Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Образование, секреция и экстрацеллюлярная деградация кофермента А у актиномицета Streptomyces lavendulae

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Образование, секреция и экстрацеллюлярная деградация кофермента А у актиномицета Streptomyces lavendulae"

академия наук белорусской сср

институт микробиологии

На правах рукописи

ЗЕЛТИНЬШ Андрис Арнолдович

удк 576.852.1

ОБРАЗОВАНИЕ, СЕКРЕЦИЯ И ЭКСТРАЦЕЛЛЮЛЯРНАЯ ДЕГРАДАЦИЯ КОФЕРМЕНТА А У АКТИНОМИЦЕТА БТРЕРТОМУСЕБ LAVENDULAE

03.00.07 — микробиология

Автореферат

Диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

минск — 1990

Работа выполнена в лаборатории генетики и физиологии микроорганизмов Института микробиологии им. А. Кирхенштейна Латвийской Академии наук.

Научные руководители:

кандидат биологических наук Д. Я. ПАВЛОВИЧА доктор химичгских наук Я. Я. ДРЕГЕРИС

Официальные оппоненты:

Ведущая организация:

-доктор биологических наук, старший научный сотрудник ' Н. И. АСТАПОВИЧ

доктор биологических наук, старший научный сотрудник В. М. МАЖУЛЬ

Институт биохимии АН БССР

Защита состоится « ^_» С&'Ср1930 г. в 14.30 на заседании

специализированного совета К 006.09.01 по присуждению степени кандидата биологических наук в Институте микробиологии АН БССР по адресу: 220733, г. Минск, Академгородок, ул. Жодинская, 2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института микробиологии АН БССР.

Автореферат разослан _»_Ш-у^-СР"®-—• 1 ддд г.

Ученый секретарь ^¡1 /О—,/----НГ В. ОБРАЗЦОВА

спецализированного совета кандидат биол. наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность тены. Получение биологически активных веществ путем культивирования микроорганизмов является одной из фундаментальных проблем современной биотехнологии, поиск альтернативных способов биосинтеза биотехнологической продукции путем скрининга, селекции и оптимизации условий на основе изучения метаболизма у потенциально активных продуцентов обеспечивает непрерывный прогресс в этой области.

Сказанное в полной мере относится и к биотехнологическому получению коФермента А (СоА) - метаболита, имеющего исключительное значение в метаболизме любой-живой клетки /Мойсеенок и др. 1989/. Среди изученных микроорганизмов, способных к сверхсинтезу Coa. наиболее активными оказались представители . рода Brevibacter¡um,' способные осуществлять трансформацию предшественников (АТР. пантотената, цистеина) в coa /sti¡m¡zu, Yamada, 1986/. Однако, в мировой практике нередко используют дешевые источники с низким содержанием СоА (например, биомассу дрожжей), что указывает на выгоду использования дешевых источников, несмотря на относительно низкий выход коФермента.

О стрептомицетах как потенциальных источниках получения СоА уже имеется некоторая информация - биомасса их использована для его выделения /ое vnes et ai., i95t/, кроме того, известны противоречивые данные, с одной стороны, не исключавшие возможность секреции коФермента при глубинном культивировании, с другой - .отрицающие выделение СоА из клеток. Прояснение спорных здесь вопросов представляет интерес не только с точки зрения биотехнологической практики. Исследование возможности секреции Coa также важно для более подробного выяснения роли стрептомицетов в естественных условиях при Формировании биоценоза и. в частности, их потенциальных способностей в стимулировании роста растений /Павловича, 1976/. Кроме того, учитывая новейшую информацию об альтернативных путях регуляции метаболизма СоА /vallan, JacKowsKi, 19ва/ у микроорганизмов, стреп-томицеты, секретируюшие СоА, могут быть использованы в качестве объектов для изучения этой проблемы.

В этой связи целью данной работы был поиск среди актиноми-

цетов рода streptomyces активных представителей, способных секретировать coa из клеток при глубинном выращивании, и исследование процесса образования и секреции кофермента у штам-на. накапливаюшего кофернент в среде культивирования.

Достижение поставленной пели требовало решения следующих экспериментальных задач:

.- скрининг представителей рода streptomyces по способности накапливать СоА в среде культивирования,

- выявление условий культивирования, способствующих накоплена кофермента,

- исследование взаимосвязи внутриклеточного пула Coa с его секрецией, '

- контроль стабильности секретированного Coa,

- исследование активности СоА-синтезирушего ферментного комплекса, с применением предшественников биосинтеза,

-• изучение возможностей изотахофоретического метода анализа Coa применительно к контролю биосинтеза кофермента. научная норизва.п.,прак.ткишюе..значение..раОота-

Впервые показано, что микроорганизмы рода streptomyce» накапливают вне клеток кофермент А, найден оригинальный продуцент, активно выделяющий СоА в среду культивирования - streptomyces iavenduiae, что подтверждено авторским свидетельством No. 1117318.

выделение coa из клеток стимулируют глицерин и нитрат-, секреция связана с активным ростом s. lavenduiae. Выявлена существенная роль фосфата в накоплении кофермента - лимитирование по фосфору в среде культивирования существенно повышает активность внеклеточной щелочной ФосФатазы, которая является одним из агентов, участвующих в деградации секретированного Coa. Количество Coa, обнаруживаемое вне клеток, отражает разницу между активностями секреции и внеклеточной'деградации; Фактические количества секретированного СоА у s. lavenduiae существенно выае.

Показана возможность биосинтеза СоА из предшественников (АТР, пантотената, анстеина) у Streptomyces Iavenduiае при использовании- высушенных клеток в качестве Ферментного препарата, синтезирующего кофермент.

Разработан новый метод определения Соа, основанный на принципах изотахоФоретического анализа.

Совокупность' полученных данных указывает на возможность дальнейшей селекции стрептомииетов - продуцентов соа путем снижения деградативных активностей и стимуляции биосинтеза-

Апробация работа. Результаты исследований доложены на iv ■ Всесоюзной межуниверситетской конференции "Биология клетки" (ТбИЛИСИ. 1985), III (КОбУЛеТИ, 1986) и IV (Ташкент, 1988) Всесоюзных конференциях "Биосинтез Ферментов микроорганизмами", xiv международном съезде микробиологов "Microbe '86" (Манчестер, Англия, 1966), и семинаре микробиологов Геттин-гена и Риги (Геттинген, ФРГ, 1989), а-также на нескольких конференциях молодых ученых (Рига, 1984, 1985, 1987).

Публикации. Основные материалы диссертации опубликованы в 8 печатных работах, из которых 1 авторское свидетельство, з журнальные статьи и i тезиса докладов конференций.

Структура и объем диссертации, диссертация состоит из введения, обзора литературы (Глава 1). материалов и методов (Глава г), результатов исследований (Глава 3), обсуждения результатов (Глава 4), выводов, списка использованной литературы и приложения- Работа содержит 125 страниц машинописного текста, " включая 17 рисунков и 12 таблиц. Список литературы включает' 179 источников.

■ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Поддержание стептомипетов осуществляли на косяках со средой CP• (красильников, 1950) при +ч°с до полугода.

тивннх представителей streptomyces, секретирующих Соа, и условий культивирования использовали среду следующего состава (в 1 л): крахмал (или другой источник) - го г, NaNo3 • 4,о г. ка-о,5 г, кгнро^ зиго - i,o г, Mgsov 7нго - о, 5 г, рн 7,о. внра-шивание проводили на качзлке и во мин-и в колбах при герцах определяли после центрифугирования и доведения рН до 7, о. Внутриклеточный пул СоА анализировали после Фракционирования и

гидролиза связанных Форм Coa /Тиььз, Garland, 1969/.

Пантотеновую кислоту (РаА) вне клеток анализировали после нейтрализации и 15 мин выдерживания образцов при 95°с; внутриклеточный пантотенат освобождали 15 мин выдерживанием мицелия при 950с /Андреюк. коган, 1967/, связанные <ьорни витамина расщепляли до пайтотената "Ферментом Липмана" /Novell i et at., 1949/ и щелочной ФосФатаз-ой по методу Nakamura et al. /1967/. .

Энзиматическое определение СоА проеодили на регистрирующем спектрофотометре весктап ои-6 методом "энзиматичзского цикла" /а11 red, Guy, 1969/ и модифицированным методом адилирования сульфоаминоазобензола (СААБ) /Шольц, Дризовская, 1966/, контролируя ход ачилирования регистрацией экстинкций при 337 нм.

Анализ пантотеновой кислоты проводили микробиологическим способом, используя тест-культуру пантотенатзависимых дрожжей

Saccnaromycodes ludwigii -1-1167, /ОДИНЦОВЗ, 1959/.

Измерение внутриклеточного объема. Измерение внутриклеточного объема проводили по методике stock et at./1977/ с применением ис-гидроксиметилинулина и 3НгО- Данные использовали для расчетов внутриклеточных концентраций метаболитов.

Анализ Coa методом капиллярного изотахоФореза (ИТф) проводили на аппарате "ИзотахоФор", созданного на Химическом Факультете Латвийского университета- Пригодность каждой из систем (табл. i.) для анализа СоА оценивали по возможности образования отдельной зоны. при изотахоФоретическом разделении, используя стандартный раствор СоА- возможность одновременного анализа других метаболитов (ATP, AMP. РаА, . систеин) проверяли в системе электролитов no. г. (табл. 4.), в качестве внутреннего стандарта использовали океалат.

Биосинтез Coa из предшественников, поиск условий, стимулирующих биосинтез, проводили, используя высушенный ацетоном (-15°с) минелий s. lavenduiae в качестве Ферментного препарата! синтезирующего СоА: мицелий гомогенизировали в инкубационной смеси (АТР - зо мкмоль, пантотенат Са - з, 75 мкмоль, t-пистеия - 7, 5 мкмоль, додецилсульфат Na - 7, 6 мкмоль, MgS<V 7HgO - 7, 5 мкмоль, dtt - 7,5 мкмоль в i мл о, i м Trie/ней и инкубировали 12 ч при рН 7,0 и зоОс, варьируя соответствующий параметр.

Контроль деградации СоА в среде культивирования, к отобра-

яным пробам культуральной среды добавляли coa и деФосфо-соА «jp-coA) до конечной концентрации го мкг/кл, и образны инкубировали в зависимости от эксперимента 15, *5, 90 или 360 мин. После инкубации образцы разбавляли (i:to) и немедленно проводили анализ на содержание СоА и йр-соа методами "энзкматичес-кого цикла" и апилироваяия СААБ., активность деградации выраже-' на в нмолях расщепленного СоА «Jp-coaj/мл в мин-

Ошгедашие' активности внеклеточной ЖФатазы проводили непосредственно в внеклеточных образцах добавляя п-шш>оФенил-ФосФат по методике Torriал i /1966/. активность фосфатазы выражали в нмолях/мл образовавшегося п-нитгоФенола в мин.

¡ШШ ШШ Содержание белка определяли модифицированные . /Larson et al;, 1986/ методом ЯоУРИ.

определение количества биомассы в ходе культивирования осуществляли гравиметрически после высушивания при Ю5°с.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИИ i. Поиск продуцентов соа среди стрептомицетов

, Способность актиномицетов рода streptomyces накапливать СоА в. среде культивирования проверяли на минеральной среде с гх крахмала, используя состав питательных веществ для выращивания стрептомицетов. стимулировавший секрецию витаминов /Павловича, - 19Í8/.- в.сего было проверено то представителей рода streptomyces из 10 таксономических групп. Анализ содержания СоА осуществляли методом ацшгарования СААБ, в котором кроме Coa реагируют dp-CoA и фосфопантетеин d'-p-PaSH).

Уровень СоА (или его предшественников) после 96 ч культивирования в среде у различных стрептомицетов сильно отличается (табл. 1.) - от о, о до 12, ? мкг/мл, при этом среди то культур рода streptomyces <и представителя накапливают СоА или его предшественники' вне клеток в количестве более чем о, 5 мкг/мл (при анализе упомянутым методом) • Если принять этот уровень активности за точку отсчета, то способностью секреции обладают бг,аи проверенных культур, наиболее активнын в этон отношении оказался streptomyces lavenflulae 3/2000 (до 12,9 нкг СоА/мл).

Таблица 1.

Накопление соА з среде культивирования у культур рода бггерготусеэ

Таксономическая группа ЧИСЛО КУЛЬТУ? секпетируют Соа»

Cfiromogenes 5 <

Flevus з ■ •' г .

Fradiae г . 1

Giaur.'js l 1

Giobisporus ' н И

Griseus б s ■

Lavendulae 20«» 14

Rubro-Aurantiacus . 2 о

Viclaceus 7 1

Viridis 10 6

70 (62, вх)

Streptomyces lavendulae 3/2000 12,9 МКГ/МЛ

Примечания: » - [Сол) > о,5 мкг/мл; «« - 17 культур получено от проф. Кузнецова (ИИБ АН СССР)

Для отбора наиболее активных клонов е. 1 ауепс>ц>ае в отношении накопления СоА в среде культивирования после изолирования клонов полученные, культуры также проверяли на способность накапливать СоА в среде культивирования (анализ СоА проводили специфичным методом "энзиматического цикла"), среди 63 проверенных клонов большинство (16) в среде культивирования накапливают от о, го до о, »о мкг/мл, активность исходного штамма (о, м мкг/мл) также находится в этих пределах, существенная разница между результатами, полученными обоими методами (0,31 и 12,9 мкг/мл для исходной культуры) указывает на присутствие в среде значительных количеств предшественников Соа. Для дальнейшей работы нами была избрана культура гопугез 1ауепс1и1ае 2000/22. в среде КУЛЬТИВИРОВаНИЯ КОТОРОГО

концентрация СоА достигает о, «з мкг/мл.

г, влияние условий культивирования на накопление Coa у Strcptomyces iavendulae

Для дальнейшего изучения процесса секреции у отобранного стрептонииета s. iavendulae было необходимо выявить другие ис-источники питания, стимулирующие накопление coa вне клеток. Источники углерода добавляли до гх, источники азота - эквимо-

Таблица г.

Влияние различных источников углерода и азота на образование биомассы и накопление coa у Streptomyces Iavendulae 2000/22

. Источник Источник азота

углерода

NaN03 (0, 4 У.) NH^NOj (0,2 ; !)

1с л!

СБ COA СБ ■ COA

г/л РН цкг/мл г/л РН мкг/мл

глюкоза 5,21 в, 6 о, 32 4, 62 2,0 0, 08

нальтоза 6,51 в, 4 0, 30 5, 68 2,0 0

крахмал 7, 62 8, б 0, 37 1,43 3,7 0, 10

фруктоза 2,21 т, в 2,66 2,2 -

ксилоза 0, 70 7,2 0 3, 03 2, i . 0

глиаерин 6,55 8, 6 0,46 0,98 2,3 0, 08

глицерин з/. в, оа 8,4 0,40 • - - -

(NH^HPO, (0, 3Z) ночевина (0,15Х)

СБ СоА СБ СОЛ

г/я РН нкг/мл г/л РН МКГ/МЛ

глюкоза 4. 82 г. i 0, 12 7. 58 7.9 0,25

нальтоза 6. 85 2.2 0, 04 0. 81 9. 3 0, 10

крахмал 3. 21 3.8 0,20 0. 66 9. 3 0, 10

фруктоза 3. 11 2.4 ■ - 0. 22 9.2 -

ксилоза 2.64 2. 6 0 0. 16 9. 3 0

глицерин 4. 33 2. 5 0, 16- 7.29 7. 0 0, 30

Примечания: "0" - не обнаружено. - нет данных

лярно содержанию азота в о,« ыано3.

Как видно из приведенных данных (табл. г.),, наиболее стимулирующими накопление кофермента среди проверенных источников-азота был иаиоз, особенно в сочетании с глицерином и крахмалом (соответственно о, 46 и о, 37 мкг/мл). Наибольший выход биомассы и характерную картину ницелиального роста наблюдали на средах с нитратом натрия (соли аммония в ходе - выращивания 'ауеп-дшае вызывают сильное понижение рН среды.и расщепление мицелия на короткие фрагменты) •

соотношение источников азота и фосфора в, среде выращивания 5. 1ауеп<щ1ае существенно влияет как на образование биомассы, так и на накопление СоА в среде культивирования (табл. 3,) Накопление соА стимулируют как повышенные дозы наио5(о, 4 • о, б у.), так и к2нро4 (о, зо - о,шь Для дальнейшего изучения процесса накопления коФермента были выбраны два зарианта - среда с о, гх N¿N03 и о, оэх кгНР04 как вариант ,с наименьшей и среда с о,4Х ыажэз и о,зох кгнР04 как вариант с наибольшей активностью накопления СоА вне клеток.

Таблица з.

влияние соотношения источников азота и фосфора на образование биомассы и накопление СоА г Зггерготусез 1ауеп^иI ас еооо/га

£_1П

о, 05

о,

АН.

СоА СБ СОА СБ СОА СБ СОА СБ СОА СБ

N Ш£Е Г/Л ИКС Г/Л ШГ г/а ШГ Г/Я ш: г/л

(Я) МЛ мл МЛ . мл ИЛ

С, 1 0, 04 3, 25 0 12 3, 06 0, и 2,94 0,65 2, 30 0,49 2, 39

о, г 0, 12 4, 65 0, 13 4, 30 0, 66 4,26 1,00 4,07 0, 39 2,65

0,4 о, £3 6, 15 0, 36 6, 20 0, 66 5, 30 1, 57 4, 36 1, 36 4,66

0, 6 0 24 5, 76 0 42 4, 47 0, 64 4, 45 1. 33 5,55 1. 30

Примечания: Р - КзНРо^ знгС! н - иамо3; СБ - сухая биомасса.

з. Содержание СоА й пантотеновой кислота в клетках И В среде культивирования ЗХгерЮтусев 1аУеп<Зи1ае

Для понимания причин существенного влияния соотношений источников азота и ФосФора на накопление СоА в коде выращивания

s, i»vendu i ас было необходимо проанализировать внутриклеточное И внеклеточное содержание СоЛ в ходе роста культуры; интерес также представляли данные об уровнях витаминного предшественника кофермента - панто.¿новой кислоты в этих условиях. Чтобы выяснить, сколько Coa необходимо для реализации метаболических потребностей и сколько кофермента инеется в клетках в свободном состоянии, был.проведен дифференциальный анализ различных эдил-СоА и coa-sh /Tubbs, Garland, 1964/. При сравнении вариантов А и В (рис. i. ) по уровню общего пула на одних и тех же часах роста в обоих вариантах существенные количественные различия не констатированы. Характер колебаний внутриклеточных концентраций свободного Сол в обоих вариантах выращивания . культуры также сходен. Полученные данные указывают на незначительное влияние источников азота и фосфора на внутриклеточный пул свободного Coa, несмотря на отлг ия в количествах кофермента. активно включенных в метаболизм в Форме различных апилов coa. как видно из рис. i., в содержании внутриклеточного пантотената радикальных различий в зависимости от концентраций источников азота и фосфора также не обнаружено.

Данные по содержанию СоА в среде культивирования s. invendu! ае. полученные специфичным к СоА "энзинатическим циклом" (рис. 2. ), показывают, что при. низком содержании фосфата в питательной среде лишь в.начале культивирования констатированы небольшие количества СоА, а данные, полученные методом апили-рования сульФоаминоазобензола, указывают на присутствие в среде культивирования, кроме самого кофермента и небольших количеств его предшественников- количество последних отражает разница между данными, полученными с помощью обоих методов. В среде с о, зх фосфата содержание coa до тг ч роста s. lavendu-lae постепенно возрастает до i,o мкг/мл и в конце Ферментации падает до i. з нкг/мл. Существенно больше кофермента констатировано при использовании неспецифичного метода определения, что указывает на присутствие в среде предшественников в количествах до з раз превышающих содержание самого кофермента.

данные анализа внеклеточного пантотената показывают, что. в отличии от накопления СоА в среде, различия в соотношениях при культивировании s. lavenduta* практически не влияют.

/соа/.адумл

dO

24 Ч 48 4

в

1 ш

г о

э т

4 а

веч

24 48 72 96 Т, Ч 84 40 72 96

Рис. 1. Содержание различных Форм СоА и лаетотената в киделии 1ауеп<зшае гооо: /гг. 1 - содержание свободного СоА !мкг/ мл), 2 - содержание ашм'-СоА с короткой углеродно" цепью и окисленного СоА (икг/ мл), з - содержание ашш-СоА с-длинно^ углеродной цепью (мкг/нл), 4- обшее со-, держание всех Форм СоА (нкг/мл); 5 - содержание пантотената ^гисг/мл); а -. вариант шгтгельной сриш с о. гг нано3 и о. 05х кгнРо$«знго; в - вариант среды с

0. 42 МэЖ>з и 0.302 кгЧР04«ЗН£0

источников азота И ФосФора на активность выделения пантотената Для дополнительного контроля и-получения сравнимых данных с опубликованными, был также проведен анализ связанных Форм пан-тотеновой кислоты. - Результаты показывают (рис. г.), что связанные Формы витамина (определнные как разнипа между общим и свободный пантотенатом) активнее секретируются в среде с высоким содержанием фосфата, что согласуется с данными анализа СоА.

Рис- г. Динамика накопления свободного и связанного пантотената И СоА В среде культивирования Streptornyces lavendulae гооо/гг в зависимости от содержания источников азота и ФосФора. •i - содержание пантотената (РаА). г - содержание Coa. по методу "энзиматического цыкла", з - содержание СоА и предшественников, по методу аиилирования СААБ; i - содержание связанного пантотената! А, В - см. пояснения к рис. i. -

Деградация СоА в среде культивирования streptomyces lavendulae

Так как СоА является соединением нестабильным в химическом отношении /BuysKe et al., 1954/, кроме того, в биологических системах нельзя исключить и- возможность его энзиматического расщепления, важным представляся контроль стабильности СоА

Рис. з. дина-ника деградации экзогенного СоА

И <1р-СоЛ в

среде культивирования б^ер*отусе» I ауегкау! гооо/гг. Экзогенный Сол И ор-Соа добавлялся к

I а з 1 в я ь. н бесклеточной

чб ч культуральной среде. ■ 1 - контроль убыли СоА по методу "энзиматического цикла", г - контроль Убыли СоА по методу апи-лирования сааБ, з - контроль убыли <1р-соа по методу ацилирова-ния сааб. а. в - см. рис. !• .

I" 1 „ . . . В4 4В тг Е£3 84-Ш7а9в е4««7Е ХЧ

Рис.*. Деградатаьная активность (1ЕД = нмоль/мл в мин» в среде культивирования е. иуепаиие гооо/гг ао отношению к СоА и ар-сол. по- - деградативная активность после термической обработки (15 нив.. 950с). а - деградирующая активность в среде с о. сьг фосфата. В - деградирующая активность в срейе с о. зох фосфата. 1 - соа, г - ор-соа.

после его секреции в среде культивирования.

в среде культивирования после 48-часового роста s. lavenduiae с низким содержанием фосфата деградация СоА. контролируемая специфичным методом, проходит наиболее бистро - к пер-вону часу деструкции подвергается более эои экзогенного Coa-, в то время как уровень ер-СоА и СоА, определенные методом ацили-рования СААБ, понижается только на so и 60/. соответственно. В варианте с высоким содержанием ФосФата в культуральной среде после 48 ч выращивания з. lavenduiae деградация Cóa как в случае специфичного, так и неспецифичного контроля происходит мед-денее (вариант В), чем в варианте А - за час обнаруживается исчезновение линь около 60 и зох экзогенного Coa соответственно; <Jp*CoA в этих условиях деградирует быстрее - ату. в i ч.

Для- выя гения деградагивной активности в среде культивирования 8. lavenduiae 2000/22 по отношению к СоА и dP-CoA, скорость расщепления этих метаболитов измерялась в обоих вариантах в течение всего периода культивирования штамма (9вч) через каждые 2« ч. В варианте А (рис. 4,) активность деградации Coa Увеличивается в процессе роста s. lavenduiae. в образцах первых 4в ч деградатавная активность чувствительна к термической обработке 03 мин, 95°с>. ор-Соа в этих условиях в пробах первых 24 ч деградирует с аналогичной, в 48 и 72 ч - с неньшей, а в 96 ч - с превышающей активностью по сравнению с Coa; на процесс также значительно влияет предварительное выдерживание образцов при 95°С.

В пробах с повышенным содержанием ФосФата в среде выращивания деградатавная активность по отношению к coa (рис. 4. в) в первые 72 ч роста в 2-3 раза ниже По сравнению с вариантом А, и на скорость исчезновения Coa незначительно влияет обработка повышенной температурой.

Так как на основе экспериментов по активности деградации coa в среде культивирования s. lavenduiae 2000/гг и литературных данных предполагалось присутствие внеклеточного Фермента, расщепляющего Coa, были проведены эксперименты по контролю активности Фосфатазы в среде выращивания. Результаты активности ФосФатазы наряду с содержанием белка, кривыми роста и изменениями рН среды отражены на рис. 6. повышение активности корре-

лирует с ростом штамма и достигает максимума на 4в ч роста -39 Ед. в стационарной фазе роста - падает до 16 ед; в варианте В активность фосфатазы не превышает о. 4 Ед . в течение всего периода роста.. Необходимо также отметить, что термическая обработка (15 мин, 95°С) снижает скорость деструкции п-нитро-фенилфосфата практически до нуля- таким образом, в наших экспериментах констатировано, что СоА в среде культивирования s. íavendutae гооо/гг подвергается дальнейшим превращениям; при этом установлено, что деградация происходит не только в варианте выращивания с низким содержанием фосфата, где СоА практически не обнаружен, но и в варианте с о. гг фосфата, в котором содержание кофермента достигает i. в нкг/ил (рис. 2.) из этих данных следует Вывод, что результаты анализа СоА в среде культивирования отражают лишь разницу между активностью секреции и деградации. До 7.2 ч .роста характер изменений активности деградации (рис. 5., А) совпадает с активностью ЧосФатазы в среде культивирования íphc. б,, А), однако, числовые значения активности, выраженные в нмоль/мл в мин, сильно отличаются.

с > IÍ?

X о. t еС'

s вГ «

в АО'

7-

i •

ВО

о- о-

&4 4В 7В ав

Р 1 V В4 4В 7В ВВ

Рис. 5, образование биомассы, секреция белка*, активность Фос-, Фатазы и изменение рН в ходе выращивания е. (зуег^иГае гооо/гг. 1 - рн среды; г -. сухая биомасса, ов (г/л); з - активность фосфатазы (АР),■ выраженная в Ед (1Ед=1нмоль деградированного л-китроФенилФосФата/мл в мин); 4 - содержание белка в среде, Р (мг/мл). а, в - см. пояснения к рис. 1. .

4

5. Биосинтез coa из предшественников.

с учетон полученных данных о секреции coa представилось важный проверить активность сол-синтезирушего Ферментного комплекса у Streptorcyves lavendulae. Одним из способов опенки активности такого комплекса может служить проверка активности образования СоА из предшественников (АТг, пантотенат. цис-теин). кроме того, на этой принципе основывается методология сушествейного повышения выхода coa, что не маловажно.с практической точки зрения. При изучении проблем биосинтеза СоА опре-

Таблица 4.

системы электролитов для разделения анионов

n0. сис-

Электролит

Добавка.

Пригодность для анализа coa

l ci "/h¡в O.OOSM pH 5,20 • Тритон не пригодна,

1 х-too (о, IX) низкая под-

вижность

т Капроат/His о,оо5н рн 5.25__сол

L сг/в-Aia о,оозм рн з,90 Тритон пригодна."

2 х-loo (O, IX) хорошее раз-

деление СоА,

т Капроат/Tris о, оозм рн 8.50 -"- атр, аир

l ацетат/Tris о, 004М рн в, to тритон не пригодна,

3 х-too (О, IX) coa подвиж-

нее ацетата

«Л1 аспарагия/ о, 004М рн в, 40 8а (ОН) z-

и сг/в-А1а о, 004к рн 3,80 тритон не пригодна, 4 Хт 100 (0,1'/) низкая под-

вижность СоА

т апетат/в-А1а о,004Н рч 4. оо____

Примечания; с - ведущий электролит; Т - замыкающий электролит;

") - среднее время прохождения границы электролитов го мин при напряжении ю-12 «v и токе юо мкА

дезевный интерес вызывали также альтернативные знзиматическим методы определения коФернента-

Используя аппаратур? и иетодику Уф-анализа, был проведен поиск систем электролитов для разделения Соа в виде отдельной зойы, варьируя рН систем, руководствуясь данными рка и подвижности буферных компонентов в электрической поле /mrokava et at., 1963/ (некоторые из проверенных систем отражены в табл. 4.) Наиболее пригодной, для разделения соа, АТР и АНР оказалась система, где в качестве ведшего электролита использовали с г с прогивоионом в-ма, а в .сачестве замыкаювего • капроновую кислоту с противоионом Trie, на рис. е. кривая 1 Показывает картину .разделения стандартней смеси сульфата, оксалата, ATP, СоА, АНР в концентрациях е-и-5 ноль/л. высота зон характеризует подвижность каждого индивидуального вещества, .длина зон - концентрацию вещества в анализе. Следует отметить, что пантотенат и «истеин в проверенных системах электролитов имеют низкую подвижность и не образуют отдельных зон-

Образцы после центрифугирования но мин, шло ь) разбавляли (i:ioo) и немедленно проводили ИТФ-аналиэ. Другие способы

—-------- оксалдт

ШР

капооат

рис. 6. изотаяоФореграммы разделения анионов, полученные с помощью кондуктометрического датчика. 1 - смесь стандартных веществ (5-ю-5 н>, г - инкубационная смесь перед процессом (г=о ч), з - инкубационная смесь после ии ч. '

ООО

400

gOO

Со А, ШУМЛ

5 воо

воо

400

200

ТТ"

13 еоо

воо

400

гоо

О - рН 0,0. 35оС В23 - рн 7.0. з;ос

101

т-г

SO 40 t,°C S 7 ВрН ABC

Рис. 7. Влияние температура, ,РН среди и концентраций предшес-венников на биосинтез СоА из предшественников с помощью высушенных клеток Sj lavenciulaa. А • 15 мкмоль/»:л АТР, 3,75 мкмоль/мл РаА и Суё В • 30 , 7, so

С • во , 16,0

i'-'H-

СоА, мкг/мл

зоо ВОО' 400

гоо

в 12 24 4В 85 Т.Ч

е. Биосинтез Coa из предшественников Ферментным препаратом КУЛЬТУРЫ Streptomyces lave.ioulae. •

Рис.

подготовки (обработка 6трихлоруксусной кислоты или инкубация -при 950q осложняли ход анализа ввиду появления новых зон, мешавших отделению анализируемого вешества. .

Следуя опыту японских авторов в работе с В. ammonlagenc» /ogata et ai., 1970/, для исследования биосинтеза Coa из предшественников в качестве Ферментного препарата использовали высушенный ацетоном (-15°c) мицелий культуры s. i avenan ас. результаты, полученные ИТФ-анализом, отражены на рис. 7. и

При проверке влияния температуры инкубирования установлено, что активность синтеза медленно увеличивается, достигая максимуна при 350с: повышение температуру до «ос приводило к снижению активности (рис. ?., о. при выяснений зависимости активности биосинтеза Coa от рн среды (рис.т.¿«o, яоказ;ано, что наибольшее количество кифермента образовывалось при рй е, о. Из рис. 7(п о видно, что оптимальной концентрацией предшественников является зо мкмоль АТР и 7,5 мкмоль/.чл Рал и вистеина (в

исходных условиях и при pH о и t:35°C).

При исследовании динамики образования СоА и; предшествен- . иков выявлено, что активный синтез происходит в первые часы инкубации (рис. е. ) , достигая к в ч воо шг/ня, после активность синтеза снижается, и> к г* ч концентрация Coa достигает взо мкг/мл, что является максимумом.

5. Нетаболизн CüA у Streptomyces lavéndulae

Совокупность результатов изучения секреции и деградации СоА позволяет представить гипотетическую схему иетаболизиа СоА у streptomyces lavenduiae (рис.9.). наблюдаемая секреция пан-

тотената у s._lavenduiae. как И В случае £■ coli /JackowsKi,

Pock, хш/, может «ыть следствием синтеза витамина,, превышающего собственные потребности • что касается секреции СоА, то в случае s. lavenduiae полученные результаты не дают пока точного отг.ета, какие именно метаболиты выделяются - или секреции подвергается как СоА, так и его предшественники,' или только coa, а констатируемые неспециФичнын методом предшественники появляются в среде в результате деградации.

Необходимо учесть - если обнаруженная нами ФосФаТаза кро-

Рис. 9. гипотетическая схема : зтаболизма Coa у streptcm/ces tavendulaé.

не своей функции в состоянии реализовать и пирофосфатазную активность, как это показано в работе с щелочной фссфатазой из S. fradiae /Hajimdar, Majumoarv 1971/, то такая фосфатаза в состоянии реализовать .превращение СоА в пантетеин (PaSH.pKc- 9.).

Некскгаочены также и другие пути деградации как coa. так и ар-соа. Образование соединения К более вероятно в среде с высоким содержанием фосфата, где доминирует термостабильный Фактор деградации (рис. 4.). Низкое содержание КгНР04 вызывает появление высокой активности ФосФатазы, что обуславливает деградавий"через деФосФо-СоА до PaSH или соединение y.

Следует обратить внимание: если при показанном уровне де-градативной активности вне клеток СоА все таки обнаруживается, то в пояной йере справедлив вывод, что культура strcptorcy-сеа lavandoiae секретирует существенно больше коФермента. нежели это видно при непосредственном измерении. При допущении, что секретируется только СоА, а все остальные связанные формы пантотената являются продуктами деградации, то примененный в качестве- контроля метод анализа' связанных форм пантотената может спутать способом оценки количества коФермента. фактически выделенного -вне' клеток В таком случае s. i avena»iae 2ooo/22 потенциально продуцирует до 40, з мкг/мл coa.

.Причины секрейии СоА у s.. iavenduiae могут оказаться

гг

сходными с выделением вне клеток фосфопантетеина у с. сом /vanan, jacKowsky, 19бв/, где. как и в случае пантотената. содержание метаболита в клетках регулируется путем выведения излишних количеств в окружающую среду.

. выводы

i. Исследована способность секреции кофермента а у то представителей рода Streptomyces, из КОТОРЫХ (62, вИ) ПРИ росте на минеральной среде с органическим источником углерода накапливают вне клеток более чем о, ь мкг/мл СоА или его предшественников (деФосФо-СоА. ФосФопактетеин).

е. Среди проверенных' культур в накоплении соа или его предшественников наиболее активен штамм Streptomyces lavendu-iae (syn. I avendofuseus) 3/2000 - до 12,9 МКГ/НЛ.

з'. Путэм субклонирования из штамма з/гооо получен штамм streptomyces lavendulae 2000/22 С активностью накопления СоА превышающей активность исходной культуры на ш

4. в результате исследования влияния различных источников углерода и азота установлено, что наиболее интенсивное накопление coa происходит при выращивании s. lavendulae в среде с глицерином и нитратом натрия, секреция СоА осуществляется в процессе активного роста культуры,

5. Повышение концентрации фосфата в питательной среде стимулирует накопление. Coa в среде культивированиния; на характер колебаний содержания свободного coa внутри клеток содержание фосфата влияет незначительно.

6. При контроле стабильности секретированного СоА показано, что при низком содержании фосфата (о, 05у.) одним из СоА-деградирукшх агентов является внеклеточная фосфатаэа, активность которой к 46 ч выращивания достигает,39 Ед; при высоком содержании фосфата to, зоу.) активность Фермента не превышает о, 4 Ед.

т. констатировано, что s. lavendulae синтезирует до бзо мкг/мл кофермента из предшественников биосинтеза (АТР, пантотената, цистеина).

е. Разработан метод анализд соа на основе изотахоФоретичес-

кого разделения анионов в системе электролитов: ведущий -HCi/e-aia, замыкающий - капроат/Tr¡s.

i. Д. Я. Павловича, а. а. Зелтиньш, Ю-О- Якобсон, л. К. гогота, Я. А, Кузманис. Штамн Stfeptomyces laven'do-fuseus 3/2000 -продуцент кофермента КоА // А. с- ссср no, 1117318. бюл--' »98»,'- Т., 37. - с. 72.

г. а. х. загаре, а. а. Зелтиньш, Д. Я• Павловича, д. а. Силарая, Я. Я. Дрегерис. Оценка активности кофермекта А синтезирующего ФеРМеНТНОГО комплекса у культуры Streptomvces iaven-doftfseus // Тр. tv всес. i-.ежунив. коиФ. "Биология клетки", Тбилиси. 1985, С. 271. '

3. а. х. larape, А. А. Зелтиньш, Д. Я. Павловича, ю. А- Зенитис,

. Я. Я- Дрегерис- ИзотахоФоретический контроль биосинтеза

СоА КУЛЬТУГОй Streptpmyces 1avendcfuseu3 // Биополимеры и клетка. * 1986. - т. г. - no. 5. - с. гбб-2б9.

4. Д. Я. Павловича, А.А. Зелтиньш, Э. я. Елейделе, Ю-0. Якобсон. Продуцент кофернента А среди культур рода streptemy-çes // Тез. докл. 11 г всес. конФ. "Биосинтез Ферментов ИИКРООРГаНЙЗИанИ". ПУШИНО, 1986, С. 128.

5. J. 0. JSKobsons, A. A. Zeltit)5, O.J. Pavloviîa. Activ.ty of Епг/тез of Nitrosen Metaboliem and CoA Production in Culture» Of Streptomycas ap. // Abstr. XIV Int. Congr. Microbioi., Manchester, 1986, p. 306.

6. A. A., Зелтиньш, Д. Я. Павловича, кхо. Якобсон. Экстрацел-люлярное накопление и Физиологические свойства strepto-myces lavendulae // Тез. докл. iv Всес. конф. "Биосинтез Ферментов микроорганизмами", Ташкент, 1988, с. 76.

7. А.А- Зелтииыа, Д.Я. Павловича. Биосинтез и секреция ко-Фермента А у актинокиаета streptotr.yces lavendulae // изв. АН Латв. ССР-- 1990.- N0.4 (513)'.- с. Ю0-105.

6. А. А. Зелтиньш. Экстраделлюлярная деградация кофермента А У актиномипета Streptomyces lavendulae // Кэв. АН.Латв. ССР. - 19.90.- N0,4 (313).- е. 106-109.

список публикации