каталазы по сравнению с данными, полученными в группе III.

Биохимические изменения, протекающие в крови, сопоставимы с изменениями в клетках других органов, поэтому снижение содержания ТБК-РП в плазме крови, а также выраженная тенденция к нормализации работы ферментов первой и второй линий антирадикальной защиты эритроцитов во всех опытных группах, получавших лечение растительными продуктами, отражает процесс инактивации процессов ПОЛ в периферических тканях и органах. Наиболее выражен этот эффект был в группе получавшей в качестве лечебного средства льняное масло (IVr группа).

Согласно проведенному нами исследованию, уровень ТАГ повышался во всех опытных группах по сравнению с группой сравнения (1П группа). Однако максимальное увеличение этого показателя наблюдалось в 1УА и 1УГ группах (в среднем на 195%, р<0,001 и 202%, р<0,001 соответственно по сравнению с Ш опытной группой) и статистически не отличались от данных, полученных в контрольной группе.

При анализе содержания ОХС в сыворотке крови крыс опытных групп, обращает на себя внимание значительное его снижение в 1УГ группе (на 17,5% по сравнению с группой сравнения). Содержание ОХС в группах Г/А, 1УЬ было сопоставимо друг с другом и ниже, чем в Ш (на 14,1%, р<0,001 и 13,0%, р<0,001 соответственно), однако выше, чем в группе Г/г Содержание ОХС в IVе группе было ниже значения данного показателя в Ш на 6,6% (р<0,001), но выше, чем в других опытных группах.

При анализе распределения ХС между ЛП частицами отмечается снижение его содержания в проатерогенной фракции ЛПНП в группах Г/А, IVе, IVе, 1Уг (на 40,6%, р<0,001; 36,7%, р<0,001; 20,5%, р<0,001; и 47,4%, р<0,001 соответственно) по сравнению с группой крыс не получавших лечение. Наиболее выраженный эффект снижения ХС ЛПНП наблюдался в группе 1УГ. Наибольшее содержание ХС ЛПОНП было зарегистрировано в ГУА (0,59±0,02 ммоль/л) и IVе (0,59±0,02 ммоль/л) группах, затем, в порядке уменьшения параметра, следовали группы IVе (0,54±0,02 ммоль/л) и IVе (0,43±0,02 ммоль/л). Содержание холестерина в антиатерогенной фракции ЛПВП было максимальным в группе 1УГ (0,90±0,02 ммоль/л), далее следовали группы ГУА (0,83±0,03 ммоль/л), IVе (0,79±0,02 ммоль/л) и IVе (0,64+0,02 ммоль/л).

Таким образом, в группах 1УА, Г/Б, IVе, IVе биохимические сдвиги носили противоположный характер, по отношешпо к крысам с моделью токсического поражения печени, не получавших лечения. Наиболее выраженные эффекты, направленные на восстановление липидного обмена, были в группе животных, получавших в качестве лечебного средства льняное масло (Г/г группа).

Как показали результаты исследования, у экспериментальных животных под действием растительных масел и лекарственного препарата фосфоглив наблюдалось увеличение содержания общего белка в сыворотке крови, как за счет фракции альбуминов, так и за счет глобулинов. Изучение содержания отдельных фракций глобулинов в сыворотке крови животных опытных групп на фоне терапии

гепатопротекторами показало увеличение фракции а-глобулинов в IVа группе на 54,8% (р<0,001), в IVе - на 47,3% (р<0,001), в IVй - на 69,5% (р<0,001), в 1УГ - на 100,6% (р<0,001) по сравнению с данными, полученными в Ш группе. Фракция глобулинов на фоне лечения уменьшилась в группе IV13 - на 14,7% (р<0,001), в 1УГ -на 27,0% (р<0,001) по сравнешпо с данными, полученными в группе сравнения. Содержание Р-глобулинов в IVа и Г/б группах статистически не отличалось от ІП опытной группы. Содержание у-глобулинов в сыворотке крови животных IVа группы было выше данных, полученных в группе сравнения на 7,3% (р<0,05), в 1УВ - на 10,6% (р<0,01), в 1УГ - на 7,9% (р<0,02). В группе IVе концентрация у-глобулинов статистически не отличалась от ІП группы.

Согласно полученным результатам (табл. 4), у животных IVа, IVе, IVе, ТУг опытных групп, по сравнению с группой ПІ, наблюдалось увеличение содержания протеолитических ферментов. В группах животных получавших лечение маслом черного ореха и льняным маслом содержание пепсина достигло уровня интактных крыс, под действием льняного масла также нормализовался синтез химотрипсина.

Таблица 4

Активность протеолитических ферментов слизистой оболочки желудка и тканн поджелудочной железы животных с моделью острого токсического поражения

печени, находящихся па лечепии исследуемыми гепатопротекторами (М±т)

Группы крыс и Пепсин, мг/г Трппспи, мг/г Хнмотриисин, ед/г

а IV (масло черного ореха) 25 1,33±0,02 Рш-т<0'001 Ріуа-,<0'5 18,67±0,13 Рш т<°>001 Р,уа,<0'Ш 1,27±0,01 Рш-п1<0'001 Р,уа,<0'05

IV5 (масло грецкого ореха) 25 1,31±0,02 Р^ш<0'001 Рпъ-,<°>05 18,95±0,21 Рпъ-т<°>001 Р^0'001 1,26±0,01 Рп'в-т<°>001 рпг„<°>02

в IV (фосфошив) 25 1,38+0,02 Рпъ-т<°>001 20,11±0,17 Рпът<0'001 Р^г<0,001 1,28±0,11 Рг.ъ-т<°-т Р,ш,<0'001

г IV (льняное масло) 25 1,36+0,01 РПТ,П<0,001 Рпт,<0-5 19,47±0,17 Ріуг-т<0'001 Рпт.,<0'001 1,29±0,17 рпг_т<0.001 РПТ-1<0-5

ПІ (СС14, 30 суток от начала эксперимента) 25 1,15±0,02 7,74±0,09 0,88±0,01

I(контрольная) 25 1,45±0,06 22,68±0,22 1,36±0,04

Таким образом, под действием исследуемых масел и препарата фосфоглив наблюдалась тенденция к восстановлению белоксинтезируютцей функции печени, а также продукции протеолитических ферментов ЖКТ. Наиболее выражены обнаруженные изменения были зарегистрированы в группе IVr, т.е. у крыс с интоксикацией ССЦ получавших льняное масло.

ВЫВОДЫ

1. У крыс, с моделью острого токсического поражения печени, вызванного воздействием четыреххлористого углерода, наблюдается формирование синдромов цитолиза, внутрипеченочного холестаза, активация процессов перекисного окисления липидов, формирование вторичной дислипидемии и дислипопротеидемии, абсолютной гииопротеинемии, диспротеинемии, а также снижение образования пищеварительных протеаз.

2. Проведенный анализ химического состава изучаемых липофильных продуктов растительного происхождения, с известными и предполагаемыми гепатопротективными свойствами, показал наличие в их составе значительного количества моно- и полиненасыщенных жирных кислот, жиро- и водорастворимых витаминов.

3. Изучение интенсивности высвобождения свободных жирных кислот под действием липолитических пищеварительных ферментов, а также особенностей влияния на активность свободнорадикального окисления отобранных для исследования растительных масел и лекарственных препаратов в опытах in vitro показало наибольшую способность к гидролизу и наличие выраженных антиоксидантных свойств у льняного масла, масел черного и грецкого орехов, препарата фосфоглив.

4. Исследуемые масла черного и грецкого орехов, льна, а также препарат фосфоглив проявили выраженные гепатопротективные свойства, регистрируемые на основании изменения морфологической картины печени, снижения активности ряда индикаторных (AJIT, ACT) и экскреторных (у-ГТП, ЩФ) ферментов, а также снижения концентрации билирубина в сыворотке крови крыс. Наиболее выраженный гепатопротективный эффект был обнаружен у препарата фосфоглив и льняного масла.

5. Применение исследуемых липофильных продуктов для лечения животных с моделью острого токсического поражения печени способствовало

снижению интенсивности процессов липопероксидации, нормализации работы ферментов антирадикальной защиты, а также характеризовалось тенденцией к восстановлению выработки пищеварительных протеиназ, нормализации протекания липидного, белкового обменов.

6. Использование льняного масла, масел черного и грецкого орехов, а также препарата фосфоглив для комплексного лечения токсического поражения печени является мощным и эффективным патогенетическим фактором в терапии данного состояния.

ПРЕДЛОЖЕНИЯ ДЛЯ ВНЕДРЕНИЯ В ПРАКТИКУ

1. Определение в сыворотке крови больных токсическим поражением печени интегральных биохимических показателей ЭХС/НЭХС, каталаза/СОД предлагается использовать в качестве ранних, достоверных диагностических и прогностических тестов для оценки тяжести метаболических нарушений и контроля лечения при остром токсическом поражении печени.

2. Для комплексного патогенетического лечения больных токсическим поражением печени целесообразно использовать масла льна, черного и грецкого орехов.

Список научных работ, опублпковапных по теме диссертации

*1. Оценка степени выраженности окислительного стресса при токсическом поражении печени и методы его коррекции / Е.Е. Есауленко, М.И. Быков, A.A. Ладутько, С.С. Бачко, М.А. Хильчук, И.М. Быков, Е.В. Щербакова // Вестник новых медицинских технологий. - 2009. - Т. XVI, №1. - С.261-262.

*2. Оценка степени выраженности метаболических нарушений в крови при экспериментальном токсическом гепатите и разработка путей их коррекции / И.М. Быков, A.A. Ладутько, Е.Е. Есауленко, М.И. Быков, С.С. Бачко, М.А. Хильчук // Кубанский научный медицинский вестник. - 2009. - № 3 (108). - С.21-26.

3. Особенности антиоксидантного действия масла ореха черного (Juglands nigra L.) в условиях токсического поражения печени / С.С. Бачко, Е.Е. Есауленко, М.А. Хильчук, М.И. Быков, A.A. Ладутько // Научные труды III съезда физиологов СНГ. - Ялта, Украина, 2011. - С. 175-176.

4. Особенности изменения липопротеинового спектра эритроцитов при экспериментальном токсическом гепатите / Е.Е. Есауленко, И.М. Быков, A.A. Ладутько, М.И. Быков, М.А. Хильчук, О.В. Дьякова // Российский журнал гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии. - 2010. - Т.ХХ, № 1. Приложение №35. - С.91.

5. Изменения липидного спектра мембран эритроцитов при остром токсическом поражении печени, вызванном интоксикацией четыреххлористым углеродом / М.А. Хильчук, Е.Е. Есауленко, И.М. Быков, A.A. Ладутько // XVII Конгресс "Гепатология сегодня". - Москва, 2012.-С.31.

6. Влияние интоксикации четыреххлористым углеродом на показатели белкового обмена в эксперименте / М.А. Хильчук, Е.Е. Есауленко, A.A. Ладутько, И.М. Быков // XVII Конгресс "Гепатология сегодня". - Москва, 2012. - С.32.

7. Экспериментальная модель токсического поражения печени и способы ее коррекции / М.А. Хильчук, Е.Е. Есауленко, A.A. Ладутько, И.М. Быков // Аллергология и иммунология. -2012. -Т. 13,№1. -С.131.

8. Влияние некоторых растительных масел на интенсивность протекания процессов свободнорадикального окисления в крови при моделировании острого токсического поражения печени / И.М. Быков, М.А. Хильчук, Е.Е. Есауленко, A.A. Ладутько, М.И. Быков // Аллергология и иммунология. - 2012. - Т. 13, №1. - С.132.

*9. Модификация липидного спектра мембран эритроцитов при экспериментальном токсическом поражении печени и возможности его коррекции растительными маслами / М.А. Хильчук, Е.Е. Есауленко, A.A. Ладутько, И.М. Быков, Н.Р. Данилова // Кубанский научный медицинский вестник. - 2012. - № 1 (130) - С.177-181.

10. Хильчук, М.А. Влияние растительных масел на активность ряда ферментов пищеварительной системы крыс в условиях острой интоксикации четыреххлористым углеродом / М.А. Хильчук, Е.Е. Есауленко, И.М. Быков // Российский журнал гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии. - 2012. - Т.ХХП, № 5. Приложение №40. -С. 135.

11. Изменение активности пищеварительных протеиназ в условиях острой интоксикации четыреххлористым углеродом / М.А. Хильчук, Е.Е. Есауленко, И.М. Быков, Н.Р. Данилова // Российский журнал гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии. - 2012. -Т.ХХП, № 5. Приложение №40. - С. 135.

*12. Хильчук, М.А. Состояние системы про-/антиоксиданты и активность пищеварительных протеиназ у крыс при острой интоксикации четыреххлористым углеродом до и после коррекции растительными маслами / М.А. Хильчук, Е.Е. Есауленко, И.М. Быков [электронный ресурс] // Современные проблемы науки и образования. - 2013. - №1; URL: http^/www.science-education.ra/107-8175 (дата обращения: 22.01.2013).

* - работа, опубликована в журнале, включенном Высшей аттестационной комиссией при Министерстве образования и науки Российской Федерации в Перечень ведущих рецензируемых научных журналов и изданий.

Список сокращений

АЛТ — аланинаминотрансфераза сод супероксиддисмутаза

ACT - аспартатаминотрансфераза ТАГ триацилглицерины

ЛП — липопротеиды ТБК тио барбитуровая кислота

у-ГТП гаммаглутамиламино-трансфераза ЩФ щелочная фосфатаза

ЛХАТ лецитинхолестеринацил-трансфераза ТБК-РП ТБК-реакгивные продукты

лпвп липопротеиды высокой ФХ фосфатидилхолин

плотности

ЛПНП липопротеиды низкой хс холестерин

плотности

ЛПОНП липопротеиды очень низкой эхе эфиры холестерина

плотности

НЭХС неэтерифицированный холестерин НЪ гемоглобин

ОХС общий холестерин

ПОЛ перекисное окисление

липидов

пнжк полиненасыщенные жирные кислоты

Хіільчук Максим Алексавдровпч

МЕТАБОЛИЧЕСКИЕ ИЗМЕНЕНИЯ ПРИ ТОКСИЧЕСКОМ ПОРАЖЕНИИ ПЕЧЕНИ И ВОЗМОЖНОСТИ ИХ КОРРЕКЦИИ

(экспериментальное исследование)

03.01.04 - биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Подписано в печать 24.01.2013г. Набор компьютерный. Гарнитура Times. Усл. П.л. 1,0

Тираж 100 экз. Отпечатано на копировально-множительной технике Типография ООО «редакция газеты «Всякая Всячина». 350020, г.Краснодар, ул.Бабушкина, 252, т. 259-41-59.

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата медицинских наук, Хильчук, Максим Александрович, Краснодар

Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Кубанский государственный медицинский университет»

Министерства здравоохранения Российской Федерации (ГБОУ ВПО КубГМУ Минздрава России)

МЕТАБОЛИЧЕСКИЕ ИЗМЕНЕНИЯ ПРИ ТОКСИЧЕСКОМ ПОРАЖЕНИИ ПЕЧЕНИ И ВОЗМОЖНОСТИ ИХ КОРРЕКЦИИ

(экспериментальное исследование)

НсЦ правах рукописи

ХИЛЬЧУК Максим Александрович

03.01.04 - биохимия

Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор

Быков Илья Михайлович

Краснодар - 2013

ОГЛАВЛЕНИЕ

Стр.

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ....................................................7

ВВЕДЕНИЕ.....................................................................................................................9

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. БИОХИМИЧЕСКИЕ МЕХАНИЗМЫ ТОКСИЧЕСКОГО ПОРАЖЕНИЯ ПЕЧЕНИ И МЕТОДЫ ЕГО ФАРМАКОЛОГИЧЕСКОЙ КОРРЕКЦИИ............................................................15

1.1. Общие представления о механизмах гепатотоксического действия химических веществ........................................................................................15

1.2. Характеристика физико-химических свойств четыреххлористого углерода. Механизм его гепатотоксичности. Влияние СС14 на протекание обменных процессов в организме............................................................................................24

1.3. Токсическое воздействие четыреххлористого углерода на другие органы пищеварительной системы.....................................................................................26

1.4. Гепатопротекторы в фармакотерапии заболеваний печени.........................28

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ, ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ В СОБСТВЕННЫХ ИСС Л ЕДОВ АНИЯХ...................................................................................................33

2.1. Характеристика экспериментальных животных...........................................33

2.2. Методика создания модели токсического поражения печени.....................34

2.2.1 Эвтаназия подопытных животных и забор биоматериала для биохимических и патоморфологических исследований......................................34

2.3. Патогистологическое исследование печени крыс.........................................34

2.4. Биохимические методы исследования...........................................................35

2.4.1. Определение концентрации общего и прямого билирубина в сыворотке крови методом Ендрассика-Грофа................................................35

2.4.2. Определение активности аланинаминотрансферазы (АЛТ) в сыворотке крови унифицированным методом Райтмана-Френкеля............35

2.4.3. Определение активности аспартатаминотрансферазы (ACT) в сыворотке крови унифицированным методом Райтмана-Френкеля............35

2.4.4. Определение активности у-глутамилтранспептидазы (у-ГТП) в

сыворотке крови унифицированным колориметрическим методом............36

2.4.5. Определение активности щелочной фосфатазы (ЩФ) в сыворотке крови унифицированным методом..................................................................36

2.4.6. Определение содержания общего белка в сыворотке крови...............37

2.4.7. Определение содержания альбумина в сыворотке крови...................37

2.4.8. Определение белковых фракций сыворотки крови турбидиметрическим методом Олла и Маккорда в модификации С.А. Карпюка..............................................................................................................37

2.4.9. Определение содержания общего холестерина (ОХС) в сыворотке крови энзиматическим колориметрическим методом...................................37

2.4.10. Определение содержания холестерина липопротеидов высокой плотности (ХС ЛПВП) в сыворотке крови энзиматическим колориметрическим методом...........................................................................38

2.4.11. Определение содержания триацилглицеринов в сыворотке крови энзиматическим колориметрическим методом..............................................38

2.4.12. Определение концентрации ХС ЛПОНП и ХС ЛПНП в сыворотке крови расчетным методом................................................................................39

2.4.13. Определение содержания эфиров холестерина (ЭХС) и неэтерифицированного холестерина (НЭХС) в сыворотке крови................39

2.4.14. Использование коэффициентов атерогенности для оценки патологии липидного обмена в условиях токсического поражения печени.................................................................................................................39

2.4.15. Определение содержания ТБК-реактивных продуктов (ТБК-РП) в сыворотке крови................................................................................................40

2.4.16. Определение активности супероксиддисмутазы (СОД) в гемолизате эритроцитов........................................................................................................40

2.4.17. Определение активности каталазы в гемолизате эритроцитов.........41

2.4.18. Определение содержания гемоглобина (НЬ) в гемолизате эритроцитов гемиглобинцианидным методом..........................................41

2.4.19. Методы определения активности пищеварительных ферментов в

гомогенатах слизистой оболочки желудка и ткани поджелудочной железы......................................................................................41

2.4.20. Определение активности пепсина в гомогенатах слизистой оболочки желудка экспресс - методом Н.П. Пятницкого..............................42

2.4.21. Определение активности трипсина в гомогенатах поджелудочной железы методом Эрлангера - Шатерникова...................................................42

2.4.22. Определение активности химотрипсина в гомогенатах поджелудочной железы....................................................................................42

2.5. Методы извлечения и изучения химических свойств липидов из продуктов растительного происхождения с предполагаемыми гепатопротективными свойствами...............................................................................................................43

2.5.1. Определение йодного числа в липидных экстрактах..........................43

2.5.2. Определение массовой доли неомыляемых липидов в экстрактах...........................................................................................................44

2.5.3. Определение жирнокислотного состава липидных экстрактов методом газожидкостной хроматографии (ГЖХ)..........................................44

2.6. Модельные системы перекисного окисления липидов, применяемые для оценки антиоксидантной активности исследуемых продуктов растительного происхождения в опытах in vitro...........................................................................45

2.6.1. Приготовление липосом.........................................................................45

2.6.2. Определение содержания ТБК-РП в суспензии липосом....................45

2.6.3. Оценка эффективности антиоксидантного действия исследуемых продуктов растительного происхождения......................................................46

2.7. Использование ферментативного липолиза in vitro для оценки метаболической доступности исследуемых продуктов растительного происхождения........................................................................................................47

2.8. Исследованные в модельных системах in vitro продукты растительного происхождения........................................................................................................49

2.9. Статистические методы исследования...........................................................50

3. ПАТОМОРФОЛОГИЧЕСКИЕ ИЗМЕНЕНИЯ ПЕЧЕНИ И БИОХИМИЧЕСКИЕ ПОКАЗАТЕЛИ КРОВИ ЛАБОРАТОРНЫХ ЖИВОТНЫХ ПРИ МОДЕЛИРОВАНИИ ТОКСИЧЕСКОГО ПОРАЖЕНИЯ ПЕЧЕНИ, ВЫЗВАННОГО ВВЕДЕНИЕМ ЧЕТЫРЕХХЛОРИСТОГО УГЛЕРОДА...................................................................................................................52

3.1. Морфологические изменения паренхимы печени, возникающие при введении лабораторным животным тетрахлорметана.........................................52

3.2. Маркеры нарушений функции печени и активности патологического процесса....................................................................................................................61

3.3. Интенсивность протекания процессов свободнорадикального окисления и состояние ферментов антирадикальной защиты крови при остром токсическом поражении печени, вызванном введением четыреххлористого углерода.........64

3.4. Особенности изменения параметров липидного обмена у лабораторных животных при остром токсическом поражении печени, вызванном введением четыреххлористого углерода.............................................................................67

3.5. Влияние интоксикации четыреххлористым углеродом на изменения параметров белкового обмена и активность пищеварительных ферментов в слизистой оболочке желудка и поджелудочной железе......................................71

4. ИССЛЕДОВАНИЕ ХИМИЧЕСКОГО СОСТАВА, АНТИОКСИДАН-ТНЫХ СВОЙСТВ И СПОСОБНОСТИ К ГИДРОЛИЗУ ПРОДУКТОВ РАСТИТЕЛЬНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ С ПРЕДПОЛАГАЕМЫМИ ГЕПАТОПРОТЕКТИВНЫМИ СВОЙСТВАМИ....................................76

4.1 Анализ химического состава продуктов растительного происхождения с предполагаемыми гепатопротективными свойствами........................................76

4.2 Изучение антиоксидантных свойств исследуемых продуктов растительного происхождения в опытах in vitro............................................................................83

4.3 Изучение способности исследуемых продуктов растительного происхождения гидролизоваться под действием липолитических ферментов пищеварительной системы......................................................................................87

5. КОРРЕКЦИЯ МЕТАБОЛИЧЕСКИХ НАРУШЕНИЙ, ВОЗНИКАЮЩИХ ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОМ ТОКСИЧЕСКОМ ПОРАЖЕНИИ ПЕЧЕНИ, С ПОМОЩЬЮ РАСТИТЕЛЬНЫХ МАСЕЛ И ПРЕПАРАТА ФОСФОГЛИВ..............................................................................................................90

5.1. Изменения морфологической картины паренхимы печени крыс под действием изучаемых продуктов...........................................................................90

5.2. Выраженность гепатопротективных свойств растительных масел и лекарственного препарата фосфоглив в условиях острого токсического поражения печени....................................................................................................92

5.3. Влияние исследуемых растительных масел и лекарственного препарата фосфоглив на интенсивность протекания процессов свободнорадикального окисления и состояние ферментов антирадикальной защиты крови при моделировании острого токсического поражения печени................................95

5.4. Влияние исследуемых растительных масел и лекарственного препарата фосфоглив на липидный обмен крыс в условиях острого токсического поражения печени..................................................................................................97

5.5. Влияние исследуемых растительных масел и лекарственного препарата фосфоглив на параметры белкового обмена и образование пищеварительных ферментов у крыс с моделью токсического поражения печени.......................101

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.........................................................................................................105

ВЫВОДЫ....................................................................................................................113

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.......................................................................................115

ПРИЛОЖЕНИЯ.........................................................................................................144

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ

АЛТ - аланинаминотрансфераза

АСТ - аспартатаминотрансфераза

АФК - активные формы кислорода

ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография

ВЭТСХ - высокоэффективная ТСХ

гжх - газожидкостная хроматография

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

дпк - двенадцатиперстная кишка

жкт - желудочно-кишечный тракт

КА - коэффициент атерогенности

КФ - кислая фосфатаза

лп - липопротеиды

лпвп - липопротеиды высокой плотности

лпнп - липопротеиды низкой плотности

лпонп - липопротеиды очень низкой плотности

ЛХАТ - лецитинхолестеринацилтрансфераза

МДА - малоновый диальдегид

мпо - миелопероксидаза

нэхс — неэтерифицированный холестерин

охс - общий холестерин

пвк - пировиноградная кислота

пнжк - полиненасыщенные жирные кислоты

пол - перекисное окисление липидов

сод - супероксиддисмутаза

СРО - свободнорадикальное окисление

ТАГ - триацилглицерины

ТБК - тиобарбитуровая кислота

ТБК-РП - ТБК-реактивные продукты

тех - тонкослойная хроматография

ФЛ - фосфолипиды

ХМ - хиломикроны

ХС - холестерин

ЩФ - щелочная фосфатаза

ЭФЛ - эссенциальные фосфолипиды

ЭХС - эфиры холестерина

СС14 — четыреххлористый углерод

НЬ - гемоглобин

8Н - сульфгидрильные (тиоловые) группы

у-ГТП - гаммаглутамиламинотрансфераза

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность исследования. В настоящее время заболевания, связанные с токсическими поражениями печени, занимают ведущее место среди патологий, вызывающих необратимые нарушения в функционировании всех систем организма. Это связано с тем, что печень является не только органом, в котором протекают центральные звенья обмена белков, липидов и углеводов, но и барьером на пути всех чужеродных веществ, попадающих в организм человека [А.Е.Вермель, 2005; С.А.Белякин и соавт., 2011; М.С.Ларькина и соавт., 2011; И.В.Калинин, Н.А.Петрук, 2011; С.В.Оковитый и соавт., 2012]. Изменение активности печеночных ферментов ведет к снижению детоксикационной функции печени. На этом фоне ряд веществ различной химической природы могут оказывать значительное воздействие на печень и другие органы (например, поджелудочную железу), приводящее к формированию их токсического поражения [Э.Ф.Аглетдинов, А.А.Никоноров, Ф.Х.Камилов, 2009]. В связи с этим проблема изучения молекулярных механизмов регуляции функциональной активности печени и ее метаболической адаптации к воздействию токсических агентов остается важным направлением современной экспериментальной и клинической гепатологии [С.А.Белякин, А.Н.Бобров, С.В.Плюснин, 2011].

В настоящее время для лечения токсических поражений печени широко используются средства растительного происхождения [В.М.Покровский, О.Г.Компаниец, 2008; Л.В.Кравченко и соавт., 2008; М.С.Николаев и соавт., 2012]. Особое место в профилактике и лечении гепатитов занимает использование фосфолипидных концентратов и растительных масел, обогащенных ненасыщенными жирными кислотами и жирорастворимыми витаминами [.Ш.Вгошпи^, Ь.Б^сгерашак, Л.ОоЬЫпэ, 2004; Л.Б.Стрелкова и соавт., 2008; Е.А.Сухосырова, З.К.Никитина, М.Б.Яковлева, 2008; И.В.Шилова и соавт., 2008; В.В.Амосов и соавт., 2009].

Наиболее широкое распространение среди препаратов с гепатопротективными свойствами получили эссенциальные фосфолипиды (ЭФЛ). Механизм их защитного действия связан с восстановлением клеточных мембран

гепатоцитов. Помимо структурной функции, ЭФЛ участвуют в процессах молекулярного транспорта, делении и дифференцировке клетки, стимулируют активность различных ферментных систем, обладают антиоксидантным действием, замедляют синтез коллагена и повышают активность коллагеназы, что лежит в основе их антифибротического эффекта [О.И.Киселев и соавт., 2006; Н.И.Гейвандова и соавт., 2008; С.С.Соколовская и соавт., 2008; Э.П. Яковенко и соавт., 2011].

Особый интерес представляют гепатопротекторы, получаемые на основе растительного сырья и морских организмов, многие из которых богаты полиненасыщенными жирными кислотами (ПНЖК), которые необходимы для поддержания жидкостности клеточных мембран, участвуют в адаптации организма к окружающей среде, являются эссенциальными факторами пищи животных и человека, обладают разнообразной биологической активностью [\У.\¥.Коо, 2003; \y.Harris, С.уоп БсЬаску, 2004; Б.Н.СаМшеН, С.К.А^о, А.М.А1-08а1гш, 2006; Е.А.Абизов, О.Н.Толкачев, 2008; А.В.Самойлова и соавт., 2008; В.В.Цуканов и соавт., 2008; В.М.Махов, 2012].

В литературе описаны механизмы действия ПНЖК семейства оо-З, содержащихся в рыбьем жире (эйкозапентаеновая, докозапентаеновая, докозагексаеновая кислоты), на липидный обмен человека и животных. Большинство авторов пришли к выводу, что регулярный прием рыбьего жира вызывает торможение синтеза триацилглицеринов (ТАГ) в печени, активацию окисления жирных кислот в тканях, снижение уровня холестерина, нормализацию обмена липопротеиновых частиц крови, а также торможение образования свободных радикалов и активных форм кислорода [А.А1Ьеги, Ы.Оитеек, Б.СоШпб, 2005; Н.В.Перова и соавт., 2007; Е.А.Абизов, О.Н.Толкачев, 2008; Ю.В.Перевалова, П.И.Цапок, 2008].

В современной литературе обсуждаются эффекты как широко известных препаратов на основе фосфолипидов и триацилглицеринов (эссенциале, фосфоглив, эссливер, омакор), так и менее известных природных продуктов (льняное масло, пальмовое масло), содержащих в своем составе ПНЖК,

жирорастворимые витамины и другие соединения, нормализующие метаболические процессы в печени и восстанавливающие целостность мембран гепатоцитов [Ж.Б.Дашинамжилов и соавт., 2008; С.Н.Жаров, Б.И.Санин, 2009].

Однако, как известные соединения, широко применяющиеся в настоящее время в медицине, так и менее распространенные на российском рынке препараты, изучены не в полной мере. В этой связи представляется актуальным исследование по уточнению биохимических механизмов, лежащих в основе токсического поражения печени веществами различной химической природы, а также поиск и изучение механизма действия новых, наиболее эффективных гепатопротекторов, с выраженными гиполипидемическими, антиоксидантными свойствами.

Цель исследования: изучить особенности изменения липидного и белкового спектров крови, активности пищеварительных протеиназ при токсическом поражении печени у лабораторных животных и разработать возможные пути их коррекции.

В связи с поставленной целью необходимо решить следующие задачи:

1. Дать биохимическую характеристику выраженности цитолитического синдрома, а также патологии белкового и липидного обменов, изменения активности пищеварительных протеиназ, возникающих у экспериментальных животных (крыс) при создании токсического поражения печени, вызванного воздействием четыреххлористого углерода.

2. Провести сравнительное изучение химического состава и физико-химических свойств, различных липо�