Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Роль транспортера ABCG1 и аполипопротеина A-I в формировании предрасположенности к атеросклерозу

ВАК РФ 03.01.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Роль транспортера ABCG1 и аполипопротеина A-I в формировании предрасположенности к атеросклерозу"

На правах рукописи

Лi¿Г^

МИРОШНИКОВА Валентина Вадимовна

Роль транспортера ABCG1 и аполипопротеина A-I в формировании предрасположенности к атеросклерозу

03.01.03 - молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург 2014

2 СКТ 2014

005552941

Работа выполнена в Отделении молекулярной и радиационной биофизики Федерального государственного бюджетного учреждения «Петербургский институт ядерной физики им. Б. П. Константинова» Национального исследовательского центра «Курчатовский институт», г. Гатчина.

Научный руководитель: Шварцман Александр Львович,

доктор биологических наук,

заведующий лабораторией молекулярной генетики человека ФГБУ «Петербургский институт ядерной физики им. Б. П. Константинова» НИЦ «Курчатовский институт», г. Гатчина.

Официальные оппоненты: Горбунова Виктория Николаевна,

доктор биологических наук, профессор кафедры медицинской генетики ГБОУ ВПО «Санкт-Петербургский государственный педиатрический медицинский университет» Минздрава РФ, г. Санкт-Петербург,

Черкашин Дмитрий Викторович,

доктор медицинских наук, начальник кафедры военно-морской терапии ФГБВОУ ВПО «Военно-медицинская академия им. С. М. Кирова» МО РФ, г. Санкт-Петербург.

Ведущая организация: - Федеральное государственное бюджетное

учреждение «Научно-исследовательский институт акушерства и гинекологии им. Д. О. Отта» РАМН, г. Санкт-Петербург.

Защита состоится г. в часов на заседании

Диссертационного совета Д.002.230.01 на базе ФГБУН «Институт цитологии» РАН по

адресу: 194064, г. Санкт-Петербург, Тихорецкий пр., д. 4.

Сайт института Ьйр//\\гту.су1зрЬ.гззьги

Адрес электронной почты института cellbio@incras.ru

Факс института 8 (812) 297 35 41.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУН «Институт цитологии» РАН и на сайте www.cytspb.rssi.ru

Автореферат разослан г.

Ученый секретарь

Диссертационного совета „

кандидат биологических наук гС1^^ £ в. Каминская

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Заболевания сердечно-сосудистой системы, обусловленные атеросклерозом, занимают первое место среди причин, приводящих к смерти во многих странах мира, в том числе в России. По данным Министерства здравоохранения Российской Федерации, доля смертей от сердечно-сосудистых заболеваний в структуре общей смертности населения составляет более 50 % (Бокерия и др., 2007).

Атеросклероз — распространенное заболевание, характеризующееся возникновением в стенках артерий очагов липидной инфильтрации и разрастания соединительной ткани с образованием фиброзных бляшек, суживающих просвет и нарушающих физиологические функции пораженных артерий, что приводит к органным и общим расстройствам кровообращения (Аронов, Лупанов, 2009). Существенное значение в патогенезе атеросклероза имеют нарушения липидного обмена, в частности повышение уровня общего холестерина (ОХС) и снижение уровня антиатерогенных липопротеинов высокой плотности (ЛПВП) плазмы крови (Kontush, Chapman, 2006). В то же время атеросклероз нередко развивается и у лиц с нормальным уровнем липидов плазмы крови. Это свидетельствует о том, что ведущую роль в атерогенезе может играть снижение скорости элиминации холестерина (ХС) из клеток интимы артерий, приводящее к его накоплению в артериальной стенке.

Атеросклероз является сложным многофакторным заболеванием, в развитии которого существенное значение имеет генетический компонент. Исследования уровня конкордантности при анализе близнецовых пар показали, что вклад наследственной предрасположенности в развитие сердечно-сосудистой патологии оценивается от 30 до 60 % (Sivapalaratnam, 2011). Генетическая предрасположенность относится к немодифицируемым факторам риска данного заболевания и имеет особенное значение в развитии атеросклероза в молодом возрасте. Известно, что полиморфные варианты генов вносят существенный вклад в вариации липидного профиля плазмы крови и развитие атеросклероза (Teslovich et al., 2010; Edmondson et al., 2011). Эпидемиологические исследования позволяют также предполагать, что изменения на уровне экспрессии генов могут вносить существенный вклад в развитие атеросклероза (Seo et al, 2004; Sinnaeve et al, 2009). Однако конкретные механизмы наследственной предрасположенности к атеросклерозу до настоящего времени остаются недостаточно изученными. Поэтому актуальность исследований, посвященных изучению молекулярно-

генетических основ развития атеросклероза, направленных как на создание эффективной системы профилактики данного заболевания, так и на поиск новых молекулярных мишеней для антиатерогенной терапии, не вызывает сомнения.

Учитывая современные представления о патогенезе атеросклероза и роли моноцитов и макрофагов сосудистой стенки в накоплении липидов и инициации формирования атеросклеротических бляшек, для настоящего исследования были выбраны генетические детерминанты обратного транспорта ХС (ОТХ), которые предположительно могут определять скорость элиминации ХС из сосудистой стенки. Аполипопротеин A-I (Ano A-I) является основным фактором, определяющим концентрацию ЛПВП в плазме крови, играя при этом важнейшую роль в биосинтезе, структуре и обеспечении функции ЛПВП (Kontush, Chapman, 2006). Снижение концентрации Ano A-I в плазме крови является независимым фактором риска развития атеросклероза {Chan, Watts, 2006). Транспортер ABCG1 осуществляет перенос ХС и оксистеролов через мембрану клетки на частицы ЛПВП (Gelissen et al., 2006; Terasaka et al., 2007). Ano A-I и транспортер ABCG1, таким образом, играют ключевую роль в эффективной мобилизации ХС из макрофагов и предотвращении их трансформации в пенистые клетки. Поэтому в настоящем исследовании была изучена роль экспрессии гена ABCG1 в моноцитах и макрофагах и полиморфных вариантов генов ABCG1 и АРОА1 в формировании предрасположенности к атеросклерозу.

Цель исследования

Исследование ассоциации уровня экспрессии гена ABCG1 и вариантов генов ABCG1 и АРОА1 с атеросклерозом в популяции Санкт-Петербурга.

Задачи исследования

1. Анализ уровня мРНК гена ABCG1 и содержания белка ABCG1 в моноцитах и макрофагах у пациентов с атеросклерозом и в контрольной группе.

2. Анализ ассоциации уровня экспрессии гена ABCG1 со степенью тяжести атеросклеротических поражений сосудов.

3. Оценка вклада вариантов генов ABCG1 ((-134)Т> G, (-204)А > С и (~384)G > А) и АР О Al {(-75)G > А и 83 С > Т) в риск развития атеросклероза в популяции Санкт-Петербурга.

4. Анализ ассоциации вышеперечисленных вариантов генов ABCG1 и АРОА1 с уровнем ОХС и ХС в составе ЛПВП (Х-ЛПВП) плазмы крови.

Научная новизна

1. Впервые у пациентов с атеросклерозом, не принимающих статины и другие гиполипидемические препараты, была исследована экспрессия гена транспортера АВСС1 в моноцитах и макрофагах, стимулированных фактором М-СББ. Впервые показана корреляция уровня экспрессии гена АБСа в моноцитах и степени артериального стеноза у пациентов с атеросклерозом. Впервые выявлен сниженный уровень мРНК АБСа и белка АВС01 в дифференцированных макрофагах у пациентов с атеросклерозом.

2. Впервые определены частоты вариантов (-134)Т > Б, (~204)А > С и (-384)0 > А гена АБС01 в популяции Санкт-Петербурга среди индивидуумов контрольной группы и пациентов с атеросклерозом. Впервые показана ассоциация вариантов (~134)Т > О и (~204)А > С гена АБСа с уровнем ОХС плазмы крови у жителей Санкт-Петербурга.

3. Впервые исследован вклад вариантов (-75)0 > А и 83С > Т гена АРОА1 в формирование предрасположенности к атеросклерозу в популяции Санкт-Петербурга. Выявлена ассоциация аллеля Т83 гена АРОА1 с повышением концентрации Х-ЛПВП и со снижением риска развития атеросклероза у жителей Санкт-Петербурга.

Теоретическая и практическая значимость работы

Результаты настоящего исследования представляют интерес для понимания молекулярно-генетических основ развития атеросклероза. Показано, что снижение уровня экспрессии гена АБСа в моноцитах и макрофагах может являться значимым фактором в развитии и прогрессировании атеросклеротического процесса. Полученные данные об ассоциации уровня экспрессии гена АБСа с атеросклерозом у человека могут быть полезны для разработки новых методов в коррекции атеросклероза. С целью своевременной профилактики полученные данные могут также быть использованы для формирования групп повышенного риска развития атеросклероза.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Уровень мРНК гена АБСа и белка АВС01 снижен в макрофагах у пациентов с атеросклерозом.

2. Пациенты с окклюзиями артерий характеризуются пониженным уровнем мРНК гена АБСа в моноцитах по сравнению с пациентами, не имеющими окклюзий, и по сравнению с контрольной группой.

3. Варианты С(-134) и С(-204) гена АБСа ассоциированы с повышением концентрации ОХС плазмы крови у жителей Санкт-Петербурга.

4. Вариант Т83 гена АРОА1 ассоциирован со снижением относительного риска развития атеросклероза и с повышением концентрации Х-ЛПВП плазмы крови у жителей Санкт-Петербурга.

Личное участие автора в получении результатов, изложенных в диссертации

Осмотр и ангиографическая диагностика атеросклероза у пациентов, забор у них периферической крови, измерения концентрации липидов плазмы крови осуществлялись сотрудниками ПСПбГМУ им. акад. И. П. Павлова и Центра атеросклероза и нарушений липидного обмена клинической больницы № 122 г. Санкт-Петербурга. Культивирование моноцитов выполнено на базе отдела биохимии ФГБУ «НИИЭМ» РАМН под руководством д. м. н., проф. А. Д. Денисенко. Культивирование макрофагов выполнено совместно с научным сотрудником ФГБУ «ПИЯФ» НИЦ «Курчатовский институт» Е. П. Деминой. Анализ уровня мРНК АБСа и содержания белка АВС01 в моноцитах и макрофагах выполнен автором лично. Выделение ДНК для создания банка ДНК пациентов с атеросклерозом и контрольной группы выполнено автором лично. Типирование полиморфных вариантов генов АБСа и АРОА1 проведено автором лично. Автор провел статистический анализ всех полученных данных и сформулировал выводы. Описание собственных исследований, анализ и обсуждение результатов выполнены автором самостоятельно. Материалы, вошедшие в представленную работу, обсуждались и публиковались совместно с соавторами и научным руководителем.

Апробация работы

Результаты работы были доложены на Российском национальном конгрессе кардиологов, Москва, 2008; на 7-м Международном симпозиуме «Горизонты молекулярной биологии», Гёттинген, 2010; на Всероссийской научной конференции молодых ученых «Проблемы биомедицинской науки третьего тысячелетия», Санкт-Петербург, 2010; на 65-м Международном научно-практическом конгрессе «Актуальные проблемы современной медицины», Киев, 2011; на Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Актуальные вопросы медицинской науки», Ярославль, 2013; на Европейской конференции по генетике человека, Париж, 2013; на Российском национальном конгрессе кардиологов, Санкт-Петербург,

2013; на 67-м Международном научно-практическом конгрессе «Актуальные проблемы современной медицины», Киев, 2013.

Публикации

Результаты диссертационной работы отражены в 16 печатных работах соискателя, в том числе опубликованы в 4-х статьях в рецензируемых научных журналах, рекомендованных ВАК РФ для публикации основных результатов диссертационных исследований.

Структура и объем диссертации

Диссертационная работа построена по общепринятому плану и состоит из следующих разделов: введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов, обсуждения результатов, заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 133 страницах машинописного текста, иллюстрирована 14 таблицами, 24 рисунками и фотографиями. Список литературы включает 266 наименований, из них 248 - зарубежные публикации.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования Характеристика обследованных групп

Были обследованы 222 пациента (средний возраст 53,8 ± 0,7 года, средний возраст начала заболевания 48,4 ± 0,6 лет, 70 % мужчин и 30 % женщин) с атеросклерозом, подтвержденным при ангиографическом исследовании. Критерием отбора служило наличие гемодинамически значимых стенозов как минимум в одной артерии одного из трех артериальных бассейнов -церебрального, коронарного, бассейна артерий нижних конечностей.

Контрольная группа состояла из 382 индивидуумов (средний возраст 47,1 ± 0,3 лет, 66 % мужчин и 34 % женщин). Все члены контрольной группы проходили обследование у врача-кардиолога с целью исключения диагноза сердечно-сосудистых заболеваний. Возраст лиц в контрольной группе соответствовал возрасту начала заболевания у пациентов. Все пациенты и лица, вошедшие в контрольную группу, являлись жителями Санкт-Петербурга и не были связаны узами родства.

У всех пациентов и у всех представителей контрольной группы были определены варианты (~134)Т> в (БОТ Ш гз1378577), (-204)А > С (8ЫР Ш ге 1893590) и (-384)0 А (БОТ ГО ге4148082) гена АВСв1 и варианты (~75в) > А (8ЫР ГО ге670) и 83С > Т(БШ ГО ге5069) гена АРОА1.

Для исследования экспрессии гена АБСа в моноцитах и макрофагах были отобраны подгруппы пациентов, которые не принимали статины либо другие гиполипидемические препараты, и соответствующие по возрасту контрольные группы (рисунок 1).

Рисунок 1 - Дизайн эксперимента по изучению экспрессии гена ABCG1 в моноцитах и макрофагах

Методы исследования

Мононуклеарную фракцию получали из свежесобранной периферической крови методом градиентного центрифугирования при 1 600 об./мин в растворе Фиколла (р = 1,077, GE Healthcare UK Limited, Великобритания). После двух отмывок в PBS мононуклеарные клетки ресуспендировали в культуральной среде (альфа-MEM, 10%-я эмбриональная сыворотка, 5 мкг/мл антибиотиков (пенициллин G, стрептомицин)) и инкубировали в С02-инкубаторе (5 % С02, 37 °С) в течение 2 ч. После этого клетки дважды промывали в PBS. Прикрепившиеся к чашкам Петри моноциты культивировали в присутствии колониестимулирующего фактора макрофагов M-CSF (R&D Systems, США; 15 нг/мл) в течение суток для получения более чистой культуры. Для получения макрофагов моноциты культивировали в тех же условиях в течение 5 сут. Далее моноциты и макрофаги были использованы для определения содержания мРНК ABCG1 и белка ABCG1.

Тотальная РНК была выделена с использованием набора для выделения РНК RNeasy Mini Kit (Qiagen, Нидерланды). кДНК получали методом обратной транскрипции с использованием набора iScript™ cDNA Synthesis Kit (Bio-Rad, США).

Определение уровня мРНК ABCG1 проводилось методом количественной ПЦР в режиме реального времени с флуоресцентными зондами TaqMan на приборе CFX96 Touch (Bio-Rad, США). В качестве референс-гена использовали ген АСТВ (ß-актин). В экспериментах были использованы разработанные нами олигонуклеотидные праймеры и зонды, синтезированные фирмой «Синтол» (Москва).

Содержание белка ABCG1 в моноцитах и макрофагах оценивали методом вестерн-блоттинга с использованием первичных антител к ABCG1 (1 : 500; NB400-132, Novus Biologicals, США). Результаты нормировали относительно окрашивания ß-актина (1 : 10 000; ab8227, Abeam, Великобритания). Клетки лизировали, количество общего белка определяли по методу Бредфорд с использованием соответствующего набора («Силекс», Россия) на спектрофотометре SmartSpecTMPlus (Bio-Rad, США). В экспериментах использовали вторичные антитела для ABCG1 и ß-актина — goat anti-rabbit IgG-H&L (HRP) (1:3 000; ab6721, Abeam, Великобритания). Результаты идентифицировали с использованием набора Amersham ECL™ Plus System (Amersham, Великобритания) и фотопленки СБА (Швеция).

Геномную ДНК выделяли из лейкоцитов периферической крови методом фенольно-хлороформной экстракции. Идентификацию вариантов (—75)G > А и 83С > Т проводили методом ПЦР с последующим рестрикционным анализом, как описано ранее (Pulkkinen et dl., 2000). Идентификацию вариантов (—134)Т> G гена ABCG1 проводили методом аллель-специфической ПЦР, как описано ранее (Furuyama et al., 2009). Для идентификации генетических вариантов (~204)А > С и (-384)G > А гена ABCG1 были разработаны оригинальные методы детекции на основе ПЦР и анализа полиморфизма длины рестрикционных фрагментов (Мирошникова и др., 2013).

Концентрацию ОХС и Х-ЛПВП в плазме крови измеряли на автоанализаторе А-15 (BioSystems, Испания) с использованием наборов фирмы BioSystems. Коэффициент атерогенности (К3) рассчитывали по формуле

,г ОХС—Хлпвп

К а=-. (1)

Хлпвп 4 '

Статистический анализ был проведен с использованием программы SPSS, версия 17.0. Для сравнения распределения генотипов между группами был использован критерий %2. Отношение шансов (OR) рассчитывали с 95%-м доверительным интервалом по формуле

где а и Ъ - количество больных, имеющих и не имеющих мутантный аллель, с и d - количество человек контрольной группы, имеющих и не имеющих мутантный аллель соответственно. Границы доверительного интервала (ДИ) вычисляли по формулам:

(3)

ORmm=OR« + ^\ (4)

Х2 = ((а х d) - (Ь х с) - 0,5 х nf х , (5)

где п\= а + Ъ\ щ= с + d\ т\ = а + с; ото= b + d;n = щ+ щ+ т] + т0.

Соответствие данных нормальному распределению проверялось с помощью критериев Шапиро - Уилка или Колмогорова - Смирнова, в зависимости от размера выборки. В случае соответствия данных нормальному распределению при сравнении уровней липидов плазмы крови при носительстве различных генотипов использовали ¿-критерий Стьюдента (или /-критерий в модификации Уэлча в случае неоднородных дисперсий) в случае двух выборок и метод Опе-Way ANO VA в случае трех выборок. Для проверки статистически достоверного результата, полученного при использовании One-Way ANOVA, был использован апостериорный критерий Джеймса — Ховелла. В случае несоответствия данных нормальному распределению сравнение полученных значений между отдельными группами предполагало использование непараметрического критерия Манна - Уитни. Для анализа корреляции между количественными характеристиками пользовались методом Спирмена. Значения р < 0,05 считались статистически значимыми. Средние величины приведены со стандартной ошибкой среднего.

Результаты исследования Экспрессия гена ABCG1 у пациентов с атеросклерозом

В нашем исследовании мы сравнили уровень экспрессии гена ABCG1 в моноцитах и макрофагах, стимулированных фактором макрофагов M-SCF, в группе пациентов с атеросклерозом и в контрольной группе. Использование фактора макрофагов M-SCF позволяет получить макрофаги с проатерогенным фенотипом, которые преимущественно присутствуют в атеросклеротических бляшках (Waldo et al., 2008).

На первом этапе исследования содержание мРНК АБСа было определено в моноцитах, активированных фактором М-СБР в течение суток, у пациентов с атеросклерозом и в контрольной группе. Значимых различий между группой пациентов с атеросклерозом и контрольной группой выявлено не было (рисунок 2). Индивидуумы мужского и женского пола не отличались по уровню мРНК АВС01 в моноцитах (в группе пациентов: 1,10 ±0,13 у мужчин и 1,05 ± 0,23 у женщин, р = 0,862; в контрольной группе: 1,41 ± 0,12 у мужчин и 1,11 ±0,19 у женщин, р = 0,121). На следующем этапе исследования был проведен сравнительный анализ содержания мРНК АБСа в макрофагах, полученных путем дифференцировки моноцитов в присутствии фактора макрофагов М-СвБ в течение 5 сут., у пациентов с атеросклерозом и в контрольной группе. Уровень мРНК АБСа в макрофагах в группе пациентов был ниже, чем в соответствующей контрольной группе (рисунок 2) (Мирошникова и др., 2014).

Л1окохдоты Макрофаги

п=29 п=30 п=20 п—15

Рисунок 2 - Относительные уровни мРНК АБСа в моноцитах и макрофагах у пациентов с атеросклерозом (светлые столбцы) и в соответствующих контрольных группах (темные столбцы)

Мы также провели измерения содержания белка АВС01 в моноцитах (9 пациентов и 6 контрольных образцов) и макрофагах (7 пациентов и 4 контрольных образца). Относительные уровни белка АВС01 в моноцитах не отличались и составили: для группы пациентов - 0,15 ± 0,04, для контрольной группы - 0,20 ±0,02 (р = 0,145). Содержание белка АВСв! в макрофагах у

пациентов с атеросклерозом было снижено по сравнению с контрольной группой (рисунок 3).

Контроль Пацпоиты

• " . .. Р<0.05

; _ . о

о

.о ■■'■■.7-. § ш ■ ■ : — ц у в

о

о

- о

Костраль ц=4

Падпеюы 11=7

Рисунок 3 — Результаты вестерн-блоттинга для белка АВС01 в макрофагах (А); относительные уровни белка АВС01 в макрофагах у пациентов и у лиц из контрольной группы (Б)

Мы провели анализ корреляции уровня мРНК АБСа в моноцитах со степенью тяжести атеросклеротических поражений сосудов. Уровень мРНК АБСа в моноцитах негативно коррелировал с показателем максимального артериального стеноза (г = -0,45, р = 0,016). Максимальный стеноз оценивался по данным ангиографического исследования как максимальная степень (в %) перекрытия артерии атеросклеротической бляшкой. Данная величина зависит от размера атеросклеротической бляшки. Окклюзия артерии, т. е. 100%-е перекрытие (закупорка) просвета артерии, является наиболее тяжелым случаем атеросклеротического повреждения. Уровень мРНК АБСа в моноцитах у пациентов с окклюзиями артерий различных отделов сердечно-сосудистой системы (Ы= 12) был достоверно ниже по сравнению с пациентами, не имеющими окклюзий (Ы= 18), и по сравнению с контрольной группой (АГ= 29) (рисунок 4). Следует заметить, что размер бляшки зависит от темпа накопления липидов в стенке артерии, но далеко не всегда от длительности заболевания (Липовецкий, 2000). Действительно, степень тяжести атеросклеротических повреждений у пациентов, отобранных для настоящего исследования, не коррелировала с длительностью заболевания (коэффициенты корреляции; между длительностью заболевания и показателем максимального

артериального стеноза г = 0,156, = 0,456; между длительностью заболевания и количеством пораженных артерий г = 0,161,/) = 0,443). Это, в свою очередь, указывает на возможное влияние уровня экспрессии гена АБСа в моноцитах на скорость формирования атеросклеротических бляшек.

Рисунок 4 - Относительный уровень мРНК ABCG1 в моноцитах у пациентов с окклюзиями артерий, у пациентов, не имеющих окклюзий, и в контрольной группе; *р < 0,05 по сравнению с контрольной группой и р < 0,05 по сравнению с подгруппой пациентов, не имеющих окклюзий

В то же время оценить корреляцию уровня мРНК ABCG1 в макрофагах со степенью тяжести атеросклеротического поражения не представилось возможным, т. к. данная группа пациентов была клинически однородной. Среди пациентов, которым выполнялось исследование экспрессии гена ABCG1 в макрофагах, было выявлено только 2 человека с окклюзией.

Наше исследование не продемонстрировало корреляции уровня мРНК ABCG1 в моноцитах и макрофагах с уровнем Х-ЛПВП плазмы крови ни в группе пациентов, ни в контрольной группе. В целом наши результаты согласуются с данными, полученными ранее и указывающими на то, что опосредованный транспортером ABCG1 отток ХС из макрофагов может не вносить существенного вклада в концентрацию Х-ЛПВП в плазме крови {Nakanishi et al., 2008). В то же время есть данные, что уровень мРНК ABCG1 в моноцитах отличается у людей с экстремально низкими и экстремально высокими уровнями Х-ЛПВП плазмы крови {Hohen et al., 2013). Отсутствие в нашем исследовании корреляции между уровнем экспрессии гена ABCG1 и

Х-ЛПВП плазмы крови можно объяснить тем фактом, что в наших выборках не было представлено людей с очень высоким уровнем Х-ЛПВП и большинство имело среднестатистические показатели. Известно, что атеросклероз нередко развивается и у лиц с нормальным уровнем Х-ЛПВП плазмы крови. Таким образом, концентрация Х-ЛПВП в плазме крови не всегда адекватно отражает антиатерогенную функцию ЛПВП, которая лучше характеризуется скоростью оттока ХС из макрофагов сосудистой стенки {Navab et al., 2009). В мировой литературе есть данные об ассоциации снижения уровня экспрессии гена ABCG1 со снижением ОТХ из макрофагов (Kennedy et al., 2005; Mauldin et al., 2008). Также известно, что ОТХ из макрофагов является основным средством реализации антиатерогенного потенциала ЛПВП (Kontush, Chapman, 2006). Наше исследование продемонстрировало, что уровень экспрессии гена ABCG1 в M-CSF-макрофагах снижен у пациентов с атеросклерозом. Мы наблюдали сниженный уровень мРНК ABCG1 в моноцитах пациентов с окклюзиями артерий по сравнению с пациентами, имеющими менее выраженные атеросклеротические повреждения. Суммируя полученные результаты, можно заключить, что снижение уровня экспрессии гена ABCG1 в моноцитах и макрофагах может являться значимым фактором в развитии и прогрессировании атеросклеротического процесса.

Анализ вклада полиморфных вариантов генов ABCG1 и АРОА1 в формирование предрасположенности к атеросклерозу

Частоты генотипов исследованных вариантов генов ABCG1 и АРОА1 в группе пациентов с атеросклерозом и в контрольной группе представлены в таблице 1.

В группе пациентов с атеросклерозом наблюдалось достоверное снижение частоты аллеля Т83 гена АРОА1 по сравнению с контрольной группой. Таким образом, носительство аллеля Т83 гена АРОА1 (генотипы ТТ83 и СТ83) было ассоциировано со снижением риска развития атеросклероза по сравнению с носителями генотипа СС83 (Мирошникова и др., 2010).

Частоты других исследованных вариантов генов ABCG1 и АРОА1 не отличались между группой пациентов и контрольной группой.

Таблица 1 - Частоты вариантов генов АБСа и АРОА1 в группе пациентов с атеросклерозом и в контрольной группе

Варианты генов Группа пациентов Контрольная

АБСв!и АРОА1 с атеросклерозом группа

(N=222) (N= 382)

АБСа ТТ п (%) 133 (59,9) 224 (58,6)

(~134)Т> С Тв п (%) 77 (34,7) 129 (33,8)

и (%) 12 (5,4) 29 (7,6)

аллель Т 0,77 0,76

аллель О 0,23 0,24

АБСа АА п (%) 94 (42,3) 166 (43,5)

(-204).А> С АС п (%) 99 (44,6) 167 (43,7)

СС п (%) 29(13,1) 49 (12,8)

аллель А 0,65 0,65

аллель С 0,35 0,35

АВСС1 вв п (%) 215 (96,8) 367 (96,1)

(-384)0 >А вАп (%) 7 (3,2) 14 (3,7)

АА п (%) 0(0) 1 (0,2)

аллель б 0,98 0,98

аллель А 0,02 0,02

АРОА1 вв п (%) 141 (63,5) 237 (62,0)

(■-75)в >А вАп (%) 75 (33,8) 126 (33,0)

АА п (%) 6 (2,7) 19(5)

аллель С 0,80 0,79

аллель А 0,20 0,21

АРОА1 СС п (%) 210 (94,6) 338 (88,5)

83С > Т СТ п (%) 12 (5,4) 40 (10,5)

ТТ п (%) 0(0) 4(1,0)

аллель С 0,973 0,937

аллель Т 0,027 0,063 *

* р = 0,004; СЖ(СТ+ 7Ту5. СС) = 0,44 (95%-й ДИ 0,29-0,66).

Среди больных атеросклерозом, которые не принимали статинов и других препаратов, способных повлиять на уровень липидов плазмы крови, и в контрольной группе был проведен сравнительный анализ содержания ОХС и Х-ЛПВП в плазме крови у носителей различных генотипов исследованных вариантов генов АБСа и АРОА1. В таблице 2 представлены выявленные ассоциации исследованных генотипов с уровнем липидов плазмы крови в контрольной группе.

Таблица 2 - Содержание холестерина плазмы крови при различных генотипах полиморфных вариантов генов АВС01 и АРОА1 в контрольной

группе

Варианты генов ABCG1и АРОА1 ОХС, ммоль/л Х-ЛПВП, ммоль/л Коэффициент атерогенности

ABCG1 (—134)Т> G ТТ TG + GG 5,12 ±0,11 5,62 ±0,15 р = 0,015 1,12 ±0,03 1,19 ±0,04 3,96 ± 0,20 4,08 ±0,19

ABCG1 (-204JA > С АЛ АС+СС 5,06 ±0,14 5,50 ±0,12 р= 0,037 1,14 ±0,03 1,16 ±0,03 3,85 ± 0,20 4,14 ±0,19

АРОА1 83С > Т СС СТ+ ТТ 5,52 ±0,12 5,15 ±0,19 1,13 ±0,02 1,33 ±0,08 р = 0,017 4,18 ±0,16 3,15 ±0,30 р = 0,013

Варианты G(-134) и С(-204) гена ABCG1 были ассоциированы с повышением концентрации ОХС плазмы крови в контрольной группе (Мирошникова и др., 2013). Нужно отметить, что данные варианты находятся в неравновесном сцеплении, поэтому влияние на концентрацию ОХС плазмы крови одного из полиморфных вариантов может объясняться влиянием второго варианта. Так, в группе пациентов ассоциация с уровнем ОХС плазмы крови наблюдалась только в случае вариантов (-134)Т> G гена ABCG1. Среди больных атеросклерозом носительство генотипа GG(—134) ABCG1 было ассоциировано с более высоким уровнем ОХС плазмы крови по сравнению с носителями генотипов ТТ(-134) и TGÇ-134) (6,11 ±0,22 vs. 5,30 ±0,11, /7 = 0,014). Нужно отметить, что среди пациентов все носители генотипа GG(-134) ABCG1 являлись носителями генотипа СС(—204) ABCG1, тогда как среди пациентов - носителей генотипа СС(—204) ABCG1 были носители различных генотипов (-134)Т> G ABCG1. Таким образом, самый высокий уровень ОХС плазмы крови среди пациентов наблюдался при носительстве сочетанного генотипа GG(-134)CC(-204) ABCG1.

Механизм влияния полиморфных вариантов (-134)Т> G и (-204)А > С гена ABCG1 на концентрацию ОХС в плазме крови неизвестен. Эти вариации представляют собой однонуклеотидные замены в промоторной области гена ABCG1 в позициях (-134) и (-204) от сайта начала транскрипции и могут затрагивать сайты посадки транскрипционных факторов. Ранее для вариантов G(-134) и С(-204) гена ABCG1 было показано снижение уровня транскрипции гена ABCG1 (Furuyama et al., 2009; Olivier et al., 2012). Однако наше исследование не обнаружило влияния этих вариантов на уровень экспрессии

гена ABCG1 в моноцитах и макрофагах человека. С другой стороны, не исключено тканеспецифичное влияние этих вариантов на экспрессию гена ABCG1.

Наше исследование также продемонстрировало ассоциацию вариантов 83С>Т гена АРОА1 с уровнем Х-ЛПВП плазмы крови у здоровых индивидуумов (Мирошникова и др., 2014). В контрольной группе концентрация Х-ЛПВП плазмы крови у носителей аллеля Т83 гена АРОА1 была выше, чем у носителей генотипа СС83 АРОА1. При этом коэффициент атерогенности у здоровых лиц - носителей аллеля Т83, напротив, был ниже, чем у носителей генотипа СС83 АРОА1. Следует отметить, что ассоциация аллеля Т83 гена АРОА1 с увеличением концентрации Апо A-I и Х-ЛПВП плазмы крови ранее была также показана среди белого населения США и Европы, а также в китайской популяции (Pulkkinen et al., 2000; Larson et al., 2002; Zou et al., 2003; Haase et al., 2012). Таким образом, атеропротективный эффект аллеля Т83 гена АРОА1 в популяции Санкт-Петербурга объясняется влиянием данного варианта на уровень антиатерогенных ЛПВП в плазме крови.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В настоящем исследовании у пациентов с атеросклерозом и в контрольной группе была исследована экспрессия гена транспортера АВС01 в моноцитах и макрофагах, стимулированных фактором М-С8Р. Впервые было продемонстрировано, что уровень экспрессии гена АБСа в макрофагах снижен у пациентов с атеросклерозом. У пациентов с окклюзиями артерий наблюдался сниженный уровень мРНК АБСа в моноцитах по сравнению с пациентами, имеющими менее выраженные атеросклеротические повреждения. Таким образом, можно заключить, что снижение уровня экспрессии гена АБСа в моноцитах и макрофагах может являться значимым фактором в развитии и прогрессировании атеросклеротического процесса. В данном исследовании была продемонстрирована протективная роль аллеля Т83 гена АРОА1 в формировании предрасположенности к атеросклерозу. Полученные данные могут быть использованы для формирования групп повышенного риска развития атеросклероза.

ВЫВОДЫ

1. В макрофагах, полученных при дифференцировке моноцитов в присутствии колониестимулирующегЬ фактора макрофагов М-СЭР, у пациентов с атеросклерозом снижен уровень мРНК гена АБСа и белка АВС01.

2. Уровень мРНК гена АВС01 в моноцитах снижен у пациентов с окклюзиями артерий по сравнению с пациентами, не имеющими окклюзий, и по сравнению с контрольной группой.

3. Для вариантов 0(-134) и С(-204) гена АВСй! характерны более высокие значения концентрации общего холестерина плазмы крови.

4. Носительство варианта Т83 гена АРОА1 снижает риск развития атеросклероза и ассоциировано с повышением концентрации холестерина в составе ЛПВП плазмы крови у жителей Санкт-Петербурга.

5. Варианты (~134)Т>в, (-204)А > С и (-384)0 > А гена АБСа и (-75)0 > А гена АРОА1 не влияют на риск развития атеросклероза в популяции Санкт-Петербурга.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи:

1. Мирошникова, В. В. Ассоциации генетических вариантов апопротеина А-1 с развитием атеросклероза у жителей Санкт-Петербурга /

B. В. Мирошникова, Т. И. Родыгина, Е. П. Демина, П. С. Курьянов,

C. А. Уразгильдеева, В. С. Гуревич, А. Л. Шварцман // Экологическая генетика. - 2010. - Т. 8. - № 2. - С. 24-28.

2. Мирошникова, В. В. Ассоциация полиморфных вариантов гена транспортера ABCG1 с концентрацией холестерина плазмы крови при атеросклерозе / В. В. Мирошникова, А. А. Пантелеева, Е. П. Демина, П. С. Курьянов, В. Н. Вавилов, С. А. Уразгильдеева, В. С. Гуревич, О. В. Сироткина, А. Л. Шварцман // Медицинская генетика. - 2013. -Т. 12.-№ 10.-С. 23-28.

3. Мирошникова, В. В. Влияние полиморфных вариантов гена аполипопротеина А-1 на липидный спектр плазмы крови в популяции Санкт-Петербурга / В. В. Мирошникова, А. А. Пантелеева, С. Н. Пчелина, А. Л. Шварцман // Ученые записки СПбГМУ им. акад. И. П. Павлова. -2014. - Т. 21. -№ 1. - С. 57-59.

4. Мирошникова, В. Б. Особенности экспрессии гена транспортера ABCG1 в мононуклеарных клетках периферической крови у пациентов с атеросклерозом / В. В. Мирошникова, Е. П. Демина, Н. В. Майоров,

B. В. Давыденко, П. С. Курьянов, В. Н. Вавилов, А. Г. Виноградов, А. Д. Денисенко, A. JI. Шварцман // Цитология. - 2014. - Т. 56. - № 3. -

C. 234-240.

Тезисы:

1. Зверева (Мирошникова), В. В. Влияние вариантов гена аполипопротеина Al на риск развития атеросклероза / В. В. Зверева (Мирошникова), Е. П. Демина, П. С. Курьянов, Т. И. Родыгина, А. Л. Шварцман // Материалы Российского национального конгресса кардиологов. Кардиоваскулярная терапия и профилактика. - 2008. -Т. 7,-№6.-С. 149.

2. Демина, Е. П. Обратный транспорт холестерина и развитие атеросклероза / Е. П. Демина, П. С. Курьянов, В. В. Зверева (Мирошникова), А. Г. Виноградов, А. Л. Шварцман // Материалы V съезда Вавиловского общества генетиков и селекционеров. - 2009. -С. 413.

3. Miroshnikova, V. ABCG1 Transporter in Atherosclerosis Development / V. Miroshnikova, E. Demina, T. Rodygina, P. Kurjanov, A. Vinogradov, A. Denisenko, A. Schwarzman // European Journal of Human Genetics. -2010.-V. 18. - Suppl. l.-P. 218.

4. Miroshnikova, V. Expression of ABCG1 Transporter Gene in Macrophages from Atherosclerotic Patients / V. Miroshnikova, E. Demina, T. Rodygina, P. Kurjanov, A. Vinogradov, A. Denisenko, A. Schwarzman// Abstract Book: 7 International PhD Student Symposium "Horizons in Molecular Biology". -P. 98.

5. Мирошникова, В. В. Экспрессия гена ABCG1 транспортера у больных атеросклерозом / В. В. Мирошникова, Е. П. Демина, Т. И. Родыгина, П. С. Курьянов, А. Г. Виноградов, А. Д. Денисенко, А. Л. Шварцман // Материалы Всероссийской научной конференции молодых ученых «Проблемы биомедицинской науки третьего тысячелетия». Медицинский академический журнал.-2010.-Т. 10. -№5.-С. 126.

6. Мирошникова, В. В. Снижение уровня экспрессии гена ABCG1 в макрофагах больных атеросклерозом / В. В. Мирошникова, П. С. Курьянов, Е. П. Демина, Т. И. Родыгина, А. Д. Денисенко, А. Л. Шварцман // Материалы Международного конгресса «Актуальные

проблемы современной медицины». Украинский научно-медицинский молодежный журнал. — 2011. - № 1. - С. 260-261.

7. Miroshnikova, V. The Role of ABCG1 Gene Expression in Atherosclerosis Development / V. Miroshnikova, E. Demina, T. Rodygina, P. Kurjanov, A. Denisenko, A. Schwarzman // Cardiovascular Research. - 2012. - V. 93. -Suppl. 1.-P.271.

8. Miroshnikova, V. Association of PON1 and APOA1 Genes Polymorphism with Men's Life Expectancy in Russian Population / V. Miroshnikova,

A. Zaharchuk, O. Sirotkina, A. Taraskina, S. Pchelina // European Journal of Human Genetics. - 2012. - V. 20. - Suppl. 1. - P. 241.

9. Мирошникоеа, В. В. Экспрессия гена транспортера ABCG1 при развитии атеросклероза / В. В. Мирошникова, П. С. Курьянов, Н. В. Майоров, Е. П. Демина, A. JI. Шварцман // Сборник тезисов Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Актуальные вопросы медицинской науки». - 2013. - С. 121— 122.

10. Miroshnikova, V. Influence of Promoter SNPs on the ABCG1 Transporter Gene Expression Level / V. Miroshnikova, E. Demina, N. Mayorov, V. Davydenko, P. Kurjanov, V. Vavilov, A. Denisenko, A. Schwarzman // European Journal of Human Genetics.-2013.-V. 21.-Suppl. 2.-P. 69.

11. Мирошникова, В. В. Влияние полиморфных вариантов в промоторной области гена ABCG1 на риск развития атеросклероза /

B. В. Мирошникова, А. А. Пантелеева, П. С. Курьянов, Е. П. Демина, В. Н. Вавилов, С. А. Уразгильдеева, В. С. Гуревич, О. В. Сироткина,

A. JI. Шварцман // Материалы Российского национального конгресса кардиологов. - 2013. - С. 379.

12. Пантелеева, А. А. Полиморфизм гена ABCG1 и его влияние на уровень холестерина плазмы крови и развитие атеросклероза / А. А. Пантелеева,

B. В. Мирошникова, А. Л. Шварцман // Материалы Международного конгресса «Актуальные проблемы современной медицины». Украинский научно-медицинский молодежный журнал. - 2013. - № 4(74). - С. 149— 150.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

Ало A-I - аполипопротеин A-I

ДИ - доверительный интервал

ЛПВП - липопротеины высокой плотности

ОТХ - обратный транспорт холестерина

ОХС - общий холестерин

Х-ЛПВП - холестерин в составе ЛПВП

ХС - холестерин

ABCG1 - АТФ-связывающий кассетный транспортер G1 M-CSF - колониестимулирующий фактор макрофагов OR - отношение шансов

СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

Аронов Д. М., Лупанов В. П. М.: Триада-Х, 2009. 248 с. - Бокерия Л. А. и др.,

2007. Бюллетень НЦССХ им. А. Н. Бакулева РАМН. 8(5): 5-11. -ЛиповецкийБ. М. СПб.: Наука, 2000. 119 с. - Chan D. С., Watts G. F., 2006. An International Journal of Medicine. 99: 277-287. - Edmondson A. C. et al, 2011. Circulation Cardiovascular Genetics. 4: 145-155. - Furuyama S. et al., 2009. The Journal of Atherosclerosis and Thrombosis. 16(3): 194—200. - Gelissen I. C. et al., 2006. Arteriosclerosis Thrombosis and Vascular Biology. 26: 534-540. -Haase C. L. et al., 2012. PLoS Genetics. 8(11): еЮОЗОбЗ.-Holven К. B. et al., 2013. PLoS One. 8(11): e78241. - Kennedy M. A. et al, 2005. Cell Metabolism. 1: 121-131. -Kontush A., Chapman M. J., 2006. Pharmacology. 58: 342-374. - Larson I. A. et al., 2002. Clinical Genetics. 61: 176-184. - Mauldin J. P. et al., 2008. Circulation. 117: 2785-2792. - Nakanishi S. et al., 2008. The Journal of Lipid Research. 50: 183— 192. - Navab M. et al., 2009. Diabetes. 58: 2711-2717. - Olivier M. et al., 2012. Arteriosclerosis Thrombosis and Vascular Biology. 32: 2223-2231. — Pulkkinen A. et al., 2000-. Diabetes Care. 23(6): 791-795. - Seo D. et al., 2004. Arteriosclerosis Thrombosis and Vascular Biology. 24: 1922-1927. - Sinnaeve P. Я et al., 2009. PLoS One. 4(9): e7037. - Sivapalaratnam S. et al., 2011. Current Atherosclerosis Reports. 13: 225-232. - Terasaka N. et al., 2007. PNAS. 104: 15093-15098. -Teslovich Т. M. et al., 2010. Lipids Nature. 466(7307): 707-713. - Waldo S. W. et al.,

2008. American Journal of Pathology. 172: 1112-1126. -Zou Y. etal., 2003. Chinese Medical Journal. 116(5): 665-668.

Отпечатано в типографии ФГБУ «ПИЯФ» НИЦ «Курчатовский институт»

188300, Гатчина Ленинградской обл., Орлова роща Зак. 221, тир. 100, уч.-изд. л. 1; 21.08.2014 г.