Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние иммуномодуляторов на обмен холестерина в макрофагах

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Влияние иммуномодуляторов на обмен холестерина в макрофагах"

г4 ч™ Л

' 1 "¿¿ШИСТЕРЯВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

: 7 НОВОСИБИРСКИЙ ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ

МЕДИЦИНСКИЙ ИНСТИТУТ

На правах рукописи

САФИНА

Альшия Фаиковна

ВЛИЯНИЕ ИЖШЮЮДШТОРОВ НА. ОБМЕН холвсттш В МАКРОФАГАХ

03.00,04 - Биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Новосгб^рск, 1993

Работа выполнена в Институте физиологии Сибирского отделения РАМН, г.Новосибирск

Научные руководители - доктор медицинских наук, профессор Т.А.Короленко,

кандидат медицинских наук, ст.н.с. М.И.Душкин

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор В.И.Феденков,

кавдвдат медицинских наук Л.М.Поляков

Ведущая организация - Институт цитологии и генетики СО РАН г.Новосибирск

Защита диссертации состоится "_"_1994 г.

в _часов на заседании специализированного совета

К 084.5203 Новосибирского медицинского института по адресу: 630091. Новосибирск-91, Красный проспект 52.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Новосибирского медицинского института

Автореферат разослан "_"_.1993 г.

Ученый секретарь специализированного Ученого совета доктор мед.наук, доцент

В.И.Шарапов

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Изучение регуляции холестеринового (ХС) обмена на разных уровнях - от системного до клеточного -является одной из центральных проблем современной биологии и медицины (Лопухин,1983; Mahley et al.,1983;Brown et al. ,1985; Takano et al. ,1990).

В настоящее время показано, что система мононуклеарных фагоцитов (С®) на уровне организма осуществляет не только неспецифическую защиту от инфекций, но и участвует в регуляции метаболизма липопротеинов (ЛП) (Маянский Д.Н. ,1992; Brown et al. , 1983). Стимуляция СЮ оказывает защитный эффект, что сопровождаемся усилением эндоцитоза, секрецией цитокинов и др. (Decker, 199J). Отмечен все возрастающий интерес к исследованию роли СШ в регуляции Ш обмена. Особое значение имеет изучение влияния стимуляции СШ на метаболизм ЛП.

Эффективный захват и деградация модифицированных липопро-теинов низкой плотности (ЛШ) в непаренхиматозных клетках печени in vivo является главной защитной реакцией СШ против возможного патогенного действия ЛНП (Van Berkel,1991). Полагают, что функциональная активность этой системы вносит большой вклад в поддержание динамического равновесия ЛП обмена в кровп и тканях. Существенную роль в катаболизме ЛП играет высокая активность лизосомной холестеролэстеразы (ЛХЭ) в макрофагах (!,©) (Takano et al. ,1990).

В последние года доказано участие и® в образовании атеро-склеротических изменений в стенках сосудов. Показано, что перерождение тканевых Щ в пенистые клетки сопряжено со следующими особенностями обмена ХС в мононуклеарных фагоцитах:нерегулируемый ХС захват модифицированных ЛИ1 путем скэвинджер-рецептор-опосредованного эндоцитоза, высокая скорость деградации ЛП и высокая скорость эстерификации ХС в цитоплазматическом компарт-менте (Brown et al. ,1980; Colman ,1991; Krieger ,1992). Биохимическая регуляция липидного обмена в О® исследована недостаточно. В последнее вреда появились данные о снижении экспрессии скэвивдкер-рецепторов под действием цитокинов (Van Lenten et al., 1992), однако влияние цитокинов на отдельные пути утилизации ХС в Ш> не изучено. Поэтому исследование действия иммуномодулято-

ров на липвдный обмен в Ш является актуальным для понимания механизмов нерероадения № в пенистую клетку и разработки способов протекции атеросклеротаческих нарушений. Для достижения этой цели необходимо исследовать действие иммуномодуляторов на разных уровнях - на клеточном и на уровне организма. Установление характер« связей между уровнем функциональной активности (Ш и состоянием холестеринового обмена в организме возможно при создании модели дефицита функции ключевого фермента гидролиза ЭХС в результате введения лизосомотропных соединений, способных подавлять липолитические системы лазосом печени ( Lüllman-Hauch, 1979).

Другим перспективным подходом в изучении влияния иммуномодуляторов Cfiffi на лшщдный обмен в МФ является использование культуры перитонеальных MS мыией, инкубированных с модифицированными Ml (Ее Gookey et al. ,1983; Hagatsu ,1992).

Цель настоядей работы - изучение роли стимуляторов системы мононуклеарных фагоцитов в регуляции обмена холестерина на клеточном уровне в культуре макрофагов и на модели дефицита активности лизосомной холестеролэстеразы печени, а также изучение возможности использования иммуномодуляторов для коррекции нарушений липопротеинового обмена.

В соответствии с целью работы были поставлены следующие конкретные задачи:

1. В культуре Ш исследовать действие иммуномодуляторов полисахаридной природы и супернатантов стимулированных Ш в лимфоцитов (ЛФ) на метаболизм ацетил-ЛНП.

2. Изучить особенности биосинтеза липддов в перитонеальных М$ при их стимуляции зимозаном in vivo с после,дующим анализом роли цитокинов в этом процессе in vitro.

3. Оценить влияние стимуляции С!® зимозаном и депрессии СШ хлористым гадолинием на содержание ХС в крови и активность лизосомной холестеролэстеразы (ЛХЭ) печени.

4. Сравнить влияние иммуномодуляторов КМ-глюкана (2 фр.) и зимозана на активность лизосомной и цитоплазматической ХЭ и уровень ХС в крови животных, получавших ХС и на модели лшшдоза, вызванного тритоном we-1339.

Новизна работы. Впервые установлено, что инкубация резидентных Щ с фактором некроза опухоли (ФНО-оС), супернатантами от смешанной культуры лимфоцитов (CKI), ЛПСДстимулированных ® также приводила к увеличению включения олеата в клеточные лшвды.

Впервые установлено, что I®, активированные зимозаномЛп vivo , обладают повышенной способностью включать р4с] -олеат в эфиры холестерина (ЭХС), триглицериды (ТГ) и фосфолипиды (ФЛ) в отсутствие JIHH в среде инкубации. Обнаруженный феномен рассматривается нами как одна из особенностей лшшдного обмена в Ш при воспалении.

Впервые установлено, что стимуляция CMS КМ-глюканом (2 фр.) и зимозаном предотвращает угнетение активности ЛХЭ в печени при воздействии лизосомотропного препарата тритона Ш -1339 и повышение уровня ХС в крови животных.

Впервые исследойано влияние на обмен ХС в Ш КМ-глюкана (2 фр.) и высказана гипотеза, что действие КМ-глюкана (2 фр.) на ЛИ обмен в Ш обусловлено высоким сродством этого препарата к скэвивджер-рецептору.

Теоретическое и практическое значение работы. По своему содержанию работа носит преимущественно теоретический характер и представляет собой биохимическое исследование механизмов действия иммуномодуляторов на отдельные звенья обмена холестерина в макрофагах в экспериментах in vivo и in vitro.

Полученные в работе данные о протективном эффекте имадно-модуляторов в процессе превращения № в пенистые клетки при ли-пидозе, вызванном тритоном WR -1339, очень важны для понимания механизмов развития гиперхолестеринемии, в том числе при депрессии СШ, воспалительных процессах и изучения их возможней функции в процессе трансформации Ш> в пенистую клетку.

Практическое значение работы состоит в том, что КМ-глюкан (2 фр.), как эффективный протектор при экспериментальном липи-дозе, как лигавд скэвинцжер-рецепторов Щ, можно рассматривать как принципиально новый антиатерогенный препарат, действие которого основано на ускоренном выведении модифицированных ЛНП из русла крови и протекции образования пенистой клетки в сосудистой ткани.

Выявлены ранее не описанные в литературе особенности лшшдного обмена при активации Ш цитокинами, которые заключаются в усилении включения жирных кислот в клеточные липвды.

На защиту выносятся следующие положения:

1. Стимуляция № зимозаном in vitro и in vivo , а также действие некоторых цитокинов (ФНО-о^, супернатанты от СКЛ и от ЛПС-стимулированных щ) увеличивает включение ["^с] -олеата' в ЭХС, ТГ и ФЛ. Вероятно, наблюдаемое ускорение метаболизма меченого рлеата является одной из важных особенностей липидного обмена стимулированных Ш.

2. Имщуномодуляторы полисахаридной природы - КМ-глюкан (2 фр.), зимозан, «ШС, БЦЖ и лимфокины, подученные от КонА-сти-мулированных лимфоцитов, эффективно подавляют метаболизм модифицированных МП в культуре перитонеальных i® и предотвращают избыточное накопление ЭХС в 1®.

3. Стимуляция С® ведет к снижению уровня ХС в крови, депрессия хлористым гадолинием сопровождается только снижением активности ЛХЭ печени. Введение стимуляторов СШ (КМ-глюка'на /2 фр./, зимозана) повышает активность ЛХЭ в печени.

Апробация работы. Основные положения и выводы диссертации доложены на сателлитном симпозиуме 8 Мевдународного конгресса по иммунологии "Биологические функции белков острой фазы и регуляция их синтеза"(Краков, Польша,1992), 6 Международном симпозиуме по полисахаридам (Братислава, Словакия, 1992), Мевдународном симпозиуме по гликоконъюгатам "Глико ХП" (Краков, Польша,1993), Международном симпозиуме "Киникы-93" (Сан-Пауло,Бразилия,1993) , 12 зимней школе по протеиназам и ингибиторам (Тирс, Италия,1993).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 13 печатных работ.

Объём и структура диссертации. Диссертация изложена на /é Q страницах машинописного текста, содержит /^таблиц, /6 рисунков л состоит из введения, обзора литературы, описания собственных исследований, включающего материалы и методы, резуль-_^_ тага и их обсувдение, заключения и списка литературы из источников.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы работы. Эксперименты проведены на 150 самцах белых крыс линии Вистар массой 180-200 г и на 400 самцах мышей линии СБА массой 18-20 г.

Для стимуляции СШ мышам или крысам вводили зимозан однократно внутрибрюшинно в дозе 100 мг/кг веса, КМ-глюкан (2 фр.) (Химический институт, Братислава, Словакия, любезно предоставлен д-ром Шавдула Й.) вводили однократно внутрибрюшинно в дозе 5 мг/ЮО г веса (Верещагин Е.И. ,1992), при этом индекс фагоцитоза, по которому оценивают функциональную активность СМФ,увеличивается максимально (в 2 раза) через 48 часов.

Для подавления СШ> использовали введение блокатора функций I® хлористого гадолиния однократно в дозе 20 мкЭД/кг веса ретро-орбитально мышам ( Вошпа et ai. ,1989). Показано, что в этой дозе препарат максимально подавляет рецепторный эвдоцитоз клеток Купфера (24 ч).

Для создания дефицита функции ЛХЭ в печени (Дуикин М.И., Долгов A.B.,1986) и моделирования развития липадоза вводили тритон ,vs -1339 внутрибрюшинно, однократно, в дозе 85 мг/100 г массы тела крыс ( .Vattiaux ,1966). Крыс забивали спустя 72 часа после введения препарата, то есть в период его максимального накопления в печени (Короленко Т.А.,1983).

Для создания модели гиперхолестеринемии мышей содержали на 5% холестериновой диете в течение 7 дней.

Для изучения влияния стимуляторов СЖ на развитие гиперхолестеринемии и нарушение функции ЛХЭ за .двое суток до введения тритона äR -1339 крысам вводили КМ-глвкан (2 фр.) и зимозан в указанных выше дозах. Контрольным животным вводили такое же количество физиологического раствора. Крыс забивали декапитацией. Гомогенат печени готовили согласно рекомендациям А.А.Покровского и В.А.Тутельяна.

В гомогенате печени крыс определяли активность лизосомной и цитоплазматической холестеролэстераз методом Brecher et al. (1976), используя в качестве субстрата холестерол-(1- ^С)-оле-ат, с удельной радиоактивностью 50,8 мКи/ммоль (Amersham , Англия), в составе лецитиновых липосом. Активность холестерол-эстеразы выражали в нмоль гцдролизованного холестерололеата в минуту на I мг клеточного белка.

Активность лизосомных цистеиновых протеиназ и гликозидаз определяли по мето,цу Barrett (1980,1981) с использованием флю-орогенных субстратов (НПО "Вектор", Кольцово, Новосибирск).

В сыворотке крови определяли содержание общего ХС, используя наборы реактивов Boehringer МагтЬе1тконцентрацию ХС выражали в мМ/л.

Резидентные или стимулированные гликогеном перитонеальные Ш мышей получали по методу i/iiitorowicz et ai. (1977), и клетки плотностью 2-Ю6 помещали в культуральные чашки Петри диаметром 35 мМ в среде RPMI-I640, содержащей 10%-ю эмбриональную сыворотку телят, 2 мМ I -глютатиона, 100 ед/мл пенициллина и 100 мкг/мл гентамицина (Brown and. Goldstein ,1980). После 2 ч инкубации в атмосфере С02 (5%) и воздуха (95%) при 37°С клеточный монослой промывали средой RPMI-I640 для удаления лимфоцитов.

Жизнеспособность клеток проверяли по методу вытеснения, трипанового синего. В среднем жизнеспособность Ш составляла около 95%. № из очага воспаления получали после внутрибрюшин-ного введения зимозана в стерильном растворе РВУ в дозе 2 мг/ /10 г веса мыши в объёме не более I мл (Маянский Д.Н.и др., 1990). Контрольным мышам вводили I мл PBS. Через определенные временные интервалы после введения зимозана (I-I20 ч) получали 1® описанным выше методом.

ЛНП (1,019 - 1,063 г/мл) выделяли из плазмы доноров методом ультрацентрифугирования ( Lindgren et al. ,1972) и ацетили-ровали с использованием уксусного ангидрида ( Goldstein and Brown ,1979).

Получение [^i] -ацетил-ЛНП было проведено общепринятым йодмонохлоридным методом в модификации для липопротеинов (Bii-heimer et al. ,1972). Удельная радиоактивность составляла 5080 имп/I мг белка. Включение ХС-[14о]-олеата в ацетил-ЛНП проводили по методу Biomhoff et ai.(I984). Удельная радиоактивность составляла 10-25 мкКи/мг общего ХС ацетил-ЛНП.

Скорость включения -олеата, связанного с БСА, в клеточные лишщы определяли при инкубации монослоя 1® в течение 4 ч в безлипидной среде (Brown and GoldstetoI980). Липиды Ш экстрагировали in situ смесью гексан: изопропанол (3:2) ( Brown et al. ,1980). ЭХС, ТГ и ФЛ получали методом тонко-

слойной хроматографии на пластинах silufol (Чехословакия) в двух системах растворителей гексан-диэтиловый эфир - уксусная кислота (60:40:1 и 90:10:1, об/об) (Душкин М.И.,1986).Подсчет радиоактивности в липвдах осуществляли в толуольном сцинтилля-торе на сцинтилляционном счетчике 'Mark з". Результаты выражали в нмолях включенного олеата на мг клеточного белка.

Скорость деградации [-^i] - ацетил-ЛНП измеряли после инкубации клеток с мечеными ЛНП в течение 24 ч в ТХУ-неосаждаемой фракции культуральной среда ( Goldstein et al.,I974). Поглощение ХС-[-^с]-олеат-ацетил-ЛШ определяли после инкубации меченых ацетил-Ж1 в течение 4 ч в культуре I®. По окончании инкубации клеточные липиды экстрагировали, экстракт высушивали в сцинтилляционных флаконах под током азота и подсчитывали [14с]--радиоактивность. Результаты выражали в мг белка ацетил-ЛНП, связанного с 1®, на I мг клеточного белка.

Для исследования влияния различных стимуляторов С№ на ли-пидный обмен в Ivffi получали: супернатант от Ш, стимулированных ШС в течение 24 ч, супернатант от индуцированных КонА сплено-цитов мышей FI (C57BI/6J х СБА), супернатант смешанной культуры лимфоцитов (СМ) мышей СБА и C57BI/6J (все супернатанты были получены и тестированы Перминовой О.М., научным сотрудником ИКИ СО РАМН), сыворотку и перитонеальный экссудат после внутри-брюшинного введения зимозана, рекомбинантный фактор некроза опухолей (ФИО) (НПО "Вектор"), опсонизированный зимозан, ман-нан родэксман (С.-Петербургский химико-фармацевтический институт), БЩ, немодифицированный глюкан.

Для электронно-микроскопического исследования Ш фиксировали глутаровым альдегидом, осмием и проведали по общепринятым методикам (Уэлси Дж.,1976). Ультратонкие срезы контрастировали ураяилацетатом и штратом свинца, а затем исследовали под микроскопом " JEM-I00" (Япония) (совместно со ст.н.с.Правоторовым Г.В.)

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

I. Влияние иммуномодуля'/оров (HIvl) полисахаридной природы и цитокинов на метаболизм ацетил-ЛНП.

Изучали влияние ИМ полисахар щной природа на скорость эс-тернфикашн ХС в Ш, инкубированных с ацетил-ЛНП (табл.1).Этот показатель отражает захват, деградацию ацетил-ЛНП в лизосомзх и транспорт ХС из лизосом в цитоплазму, что сопровождается ин-

Таблица I

Влияние стимуляторов полисахарддной природы на скорость включения [14с] -олеата в ЭХС инкубированных в присутствии и отсутствии ацетил-ЛШ (50 мкг/мл) (М ±т )

Концен- Включение те -олеата в ЭХС, % ингибиро-Соединение трашя, в нмоль/мг клеточного белка вания ско-мкг/мл _4 ч инкубации роста образования <ЭХС

-ацетил-ЛШ +ацетил-ЛНП в присутствии ацетил_ЛНП

Контроль - 0,2±0,01 4Д±0,12 0

КМ-глюкан 0,2±0,02 1,6±0,05

(2 ®>.) 16 60,0

64 0,2±0,02 0,7±0,02 82,3

100 0,2±0,01 0,7±0,01 82,4

200 0,2±0,00ж 0,3^0,01®® 91,9

Зимозан 100 0,1±0,00ж 1,0*0,01** 75,3

250 0,2±0.01 1,0*0,01я® 75,5

500 0,2±0,01 0,9*0,01"® 77,8

Б Ц Ж 50 0,4±0,09 2,8*0,17* 29,2

100 0,4±0,02 2,2*0,11*® 46,8

Партикулярный 0,2^0,01 3,2*0,17

глюкан 100 21,9

Родэксман 50 . 0,2±0,01 3,9*0,71 4,9

100 0,1±0,04 4,4*0,02 0

Л П С 6 - 4,2*0,09 0

12,5 - 6,2*0,27 -

25 - 3,1*0,08 24,5

75 - 4,5*0,06 0

Достоверность изменения величин по сравнению с контролем: к - Р <0,05; - Р <0,01. Число опытов - 3, в трех параллелях.

дукцией скорости эстерификации ХС (Brown, Goldstein ,1983). Добавление ацетил-ЛНП к интактным № приводило к 20-кратчому увеличению скорости эстерификации ХС (контроль). Обнаружено, что 18-часовая преинкубация с КМ-глюканом (2 фр.) в концентрациях от 16 до 200 мкг/мл дозозависимо снижала метаболизм аце-тил-ЛШ в 12 раз. Зимозан независимо от концентрации (100-500 мкг/мл) снижал включение меченого олеата лишь в 4 раза, БВД -только приблизительно в 2 раза. Другие полисахариды не оказывали действия на этот показатель. Добавление полисахаридов в отсутствие ацетил-ЛНП достоверно не изменяло скорость эстерификации ХС.

Таким образом КМ-глюкан (2 фр.) и зимозан эффективно препятствовали увеличению скорости включения меченого олеата в ЭХС 1®, инкубированных с ацетил-ЛНП.

Чтобы выяснить, на каком этапе метаболизма ацетил-ЛНП действуют изучаемые наш ИМ, мы исследовали влияние этих препаратов на захват меченых ацетил-ЛНП. Показано, что зимозан, КМ-глюкан (2 фр.) и ЛПС препятствуют захвату меченых апетил-ЛНП в f<@ (табл.2). Следовательно, снижение скорости эстерификации ХС

Таблица 2

Влияние стимуляторов полисахаридной природы на захват

ХС-[14с]-олеат-ацетил-ЛНП в культуре № (М - ш)

Концентрация, Соединение №г/мл

Захват ХС-[. с]-олеат-аиетил-ЛНП в мг анетил-ЛШ1/мг клеточного белка/ 4 ч инкубации

Контроль - 413,4 + 19,8

КМ-глюкан

I фракция 100 375,4 ± 23,5

2 фракция IC0 130,3 + П,8Ж

Зимозан 100 178,4 + 13,1"®

Б Ц Е 100 416,3 + 19,0

ЛПС 100 225,3 + 14,1®

Родэксман 100 397,8 + 28,0

Достоверность изменения во личин по сравнению с контрольным: ж - Р <0,05; ш - Р <0,01. Ф.сло опытов - 3, в трех параллелях.

в присутствии ацетил-ЛНП в Ш, вызванное действием этих препаратов, связано с подавлением поглощения ацетил-ЛНП. Полученные результаты о действии ЛПС и зимозана на метаболизм ацетил-ЛНП хорошо согласуются с данными экспериментов на культуре моноцитов человека (Lopez-Virella ,1987) и I® мыши (Lealse et al.,1989)

Мы обнаружили, что КМ-глюкан (2 фр.) по сравнению с другими ИМ обладал наиболее выраженной способностью тормозить биосинтез ЭХС в культуре №, инкубированных в присутствии ацетил--ЛБП (табл.1). Мы предположили, что наличие отрицательно заряженных карбоксиметильных групп в структуре КМ-глюкана создает условия для его высокого сродства к скэвинджер-рецепторам на поверхности MS. Полученные наш данные о том, что КМ-глюкан в относительно низких концентрациях предотвращал увеличение синтеза ЭХС в присутствии ацетил-ЛНП можно объяснить конкуренцией КМ-глюкана'с ацетил-ЛНП за связывание с этими рецепторами. Это предположение подтверждено при сравнении влияния декстрансуль-фата (известного лигавда скэвинджер-рецепторов) и КМ-глюкана ' (2 фр.) на скорость эстерификации XG в I® в присутствии ацетил-ЛНП (рис.1). Наш обнаружено, что оба препарата сходным образом влияли на этот показатель. КМ-_глюкан в концентрации 2 нМ сникал скорость эстерификации ХС до 30% от исходного уровня, и декстрансульфат в аналогичной концентрации полностью блокировал захват ацетил-ЛНП клетками. Повышение концентрации КМ-глюкана до 30 нМ приводило к прекращению эстерификации ХС ацетил-ЛНП. Электронно-микроскопические исследования тоже показали, что КМ-глюкан в концентрации 10 НМ снижал накопление липидныхх включений в четыре раза по сравнению с контролем.

Хорошо известно, что различные секреторные продукты активированных Ш (ФНО, M-I, ПГ) и лимфоцитов интерферон-^ (ИФНГ) обладают мощным модулирующим влиянием на метаболизм резидентных моноцитов и Щ (Lopez-Virella ,1987; Маянский Д.Н. и др.,1992). Нами были исследованы эффекты супернатантов от ми-тоген- и аллогенстимулированных лимфоцитов (ЛФ), ЛПС-стимули-рованных № и рекомбинантного ФНО-сС на процесс эстерификации ХС в резидентных 1®, инкубированных в присутствии ацетил-ЛНП (рис.2). Обнаружено, что супернатант от КонА-стимулированных ЛФ дозозависимо (разведение от 1% до 50%) снижал этот показатель (от 20 до 44% соответственно). Подобным эффектом обладал

Рис.1. Скорость включения [Мс]-олеата в ЭХС перитоне-альных МФ в присутствии КМ-глюкана (2 фр.)(в) и декстран' сульфата (о) .

По оси.абсцисс - концентрация КМ-глюкана и декстрансуль-фата в нМ.

По оси ординат - включение [^^с]-олеата в ЭХС, %. Число опытов - 4.

КонА-стимулированные ЛФ

"( А ) 1+1 хх

I:.

скл

( Б ) **

я

I 10 50

I 25 50

1,0..

0,5

ЛПС-стимулированные ( В )

нн

гЬ

5 25 50

10

I -

ФНО- оС

к

( Г } г^

* * т

5 10 25 50 100 200

5

Рис.2. Влияние супернатантов от КонА-стимулированных ЛФ (А), от СКЛ (Б), ЛПС-стимулированных М$ (В) и ФН0-о<(Г) на включение [^с]-олеата в ЭХС в присутствии ацетил-ЛНП. По оси абсцисс - А,Б,В - разведения супернатантов в % от исходного; Г - концентрация в нг/мл.

По оси ординат - включение [*4с] -олеата в ЭХС в нмолях/ мг клеточного белка/ 4 ч инкубации.

( Щ ) - контроль: А - КонА (5мкг/мл) + супернатант от нестиму— лированных ЛФ; Б - общий супернатант двух нестимулированных линий ЛФ; В - супернатант от нестимулированных МФ + ЛПС (25 мкг/ мл); Г - среда культивирования.к -р<0,05; хэе -р<0,01.

12

супернатант от СКЛ: так, 50-е разведете приводило к снижению эстерификации XG в 2,4 раза (рис.2). Супернатант от ЛПС-стиму-лированных 'J® действовал противоположным образом: повышал этот показатель на 30$ (при 50$ разведении этого супернатанта). ФНО- Ы. в низких концентрациях 5 нг/мл снижал скорость эстерификации ХС в I®, при дальнейшем повышении концентрации есть тенденция к увеличению. При более высоких концентрациях этот цито-кин, вероятно, оказывает влияние не только на захват и катаболизм ацетил-ЛШ, но, как это следует из наших дальнейших экспериментов, оказывает непосредственное влияние на скорость эсте~. рификации ХС в I®, инкубированных в отсутствии ацетил-ЛШ. Основным цитокином, секретируемым митоген- и аллогенстимулирован-ными ЛФ, является ИФНГ; можно предположить, что он снижает экспрессию рецепторов к ацетил-ЛШ Ю, приводя к снижению скорости эстерификации ХС в МФ. Подученные данные согласуются с результатами Pong с соавторами (1990), показавшими, что ИФНГ обладает способностью снижать экспрессию скэвинджер-рецепторов в I®, ЛПС-стимулированные МФ секретируют целый ряд цитокинов, среди которых доминируют ИЛ-I и ФНО- оС (Van Lenten ,1992). В условиях нашего эксперимента обнаружено, что супернатант от активированных ЛПС Г.® повышал этот показатель, что, вероятно, отражает суммарное влияние различных медиаторов на метаболизм ацетил-ЛШ в резидентных МФ.

2. Включение [14с]-олеата в ЭХС, ТГ и ФЛ МБ, стимулированных зимозаном in vivo и in vitro.

С целью изучения особенностей биосинтеза липцдов и деградации ацетил-ЛШ в № из очага воспаления мы получали перито-неальные Ш в различные сроки после внутрибрюшинного введения мышам зимозана. Исследование деградации [ i] -ацетил-ЛШ в МФ, полученных через 24 ч после введения зимозана показало, что происходит снижение деградации меченых ацетил-ЛШ на 44$ по сравнению с контролем (введение физиологического раствора). В то же время в безлипидной среде обнаружено резкое увеличение скорости включения [14с]-олеата в эфиры холестерина (ЭХС), тригли-цериды (ТГ) и фосфолипиды (ФЛ) в инкубированных клеткйХ (рис.3). Максимум включения олеата в липиды наблюдали, через 18-24 часа (увеличение включения [14с]-олеата в ЭХС - в',II раз, в ТГ - в

Рис.3 . Динамика скорости включения [-олеата в ЭХС, ТГ и ФЛ перитонеальных МФ после внутрибрюшинного введения PBS (I) и зиыозаиа в концентрации 2 мг/Ю г веса мыши (2). По оси абсцисс - время в часах после введения зимозана. По оси ординат - включение [^с] -олеата в ЭХС, ТГ и ?'Л. За 100% принято : в ЭХС - 9,57, ТГ - 36,67, ФЛ - 1069 нмоль эстерифициро-ванного олеата /иг клеточного белка /4 часа. Достоверность величин по сравнению с контролем (PBS): к- р<0,05, нх- р<0,01. Число экспериментов -3., в трех параллелях.

9 раз, в ФЛ - в 2 раза). В более отдаленные сроки (72 и 120 ч) после введения препарата животным происходило значительное снижение этих показателей, которые, однако, оставались выше исходного уровня.

В связи с отсутствием изменений биосинтеза липидов при действии зимозана in vitro (200-500 мкг/мл) (табл.1), мы предположили, что действие этого препарата обусловлено освобождением воспалительных медиаторов. Действительно, при инкубации рези -дентных Ш с сывороткой крови и перитонеальным экссудатом, полученными через 24 ч после введения мышам зимозана, скорость включения олеата в ЭХС увеличивалась. Подобным эффектом стимулировать скорость включения меченого олеата в ЭХС, ТГ и ФЛ обладали также супернатанты от КонА-стимулированных ЛФ, СКЛ, ЛПС-стимулированных щ (табл.3). ФН0-°< также обладал значительным стимулирующим действием на биосинтез липидов в резидентных ® (табл.3). Интересно, что этот эффект различных медиаторов воспаления реализуется в отсутствии липидов в культуральной среде. Обнаруженные нами увеличения биосинтеза ЭХС и ГГ в резидентных Ш, которые, вероятно, реализуются в результате действия цито-кинов на неактивированную клетку, в литературе не описаны. Имеются лишь фрагментарные данные о способности ФИО-с* стимулировать синтез ТГ в гладкомышечных клетках сосудов (stein et al.,

1991). Обнаруженный феномен может иметь отношение к процессу формирования пенистой клетки при атеросклерозе, который в настоящее время рассматривается как разновидность хронического зоспалниельного заболевания ( ЫЪЪу et al.,1991; Siele et al.,

1992).

При введениии стимуляторов С.® in vivo важной мишенью их действия являются непаренхиматозные клетки печени, главным образом, клетки Купфера. Хорошо известно, что основное количество Г® в организме локализуется в печени, и непаренхиматозные клетки печени играют существенную роль в ЛП обмене (van Berkel, 1989,1991).

4. Влияние зимозана и хлористого гадолиния на развитие гиперхолестеринемии и активность ЛХЭ в печени мышей.

Для определения роли клеток С® в регуляции содержания'ХС в крови и активности ключевых ферментов гидролиза ХС в печени

Таблица 3

Влияние супернатантов стимулированных Ш, ЛФ и ФНО-оС на включение [14с] -олеата в ЭХС и ТГ резидентных I,® в отсутствии ацетил-ЛНП ( ы * т )

Соединение, его Включение те -олеата в ЭХС и

„ ТГ в нмолях эстерифицированного

концентрация олеата/мг клеточного белка, 4 ч

ЭХС ТГ

Контроль (среда) 0,11*0,0007 4,5*0,54

Супернатант нестимулированных ЛФ 0,21*0,0002®** 7,7*0,34*

КонА ( 5 мкг/мл) 10$ 0,16*0,014 4,7*0,84

С 5 мкг/мл) 50$ 0,24*0,040 7,4*0,59

(25 мкг/мл) 50$ 0,16*0,005®* 9,6*1,02*

Супернатант от КонА (5 мкг/мл)-стимулиро-ванных ЛФ 1$ ш 0,12*0,023 0,29*0,065 8,3*0,13 9,3*0,44

50$ 0,48*0,01*** 13,2*0,59*

(25 мкг/мл) 50$ 0,56*0,06*® 14,6*0,70**

Контроль (среда А) 0,17*0,019 6,4*0,16

Супернатант нестимули- I линии 0,19*0,019 11,9*0,14

рованных ЛФ 2 линии 0,21*0,013 9,9*0,75

Супернатант СКЛ('1 и 1% 0,23*0,011 8,7*0,94

2 линии) 25$ 0,45*0,044* 11,3*0,45®*

50$ 0,72*0,047** 19,1*1,II***

Контроль (среда А) 0,18*0,020 5,4*0,55

Супернатант от нестимулированных 0,20*0,08

№ + ЛПС (25 мкг/мл) 7,7*0,12

Супернатант от ЛПС-сти- 5$ 0,18*0,028 5,3*0,14

мулированных Ш 25$ 0,32*0,048я® 9,7*0,87*

50$ 0,41*0,050* 12,8*0,89***

Контроль (среда А) 0,65*0,023 27,6*0,08

Ф Н 0 - с< 5 нг/мл 0,86*0,046 26,8*0,22

10 нг/мл 1,17*0,079* 46,6*0,33

25 нг/мл 1,62*0,019** 39,3*0,75**

50 нг/мл 1,86*0,092** 42,6*0,58*

100 нг/мл 2,54*0,072** 46,8*0,25**®

200 нг/мл 1,91*0,244 42,8*0,65**

Достоверность: к-Р <0,05; аж • - Р <0,01; лаж - Р <0,001..

Число экспериментов - 3, в трех параллелях.

15

мы моделировали активацию и блокаду клеток СШ у мышей при введении им зимозана и хлористого гадолиния соответственно. Активацию и блокаду клеток С® оценивали по индексу фагоцитоза коллоидного углерода и увеличению активности лизосомных ферментов з сыворотке и печени животных. При введении зимозана активность лизосомных гликозидаз -и -ацетилглюкозаминидазы, р-и-ацв-тилгалактозамйнидазы) и цистеиновых протеиназ в печени максимально повышается на 5 сутки (БаПаа еъ а1. ,1991). Однократное введение зимозана мышам, а также крысам сопровождалось стимуляцией фагоцитоза коллоидного углерода (1-5 сутки), а хлористого гадолиния - подавлением этого показателя (I сутки) (Уразгалиев К.Ш. и соавт.,1992).

Как видно из рис.4,зимозан снижал уровень ХС в крови животных, получавших пищу с 5% 1С, лишь на 5 сутки после его введения (у контрольных - на I сутки). Напротив, на 5 сутки после введения хлористого гадолиния контрольным животным наблюдалось увеличение уровня ХС в крови. У животных, получавших с пищей ХС, хлористый гадолиний увеличивал содержание ХС в сыворотке крови на I и 5 сутки.

Зимозан стимулировал активность ЛХЭ как у контрольных мышей, так и у животных, получавших ХС с пищей (табл.4). Активность

Таблица 4

Влияние зимозана и хлористого гадолиния на активность лизосомной холестерол/'эстеразч печени мыией, получавших стандартную или 5% холестериновую диету (М - а )

№№ Группы Сут- Удельная активность ХЭ в нмолях гадро-пл. животных ки лизованного холестерололеата/мин/мг

_белка_

Стандартная 5% холестериновая

диета диета

I. Контроль 5 0,52 + 0,04 0,19 + 0,02

2. Зимозан 5 0,84 + 0,10® 0,34 + 0,05®

3. Хлористый + 0,20 +

гадолиний 5 0,42 0,03 0,03

Число животных в группе - 6. ж - Р<0,05

А Б

12 5 12 5

Рис.4. Уровень XG в крови мышей при активации СШ зимозаном (100 мг/кг веса мыши) и блокаде хлористым гадолинием (20 мкг/ кг веса мыши).

А - стандартная диета; Б - Ъ% холестериновая диета. По оси абсцисс - время в сутках после введения препарата. По оси ординат - концентрация XG в плазме крови, мМ/л. Условные обозначения: (О) -зимозан; (©) - хлористый гадолиний; O) -Q,9% JfaCI (контроль).

этого фермента в печени после введения хлористого гадолиния не изменялась, хотя у контрольных животных уменьшалась ~ в 2 раза. Полученные результаты указывают на возможность использования стимуляторов С® при гиперхолестеринемии для снижения уровня ХС в плазме и активации катаболизма ЭХС ЛП в клетках печени.

Мы исследовали возможности использования стимуляторов СШ как протекторов развития гиперлипидемии и дефицита ЛХЭ в печени при введении тритона .vR -1339.

5. Влияние КМ-глюкана (2 фр.) и зимозана на развитие липи-доза у крыс, индуцированного тритоном WR-I339.

Известно, что тритон ivR-1339, накапливаясь в лизосомах клеток печени ('Vattiaux ,1966), избирательно ингибирует липо-литические ферменты (Hayashi et al. ,1981; Короленко Т.А.,1983). При этом развивается гиперлипидемия, а в клетках печени наблюдается нарушение деградации ЛП, что ведет к повышению содержания ЭХС и ТГ (Душкин М.И., Долгов А.В.,1986).

При стимуляции С® КМ-глюканом (2 фр.) индекс фагоцитоза коллоидного углерода in vivo и способность № восстанавливать нитросиний тетразолий в культуре максимально увеличены через 72 часа (Vereschagin et al. ,1991). Предварительное введение КМ-глюкана (2 фр.) интактным животным приводило к значительному снижению уровня ХС в крови (рис.5). Уровень ХС у интактных животных после введения зимозана также снижался. Предварительное введение как зимозана, так и КМ-глюкана (2 фр.) животным, получавшим тритон vVR -1339, снижало уровень ХС на 34 и 40$, соответственно (рис.5). Данные препараты оказывали выраженный активирующий эффект на ЛХЭ печени крыс (рис.6). При этом КМ-глюкан (2 фр.) в большей степени стимулировал активность этого фермента по сравнению с зимозаном у интактных животных. Введение тритона WH -1339 крысам вызывало снижение активности ЛХЭ в печени в 2 раза по сравнению с контролем (рис.6). Как КМ-глюкан (2 фр.), так и зимозан предотвращали ингибирующий эффект тритона WH-I339, восстанавливая активность ЛХЭ до контрольного уровня.

Таким образом, полученные данные свидетельствуют о возможности использования исследованных стимуляторов СМ5 in vivo для активации катаболизма ЛП в печени и коррекции уровня ХС в плаз-

А Б

Рис.5 • Влияние КМ-глюкана и зимозана на содержание общего ХС плазме крови интактных (А) и после введения тритона 1339 (Б). I - контроль, 0,9% ]ГаС1, 2 - зимозан (100 мг/кг веса), 3 - КМ-глкжан (50 мг/кг веса), 4 - тритон ^Я-1339 ( 85 мг/Ю0г веса), 5 - зимозан, введенный за 48ч до тритонаМЦ -1339, 6 - КМ-глюкан, введенный за 48ч до тритона ^К-133Э. По оси ординат - концентрация общего ХС в плазме крови в ммолях/л. зф<0,05; ж« р<0,01. Число животных в каждой группе - 8.

19

4,0.. 3,0..

2,0-1,0

I 2 3

4 5 6

Рис. 6• Влияние КМ-глюкана (2 фр.) и зимозана на активность ЛХЭ печени у интактных животных (А) и после введения тритона МП -1339 (Б).

I - контроль, 0,9%, №аС1; 2 - зимозан ( 100 мг/кг веса )*,3 -КМ-глюкан ( 50 мг/кг веса); 4 - тритон МП -1339 ( 85 мг/ЮО г веса); 5 - зимозан, введенный за 48 ч до тритона VI//?, -1339; 6 - КМ-глюкан, введенный за 48 ч до тритона -1339. По оси ординат - удельная активность ЛХЭ печени в нмолях гид-ролизованного холестерололеата х мин-^ х мг белка"^. р1)3<0,01', 0,05; р4)5<0,05; р4)6<0,01.-Число живот-

ных в каждой группе - 8.

ме крови. При втом, не исключено, что секретируемые при действии данных ИМ цитокины могут оказывать непосредственное влияние на обмен ХС в Щ, препятствуя образованию пенистых клеток в-результате снижения метаболизма модифицированных ЛНП.

ВЫВОДЫ

1. Стимуляторы СЮ зимозан, КМ-глюкан (2 фр.), супернатанты от КонА-стабулированных лимфоцитов и СКЛ снижали скорость эсте-рификации холестерина в №, культивируемых с ацетил-ЛНП, что свидетельствует о возможности предотвращения этими препаратами накопления эфиров холестерина в клетках и трансформации Щ в пенистые клетки,

2. Биохимические и электронно-микроскопические исследования показывают, что действие КМ-глюкана (2 фр.) на метаболизм ацетил-ЛНП в культуре Ш связано с его способностью эффективно препятствовать захвату ацетил-ЛНП и их катаболизму путем конкуренции за связывание со скэвиндаер-рецепторами Ш.

3. Перитонеальные ш, выделенные через 24 ч после однократного введения зимозана, и резидентные перитонеальные AS, инкубированные с зимозаном in vitro , обладали сниженной способностью к захвату и деградации ацетил-ЛНП.

4. Перитонеальные Ш, подученные после внутрибрюшинного введения зимозана мышам, показали высокую способность включать [14с]-олеат в ЭХС, ТГ и ФЛ (максимум активации 18-24 ч) в без-липидной среде. Спустя 72-120 ч наблюдалось снижение этих показаний, которые, однако, оставались выше исходного уровня. Эти результаты указывают на повышение скорости синтеза нейтральных липидов в Ш из очага воспаления, что способствует превращению их в пенистые клетки.

5. Преинкубация резидентных перитонеальных МФ в отсутствие ацетил-ЛНП в течете 24 ч с сывороткой крови и перитонеальним экссудатом стимулированных in i/'Vo зимозаном животных, ФН0-с<., супернатантами от СКЛ, КонА-стимулированных ЛФ, ЛПС-стимулиро-ванных I® приводила к увеличению включения [14с]-олеата в ЭХС

и ТГ, что свидетельствует об индукции синтеза липидов в ffi при их премировании воспалительными медиаторами.

6. Стимуляция СМ зимозаном и КМ-глюканом (2 фр.) вызыва* ла повышение активности ЛХЭ печени у интактных крыс, предотвращала снижение активности этого фермента при введении тритона W-I339,4to свидетельствует о способности данных иммуномодуля-торов стимулировать катаболизм липопротеинов в печени и корригировать содержание холестерина в крови.

СПИСОК РАБОТ, опубликованных по теме диссертации

1. Сафина А.Ф., Короленко Т.А., Душкин М.И. Преимущества использования флуоресцентных субстратов для раздельного определения катепсинов В, L и Н при стимуляции макрофагов// Тезисы докладов 1У Всесоюзного совещания "Люминесцентный анализ в медицине и биологии и его аппаратурное обеспечение"-М.- i992.- Вып.4. -С.Ю

2. Короленко Т.А..Верещагин Е.И..Уразгалиев К.Ш., Сафина А.Ф., Кашкина М.А., Сандула Й. Иммуномодуляторы - дрожжевые полисахариды, лизосомотропные свойства и биологический эффект// Тезисы докладов 1-го Российского Конгресса "Человек и лекарство".- М.-1992,- С.100

3. Уразгалиев К.Ш. ,/,Ьнкина Г.И. .Правоторов Г.В. ,Демиденко Н.Я., Сафина А.Ф. .Кашкина .Л. А., Короленко Т. А. Ьндоцитоз клетками печени при стимуляции системы мононуклеарных фагоцитов дрожжевыми полисахаридами// Воллетень эксперим.биологии и медицины. -1992 .- й У. - С.276-278

4-. Safina A.F.,Korolenko T.A.,Mynfeina G.I.,Dushkin M.I. and. Krasnoselskaya G.A. Immunomodulators, inflammation and lysosomal proteinases of macrophages//International Conference ¡CIUIN'91, Munich. Abstracts/Munich,Germany, 1991.- P.191

5. ivorolenko T.A., Safina A.P., Vereschagin E.I., and Dushkin И. Macrophage stimulation and proteinase/proteinase inhibitors balance during inflammation // Folia Histochemica et Oyto-biologica. - 1992.- V.30, N 4.- P.215-218

6. Korolenko T. A., Safina A.F., Dushkin M.I. .Veresohagin E.I. and Kukavishnikova E.V. Macrophage stimulation and proteinases/proteinases inhibitors balance // Abstracts of 6th International Symposium on Cells of the Hepatic Sinusoid/ Antwerp,Belgium. - 1992.f P.98

7. Safina A.F.,Korolenko T.A.,Kynkina G.I.,Dushkin H.I. and Krasnoselskaya G.A. liver and serum lysosomal enzymes activity during zymosan-induced inflammation in mice // Agents and Actions. Supplements. -1992. -V.58(111).-P.370-375

8. Korolenko 5.A., Urazgaliyev K.S&.,Dushkin K.I.,Safina A.F., Vereschagin E.I. and Sandula J. Mechanism of macrophage stimulation induced by yeast polysaccharides and their dederivatives // 6th Bratislava Symposium on Saccharides/ Smo-lenice,Czechoslovakia,1992. -P. 3- 6

9.Korolenko T.A., Vereschagin E.I., Urazgaliyev K.Sh.,Safina A.P., Duchkin M.I.,Arkhipov S.A. and Sandula J. Immunomodulatory and antiproteolytic function of acute phase proteins//Satel-lite Symposium.of the 8th International Congress of Immunology/ Krakow,Poland. -1992. - P.45

10.Dushkiii H.I.,Safina A.F., Korolenko T.A., and Pravotorov G.V. Interaction of carboxymethylated J}-1,3-glucan with scavenger receptors of murine peritoneal macrophages // XII International Symposium on Glycoconjjugates/Krakow,Poland. -1933. - P.303

11.Korolenko T.A., Dushkin K.I., Vakulin G.K. ,Sa£ina A.F. and Usynin I.P. Experimental models of lysosomal storage and prevention of their development //The Second International Duo-dec in Symposium/ Ha3vik>?inland. - 1993. - P.80

12.Korolenko T.A.,Safina A.F.,Dushkin M.I.,Vereschagin E.I., Urazgaliyev K.Sh., and Arkhipov S.A. Macrophage secretion of of inflammatory mediators during treatment by new immunomodulators - yeast polysaccharides// Abstracts of the International Conference Kiura'93/Guaru3a,Brazil.-1993. -P.39

13.Krylova I.N., Dushkin K.I.,£afina A.F., and Korolenko T.A. Zymosan corrects lioid metabolism disturbances during Triton WR 1339-induced hyperlipidemia in rats //. Abstracts of the International Conference KININ193/Guaruja, 3razil.-1993--P.23

3an.Tap.100. IIeq.a.1,0 Tun.CO PAMH. HoBocn<5npcK, 1993.