Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Сфинголипиды нормальной и опухолевой ткани яичника человека

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата химических наук, Рылова, Светлана Николаевна, Москва

/

С-

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ имени М.М.ШЕМЯКИНА и Ю.А.ОВЧИННИКОВА

на правах рукописи

РЫЛОВА Светлана Николаевна

СФИНГОЛИПИДЫ НОРМАЛЬНОЙ И ОПУХОЛЕВОЙ ТКАНИ ЯИЧНИКА ЧЕЛОВЕКА

Специальность 03.00.04. - биохимия

Диссертация на соискание ученой степени кандидата химических наук

Научный руководитель -доктор химических наук проф. Э.В.ДЯТЛОВИЦКАЯ

Москва -1998

Оглавление:

Список сокращений...............................................................4

ВВЕДЕНИЕ...........................................................................5

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. "Биосинтез, структура и функции церамидов."

Глава 1. Структура церамидов..................................................9

Глава 2. Биосинтез церамидов..................................................10

Глава 3. Сфингомиелиновый цикл............................................15

Глава 4. Биологические функции церамидов.............................18

4.1. Роль церамидов в супрессии роста клеток.

4.1.1. Индукция клеточной дифференцировки...........................19

4.1.2. Ингибирование роста клеток..........................................21

4.1.3. Торможение клеточного цикла.......................................24

4.1.4. Активация ЯЬ-белка - супрессора ракового роста................25

4.1.5. Подавление протоонкогена с-тус....................................28

4.1.6. Дряхление клеток.........................................................29

4.2. Роль церамидов в индукции апоптоза..................................31

4.3. Роль церамидов в иммунном ответе....................................38

4.3.1. Образование цитокинов.................................................38

4.3.2. Генерация эйкозаноидов................................................39

4.3.3. Активация фактора ОТ-кВ.............................................39

4.4. Зависимость биологического эффекта церамидов

от их структуры.............................................................. .42

4.5. Роль внутриклеточной локализации образования

церамидов в их биологических эффектах..................................46

4.6. Роль церамидов в координации клеточных

ответов на стресс.............................................................49

4.7. Церамиды - супрессоры опухолей.....................................51

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Глава 5. Содержание церамидов и ганглиозидов в опухолях яичника человека и сыворотке крови пациентов-

опухоленосителей................................................54

5.1. Содержание ганглиозидов в опухолях...............................55

5.2. Содержание церамидов и молярное отношение

церамиды : ганглиозиды в опухолях.......................................57

5.3. Содержание ганглиозидов в сыворотке крови пациентов-опухоленосителей..............................................................58

5.4. Содержание церамидов и молярные отношения церамиды : ганглиозиды в сыворотке крови

пациентов-опухоленосителей..............................................60

5.5. Заключение................................................................61

Глава 6. Структура церамидов и сфингомиелинов

опухолей яичника человека..............................................64

6.1. Жирные кислоты...........................................................66

6.2. Сфингоидные основания.................................................70

6.3. Заключение..................................................................73

Глава 7. Антипролиферативная активность церамидов

опухолей яичника человека..........................................76

Заключение..............................................................................82

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ............................................84

ВЫВОДЫ................................................................................99

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.........................................................101

Сокращения

ДАТ - диацилглицерин ПКС - протеинкиназа С Сег - церамид

Сг-Сег - Ы-ацетил-сфингенин

Сб-Сег - Ы-гексаноил-сфингенин

Сз-Сег - 1М-октаноил-сфингенин

САРР - церамид-активируемая протеинфосфатаза 2А

1Ш-у - интерферон-у

РАЛР - (поли-АДФ-рибоза) полимераза

РБМР - 1-фенил-2-деканоиламино-3-морфолино-1-пропанол

БМ - сфингомиелин

ЮТ-а - фактор некроза опухолей-а

Введение

В последние два десятилетия большое внимание исследователей привлекают сфинголипиды, которые являются обязательными компонентами мембран всех эукариот. Многолетними исследованиями установлено, что они участвуют в рецепции гормонов, токсинов, факторов роста, являются клеточными антигенами и иммуномодуляторами [1-4].

Показано также, что при малигнизации клеток происходят нарушения биосинтеза и катаболизма сфинголипидов, в результате чего изменяется их состав и содержание [1, 3, 5, 6]. При изучении изменений, происходящих в составе и структуре сфинголипидов при злокачественном росте, основное внимание было обращено на углеводную цепь гликосфинголипидов, в то время как церамиды - липидная основа всех сфинголипидов - явно игнорировались. Между тем в 1989 году было открыто существование ранее неизвестного пути сигнальной трансдукции - "сфингомиелинового цикла", в котором церамиды являются вторичными мессенджерами и участвуют в проведении сигналов различных внешних агентов внутрь клетки [7]. В настоящее время имеется большое количество обзоров, рассматривающих участие церамидов в регуляции различных клеточных процессов [8-21].Установлено, что церамиды обладают антипролиферативной активностью, стимулируют апоптоз, способствуют дифференцировке, участвуют в иммунном ответе.

На основе этого было высказано предположение, что церамиды являются супрессорами опухолевого роста [14]. При этом было обнаружено, что супрессорная активность церамидов зависит от структуры сфингоидного основания, входящего в их состав. Указанные биологические эффекты оказывали только церамиды, содержащие Б-эритро-сфингенин, в котором имеется транс-4,5-двойная связь. Дигидроцерамиды, содержащие сфинганин, в котором отсутствует двойная связь, были неактивны [14].

В то же время показано, что сложные сфинголипиды - ганглиозиды -угнетают бласттрансформацию Т- и В-лимфоцитов и цитотоксическую активность естественных киллеров, способны связывать лимфокины, образуя неактивные комплексы. В результате этого ганглиозиды угнетают противоопухолевый иммунитет и способствуют развитию опухолевого процесса [1-4].

Таким образом можно предположить, что в организме существует определенное равновесие, по крайней мере между двумя типами сфинголипидов, церамидами и ганглиозидами, оказывающими противоположное влияние на опухолевый процесс. Сдвиг равновесия в сторону ганглиозидов может способствовать развитию опухолей.

К началу настоящей работы о ганглиозидах опухолей было известно достаточно много, в то время как о церамидах опухолей данные практически отсутствовали. Поэтому представляло интерес выяснить:

1) как изменяется содержание и структура церамидов в опухолевых тканях по сравнению с нормой;

2) как изменяется содержание и состав ганглиозидов в этих же опухолях;

3) имеются ли различия в антипролиферативной активности церамидов, выделенных из опухолей и гомологичной нормальной ткани.

С этой целью в настоящей работе проведено сравнительное изучение сфинголипидов доброкачественных и злокачественных эпителиальных опухолей и нормального яичника человека. Поскольку известно, что опухолевые клетки "сбрасывают" во внеклеточную среду (и в кровоток) мембранные фрагменты, в том числе ганглиозиды, было изучено содержание церамидов и ганглиозидов в крови пациентов с указанными опухолями по сравнению с кровью здоровых доноров.

В ходе проделанной работы было установлено, что в опухолях (по сравнению с нормой) понижается содержание церамидов, изменяется их строение (появляется значительное количество дигидроцерамидов), изменяется состав и содержание ганглиозидов, результатом чего является сдвиг молярного отношения церамиды/ганглиозиды в сторону ганглиозидов. Помимо этого было обнаружено, что "опухолевые" церамиды обладают более низкой антипролиферативной активностью, чем "нормальные". Совокупность полученных данных свидетельствует о том, что в изученных опухолях происходят такие изменения сфинголипидов, которые могут способствовать развитию опухолевого процесса.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. "Биосинтез, структура и функции церамидов"

Глава 1. Структура церамидов.

Церамиды являются наиболее простыми представителями класса сфинголипидов. Их молекула состоит из длинноцепочечного сфингоидного основания (аминоспирта) и жирной кислоты, которая присоединяется к аминогруппе основания. В церамидах млекопитающих преобладают аминоспирты, содержащие 18 углеродных атомов в цепи. Наиболее распространенным сфингоидом является сфингенин (сфингозин). Его молекула содержит гидроксильные группы в 1-м и 3-м положениях, аминогруппу во 2-м

положении и транс-4,5-двойную связь (рис.1). В качестве минорного компонента встречается сфинганин, в молекуле которого отсутствует транс-4,5-двойная связь. В связи с этим, №ацил-сфингенин обычно называют церамидом,

О-эритро-церамид

ОН

о

Р-эритро-дигидроцерамид

о

рис.1. Структура церамида и дигидроцерамида

а N-ацил-сфинганин - дигидроцерамидом [8, 22-25].

Молекула сфингенина имеет два ассиметричных углеродных атома (в положении 2 и 3) и поэтому может существовать в четырех стереоизомерных формах, различающихся пространственным расположением функциональных групп: D-эритро и -трео, L-эритро и -трео. В природных соединениях присутствует только D-эритро-изомер.

Жирные кислоты церамидов (обычно мононенасыщенные или насыщенные) включают от 16 до 24 атомов углерода. В церамидах млекопитающих преобладают пальмитиновая (С16:0), стеариновая (С18:0), олеиновая (С18:1), нервоновая (С24:1), и лигноцериновая (С24:0) жирные кислоты. В церамидах кожи присутствует большое количество гидроксикислот.

Глава 2. Биосинтез церамидов.

Биосинтез церамидов de novo протекает в эндоплазматическом ретикулуме и начинается с конденсации серина и ацильного производного коэнзима-А, причем образуется 3-кетосфинганин (рис.2). Реакцию катализирует пиридоксаль-5-фосфат - зависимый фермент, серин-пальмитоил-трансфераза или 3-кето-сфинганин синтаза, локализующийся на цитозольной поверхности эндоплазматического ретикулума [26, 27]. Этот фермент обладает высокой специфичностью к пальмитоил-КоА, что объясняет преобладание Cig-сфингоидов в сфинголипидах млекопитающих [22]. Данная реакция является

лимитирующей и контролирует скорость биосинтеза сфинголипидов [28]. Затем 3-кетосфинганин быстро восстанавливается до сфинганина под действием NADFH-зависимой редуктазы. Активность этого фермента намного выше по сравнению с первым, поскольку 3-кетосфинганин не выявляется в интактных клетках [29].Далее сфинганин ацилируется с образованием N-ацил-сфинганина (дигидроцерамида). Реакцию катализирует сфинганин-Ы-ацилтрансфераза или церамид синтаза, которая не оказывает предпочтение сфингенину или сфинганину [23]. Фермент локализуется на цитозольной поверхности эндоплазматического ретикулума и сильно ингибируется грибным токсином -фумонизином [26, 30-32].

Долгое время оставалось неясным, в какой момент биосинтеза происходит введение транс-4,5-двойной связи в молекулу: на стадии сфинганина или после его ацилирования? В ряде экспериментов было показано, что при блокировании N-ацилтрансфераз фумонизином происходило накопление сфинганина, но не сфингенина [33]. В присутствии фумонизина церамиды образовывались только в случае введения N-ацил-сфинганина, но не сфинганина [34]. Полученные данные свидетельствуют, что введение транс-4,5-двойной связи в молекулу церамида происходит после образования N-ацилсфинганина. В связи с этим исключается возможность образования сфингенина в качестве интермедиата при биосинтезе церамидов de novo, т.е. он является продуктом катаболизма

ацил-КоА

серии

К-С-в-СоА + Н00С-СН-СН20Н и , |

0 I NN2

Я -С - СН-СН 2ОН + С02

О NN2 ИАЦфИ

[Ч-СН - СН-СНгОН ОН

щил-КоА

К-СН - СН-СН2ОН

Ан ЫН

и к"

- 2Н

г

[Ч-СН=СН-СН - СН-СНгОН

Ан '

3-кетосфинганин

сфинганин (дигидро-сфингозин)

1Ч-ацилсфинганин (дигидроцерамид)

О II

жк^'

1Ч-СН=£Н-СН - СН-СНг-О-^-О"

Ан ын ^

?Н2

СН2 + 1

Ы(СНз) з

А.

ин с=о

А-

церамид

"

\ нейтральные гликосфинголипиды

ЖК ^

сфингомиелин

К-СН^Н-СН - СН-СНгОН

Ан ЫНг

сфингозин

ганглиозиды сульфатиды

Рис. 2. Метаболизм сфинголипидов. ФХ - фосфатидилхолин; ДАТ -

диацилглицерин; ЖК - жирная кислота.

церамидов. Фермент, катализирующий реакцию введения двойной связи, на данный момент мало изучен. Первоначально считали, что им является дигидроцерамид дегидрогеназа, но недавние исследования показали, что для активности ферменту необходимы NADFH, молекулярный кислород и цитохром b 5. Это указывает на его принадлежность к десатуразам [35, 36]. Дальнейшее изучение дегидроцерамид десатуразы представляет большой интерес, поскольку как недавно выяснилось, двойная связь играет решающую роль в биологической активности церамидов [13].

В целом синтез церамидов in vivo протекает очень быстро, поскольку свободные длинноцепочечные основания не обнаруживаются как интермедиаторы биосинтеза. Это биологически оправдано в связи с тем, что сфингоиды являются биоэффекторами и способны ингибировать протеинкиназу С [27, 37].

Синтезированный de novo церамид служит основой для синтеза всего многообразия сложных сфинголипидов (рис. 2). В случае присоединения фосфохолина вС-1 положении церамида образуется сфингомиелин, причем было установлено, что донором фосфохолиновой группы является фосфатидилхолин [28, 38, 39]. Реакцию катализирует фосфатидилхолин: церамид-холин-фосфотрансфераза или сфингомиелин синтаза. Поскольку в результате реакции высвобождается диацилглицерин, фермент одновременно регулирует уровень церамидов и ДАГ, осуществляя связь метаболизма

сфинголипидов с фосфоинозитидным путем сигнальной трансдукции. Однако пока неизвестно, использует ли клетка эту взаимосвязь в регуляторных целях [28]. Почти 90 % синтеза сфингомиелина de novo в печени происходит в аппарате Гольджи [40-43]. Кроме этого, небольшая сфингомиелинсинтазная активность обнаружена в плазматической мембране [44]. Это предполагает существование отдельного пула SM. Высказываются предположения о возможной роли этого пула в сигнальной трансдукции [45].

Присоединение в С-1 положении одного и более углеводных остатков приводит к образованию более 300 различных гликосфинголипидов. Синтез гликосфинголипидов осуществляется, как правило, путем прямого переноса углеводных остатков с УДФ-производных Сахаров специфическими гликозилтрансферазами. Реакции протекают на цитозольной поверхности эндоплазматического ретикулума и в аппарате Гольджи [28].

Церамид также является центральной молекулой катаболизма сфинголипидов. Они образуются в результате поэтапного отщепления Сахаров от гликосфинголипидов или после гидролиза SM под действием сфингомиелиназ. При этом имеются данные о необходимости участия белков-активаторов сфинголипидов в процессах катаболизма. Отсутствие или низкая активность тех или иных ферментов катаболизма сложных сфинголипидов, приводит к различным сфинголипидозам - заболеваниям, связанным с накоплением соответствующих сфинголипидов в клеточных лизосомах [28].

Образующиеся церамиды далее могут подвергаться деградации, т.е. деацилироваться под действием церамидаз. Образующийся при этом сфингенин может либо вновь участвовать в образовании церамидов, либо фосфорилироваться или подвергаться дальнейшей деградации. Кроме этого, было обнаружено, что церамиды, образующиеся при гидролизе БМ, но не гликосфинголипидов, могут фосфорилироваться вС-1 положении в плазматических мембранах [46, 47] и синаптических везикулах [48] с помощью кальций-зависимой церамидкиназы.

Таким образом, можно сделать вывод, что церамид является центральной молекулой метаболизма сфинголипидов аналогично диацилглицерину в метаболизме глицеролипидов.

Глава 3. Сфингомиелиновый цикл.

Долгое время фосфолипиды рассматривались лишь как структурные компоненты клеточных мембран. Большим шагом в переоценке их биологической роли стало открытие в 70-х годах фосфоинозитидного пути передачи сигнала, в котором вторичными посредниками служили продукты гидролиза мембранных фосфолипидов - диацилглицерин и инозит-1,4,5-фосфат [49, 50]. Позже, в 1986 году было открыто ингибирование протеинкиназы С (установленной мишени ДАТ) сфингозином, который является продуктом катаболизма мембранных сфинголипидов [51]. Это позволило предположить,

что сфинголипиды, подобно глицерофосфолипидам, могут служить предшественниками активных метаболитов, участвующих в регуляции клеточных процессов. Для проверки этой гипотезы изучили уровень SM в промиелоцитных лейкемических клетках человека HL-60 после обработки их 1-а,25-дигидроксивитамином D3 - индуктором дифференцировки по моноцитному пути. В результате был установлен гидролиз SM с максимумом через 2 ч и накопление церамидов. Параллельно в клетках наблюдалось 2-х кратное увеличение активности нейтральной сфингомиелиназы с максимумом через 2 ч после обработки. Через 4 ч уровень сфингомиелина и церамидов в клетке возвращался к исходному [7].

Полученные данные легли в основу гипотезы о существовании сфингомиелинового цикла - нового пути передачи сигнала с помощью липидных вторичных мессенджеров. Суть гипотезы заключается в том, что внеклеточные агенты, связываясь со своими рецепторами на поверхности мембран, акт