Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изменения различных классов протеаз и ингибиторов протеаз как возможных сывороточных маркеров фиброза у больных хроническим вирусом С (клинико-экспериментальное исследование)

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Изменения различных классов протеаз и ингибиторов протеаз как возможных сывороточных маркеров фиброза у больных хроническим вирусом С (клинико-экспериментальное исследование)"

На правах рукописи

ииоиьНБЭО

Юзько Юлия Валерьевна

ИЗМЕНЕНИЯ РАЗЛИЧНЫХ КЛАССОВ ИРОТЕАЗ И ИНГИБИТОРОВ ПРОТЕАЗ КАК ВОЗМОЖНЫХ СЫВОРОТОЧНЫХ МАРКЕРОВ ФИБРОЗА У БОЛЬНЫХ ХРОНИЧЕСКИМ ВИРУСНЫМ ГЕПАТИТОМ С (КЛИНИКО-ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ)

03 00 04 - биохимия 14 00 05 - внутренние болезни

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Новосибирск - 2007

003058690

Работа выполнена в Государственном учреждении Научно-исследовательском институте физиологии Сибирского отделения Российской академии медицинских наук

Научные руководители

доктор медицинских наук, профессор

доктор медицинских наук

Официальные оппоненты

доктор медицинских наук, профессор Колпаков Аркадий Ростиславович

доктор медицинских наук Кривошеев Александр Борисович

Ведущая организация

Институт цитологии и генетики Сибирского отделения Российской академии наук, г Новосибирск

Защита состоится «_»_2007 г. в_час на заседании

диссертационного совета Д 001 034 01 при ГУ Научно-исследовательском институте биохимии СО РАМН (630117, г Новосибирск, ул Академика Тимакова, 2)

Короленко Татьяна Александровна Волошина Наталья Борисовна

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ Научно-исследовательского института биохимии СО РАМН (630117, г Новосибирск, ул Академика Тимакова, 2)

Автореферат разослан «_»_2007г

Ученый секретарь диссертационного совета

кандидат биологичесь их наук Русских Галина Сергеевна

Общая характеристика работы Актуальность темы.

Наиболее частой причиной развития хронических гепатитов является поражение гелатотропными вирусами, и, прежде всего, вирусами гепатитов В и С Верифицированы возбудители вирусных гепатитов А, В, С, D, Е Обсуждается роль вирусов G , TTV и SEN в развитии острого и хронического поражения печени (Ивашкин В Т, 2002, Подымова С Д, 1998, Соринсон С Н, 1998, Шерлок Ш , и соавт , 1999, Van Damme Р , 2002, White Р A et al, 2002, Мамедов М К , 2005)

В настоящее время в мире насчитывается около 300 млн больных гепатитом С В США более 4 миллионов человек инфицированы HCV (Bonkovsky Н et al, 1999, Kim WR et al, 2002, Camma С, 2001, Donato F et al, 2001) По данным НИИ вирусологии им Д И Ивановского РАМН, в нашей стране отмечается неуклонный рост заболеваемости хроническими вирусными гепатитами (Ивашкин В Т, 2002, Погромов JI Ю и соавт , 2002, Подымова С Д , 1998, Тучина JI М и соавт, 2000)

Тревожная эпидемиологическая обстановка в отношении хронической HCV -инфекции наблюдается в городе Новосибирске По данным эпидемиологического исследования, проведенного в НИИ терапии СО РАМН, «распространенность маркеров вируса гепатита В в популяции Новосибирска сходна с таковой в центральной России, в том числе в Москве», а доля HCV - позитивных лиц существенно выше, чем в других регионах (Курилович С А , Решетников О В , 2000, Решетников О В , 2001)

Хронические вирусные гепатиты являются основной причиной развития цирроза печени и гепатоцеллюлярной карциномы (Блохина Н П , 1998, 1999, Дьякова И П, Ильченко Л Ю, 2003, Ивашкин В Т, 2002, Лопаткина Т Н, 1999, 2002, Подымова С Д , 1998, 2001, Asaba N et al, 1999, Bonkovsky H et al, 1999, Camma С et al ,2001, Donato F et al, 2001)

Однако многие вопросы, связанные с диагностикой и лечением ХВГ, остаются недостаточно изученными Часто вирусное поражение печени протекает латентно без каких-либо клинических проявлений или «маскируется» под другие заболевания, но даже латентное течение хронического гепатита может стать причиной цирроза печени

и гепатоцеллюлярной карциномы Ранняя диагностика хронических вирусных гепатитов и правильная лечебная тактика способны предотвратить возможные необратимые последствия, поэтому важной задачей клиницистов является определение степени фиброза у больных ХВГ С на разных стадиях заболевания, что позволило бы прогнозировать течение заболевания, обратимость выявленных изменений и, в конечном счете, определить лечебную тактику для каждого пациента

В настоящее время «золотым стандартом» определения степени фиброза является пункционная биопсия печени (ПБП), однако возможности пункционной биопсии ограничены наличием противопоказаний, погрешностями в получении материала и в трактовке результатов, а также необходимостью выполнять несколько биопсий в течение жизни одному пациенту, значительной стоимостью процедуры (Ющук Н Д и соавт, 2002) Кроме того, являясь инвазивным методом, ПБП имеет ряд осложнений вплоть до летальных исходов По данным некоторых авторов количество легальны* случаев варьирует от 0 до 3,3 на 1000 ПБП (Poynard Т et al, 2000) Прогноз и управление развитием хронического гепатита в значительной степени зависит от степени и прогрессирования фиброза печени В связи с этим поиск неинвазивных (сывороточных) маркеров развития фиброза приобретает все большее значение (Takahata Т et al , 2004, Leroy V et al, 2004)

Среди сывороточных маркеров фиброза рассматриваются матриксные металлопротеазы -1, -2, -9 и их эндогенные ингибиторы — тканевые ингибиторы металлопротеаз (TIMP-1, TIMP-2), коллаген I, IV и VI типов, гиалуроновая кислота, а2 -макроглобулин, общий билирубин, TGF-p, PGF, а также лизосомные ферменты сыворотки крови (Forns X , 2003, Leroy V et al, 2004) Однако наиболее важными их них являются матрикс ные металлопротеазы и их тканевые ингибиторы (Leroy et al, 2004, Lichtinghagen et al, 2000) Несколько групп исследователей обнаружили тесную корреляцию между металлопротеазами, эндогенными ингибиторами и развитием цирроза печени при токсическом повреждении печени, связанном со злоупотреблением алкоголя, при хроническом воспалении, развивающемся у больных хроническим вирусным гепатитом С (Lichtinghagen et al, 2000, Poynard et al, 2003, Rosenberg et al, 2004) Тем не менее, до настоящего времени четких

диагностических критериев, альтернативных инвазивным методам определения и оценки степени фиброза печени, не найдено Поэтому выбранное направление исследования представляется актуальным и перспективным

Цель работы

Изучить изменения активности и концентрации матриксных металлопротеаз, ингибиторов протеаз и лизосомных ферментов при хроническом вирусном гепатите С, циррозе печени в исходе вирусного гепатита С как возможных маркеров развития фиброза

Задачи исследования

1 Исследовать сывороточную концентрацию ММП-2, активность ММП-2,7, концентрацию ТИМП-1, ингибиторов сериновых и цистеиновых протеаз, универсального ингибитора протеаз - а2-макроглобулина у больных ХВГ С в зависимости от активности и стадии заболевания

2 Оценить активность лизосомных ферментов — хитотриозидазы и (З-Б-галактозидазы в сыворотке крови пациентов с ХВГ С в зависимости от стадии заболевания

3 Изучить изменения концентрации ТИМП-1 в сыворотке крови и ткани печени, сывороточную активность Р-Б-галактозидазы и активность лизосомных протеаз в печени при развитии фиброза на модели хронического ССЦ-гепатита у мышей,

4 Сопоставить изменения протеаз и ингибиторов протеаз, полученные в эксперименте, с изменениями у больных ХВГ С

5 Оценить влияние ИФН-а на исследованные ферменты и ингибиторы при остром и хроническом токсическом гепатите у мышей

Научная новизна

Впервые проведено сравнительное изучение сывороточных маркеров развития фиброза у больных хроническим вирусным гепатитом С и циррозом печени в исходе вирусного гепатита С, в результате которого как наиболее информативные выделены ММП-2 и ТИМП-1, выявлено значительное снижение сывороточной активности лизосомного фермента р-О-галактозидазы на разных стадиях ХВГ С, а также увеличение концентрации ингибитора цистеиновых протеаз - цистатина С

На основании изучения различных классов протеаз и их ингибиторов (металлопротеаз, цистеиновых и сериновых протеаз) установлено, что наибольшим изменениям подвержена ММП-2, тесно связанная с формированием фиброза

Для больных циррозом печени в исходе вирусного гепатита С характерны нарушения регуляции ММП, сопровождающиеся повышением активности ММП-2,7 и концентрации ММП-2 и ТИМП-1, связанные с нарушением функционирования компонентов внеклеточного матрикса (синтез коллагена и увеличение внеклеточного матрикса) в печени Отмечено повышение активности арпротеиназного ингибитора и хитотриозидазы, отражающих процесс воспаления и формирование фиброза

Клинические исследования, проведенные у больных ХВГ С, подтверждаются данными, полученными в эксперименте Так, при хроническом токсическом гепатите в сыворотке крови мышей обнаружено снижение активности р-О-галактозидазы и повышение содержания ТИМП-1 Аналогичные изменения отмечены в сыворотке крови пациентов с ХВГ С Выраженная инактивация р-О-галактозидазы обусловлена прямым действием повреждающих факторов (вируса гепатита С у больных и метаболитов СС14 у мышей) на клетки печени Эти изменения свидетельствуют об универсальности механизмов хронического повреждения печени при ХВГ С у больных и в эксперименте Таким образом, модель хронического токсического гепатита у мышей позволяет изучать механизмы развития хронического повреждения печени и оценивать эффективность препаратов, используемых в лечении вирусных гепатитов у человека

Практическая значимость

Повышение активности ММП-2,7, соотношения ММП-2 ТИМП-1 и хитотриозидазы, наблюдающиеся в сыворотке крови больных хроническим вирусным гепатитом С, являются признаками развития фиброза печени и могут быть использованы как неинвазивные маркеры прогрессирования заболевания

Положения, выносимые на защиту:

] Среди сывороточных ингибиторов протеаз различных классов (сериновых, цистеиновых, металлопротеаз) для ХВГ С характерно повышение концентрации цистатина С, при отсутствии изменений других ингибиторов (ТИМП-1, а, -протеиназного ингибитора и а2-макроглобулина)

2 Развитие фиброза характеризуется повышенной активностью ММП-2,7, нарушением соотношения ММП-2 ТИМП-1 в сыворотке крови, повышением активности хитотриозидазы - маркера стимуляции макрофагов, которые можно рассматривать в качестве неинвазивных сывороточных показателей развития фиброза

3 Развитие хронического токсического СС14-гепатита у мышей сопровождается повышением концентрации ТИМП-1, снижением активности цистеиновой протеазы катепсина Ь в ткани печени и снижением активности Р-Б-галактозидазы в сыворотке крови Однократное введение ИФН-а повышает активность цистеиновых катепсинов В и Ь и аспартильной протеазы катепсина О, участвующих в деградации компонентов внеклеточного матрикса

4 Острый токсический ССЦ-гепатит у мышей характеризуется повышением сывороточной активности хитотриозидазы

Внедрение. Основные результаты настоящей работы используются в лекционном курсе для студентов лечебного факультета ГОУ ВПО НГМУ по пропедевтике внутренних болезней

Апробация работы

Основные материалы диссертации доложены на V молодежной научной конференции СО РАМН «Фундаментальные и прикладные проблемы современной медицины» - Новосибирск, 2004, V Сибирском физиологическом съезде - Томск,

2005, X Российской конференции «Гепатология сегодня» - Москва, 2005, I Съезде терапевтов Сибири и Дальнего Востока - Новосибирск, 2005, XII Российской Гастроэнтерологической Неделе - Москва, 2006, VI Восточно-сибирской гастроэнтерологической конференции с международным участием - Красноярск,

2006, VI всероссийской конференции молодых ученых «Проблемы фундаментальной и прикладной медицины» в рамках 13 международного конгресса по приполярной

медицине - Новосибирск, 2006, Falk Symposium 157 «Chronic Hepatitis Metabolic, Cholestatic, Viral, and Autoimmune», Freiburg, 2006

Публикации: по материалам диссертации опубликована 21 научная работа, в том числе 5 статей, 4 публикации в зарубежной печати

Объем и структура диссертации

Материал диссертации изложен на 137 страницах машинописного текста, содержит разделы введение, обзор литературы, материалы и методы исследования, обсуждение, выводы, список литературы Работа иллюстрирована 37 рисунками и 15 таблицами Список цитируемой литературы включает 46 отечественных и 125 зарубежных источников Материалы и методы исследования

Общая характеристика больных. Исследование проведено у 106 больных хроническим вирусным гепатитом С (67 мужчин, средний возраст 36,78 ± 11,62 лет и 39 женщин, 43,26 ± 15,81 лет) и у 27 больных циррозом печени в исходе вирусного гепатита С (13 мужчин, средний возраст 49,69 ± 10,48 лет и 14 женщин 60,50 ± 11,90 лет) Все пациенты обратились за медицинской помощью в МУЗ МКБ № 7 г Новосибирска по поводу астенического синдрома и/или болей билиарного характера Ранее заболеваний печени у них диагностировано не было Диагноз ХВГ С подтвержден на основании определения маркеров методами ИФА и ПЦР-диагностики с определением РНК вируса гепатита С полуколичественным методом с генотипированием У части больных (25,5%) диагноз подтвержден морфологическим методом при пункционной биопсии печени

Диагноз цирроза печени в исходе вирусного гепатита С верифицирован с использованием полного клинического обследования больных, лабораторной диагностики и инструментальных методов обследования (фиброгастродуоденоскопия, ультразвуковое исследование органов брюшной полости и т д) У всех пациентов определен прогностический класс А по Чайльд-Пью

Контрольную группу составили 20 практически здоровых постоянных доноров (11 мужчин 33,45 ± 6,76 лет и 9 женщин 36,78 ± 7,84 лет) У всех пациентов получено письменное информированное согласие для проведения исследования

Экспериментальные модели. В работе использованы самцы мышей линии СВА, массой 20-25 г (виварий Института фармакологии СО РАМН, г Томск) В ходе работы проведены 2 серии экспериментов воспроизведение моделей острого и хронического ССЦ-гепатитов Для воспроизведения модели острого токсического гепатита мышам однократно перорально вводили масляный раствор СС14 в дозе 50 мг/кг массы тела Животных декапитировали через 24, 48, 72 ч после затравки СС14 Для изучения возможного защитного действия а-интерферона животным за 24 ч до затравки СС14 внутрибрюшинно однократно вводили раствор а-интерферона (ДГУ ПП «Вектор-фарм», Новосибирск) в дозе 10000 ME Модель хронического токсического гепатита воспроизводили посредством перорального введения СС14 При воспроизведении данной модели масляный раствор СС14 в дозе 50 мг/кг массы тела животного вводили 2 раза в неделю в течение 4-х недель а-интерферон вводили внутрибрюшинно в той же дозе, что и при воспроизведении острого токсического гепатита однократно за 24 ч до последней затравки СС14 Животных декапитировали через 24 ч после последнего введения СС14

Морфологическое исследование печени мышей выполнено совместно с к м н Фаламеевой О В и д м н Филимоновым П Н

Методы определения активности и/или содержания ферментов и ингибиторов протеаз. Активность P-D-галактозидазы в сыворотке крови определяли по методу Barrett, 1972 г в модификации Sewell et al, 1988г с использованием флуоресцентного субстрата 4-метилумбеллиферил-Р-Б-галактопиранозида (Melford Laboratories ltd, England), активность хитотриозидазы определяли по методу, предложенному Guo et al (1995) В качестве субстрата использовали 4-метилумбеллиферил- P-D-N,N,N "триацетилхитотриозид (С34Н47^018), активность матриксных металлопротеаз-2,7 (ММП-2,7) определяли по методу Nagase et al (1994) с использованием субстрата MCA-Pro-Leu-Gly-Leu-DPA-Ala-Arg-NH2 (ICN Biomedicals Inc, USA), активность катепсина В в гомогенате печени мышей

определяли с помощью флуоресцентного субстрата Na-CBZ(carbobenzoxy) -Arg-Arg-7-amido-4methylcoumarin hydrochloride («Вектор», Новосибирск) по методу Barrett, Kirschke, 1981, для определения активности катепсина L использовали субстрат Na-CBZ(carbobenzoxy) -Phe-Arg-7-amido-4methylcoumarin hydrochloride («Вектор», Новосибирск) с добавлением в инкубационную смесь селективного ингибитора катепсина В СА-074 (Kirschke Н , Wiederanders В , 1984), Активность катепсина D в гомогенате печени мышей определяли спектрофотометрическим методом Видерандерса и Ольке (Wiederanders В, Oelke В, 1986) В качестве субстрата использовали 2% раствор азоказеина, приготовленный на 6,0 М растворе мочевины, рН=5 0, содержание белка определяли по методу Лоури (Lowry О , 1951), активность «[ — протеиназного ингибитора и а2 -макроглобулина в сыворотке крови определяли по методу Яровой и соавт, 1982 с использованием субстрата бензоил-аргинин-этиловый эфир гидрохлорид (БАЭЭ), концентрацию ММП-2 и ТИМП-1 в сыворотке крови определяли с помощью готовых коммерческих наборов ИФА для человека (Ray Biotech, Human ММР-2 ELISA Kit, Human TIMP-1 ELISA Kit, USA) и мышей (Ray Biotech, Mouse TIMP-1 ELISA Kit, USA) (Clark et al, 1991, Plumpton et al, 1995), концентрацию цистатина С в сыворотке крови определяли с помощью готовых коммерческих наборов ИФА для человека (BioVendor, Czech Republic)

Статистическая обработка результатов. Статистическая обработка проведена с применением пакета программ SPSS 9 0 и включала создание базы данных, автоматизированную проверку качества подготовки информации и статистический анализ (Гланц С , 1998, Реброва О Ю , 2000, Флетчер Р И соавт , 1998, Власов В В , 2001) Таблицы и рисунки содержат информацию в виде средних арифметических величин (М) и стандартных ошибок средних (т), достоверность оценивалась по t-критерию Стьюдента Рассчитывались доверительные интервалы, позволяющие оценить, в каких пределах может находиться истинное значение параметра В ряде случаев, ввиду наличия выборок из переменных, не подчиняющихся нормальному распределению, использовались непараметрические методы статистической обработки (U критерий Манна-Уитни) Для определения связи между изучаемыми признаками использовались коэффициенты корреляции Пирсона и Спирмана

Результаты и обсуждение Результаты клинических исследований. При обследовании больных ХВГ С обнаружено повышение содержания ММП-2 (U=109,5; р=0,001) и тенденция к повышению содержания ТИМП-1 а сыворотке крови по сравнению со здоровыми донорами (рис.1;табл.1). Выявлена прямая корреляционная зависимость концентрации ММП-2 и ТИМП-1 (г=0,345). Эти изменения свидетельствуют о том, что в результате персистенций повреждающего фактора (вируса гепатита С) регенерация паренхимы печени замедляется и гепатоциты замещаются избыточным количеством белков вне клеточного штриксв, включая фибриллярный коллаген. Накопление внеклеточного мэтр икса является результатом, как повышения синтеза, гак и снижения деградации его элементов - ММП, фибронектииа, ундулина, коллагенов I, 11] и IV типов и протеогликанов. Снижение скорости выведения внеклеточного матрикса к ММП является следствием персаыевобожления rix специфических ингибиторов - ТИМП.

1В00 1 с1600 -11400

giaoo

1 1000 5

i 800 I еоо ■

а

| 400 ■

| 200-К

0-

Гисунок !. Концентрация ММП-2 и ТИМП-1 в сыворотке крови больных ХВГ С

Примечание: * -р<0,05 В сыворотке крови больных ХВГ С не отмечено изменений активности ингибитора оериновЫХ протеаз - агпротеиназного ингибитора и универсального ингибитора протеаз всех четырех классов - (ь-макроглобулина, тем не менее, отмечена обратная корреляционная зависимость активности МГ с концентрацией ТИМП-1 (г=-0,717). Таким образом, увеличение концентрации ММП-2 может быть связано с усилением расхода не только эндогенного ингибитора ТИМП-1, но и

п

универсального ингибитора протеаз - МГ, так как известно, что он, наряду со специфическими ингибиторами ММП - ТИМП, является неспецифическим ингибитором ММП

Показано, что е сыворотке крови больных ХВГ С повышается содержание ингибитора цистеиновых протеаз - цистатина С Это, вероятно, обусловлено тем, что в протеолитический каскад деградации компонентов внеклеточного матрикса вовлечены протеазы различных классов, в том числе и цистеиновые (катепсины В и Ь)

Отмечено снижение активности лизосомного фермента р-Б-галактозидазы в сыворотке крови больных ХВГ С (табл 2), не зависящее от активности гепатита Полученные результаты свидетельствуют о прямом цитопатическом воздействии на клетки печени, так как нейраминидаза, входящая в состав вируса, после эндоцитоза вируса клетками печени может разрушает комплекс галактозидаза-нейраминидаза-катепсин А (так называемый стабилизирующий белок)

Изменений активности хитотриозидазы и активности ММП-2,7 в сыворотке крови больных ХВГ С не отмечено (табл 2)

Таблица 1

Характеристика ММП -2 и ингибиторов протеаз в сыворотке крови больных ХВГ С

Ферменты/ ингибиторы Доноры ХВГ С

N М т N М т

ММП-2, пкг/мл 15 453,0 184,0 36 1308,47" 318,59

ТИМП-1, пкг/мл 13 380,38 94,64 34 446,18 142,06

Цистатин С, нг/мл 10 1242,0 290,2 10 2969,0* 1136,77

а,-ПИ, ИЕ/мл 10 21,16 1,9 10 22,8 2,72

МГ, ИЕ/мл 9 2,82 0,41 9 2,22 0,3

Примечание * - р<0,05, **- р<0,001

Таблица 2,

Активность лщосомкых ферментов и MMI 1-2,7 в сыворотке крови больных ХВГ С

Ферменты Доноры ХВГ С

Ц М ш N М m

ß-гаяактозндаза, мкмоль МУФ/л в мин 10 0,72 0,04 (00 0,12" 0,01

X итотр и оз и даз а 5 мкмоль МУФ/л в мин 15 3.85 0,35 42 3,62 0,43

ММП-2,7, мкмоль МКА/л в час 6 258,13 15,9 11 236,1 29,75

Примечание: **- р<0,001

В сыворотке крови пациентов с циррозом печени Fi исходе вирусного гепатита С обнаружено повышение активности ММП-2,7 по сравнению с больными ХВГ С без Признаков цирроза печени (р~0,01; 95% С1 381,6-62,4). 1 !ри сопоставлений активности фермента с донорами также отмечены достоверные изменения (p=0,ÜUl; 95% CI 126,97-273,48) (таблица 3).

Рисунок 2, Активность ММП-2,7 в сыворотке крови больных циррозом печени в исходе вирусного гепатита С Примечание:* - р<0,05

Тем не менее, изменений концентрации ММП-2 и ТИМП-1 в сыворотке крови больных циррозом печени в исходе вирусного гепатита С по сравнению с пациентами с ХВГ С не отмечено, наблюдалась лишь тенденция к повышению, р>0,05 (табл.3). Несмотря на это, при подсчете соотношения ММП-2:ТИМП-1 показано, что у здоровых доноров это соотношение составляет приблизительно 1:1, у

больных ХВГ С - 3 1, а у пациентов с циррозом печени в исходе вирусного гепатита С -41, что, вероятно, связано с избыточным накоплением компонентов внеклеточного матрикса Обнаружены прямые корреляционные взаимосвязи между концентрациями ММП-2, ТИМП-1 и активностью АЛТ (г=0,610, р=0,007), а также прямая корреляционная зависимость ММП-2 и ТИМП-1 между собой (корреляционный коэффициент Пирсона г=0,665, р=0,007) Эги данные указывают на то, что формирование фиброза у данной группы пациентов тесно связано с воспалительным процессом в печени Поврежденные гепатоциты через активацию провоспалительных цитокинов активируют клетки Купфера и звездчатые клетки (основные продуценты внеклеточного матрикса) Под воздействием трансформирующего фактора роста-(31 (TGF- pi) происходит дифференцировка звездчатых клеток печени в миофибробласто-подобные клетки, которые приобретают сократительные, провоспалительные и фиброгенные свойства Таким образом, наблюдается ситуация, когда клетки воспаления и клетки, ответственные за фиброгенез, активируют друг друга

Таблица 3

Характеристика ММП-2 и ингибиторов протеаз в сыворотке крови больных циррозом печени в исходе вирусного гепатита С

Ингибиторы Доноры хгв с Цирроз печени

N М±ш N М±ш N М±ш

ММП-2, пкг/мл 15 453,0±184,0 36 1308,5±318,6* 2224,4±578,1*

ТИМП-1, пкг/мл 13 380,4±94,6 34 446,18 ± 142,1 16 578,1±276,5

Цистатин С, нг/мл 10 1242,0 ±290,2 10 2969,0 ±1136,8* 10 3088,0±476,3*

а,-ПИ, ИЕ/мл 10 21,16 d= 1,9 10 22,8 ± 2,72 9 27,60 ±1,3*

МГ, ИЕ/мл 9 2,82 ±0,41 9 2,22 ± 0,3 8 2,40 ± 0,2

Примечание * - р<0,05 - по сравнению с донорами

На активацию макрофагов указывает и повышение активности хитотриозидазы в сыворотке крови больных циррозом печени в исходе вирусного гепатита С как по

сравнению с донорами, так и по сравнению с больными ХВГ С без признаков цирроза печени (табл 4) Тем не менее, выявлена обратная корреляционная зависимость активности хитотриозидазы и активности АЛТ (корреляционный коэффициент Спирмана г=-0,525, р=0,021), а также обратная корреляционная зависимость между активностью хитотриозидазы и концентрацией ММП-2 (корреляционный коэффициент Спирмана г=-0,531, р=0,034) Полученные результаты свидетельствуют о том, что, повышение концентрации ММП-2 и активности АЛТ в сыворотке крови сопровождалось умеренным снижением активности хитотриозидазы, несмотря на повышение активности фермента в общей группе пациентов

В сыворотке крови больных циррозом печени в исходе вирусного гепатита С отмечено снижение активности Р-О-галактозидазы по сравнению с донорами (р=0,0001, 95% С1 0,66-0,52) и повышение по сравнению с больными ХВГ С без признаков цирроза печени (р=0,002, 95% С1 0,04-0,20) (табл 4)

Таблица 4

Активность лизосомных ферментов и ММП-2,7 в сыворотке крови больных циррозом печени в исходе вирусного гепатита С

Ферменты Доноры ХВГ С Цирроз печени

N М±т N М ± т N М±т

Р-галактозидаза, мкмоль МУФ/л в мин 10 0,72 ± 0,04 100 0,12 ±0,01" 18 0,24 ± 0,07л*

Хитотриозидаза, мкмоль МУФ/л в мин 15 3,85 ±0,35 42 3,62 ± 0,43 19 5,81 ± 1,24А

ММП-2,7,мкмоль МКА/л в час 6 258,13 ± 15,9 11 236,1 ±29,75 3 458,35 ±15,4Л*

Примечание **- р<0,001 по сравнению с донорами,

л - р<0,05 по сравнению с ХГВС В сыворотке крови больных циррозом печени в исходе вирусного гепатита С по сравнению со здоровыми донорами выявлено повышение ингибиторной активности арПИ (р=0,02, 95% С1 1,43-11,46) (табл 3) Изменений активности ингибитора по сравнению с пациентами с ХВГ С без признаков цирроза не найдено (р>0,05)

Отмечено повышение концентрации цистатина С в сыворотке крови больных циррозом печени в исходе вирусного гепатита С по сравнению с донорами, соответственно 3088,0 ± 476,25 нг/мл и 1242,0 ± 290,2 нг/мл (р=0,005, 95% CI 656,41 -3035,59) Изменений концентрации данного ингибитора по сравнению с больными ХВГ С без признаков цирроза не обнаружено (р>0,05)

Несмотря на то, что изменений содержания цистатина С в сыворотке крови больных циррозом печени в исходе вирусного гепатита С не выявлено, отмечена прямая корреляционная зависимость концентрации цистатина С и активности ai -протеиназного ингибитора (коэффициент корреляции Пирсона г=0,731, р=0,025) Обнаруженная взаимосвязь между ингибиторами цистеиновых и сериновых протеаз отражает их участие в протеолитическом каскаде при деградации компонентов внеклеточного матрикса, так как известно, что одной из биологических функций катепсина В и эластазы (сериновая протеаза) является расщепление белков соединительной ткани (фибронектин, ламинин и др ) (Yan and Sloane, 2003) Результаты экспериментальных исследований.

С целью изучения влияния ИФН-а на изменения протеаз и ингибиторов не только в сыворотке крови, но и в ткани печени при развитии фиброза, проведена серия экспериментов по воспроизведению модели хронического токсического гепатита у мышей В качестве токсического агента был выбран четыреххлористый углерод как наиболее изученный и удобный в использовании Для изучения влияния интерферонотерапии на исследуемые показатели у больных хроническим вирусным гепатитом С, животным с СС14-гепатитом однократно вводили ИФН-а в дозе 10000 ME за 24 ч до последней затравки СС14

При исследовании срезов печени мышей с СС14-гепатитом в световом микроскопе показано преобладание проявлений хронического токсического гепатита воспалительная полиморфноклеточная инфильтрация (лимфоциты, моноциты, макрофаги и нейтрофилы) преимущественно в перицентральных отделах долек, лобулярные очаговые некрозы гепатоцитов с нарушением в этих зонах балочного строения и формированием фагоцитарных макрофагальных гранулем, большинство гепатоцитов в состоянии умеренно выраженной или тяжелой дистрофии, большинство

центролобулярных воспалительных инфильтратов распространяется узкими тяжами в соседнюю дольковую паренхиму по типу мостовидных некрозов с формированием молодых незрелых соединительнотканных септ Дольковое строение печени в целом сохранено, и септальный фиброз соответствует II стадии Имеются также признаки центро-перицентрального и очагового лобулярного перисинусоидального фиброза, в основном вблизи от воспалительных инфильтратов

Введение мышам с ССЬггепатитом ИФН-а сопровождалось аналогичными изменениями в печени, однако воспалительный компонент поражения был менее выражен по сравнению группой животных с СС14-гепатитом, что позволяет говорить о слабом защитном действии ИФН-а

Развитие ССЦ-гепатита сопровождалось снижением активности в сыворотке крови лизосомного фермента Р-О-галактозидазы по сравнению с интактными животными (р=0,024, 95% С1 0,23-2,90) Однократное введение ИФН-а мышам с СС14-гепатитом не сопровождалось изменением активности фермента (табл 5)

Аналогичные изменения сывороточной активности Р-О-галактозидазы отмечены и у больных ХВГ С Для Р-О-галактозидазы не обнаружено эндогенных белковых ингибиторов, фермент может подвергаться действию перекисей липидов и свободных радикалов, возникающих при метаболизме четыреххлористого углерода Можно полагать, что резкое снижение активности р-О-галактозидазы сыворотки крови является следствием прямого действия повреждающих факторов (вируса гепатита С у больных и метаболитов СС14 у мышей) на клетки печени Возможно, выраженная инактивация р-О-галактозидазы свидетельствует об универсальности механизмов хронического повреждения печени при ХВГ С у больных и в эксперименте

В сыворотке крови мышей с хроническим ССЦ-гепатитом обнаружено повышение содержания ТИМП-1 по сравнению с интактными животными, р=0,020, 95% С1 - 518,91-48,65 (рис 3, табл 5), в тоже время, введение ИФН-а не сопровождалось изменением концентрации ТИМП-1 (р>0,05) Показано, что в гомогенате печени мышей концентрация ТИМП-1 повышена по сравнению с интактными животными (р=0,044, 95% С1 -35,21-0,62 (табл 6), а однократное введение ИФН-а снижало содержание ТИМП-1 даже ниже контрольных значений

(р=0,0001; 95% С1 13,21-31,53) (табл. 6). Эти данные представляют определенный интерес и свидетельствуют о том, что даже однократное воздействие высокой дозы ИФН-а (10000 МЕ) проявляет защитный эффект при хроническом токсическом гепатите. Можно полагать, что ИФН-а оказывает благоприятное влияние на развитие фиброза печени у мышей, как и интерферонотерапня у пациентов с ХВГ С.

Рисунок 3. Содержание ТИМП-1 в сыворотке крови и гомогенате печени мышей с хроническим токсическим гепатитом и однократным введением ИФН-а. Примечание: * - р<0,05 по сравнению с иитактными; Л - р<0,05 по сравнению с СС14

Таблица 5.

Активность АЛТ, В-Э-галактозидазы и ТММП-1 в сыворотке крови мышей с хроническим токсическим гепатитом и однократным введением ИФН-а.

Интактные СС14 СС1., + ИФН-а

М ± т М ± т М ±т

13-0-галактозидаза, мкмоль МУФ/ л мин 3,68 ± 0,57 п=9 2,12 ±0,32* п=10 2,93 ±0,35 п= 0

ТИМП-1, пкг/мл 425,56 ± 45,65 н=9 709.33 ±82,83 п=15 607,33 ±86,56 п=15

Примечание: * - р<0,05; ** - р<0,001.

В регуляции синтеза и деградации компонентов внеклеточного матрикса принимают участие протеазы различных классов, в том числе цистеиновые (катепсины В и Ь) и аспартильные {катепсин О). Учитывая тот факт, что в сыворотке крови представлены, в основном, ингибиторы, большой интерес представляет исследование активности этих лнзосомных ферментов в ткани печени.

Так, в гомогенате печени мышей с ССЦ-гепатитом показано снижение активности катепсина Ь по сравнению с интактными животными (р~0,0001; 95% С! 0,20-0,36), а также повышение активности катепсина О (р=0,0001; 95% С] -0,46-0,26) (табл. 6). Изменений активности катепсина В не обнаружено. Тем не менее, у данной группы животных отмечена прямая корреляционная зависимость между изменениями активности катепсинов В и О (г=0,723; р=0,028). Однократное введение ИФН-ц мышам с ССЦ-гепатитом сопровождалось повышением активности катепсинов В, Ь и Б (табл. 6).

катепсин 8 кате псин 1_ вате л сип □ [вИнтастные ОСС14|

Рисунок 4. Активность катепсинов В, Ь и О в ткани печени мышей СБА

Таблица 6.

Активность лизосомных ферментов и концентрация ТИМ] [-1 в печени .мышей с хроническим токсическим гепатитом и однократным введением ИФН-а.

Интактные СС14 сси + ИФН-а

М ± т М ± т М ±т

Катепсин В, мкмоль МКА/мин на мг белка 0,20 ± 0,03 п=10 0,14 ±0,02 п=9 0,32 ± 0,05А п=10

Катепсин Ц мкмоль МКА/мин на мгбелка 0,43 ± 0,03 п=10 0,15 ±0,01* 11=9 0,50 ±0,0$^ п=10

Катепсин Э, Езм,х10*/ мин в расчете на мг белка 0,23 ± 0,02 п=Ю 0,59 ± 0,02** п=9 0,71 ±0,1* п=9

ТИМП-1, пкг/мл 6,84 ± 0,67 п=5 24,76 ± 8,28* п=4 2,38 ±0,95* п=15

Примечание:* - р<0,05 -по сравнению с интактными; л - р<0,05 - по сравнению с ССЦ

ИФН-а обладает не только противовирусным, но и иммуномодулирующим эффектом Интерфероны повышают клеточный иммунный ответ, стимулируя активность цитотоксических Т-клеток и естественных киллеров и продукцию цитокинов Т-клетками и макрофагами Повышение активности лизосомных ферментов - катепсинов В, Ь и Б в ткани печени мышей с СС14-гепатитом под воздействием ИФН-н свидетельствует об иммуноопосредованном запуске протеолитического каскада, направленного, главным образом, на деградацию компонентов внеклеточного матрикса и разрешение фиброза Эти же механизмы, вероятно, обеспечивают терапевтический эффект ИФН-а при лечении вирусных гепатитов у человека

Выводы

1 Повышение активности ММП-2,7 в сыворотке крови пациентов с циррозом печени в исходе вирусного гепатита С по сравнению с больными ХВГ С без признаков цирроза, не зависящее от активности АЛТ сыворотки крови, является показателем деградации компонентов внеклеточного матрикса, что позволяет включить его в ряд сывороточных маркеров фиброза печени

2 Повышение активности хитотриозидазы в сыворотке крови больных циррозом печени в исходе вирусного гепатита С отражает стимуляцию макрофагов и развитие воспаления, снижение активности р-О-галактозидазы при ХВГ С связано с прямым цитопатическим действием вируса

3 Модель хронического СС14-гепатита у мышей характеризуется развитием фиброза, повышением концентрации ТИМП-1, снижением активности катепсина Ь и повышением активности катепсина О в ткани печени, что свидетельствует о нарушении регуляции е системе протеазы-ингибиторы протеаз

4 Однократное введение высокой дозы ИФН-а мышам с хроническим СС14-гепатитом повышает содержание ТИМП-1, повышенная активность катепсина В и катепсина Б отражает стимуляцию макрофагов печени

5 Наиболее информативными сывороточными маркерами раннего выявления фиброза печени у пациентов с ХВГ С являются суммарная активность ММП и соотношение концентрации ММП-2 ТИМП-1

Список опубликованных работ

1 Гурова (Юзько) Ю В , Гончарова И А , Алексеенко Т В Влияние стимуляторов макрофагов и реаферона на повреждение печени мышей и секрецию ферментов лизосом // Тез докл V молодежной научной конференции СО РАМН «Фундаментальные и прикладные проблемы современной медицины» -Новосибирск, 2004г - С 9

2 Короленко Т А , Юзько Ю В , Савченко Н Г , Алексеенко Т В , Сорочинская Н В , Жанаева С Я , Потеряева О Н , Волошина Н Б , Гончарова И А , Гончарова Н В , Нагорный В В Нарушения функциональных проб печени и лизосомных ферментов сыворотки крови у больных хроническими вирусными гепатитами // TERRA MEDICA nova -2004 -№1 -С 16-18

3 Юзько Ю В , Волошина Н Б , Алексеенко Т В , Савченко Н Г , Короленко Т А Лизосомные ферменты сыворотки крови у больных хроническим вирусным гепатитом С и циррозом печени // Бюллетень Сибирского отделения Академии Медицинских Наук -2005 -№4(118) - С 85-89

4 Юзько Ю В , Савченко Н Г , Алексеенко Т В , Жанаева С Я , Короленко Т А Активность хитотриозидазы сыворотки крови как показатель стимуляции макрофагов // Тез докл V Сибирского физиологического съезда — Томск -2005 -С 102

5 Савченко Н Г , Юзько Ю В , Алексеенко Т В , Сорочинская Н В , Короленко Т А Лизосомные ферменты в желчи мышей — интактных и при развитии внутрипеченочного холестаза // Тез докл V Сибирского физиологического съезда - Томск - 2005 - С 62

6 Бенедиктова А А , Фаламеева О В , Юзько Ю В Активность аспартильной протеазы катепсина D в печени у крыс при старении // Тез докл V Сибирского физиологического съезда — Томск - 2005 — С 111

7 Волошина Н Б , Осипенко М Ф , Пальцев А И , Юзько Ю В , Савченко Н Г Влияние этиотропной терапии на состояние билиарного тракта при ХВГ // Материалы X Российской конференции «Гепатология сегодня» - Москва, 28-30 марта 2005 - С 77

8 Юзько Ю В , Короленко Т А , Савченко Н Г , Алексеенко Т В , Сорочинская Н В , Волошина Н Б , Гончарова Н В // Тез докл I Съезда терапевтов Сибири и Дальнего Востока - Новосибирск, 6-8 декабря 2005г - С 823

9 Савченко Н Г , Юзько Ю В , Алексеенко Т В , Сорочинская Н В , Волошина Н Б, Короленко Т А Лизосомные ферменты в желчи при развитии внутрипеченочного холестаза // Тез докл I Съезда терапевтов Сибири и Дальнего Востока - Новосибирск, 6-8 декабря 2005г - С 628

10 Юзько ЮВ, Волошина НБ, Короленко ТА Прогностическая роль матриксных метгшлопротеаз, тканевого ингибитора ТИМП-1 и хитотриозидазы в развитии фиброза и цирроза печени // Материалы XII Российской Гастроэнтерологической Недели - Москва, 16-18 октября 2006 - С 90

11 Юзько Ю В , Филатова Т Г , Алексеенко Т В , Жанаева С Я , Волошина Н Б , Короленко Т А Роль изменений металлопротеаз и ингибиторов в сыворотке крови больных хроническим вирусным гепатитом // Материалы VI Восточносибирской гастроэнтерологической конференции с международным участием «Клинико-эпидемиологические и этно-экологические проблемы заболеваний органов пищеварения» - Красноярск, 4-5 мая 2006 - С 287-293

12 Волошина НБ, Юзько ЮВ, Короленко ТА, Савченко НГ Активность хитотриозидазы у больных хроническим гепатитом С и циррозом печени // Материалы VI Восточно-сибирской гастроэнтерологической конференции с международным участием «Клинико-эпидемиологические и этно-экологические проблемы заболеваний органов пищеварения» - Красноярск, 4-5 мая 2006 — С 345

13 Юзько ЮВ, Волошина НБ, Короленко ТА Влияние хронической НСУ-инфекции на активность р-галактозидазы лизосом, хитотриозидазы и матриксных металлопротеаз-2,7 сыворотки крови // Тез докл VI всероссийской конференции молодых ученых «Проблемы фундаментальной и прикладной медицины» в рамках 13 международного конгресса по приполярной медицине -Новосибирск, 12-16 июня 2006г - С 63

14 Савченко НГ, Юзько ЮВ, Короленко ТА Активность лизосомальных ферментов в желчи при развитии внутрипеченочного холестаза // Тез докл VI всероссийской конференции молодых ученых «Проблемы фундаментальной и прикладной медицины» в рамках 13 международного конгресса по приполярной медицине - Новосибирск, 12-16 июня 2006г - С 48

15 Короленко ТА, Филатова ТГ, Юзько ЮВ, Савченко НГ, Волошина НБ Концентрация ТИМП-1 сыворотки крови больных хроническим вирусным гепатитом С и циррозом печени // Материалы 13 международного конгресса по приполярной медицине - Новосибирск, 12-16 июня 2006г - С 143

16 Пальцев А И , Волошина Н Б , Еремина А А , Шишаева JI П , Курганова И В , Юзько Ю В , Савченко Н Г , Борисов В И , Мигуськина Е И Проблема боли в историческом аспекте Боль при гепатобилиарной патологии Значение мебеверина гидрохлорида в комплексной патологии // Экспериментальная и клиническая гастроэнтерология - 2006 - №2 - С 83-95

17 Короленко Т А , Филатова Т Г , Савченко Н Г , Юзько Ю В , Гончарова И А , Алексеенко Т В Нарушения концентрации тканевого ингибитора металлопротеаз первого типа в сыворотке крови и в печени мышей с СС14 — гепатитом // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины — 2007 - №3 (143) - С 280-283

18 ТА Korolenko, N G Savchenko, TV Alexeenko, Ju V Yuz'ko, S Ya Zhanaeva, N Sorochinskaya, С P Korolenko and V I Kaledin Chitotriosidase activity in serum and bile during lysosomal storage of lipids in liver cells // 15th European Study Group on Lysosomal Disease Workshop - Oslo, Norway - September 15-18, 2005 -P 86

19 Yuz'ko Y V , Korolenko T A , Voloshina N В Biochemical characteristic of liver damage in patients with chronic HCV infection and liver cirrhosis // Falk Symposium 157 Chronic Hepatitis Metabolic, Cholestatic, Viral and Autoimmune -Freiburg -October 10-11, 2006 -P 222

20 Voloshina N В , Yuz'ko Y V, Savchenko N G Cholestasis syndrome of CVH patients // Falk Symposium 157 Chronic Hepatitis Metabolic, Cholestatic, Viral and Autoimmune - Freiburg - October 10-11,2006 -P 215

21 Savchenko N G , Yuz'ko Y V , Alexeenko T V , Sorochmskaya N V , Korolenko T A Bile lysosomal enzymes activity in intrahepatic cholestasis development // Falk Symposium 157 Chronic Hepatitis Metabolic, Cholestatic, Viral and Autoimmune — Freiburg -October 10-11,2006 -P 174

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ AJIT — аланиновая аминотрансфераза ИФА - иммуноферментный анализ ИФН-а - интерферон-а МГ - а2-макроглобулич ME - международные единицы МКА — метилкумариламид

ММП-2 - матриксная металлопротеаза второго типа

МУФ — метилумбеллиферил

ПЦР — полимеразная цепная реакция

ПБП — пункционная биопсия печени

ТИМП-1 - тканевой ингибитор металлопротеаз первого типа

ХВГ С - хронический вирусный гепатит С

СС14- четыреххлористый углерод

IL-1 - интерлейкин 1

HCV — вирус гепатита С

TGF-p - фактор роста опухоли р

TNF-a - фактор некроза опухоли a

агПИ - ai-протеиназний ингибитор

Соискатель Юзько Ю В

Подписано к печати 16 апреля 2007 г. Тираж 100 экз Заказ №1745 Отпечатано «Документ-Сервис», 630090, Новосибирск, Институтская 4/1, тел. 335-66-00

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Юзько, Юлия Валерьевна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Современное представление о хроническом вирусном гепатите

1.1.1. Клеточные механизмы развития повреждения гепатоцитов и роль компонентов внеклеточного матрикса

1.2. Биохимическая характеристика и маркеры хронического повреждения печени и развития цирроза у больных ХВГ С

1.2.1. Металлопротеазы и их ингибиторы, роль в повреждении печени

1.2.2. Характеристика сывороточных ингибиторов различных типов протеаз

1.2.2.1. Ингибитор сериновых протеаз - агпротеиназный ингибитор

1.2.2.2. (Х2- макроглобулин - универсальный ингибитор протеаз

1.2.2.3. Нистатин С - эффективный ингибитор цистеиновых протеаз

ГЛАВА II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Характеристика больных ХВГ С и циррозом печени

2.2. Экспериментальные модели

2.3. Препаративные процедуры

2.4. Методы исследования

2.4.1. Определение активности (З-Б-галактозидазы

2.4.2. Определение активности хитотриозидазы

2.4.3. Определение активности ММП-2,

2.4.4. Определение активности катепсина В

2.4.5. Определение активности катепсина Ь

2.4.6. Определение активности катепсина Б

2.4.7. Определение содержания бежа

2.4.8. Определение активности агпротеиназного ингибитора

2.4.9. Определение активности а2-макроглобулина

2.4.10. Определение содержания ММП

2.4.11. Определение содержания ТИМП

2.4.12. Определение содержания цистатина С

2.5. Статистическая обработка результатов

ГЛАВА III. РЕЗУЛЬТАТЫ

3.1. Лизосомные ферменты, матриксные меаллопротеазы и ингибиторы протеаз у больных хроническим вирусным гепатитом С

Активность ß-D-галактозидазы в сыворотке крови больных ХВГ С

Активность хитотриозидазы в сыворотке крови больных ХВГ С

Активность ММП-2,7 в сыворотке крови больных ХВГ С

Активность агПИ и МГ в сыворотке крови больных ХВГ С

Концентрация цистатина С в сыворотке крови больных ХВГ С

Концентрация ММП-2 в сыворотке крови больных ХВГ С

Концентрация ТИМП-1 в сыворотке крови больных ХВГ С

3.2. Лизосомные ферменты, матриксные меаллопротеазы и ингибиторы протеаз у пациентов с циррозом печени в исходе вирусного гепатита С

Активность ß-D-галактозидазы и хитотриозидазы в сыворотке крови больных циррозом печени

Активность ММП-2,7 в сыворотке крови больных циррозом печени

Активность агПИ и МГ в сыворотке крови больных циррозом печени

Концентрация ММП-2 в сыворотке крови больных циррозом печени

Концентрация ТИМП-1 и цистатина С в сыворотке крови больных циррозом печени

3.3. Характеристика нарушений АЛТ, лизосомных ферментов и ТИМП-1 у мышей с острым и хроническим токсическим гепатитами

3.3.1. Изменения активности АЛТ и лизосомных ферментов в сыворотке крови мышей с острым ССЦ-гепатитом

Влияние предварительного введения ИФН-а на активность АЛТ и лизосомных ферментов в сыворотке крови мышей с острым токсическим ССЦ-гепатитом

3.3.2. Характеристика нарушений лизосомных ферментов и ТИМП-1 при хроническом токсическом гепатите у мышей

Активность АЛТ и морфологическая картина срезов печени мышей с хроническим ССЦ-гепатитом

Изменения активности Р-Б-галактозидазы в сыворотке крови мышей с хроническим ССЦ-гепатитом

Изменения концентрации ТИМП-1 в сыворотке крови и ткани печени мышей с хроническим ССЦ-гепатитом

Изменения удельной активности катепсинов В, Ь, и Б в гомогенате печени мышей с хроническим ССЦ-гепатитом

Влияние ИФН-а на активность АЛТ, лизосомных ферментов и содержание ТИМП-1 в сыворотке крови и гомогенате печени мышей с хроническим СО4гепатитом

ГЛАВА IV. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

ВЫВОДЫ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Изменения различных классов протеаз и ингибиторов протеаз как возможных сывороточных маркеров фиброза у больных хроническим вирусом С (клинико-экспериментальное исследование)"

Актуальность проблемы. Наиболее частой причиной развития хронических гепатитов является поражение гепатотропными вирусами, и, прежде всего, вирусами гепатита В и С. Верифицированы возбудители вирусных гепатитов А, В, С, D, Е. Обсуждается роль вирусов G , TTV и SEN в развитии острого и хронического поражения печени (Ивашкин В. Т., 2002; Подымова С. Д., 1998; Соринсон С. Н., 1998; Шерлок Ш., и соавт., 1999; Van Damme P., 2002; White P. A. et al, 2002; Мамедов M.K., 2005). Благодаря иммуноферментному, радиоиммунному, иммуноблоттинговому методу, а также полимеразной цепной реакции появилась возможность не только идентифицировать эти вирусы, но и выявлять их репликацию.

В настоящее время в мире насчитывается около 300 млн. больных гепатитом С. В США более 4 миллионов человек инфицированы HCV ( Bonkovsky Н. et al., 1999; Kim W.R. et al., 2002; Camma С., 2001; Donato F. et al., 2001; Zarski J. et al., 2003; Suares A. et al., 1997). По данным НИИ вирусологии им. Д. И. Ивановского РАМН, в нашей стране отмечается неуклонный рост заболеваемости хроническими вирусными гепатитами (Ивашкин В. Т., 2002; Погромов Л. Ю. и соавт., 2002; Подымова С. Д., 1998; Тучина Л. М. и соавт., 2000).

Тревожная эпидемиологическая обстановка в отношении хронической HCV - инфекции наблюдается в городе Новосибирске. По данным эпидемиологического исследования, проведенного в НИИ терапии СО РАМН, «распространенность маркеров вируса гепатита В в популяции Новосибирска сходна с таковой в центральной России, в том числе в Москве», а доля HCV - позитивных лиц существенно выше, чем в других регионах (Курилович С. А., Решетников О. В., 2000; Решетников О. В., 2001).

ХВГ являются основной причиной развития цирроза печени и гепатоцеллюлярной карциномы (Блохина Н. П., 1998, 1999; Дьякова И. П., Ильченко Л. Ю., 2003; Ивашкин В. Т., 2002; Лопаткина Т. Н., 1999, 2002; Подымова С. Д., 1998, 2001; Asaba N. et al., 1999; Bonkovsky H. et al., 1999;

Camma С. et al., 2001; Donato F. et al., 2001). Однако многие вопросы, связанные с диагностикой и лечением ХВГ, остаются недостаточно изученными. Часто вирусное поражение печени протекает латентно без каких-либо клинических проявлений или «маскируется» под другие заболевания, но даже латентное течение хронического гепатита может стать причиной цирроза печени и гепатоцеллюлярной карциномы. Ранняя диагностика хронических вирусных гепатитов и правильная лечебная тактика способны предотвратить возможные необратимые последствия, поэтому важной задачей клиницистов является определение степени фиброза у больных ХВГ С на разных стадиях заболевания, что позволило бы прогнозировать течение заболевания, обратимость выявленных изменений и, в конечном счете, определить лечебную тактику для каждого пациента.

В настоящее время «золотым стандартом» определения степени фиброза является пункционная биопсия печени (ПБП), однако возможности пункционной биопсии ограничены наличием противопоказаний, погрешностями в получении материала и трактовке результатов, а также необходимостью выполнять несколько биопсий в течение жизни одному пациенту, значительной стоимостью процедуры. (Ющук Н.Д. и соавт., 2002). Кроме того, являясь инвазивным методом, ПБП имеет ряд осложнений вплоть до летальных исходов. По данным некоторых авторов количество летальных случаев варьирует от 0 до 3,3 на 1000 ПБП (Poynard T. et al., 2000). Прогноз и управление развитием хронического гепатита в значительной степени зависит от степени и прогрессирования фиброза печени. В связи с этим поиск неинвазивных (сывороточных) маркеров развития фиброза приобретает все большее значение (Takahata T. et al., 2004; Leroy V. et al., 2004).

Среди сывороточных маркеров фиброза рассматриваются матриксные металлопротеазы -1, -2, -9 и их эндогенные ингибиторы - тканевые ингибиторы металлопротеаз (TIMP-1, TIMP-2), коллаген I, IV и VI типов, гиалуроновая кислота, а2 -макроглобулин, общий билирубин, TGF-P, PGF, а также лизосомные ферменты сыворотки крови (Forns X., 2003; Leroy V. et al., 2004). Однако наиболее важными их них являются матриксные металлопротеазы и их тканевые ингибиторы (Leroy et al., 2004; Lichtinghagen et al., 2000). Несколько групп исследователей обнаружили тесную корреляцию между металлопротеазами, эндогенными ингибиторами и развитием цирроза печени при токсическом повреждении печени, связанном со злоупотреблением алкоголя, при хроническом воспалении, развивающемся у больных хроническим вирусным гепатитом С (Lichtinghagen et al., 2000; Poynard et al., 2003; Rosenberg et al., 2004). Тем не менее, до настоящего времени четких диагностических критериев, альтернативных инвазивным методам определения и оценки степени фиброза печени, не найдено. Поэтому выбранное направление исследования представляется актуальным и перспективным.

Цель исследования:

Изучить изменения активности и концентрации матриксных металлопротеаз, ингибиторов протеаз и лизосомных ферментов при хроническом вирусном гепатите С, циррозе печени в исходе вирусного гепатита С как возможных маркеров развития фиброза. Задачи исследования:

1. Исследовать сывороточную концентрацию ММП-2, активность ММП-2,7, концентрацию ТИМП-1, ингибиторов сериновых и цистеиновых протеаз, универсального ингибитора протеаз - а2-макроглобулина у больных ХВГ С в зависимости от активности и стадии заболевания.

2. Оценить активность лизосомных ферментов - хитотриозидазы и D-галактозидазы в сыворотке крови пациентов с ХВГ С в зависимости от стадии заболевания.

3. Изучить изменения концентрации ТИМП-1 в сыворотке крови и ткани печени, сывороточную активность P-D-галактозидазы и активность лизосомных протеаз в печени при развитии фиброза на модели хронического ССЦ-гепатита у мышей.

4. Сопоставить изменения протеаз и ингибиторов протеаз, полученные в эксперименте, с изменениями у больных ХВГ С.

5. Оценить влияние ИФН-а на исследованные ферменты и ингибиторы при остром и хроническом токсическом гепатите у мышей.

Научная новизна

Впервые проведено сравнительное изучение сывороточных маркеров развития фиброза у больных хроническим вирусным гепатитом С и циррозом печени в исходе вирусного гепатита С, в результате которого как наиболее информативные выделены ММП-2 и ТИМП-1; выявлено значительное снижение сывороточной активности лизосомного фермента р-Б-галактозидазы на разных стадиях ХВГ С, а также увеличение концентрации ингибитора цистеиновых протеаз — цистатина С.

На основании изучения различных классов протеаз и их ингибиторов (металлопротеаз, цистеиновых и сериновых протеаз) установлено, что наибольшим изменениям подвержена ММП-2, тесно связанная с формированием фиброза.

Для больных циррозом печени в исходе вирусного гепатита С характерны нарушения регуляции ММП, сопровождающиеся повышением активности ММП-2,7 и концентрации ММП-2 и ТИМП-1, связанные с нарушением функционирования компонентов внеклеточного матрикса (синтез коллагена и увеличение внеклеточного матрикса) в печени. Отмечено повышение активности арпротеиназного ингибитора и хитотриозидазы, отражающих процесс воспаления и формирование фиброза.

Клинические исследования, проведенные у больных ХВГ С, подтверждаются данными, полученными в эксперименте. Так, при хроническом токсическом гепатите в сыворотке крови мышей обнаружено снижение активности (З-Э-галактозидазы и повышение содержания ТИМП-1. Аналогичные изменения отмечены в сыворотке крови пациентов с ХВГ С. Выраженная инактивация Р-Б-галактозидазы обусловлена прямым действием повреждающих факторов (вируса гепатита С у больных и метаболитов СС14 у мышей) на клетки печени. Эти изменения свидетельствуют об универсальности механизмов хронического повреждения печени при ХВГ С у больных и в эксперименте. Таким образом, модель хронического токсического гепатита у мышей позволяет изучать механизмы развития хронического повреждения печени и оценивать эффективность препаратов, используемых в лечении вирусных гепатитов у человека.

Практическая значимость работы

Повышение активности ММП-2,7, соотношения ММП-2:ТИМП-1 и хитотриозидазы, наблюдающиеся в сыворотке крови больных хроническим вирусным гепатитом С, являются признаками развития фиброза печени и могут быть использованы как неинвазивные маркеры прогрессирования заболевания.

Внедрение. Основные результаты настоящей работы используются в лекционном курсе для студентов лечебного факультета ГОУ ВПО НГМУ по пропедевтике внутренних болезней.

Апробация работы. Основные материалы диссертации доложены на V молодежной научной конференции СО РАМН «Фундаментальные и прикладные проблемы современной медицины» - Новосибирск, 2004; V Сибирском физиологическом съезде - Томск, 2005; X Российской конференции «Гепатология сегодня» - Москва, 2005; I Съезде терапевтов Сибири и Дальнего Востока - Новосибирск, 2005; XII Российской Гастроэнтерологической Неделе - Москва, 2006; VI Восточно-сибирской гастроэнтерологической конференции с международным участием -Красноярск, 2006; VI всероссийской конференции молодых ученых «Проблемы фундаментальной и прикладной медицины» в рамках 13 международного конгресса по приполярной медицине - Новосибирск, 2006; Falk Symposium 157 «Chronic Hepatitis: Metabolic, Cholestatic, Viral, and Autoimmune», Freiburg, 2006.

Публикации; по материалам диссертации опубликована 21 научная работа, в том числе 5 статей, 4 публикации в зарубежной печати.

Положения, выносимые на защиту:

1. Среди сывороточных ингибиторов протеаз различных классов (сериновых, цистеиновых, металлопротеаз) для ХВГ С характерно повышение концентрации цистатина С, при отсутствии изменений других ингибиторов (ТИМП-1, aj-протеиназного ингибитора и аг-макроглобулина).

2. Развитие фиброза характеризуется повышенной активностью ММП-2,7, нарушением соотношения ММП-2:ТИМП-1 в сыворотке крови, повышением активности хитотриозидазы - маркера стимуляции макрофагов, которые можно рассматривать в качестве неинвазивных сывороточных показателей развития фиброза.

3. Развитие хронического токсического СС14-гепатита у мышей сопровождается повышением концентрации ТИМП-1, снижением активности цистеиновой протеазы катепсина L в ткани печени и снижением активности P-D-галактозидазы в сыворотке крови. Однократное введение ИФН-а повышает активность цистеиновых - катепсинов В и L и аспартильной протеазы катепсина D, участвующих в деградации компонентов внеклеточного матрикса.

4. Острый токсический ССЦ-гепатит у мышей характеризуется повышением сывороточной активности хитотриозидазы.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Юзько, Юлия Валерьевна

выводы

1. Повышение активности ММП-2,7 в сыворотке крови пациентов с циррозом печени в исходе вирусного гепатита С по сравнению с больными ХВГ С без признаков цирроза, не зависящее от активности АЛТ сыворотки крови, является показателем деградации компонентов внеклеточного матрикса, что позволяет включить его в ряд сывороточных маркеров фиброза печени.

2. Повышение активности хитотриозидазы в сыворотке крови больных циррозом печени в исходе вирусного гепатита С отражает стимуляцию макрофагов и развитие воспаления; снижение активности р-Э-галактозидазы при ХВГ С связано с прямым цитопатическим действием вируса.

3. Модель хронического СС14-гепатита у мышей характеризуется развитием фиброза, повышением концентрации ТИМП-1, снижением активности катепсина Ь и повышением активности катепсина Э в ткани печени, что свидетельствует о нарушении регуляции в системе протеазы-ингибиторы протеаз.

4. Однократное введение высокой дозы ИФН-а мышам с хроническим ССЦ-гепатитом повышает содержание ТИМП-1; повышенная активность катепсина В и катепсина Б отражает стимуляцию макрофагов печени.

5. Наиболее информативными сывороточными маркерами раннего выявления фиброза печени у пациентов с ХВГ С являются суммарная активность ММП и соотношение концентрации ММП-2: ТИМП-1.

Автор выражает искреннюю признательность и благодарность своим научным руководителям - д.м.н., проф. Короленко Татьяне Александровне и д.м.н. Волошиной Наталье Борисовне за неоценимую методическую помощь, постоянную поддержку и консультации; сотрудникам ГУ НИИ физиологии СО РАМН: зав. биохимической лаборатории к.м.н. Филатовой Татьяне Григорьевне, ст.н.с. д.м.н. Максимову Валерию Федоровичу, Алексеенко Татьяне Владимировне, ст.н.с. к.б.н. Жанаевой Светлане Яковлевне, ст.н.с. к.б.н. Каледину Василию Ивановичу, Савченко Наталье Геннадьевне, д.м.н. Филимонову Павлу Николаевичу (ГУ НИИ туберкулеза), Гончаровой Наталье Валерьевне, зав. биохимической лаборатории МКБ №1 к.м.н. Гончаровой Илоне Анатольевне, зав. патологоанатомическим отделением к.м.н. Фаламеевой Ольге Викторовне, оказавшим помощь при выполнении данной работы.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Юзько, Юлия Валерьевна, Новосибирск

1. Аруин Л. И. Апоптоз и патология печени. // Российский журнал гастроэнтерол., гепатол., колонопроктол. - 1998. - №2. - С. 6 - 10.

2. Блохина Н. П. Возможности, варианты и перспективы лечения хронического гепатита С после проведения одного курса интерферонотерапии. // Вирусные гепатиты. Достижения и перспективы. 1998. - №-1 (3). - С. 8 - 12.

3. Блохина Н. П. Новые стратегии интерферонотерапии больных хроническим гепатитом С. // Вирусные гепатиты. Достижения и перспективы. 1999. - №2 (6). - С. 11 - 18.

4. Буеверов А. О., Дмитриева Е. В., Москалева Е. Ю. и соавт. FAS-опосредованный апоптоз при хронических вирусных гепатитах. // Рос. журн. гастроэнтерол., гепатол., колопроктол. 2002. - №5. -Приложение 17. - С. 81.

5. Буеверов А. О., Тихонина Е. В., Москалева Е. Ю. и соавт. Апоптоз периферических лейкоцитов при хронических вирусных гепатитах. // Российский журнал гастроэнтерол., гепатол., колонопроктол. -2000.-№6.-С. 30-33.

6. Буеверов А.О. Апоптоз и вирусные гепатиты // Вирусные гепатиты: достижения и перспективы. 2001. - №1 (11). - С. 12-14.

7. Бурневич Э. 3. Новый взгляд на прогнозирование устойчивого вирусологического ответа при лечении гепатита С. // Вирусные гепатиты. Достижения и перспективы. 2003. - №-1 (16). - С. 6 - 8.

8. Бурневич Э.З., Лопаткина Т.Н., Никулина E.H. Противовирусная терапия цирроза печени в исходе хронического гепатита С // Вирусные гепатиты: достижения и перспективы. 2005. - №2 (21). -С. 3-10.

9. Бышевский А.Ш., Терсенов O.A. Биохимия для врача. -Екатеринбург: Уральский рабочий, 1994. 384с.

10. Власов В. В. Введение в доказательную медицину. М.: Медиа Сфера. 2001.-392 с.

11. Гепатит С: консенсус 2002. (Национальный институт здоровья США, 10-12 июня 2002г.). // Вирусные гепатиты. Достижения и перспективы. 2002. - №-2 (15). - С. 3-11.

12. Гланц С. Медико-биологическая статистика. Пер с англ. М.: Практика. 1998. - 459 с.

13. Гончарова И.А., Левина O.A., Короленко Т.А. и соавт. Клинико-биохимическая характеристика вирусного гепатита С на фоне наркотической зависимости // Terra Medica. 2003.- №1.- С. 12-14

14. Дьякова И. П., Ильченко Л. Ю., Гудкова Р. Б. Гепатоцеллюлярная карцинома: 2-годичное наблюдение.// Экспериментальная и клиническая гастроэнтерология. 2003. - №1. - С. 125 - 126.

15. Жданов К.В., Лобзин Ю.В., Гусев Д.А. и соавт. Значение морфологических исследований в диагностике и лечении парентеральных вирусных гепатитов. // Вирусные гепатиты. Достижения и перспективы. 2003. - №-2 (17). - С. 11-16.

16. Зорин H.A., Зорина В.Н., Зорина P.M., Левченко В.Г. Универсальный регулятор а2 - макроглобулин (обзор литературы) // Клиническая лабораторная диагностика. - 2004. - № 11.-С. 18 -22.

17. Ивашкин В. Т. Болезни печени и желчевыводящих путей. Руководство для врачей. М.: ООО «Издат. Дом. « M - Вести», 2002.-С. 432.

18. Короленко Т.А. Катаболизм белка в лизосомах // Новосибирск: Наука, 1990.-185 с.

19. Короленко Т. А., Жанаева С .Я., Потеряева О.Н. и др. Активность и концентрация катепсина В как прогностический критерий в развитии лимфосаркомы мышей и аденокарциномы легких Льюис. Бюллетень экспер. биол. мед. // 2002. Т. 133. - С. 452-455.

20. Короленко Т.А., Фаламеева О.В., Жанаева С.Я. и соавт. Хитотриозидаза новый фермент макрофагов: биологическая роль и значение в диагностике лизосомных болезней накопления // Бюллетень СО РАМН. - 2001. - №1 (99). - С. 28-34.

21. Короленко Т.А., Черканова М.С. , Филатова Т.Г. , Бравве И.Ю. Возрастные изменения эндогенного ингибитора цистеиновых протеаз цистатина С и С-реактивного белка у здоровых лиц // Лабораторная диагностика Terra Medica. - 2007. - № 1. - С. 8-11.

22. Курилович С. А., Решетников О. В. Эпидемиология заболеваний органов пищеварения в западной Сибири. Новосибирск, 2000. 165 с.

23. Лопаткина Т. Н. Опыт лечения хронического гепатита С высокими дозами интерферона альфа. // Вирусные гепатиты. Достижения и перспективы. 1999. - N-3 (7). - С. 16 - 19.

24. Лопаткина Т. Н., Абдурохманов Д. Т., Крель П. Е. Современные тенденции противовирусной терапии хронической HBV инфекции. // Фарматека. - 2002. - №9. - С. 33 - 39.

25. Маевская М.В. Хронический гепатит С // Медицинская кафедра. 2002. - №. - С.22.

26. Мамедов М.К., Михайлов М.И. От вируса гепатита С до TTV и далее (к 15-летию идентификации вируса гепатита С) // Вирусные гепатиты: достижения и перспективы.- 2005.- №2 (21).- С. 11-15.

27. Мухин Н. А., Апросина 3. Г. Трудности лечения хронических вирусных заболеваний печени. // Вирусные гепатиты. Достижения и перспективы. 2003. - №-1 (16). - С. 3 - 5.

28. Назаренко Г.И., Кишкун A.A. Клиническая оценка результатов лабораторных исследований. М.: Медицина, 2000. - 544с.

29. Назаров П.Г. Реактанты острой фазы воспаления. Санкт-Петербург: Наука, 2001, - 423 с.

30. Пальгова Л. К., Друд Л. Я., Шакиров Т. Г. Анализ первого опыта противовирусной терапии вирусных циррозов печени ламивудином. // Материалы восьмой Российской конференции «Гепатология сегодня» Москва, 2003. - С. 18.

31. Погромов Л. Ю., Мишнаевский А. Л., Мустафин X. X. Вирусные поражения печени у наркоманов. // Экспериментальная и клиническая гастроэнтерология. 2002. - № 1. - С. 61 - 63.

32. Подымова С. Д. Болезни печени. М.: Медицина, 1998. 703 с.

33. Подымова С. Д., Азов А. Г. Вирусные гепатиты у пожилых пациентов. Особенности эпидемиологии, клинической картины, профилактики и лечения. // Вирусные гепатиты. Достижения и перспективы. 2001. - №1 (11). С. 3 - 12.

34. Потеряева О.Н., Фаламеева О.В., Жанаева С.Я. и др. Роль цистатина С и цистеиновых протеаз в развитии мышиной Ь8 лимфосаркомы. Бюлл. экспер. биол. мед. // 2001. N 7. - С. 77 - 79.

35. Потеряева О.Н., Поляков Л.М. Короленко Т.А. и др. Действие полисахаридов и липопротеинов плазмы крови на секрецию цистатина С перитонеальными макрофагами мышей в норме и при опухолях // Биохимия. 2004. - Т. 69. - С. 295-298.

36. Реброва О. Ю. Описание процедуры и результатов статистического анализа в разделе «Материалы и методы». Представление данных в разделе «Результаты». // Межд. жур. мед. Практики. 2000. - №4. - С. 43 - 45.

37. Решетников О. В. Эпидемиологические аспекты заболеваний органов пищеварения: Авт. дисс. . д. м. н. Новосибирск. - 2001. -40 с.

38. Соринсон С. Н. Вирусные гепатиты. С.- П.: Теза. 1998. - 325 с.

39. Сюткин В. Е., Иваников И. О., Минушкин О. Н. Течение и факторы риска прогрессирования хронических заболеваний печенивирусной этиологии. // Кремлевская медицина. Клинический вестник. 2002. - № 1. - С. 59 - 61.

40. Тучина Л. М., Жук Л. Г. Порошенко Г. Г. Эпидемиология заболеваний печени и желчных путей населения г. Москвы. //Российский гастроэнтерологический журнал. 2000. - №1. - С. 5 -9.

41. Филимонов П.Н., Сухенко Т.Г., Гаврилова Н.И., Шкурупий В.А. Влияние ИФН-а на ССЦ-индуцированный фиброз печени и иммунный статус у мышей разного возраста // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2005. - Т. 139. - №3. -С. 303-306.

42. Флетчер Р., Флетчер С., Вагнер Э. Клиническая эпидемиология. Основы доказательной медицины: Пер. с англ. / Под ред. С. Е. Бащинского, С. Ю. Варшавского. М.: Медиа Сфера. - 1998. - 352 с.

43. Шахгильдян И. В. Современная эпидемиологическая характеристика гепатитов В и С в Российской Федерации. // Вирусные гепатиты. Достижения и перспективы. 1999. - №-3 (7). -С. 9-16.

44. Шахгильдян И. В., Онищенко Г. Г., Хухлович П. А. и соавт. Итоги изучения и нерешенные вопросы эпидемиологии и профилактики парентеральных вирусных гепатитов в России. // Ж. микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 1994. - № 5. -С. 26-32.

45. Ющук Н.Д., Знойко О.О., Сафиуллина Н.Х., Келли Е.И. Пункционная биопсия печени и возможности неинвазивного мониторинга фиброза при хроническом вирусном гепатите С // Клинические перспективы гастроэнтерологии, гепатологии. 2002.Т. 1.-С. 9-16.

46. Яровая Г.А., Доценко В.Л., Пашинцева Л.П. Определение активности а 1-антитрипсина и а2-макроглобулина в плазме кровичеловека унифицированным энзиматтическим методом // Методы клинической биохимии. М., 1982. - С. 22-25.

47. Abrahamson М. Cystatins // Methods Enzymol. 1994. - 244. - P. 685-700.

48. Abrahamson M., Alvares-Fernandez M., Nathanson C.-M. Cystatins // Biochem. Soc. Symp. 2003. - Vol. 70. - P. 179-199.

49. Aerts JM, Hollak CE, van Breemen M et al. Identification and use of biomarkers in Gaucher disease and other lysosomal storage diseases // Acta Paediatr Suppl. 2005. - Vol. 94 (447). - P. 43-46.

50. Aguilera В., Ghauharali-van der Vlugt K., Helmond M.T.J, et al. Transglycosidase activity of chitotriosidase: improved enzymatic assay for the human macrophage chitinase // J. Biol. Chem. 2003. - Vol. 278. -P. 40911-40916.

51. Armstrong P.B., Quigley J.P. Alpha2-macroglobulin, an evolutionary conserved arm of the innate immune system // Dev. Сотр. Immunol. -1999.-Vol. 23.-P. 375-390.

52. Arthur M.J.P. Fibrogenesis. II. Metalloproteinases and their inhibitors in liver fibrosis // Amer. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 2000. -Vol. 279. - G245-G249.

53. Asaba N., Okamura H., Tokuue H. et al. Comparative study of TTV со infection in patients with chronic liver disease В, С and non - В non -С. // Hippon Rinsho. - 1999. - V. 57. - N. 6. - P. 1362 - 1365.

54. Asanuma K., Shirato I., Ishidoh K. et al. Selective modulation of the secretion of proteinases and their inhibitors by growth factors in cultured differentiated podocytes // Kidney Int. 2002. - Vol. 62 (3). - P. 822831.

55. Baker A.B., Edwards D.R., Murphy G. Metalloproteinase inhibitors: biological actions and therapeutic opportunities // J. Cell. Science. -2002.- Vol. 115.-P. 3719-3727.

56. Bao J. J., Reed-Fourquet L., Sisers R. N. et al. Molecular structure and sequense homology of a gene related to a 1-antitrypsin in the human genome / Genomics. 1988. Vol. 2. P. 165-173.

57. Barret A.J. Lysosomal enzymes. In: Lysosomers: a laboratory handbook // J.T. Dingle ed. Amsterdam. London: North Holland, 1972. -p. 46-135.

58. Barrett A. The cystatins: a diverse superfamily of cysteine peptidase inhibitots // Biomed. Biochim. Acta. 1986. - Vol. 45. - P. 1363-1374.

59. Barrett A., Kirschke H. Cathepsin B, cathepsin H and cathepsin L // Methods in Enzymology /Lorand L., ed. New York: Academic Press. -1981.-Vol. 80.-P. 535-561.

60. Bataller R. and Brenner D.A. Liver fibrosis // J. Clin.Invest. 2005. -Vol. 115. - №2. -P.209-218.

61. Bellentani S., Saccoccio G., Costa G. et al. Drinking habits as cofactors of risk for alcohol induced liver damage. // Gut. 1997, - Vol. 41. -P. 579- 590.

62. Bengtsson E., To F., Grubb A. et al. Absence of the protease inhibitor cystatin C in inflammatory cells results in larger plaque area in plaque regression of apoE-deficient mice // Atherosclerosis. 2005. Vol. 180. -P. 45-53.

63. Birkedal-Hansen H. et al. Matrix metalloproteinases: a review. // Crit Rev Oral Biol Med. 1993. - Vol. 4. - P. 197-250.

64. Birkenmeier G., Muller R., Huse K. et al. Human alpha2-macroglobulin: genotype-phenotype relation // Exp Neurol. 2003. -Vol. 184(1).-P. 153-161.

65. Bokenkamp A., Herget-Rosenthal S., Bokenkamp R. Cystatin C, kidney function and cardiovascular disease // Pediatric Nephrology. -2006.-Vol. 10.-P. 11-48.

66. Bollen A., Herzog A., Cravador A. et al. Cloning and expression in Excherichia coli of full-length complementary DNA coding for human alpha 1- antitrypsin / DNA. 1983. Vol. 2. P. 255-264.

67. Bonkovsky H., Woolley M. Consensus Interferon Study Group. Reduction of health related quality of life in chronic hepatitis C and improvement with interferon therapy. // Hepatology. - 1999. - Vol. 29. -P. 264-270.

68. Borkakoti N. Matrix metalloprotease inhibitors: design from structure // Biochemical Society Transactions. 2004. - Vol. 32. - P. 17-20.

69. Camma C., Giunta M., Andreone P. et al. Interferon and prevention of hepatocellular carcinoma in viral cirrhosis: An evidence-based approach. // Hepatology. 2001.- V. 34. - P. 593-602.

70. Cargalia M., Vitale G., Marra M. et al. Translational and post-translational modification of proteins as a new mechanism of action of Alpha-Interferon: Review article // Amino Acids. 2004. - Vol. 26. - P. 409-417.

71. Castera L., Pawlotsky J.-M. Noninvasive diagnosis of liver fibrosis in patients with chronic hepatitis C // Medscape General Medicine. 2005. - Vol. 7.-P. 39-43.

72. Chen T.-Y., Hsieh Y.-Sh., Yang Ch.-Ch. et al. Relationship between matrix metalloproteinase-2 activity and cystatin C levels in patients with hepatic disease // Clinical Biochemistry. 2005. - Vol. 38. - P. 632-638.

73. Chu S.C., Wang C.P., Chang Y.H. et al. Elevated cystatin C serum concentrations in patients with hepatic diseases of various severities // Clin. Chim. Acta. 2004. - Vol. 341. - P. 133-138.

74. Clark I.M. et al. Polyclonal and monoclonal antibodies against human tissue inhibitor of netalloproteinases (TIMP) and the design of an enzyme-linked immunosorbent assay to measure TIMP // Matrix- 1991.-Vol. 11. P.76-85.

75. Czaya A. J., Carpenter H. A., Santach P. J. et al. Host and disease specific factors affecting steatosis in chronic hepatitis C. // J Hepatol. -1998.-Vol. 29.-P. 198-206.

76. De Duve C. C., Pressman B.C., Gianetto et al. Tissue fractionation studies. 6. Intracellular distribution patterns of enzymes in rat-liver tissue // Biochem. J. 1955. - Vol. 60, № 4. - P. 604-617.

77. Donato F., Gelatti U., Tagger A. et al. Intrahepatic cholangiocarcinoma and hepatitis C and B virus infection, alcohol intake, and hepatolithiasis: a case-control study in Italy. // Cancer Causes Control. 2001. - Vol. 12. - N. 10. - P. 959-964.

78. Donato MF, Degott C, Arosio E et al. Interferon-alpha suppresses liver cell proliferation in patients with chronic hepatitis C virus infection // J Viral Hepat. 2005. - Vol. 12. - P. 499 - 506.

79. Dubin G. Proteinaceous cysteine protease inhibitors // Cell. Mol. Life Sci. 2005. - Vol. 62. - P. 685-700.

80. Filler G., Bokenkamp A., Hofmann W. et al. Cystatin C as a marker of CFR history, indications, and future research // Clinical Biochemistry. -2006.-Vol. 38.-P. 1-8.

81. Forns X., Bataller R. Can we indentify liver fibrosis in HCV-infected patients without a liver biopsy? // Current Hepatitis Reports. 2003. -Vol. 2-P. 146-154.

82. Fried M. W, Schiffman M. L., Reddy R. et al. Peginterferon Alfa-2a Plus Ribavirin for Chronic Hepatitis C Virus Infection. // N. Engl. J. Med. 2002. - Vol. 347. - N. 13. - P. 975-982.

83. Garber T.R., Gonias S.L., Webb D.J. Interleukin-4 and IL-10 bind covalently to activated human alpha2-macroglobulin by a mechanism that requires Cys949 // J Interferon Cytokine Res. 2000. - Vol. 20. - P. 125-131.

84. Garsiade Leon Mdel C., Montfort I., Tello Montes E. et. al. Hepatocyte production of modulators of extracellular liver matrix in normal and cirrhotic rat liver // Exp. Molec. Pathol. 2006. - Vol. 80. - P. 97-108.

85. Geisler S., Lichtinghagen R., Boker K. H. W., Veh R. W. Differential distribution of five members of the matrix metalloproteinase family and one inhibitor (TIMP-1) in human liver and skin // Cell Tissue Res. -1997.- Vol.-289.-P. 173-183.

86. Giannelli G., Bergamini C., Marinosci F. et al. Antifibrogenic effect of IFN-alpha2b on hepatic stellate cell activation by human hepatocytes // J Interferon Cytokine Res. 2006. - Vol. 26. - P. 301-308.

87. Glikberg F., Braver-Ostrovsky J., Ackerman Z. Very high prevalence of hepatitis B and C in Bukharian Jewish immigrants to Israel. // J. Clin. Gastroenterol. 1997. - Vol. 24. - P. 30 - 33.

88. Hammani K. Structure and characterization of the human tissue inhibitor of metalloproteinases-2 gene // J Biol Chem. 1996. - Vol. 271. -P. 25498-25505.

89. Heilman R., Mazur M.J. Cystatin C as a more sensitive indicator of diminished flomerular filtration rate. Liver transplantation. 2005; 11 (3): 264-266.

90. Hibbetts K., Hines B., Williams D. An overview of proteinase inhibitors // Br. J. Cancer. 1999.-Vol. 79.- P. 244-250.

91. Hollak C.E.M., van Weely S., van Oers M.H.J., Aerts J.M.F.G. Marked elevation of plasma chitotriosidase activity: a novel hallmark of Gaucher disease // J. Clin. Invest. 1994. - Vol.93. - P.1288-1292.

92. Hoofnagle J. H., DiBisceglie A. M. The treatment of chronic viral hepatitis. // N. Engl. Med. 1997. - Vol. 336. - P. 347 - 356.

93. Hornebeck W. Down-regulation of tissue inhibitor of matrix metalloprotease-1 (TIMP-1) in aged human skin contributes to matrix degradation and impaired cell growth and survival // Pathol Biol (Paris). -2003.-Vol. 51(10).-P. 569-73.

94. Hsu S.J., Nagase H., Balmain A. Identification of fetuin B as a member of a cystatin-like gene family on mouse chromosome 16 with tumor suppression activity // Genome. - 2004. - Vol. 47. - P. 931-946.

95. Irani D.N., Anderson C., Gundry R. et al. Cleavage of cystatin C in the cerebrospinal fluid of patients with multiple sclerosis // Ann. Neurol. 2006. - Vol. 59. - P. 237-247.

96. Iredale J.P. Hepatic Stellate Cell Behavior during Resolution of Liver1.jury// Semin. Liver Dis. -2001. Vol. 21. - P. 427-436.

97. J. Biol. Chem. 1999. - Vol. 274. - P. 2191.

98. Janciauskiene S. Conformational properties of serine proteinase inhibitors (serpins) confer multiple pathophysiological roles // Biochim. Biophys. Acta. 2001. - Vol. 1535. - P. 221-235.

99. Janciauskiene S., Larsson S., Larsson P. et al. Inhibition of Lipopolysaccharide-mediated human monocyte activation, in vitro, by alphal-antitrypsin // Biochem Biophys Res Commun. 2004. - Vol. 321. -P. 592-600.

100. Jones B., Roberts P.J., Faubion W.A. et al. Cystatin C expression reduces bile salt induced apoptosis in a rat hepatoma cell line // Amer. J. Physiol. (275. Gastrointestinal Liver Physiol.). 1998. - Vol. 38. -G723-G730.

101. Joyce J.A., Baruch A., Chehade K. et al. Cathepsin cysteine proteases are effectors of invasive growth and angiogenesis during multistage tumorigenesis // Cancer Cells. 2004. - Vol. 5. - P. 443-453.

102. Keppler D. Towards novel anti-cancer strategies based on cystatin functions // Cancer Letters. 2006. - Vol. 235. - P. - 159-176.

103. Kim W. R., Ishitani M. B., Dickinson E. R. Rising burden of hepatitis B in the United States: Should the other virus be forgotten? // Hepatology. 2002. - Vol. 36. - P. A-222.

104. Knittel T., Mehde M., Grundmann A. et al. Expression of matrix metalloproteinases and their inhibitors during hepatic tissue repair in the rat // Histochem Cell Biol. 2000. - Vol. 113. - P. 443-453.

105. Kohler A, Wahl E., Soffker K. Functional and morphological changes of lysosomes as prognostic biomarkers of toxic liver injury in marine flatfish (Platichthys flesus (L.) // Environ. Toxicol. Chem. 2002. - Vol. 21 (11).-P. 2434-2444.

106. Korolenko T.A., Djanayeva S. J., Falameyeva O. V. et al. Chitotriosidase as a new marker of macrophage stimulation in a tumor model treated with cyclophospamide and Ukrain // Drugs. Exptl. Clin. Res. 2000. - Vol. 27. - P. 279-283.

107. Korolenko T.A., Levina O.A., Falameyeva O.V.,. et al. Comparative characteristic of serpin alpha-1 proteinase in human and mice serum // Ros Fiziol Zh Im IM Sechenova. - 2003. - Vol. 89. - P. 420-426.

108. Korolenko T.A., Poteryaeva O.N., Djanaeva S.Ya. et al. Cystatin C in LS lymphosarcoma and HA-1 hepatoma treated with ukrain and cyclophosphamide and involvement of apoptosis // Drugs Exper. Clin. Res. 2000. Vol. 25 (5/6). - P. 285-292.

109. Kos J., Krasovec M., Cimerman N. et al. Cysteine proteinase inhibitors stefin A, stefin B, and cystatin C in sera from patients with colorectal cancer: relation to prognosis // Clin. Cancer Res. 2000. — Vol. 6.-P. 505-511.

110. Koulentaki M., Valatas V., Xidakis K. et al. Matrix metalloproteinases and their inhibitors in acute viral hepatitis // J. Viral Hepatitis. 2002. -Vol. 9.-P. 189-193.

111. Krahenbuhl L., Lang C., Ludes S. et al. Reduced hepatic glycogen stories in patients with hepatic fibrosis // Liver international. 2003. -Vol. 23.-P. 101-109.

112. Lacki J. K., Schochat T., Leszcynski P. et al. IgA-a-1-antitrypsin complex in systemic Lupus erythematosus-preliminary report / Lupus. 1995. Vol. 4, N 3. P. 221-224.

113. Larsson A., Helmersson J., Hansson L.-O., Basu S. Increased serum cystatin C is associated with increased mortality in elderly men // Scand. J. Clin. Lab. Invest. 2005. - Vol. 65. P. 301-306.

114. Lebensztein DM, Skiba E, Kaszmarski M. et al. Serum cystatin C concentration does not predict advanced liver disease in children with chronic hepatitis B // Clin. Chim. Acta. 2004. - Vol. 347 (1-2). - P. 227-228.

115. Lichtinghagen R., Huegel O., Seifert Th. et al. Expression of matrix metalloproteinase-2 and -9 and their inhibitors in peripheral blood cells of patients with chronic hepatitis C // Clinical Chemistry. 2000. - Vol. 46 (2).-P. 183-192.

116. Liu H.L., Li X.H., Wang D.Y., Yang Sh.P. Matrix metalloproteinase-2 and tissue inhibitor of metalloproteinase-1 expression in fibrotic rat liver. World Journal of Gastroenterology, 2000, vol. 6, N 6, pp.881-884.

117. Lopez-Otin C., Overall Ch. M. Protease degradomics: a new challenge for proteomics // Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 2002. -Vol. 3.-P. 509-519.

118. Lowry O., Rosenbrough H., Farr A., Randell R. Protein measurment with the Folin phenol reagent // J. Biol. Chem. 1951. vol. 193, № 1. - p. 265-275.

119. Maltseva N., Zorin N. The Comparison of Immunoregulatory Properties of Human Alpha2-Macroglobulin and Pregnancy-Associated Alpha2-Glycoprotein // Russ J Immunol. 1997. - Vol. 2. - P. 97-102.

120. Mares J., Stejskal D., Vavrouskova J. et al. Use of cystatin C determination in clinical diagnostics // Biomed Papers. 2003. - Vol. 147.-P. 177-180.

121. Marinosci F., Bergamini C., Fransvea E. et al. Clinical role of serum and tissue matrix metalloprotease-9 expression in chronic HCV patients treated with pegylated IFN-alpha2b and ribavirin // J Interferon Cytokine Res. 2005. - Vol. 25. - P. 453-8.

122. McLindon J. P., Paver W. K., Babbs C. et al. Hepatitis C related chronic liver disease among asymptomatic blood donors in the north west of England. // J. Infect. - 1995. - Vol. 30. - P. 253 - 259.

123. Mettenburg J.M., Webb D.J., Gonias S.L. Distinct binding sites in the structure of alpha 2-macroglobulin mediate the interaction with beta-amyloid peptide and growth factors // J. Biol. Chem. 2002. - Vol. 277. -P.13339 - 13345.

124. Mohammed F.F., Pennington C. J., Kassiri Z. et al. Metalloproteinase inhibitor TIMP-1 affects hepatocyte cell cycle via HGF activation in murine liver regeneration // Hepatology. 2005. - Vol. 41. - P. 857-867.

125. Mulaomerovic A., Halilbasic A., Cickusic E. et al. Cystatin C as a potential marker for relapse in patients with non-Hodgkin B-cell lymphoma // Cancer Letters. 2007. - Vol. 248 (2). - P. 192-197.

126. Nagase H., Fields C.G., Fields G.B. Design and characterization of a fluorogenic substrate selectively hydrolyzed by stromelysin 1 (matrix metalloproteinase-3) //J. Biol. Chem. 1994.-Vol.269. - P.20952-20957.

127. Nagase H., Woessner J.F.Jr. Matrix metalloproteinases. Minireview // J. Biol.Chem. 1999. - Vol. 274. - P. 2191.

128. Nakabayashi H., Hara M., Shimuzu K. Clinicopathologic significance of cystatin C expression in gliomas // Human Pathology. 2005. - Vol. 36.-P. 1008-1015.

129. Nakamuta M., Kohjima M., Fukushima M. et al. Cyclosporine suppresses cell growth and collagen production in hepatic stellate cells // Transplant Proc. 2005. - Vol. 37. - P. 4598-4602.

130. Nordoy I., Schrumpf E., Elgio K. Liver disease in anti-hepatitis C virus positive Norwegian blood donors. // Scand. J. Gastroenterol. -1994.-Vol. 29.-P. 77-81.

131. Ognibene A., Manucci E., Caldini A. et al. Cystatin C reference values and aging // Clinical Biochemistry. 2006. - Vol. 29. - P. 658-661.

132. Opdenakker G., Van Damme J. Cytokine-regulated proteases in autoimmune diseases // Immunol Today. 1994. - Vol. 15. - P. 103-107.

133. Orlando R., Mussap M., Plebani M. et al. Diagnostic value of plasma cystatin C as a glomerular filtration marker in decompensated liver cirrhosis // Clinical Chemistry. 2002. - Vol. 48 (6). - P. 850-858.

134. Patel T., Gores G.J., Steer C.J. Apoptosis and the liver: a mechanism of disease, growth regulation and carcinogenesis // Hepatology. 1999. -Vol. 30.-P. 811-815.

135. Pendas A.M., Folgueras A.R., Liano E. et al. Diet-induced obesity and reduced skin cancer susceptibility in matrix metalloproteinase 19-deficient mice // Mol Cell Biol. 2004. - Vol. 24. - P. 5304-5313.

136. Pessione F., Degos F., Marcellin P. et al. Effect of alcohol consumption on serum hepatitis C virus RNA and histological lesions in chronic hepatitis C. // Hepatology. 1998. - Vol. 27. - P. 1717-1722.

137. Petersen C.M. Alpha 2-macroglobulin and pregnancy zone protein. Serum levels, alpha 2-macroglobulin receptors, cellular synthesis and aspects of function in relation to immunology // Dan. Med. Bull. 1993. -Vol. 40.-P. 409-446.

138. Pinon P., Kaski J.C. Inflammation, atherosclerosis. And cardiovascular disease risk: PAPP-A, Lp-PLA2, and cystatin C. New insights or regular information? // Rev. Esp. Cardiol. 2006. - Vol. 59. -P. 247-258.

139. Poynard T., Bedossa P., Opolon P. Natural history of liver fibrosis progression in patients with chronic hepatitis C: the OBSVIRC, METAVIR, CLINVIR, and DOSVIRC groups. // Lancet. 1997. - Vol. 349.-P. 825-832.

140. Poynard T., McHutchison J., Davis G.L. Impact of interferon alfa-2b and ribavirin on progression of liver fibrosis in patients with chronic hepatitis C // Hepatology. 2000. - Vol. 32. - P. 1131-1137.

141. Poynard T., McHutchison J., Manns M. et al. Biochemical surrogate markers of liver fibrosis and activity in a randomized trial ofpeginterferon alfa-2b and ribavirin // Hepatology. 2003. - Vol. 38. - P. 481-492.

142. Poynard T., Vlad Ratziu, Yves Benmanov et al. Fibrosis in patients with Chronic Hepatitis C: Delection and Significance // Seminars in Liver Disease. 2000. - Vol. 20, N. 1. - P. 47-54.

143. Pshezhetsky A.V., Potier M. Association of N-acetylgalactosamin-6-sulfatase with the multienzyme lysosomal complex of P-galactosidase, cathepsin A and neuraminidase // J. Biol. Chem.-1996.-Vol. 271.-P. 28359-28365.

144. Rapp G., Freudenstein J., Klaudiny J. et al. Characterization of three abundant mRNAs from human ovarian granulosa cells // DNA Cell. Biol. 1990. Vol. 9. P.479-485

145. Rehermann B. Interaction between the Hepatities C Virus and the Immune System // Seminars in liver disease. 2000. - Vol. 20. - P. 127141.

146. Robinet P., Fradagrada A., Monier MN. et al. Dynamin is involved in endolysosomal cholesterol delivery to the endoplasmic reticulum: role in cholesterol homeostasis // Traffic. 2006. - Vol. 7. - P.811-823.

147. Roeb E., Graeve L., Mullberg J. et al. TIMP-1 protein expression is stimulated by IL-l-P and IL-6 in primary rat hepatocytes // Ann. N.Y. Acad. Sci. 1995. - Vol. 762. - P. 462-464.

148. Rogers J., Kalsheker N., Wallis S. et al. The isolation of a clone for human a 1-antitrypsin and the detection of a 1-antitrypsin in mRNA from liver and leukocytes / Biochem. Biophys. Res. Commun. 1983. Vol. 116. P. 375-382.

149. Rosenberg W.M., Voelker M. Thiel R. et al. Serum markers detect the presence of liver fibrosis. A cohort study // Gastroenterology. 2004. -Vol. 99.-P. 271-279.

150. Rust C., Gores G.J. Apoptosis and liver disease // Am. J. Med. 2000. -Vol. 108.-P. 567-574.

151. Sanchez J.-Ch., Guillaume E., Lescuyer P. et al. Cystatin C as a potential cerebrospinal fluid marker for the diagnosis of Creutzfeld-Jacob disease // Proteomics. 2004. - Vol. 4. - P. 2229-2233.

152. Sarnak M.J., Katz R., Stehman-Breen C. et al. Cystatin C concentration as a risk factor for heart failure in older adults // Ann. Intern. Ned. 2005. Vol. 142. - P. 497-505.

153. Schuppan D., Krebs A., Bauer M. et al. Hepatitis C and liver fibrosis // Cell Death Differ. 2003. - N 10. - P. 59-67.

154. Schuppan D., Ruehl M., Somasundaram R. et al. Matrix as a modulator of hepatic fibrogenesis // Semin Liver Dis. 2001. - Vol. 21. -P. 351-72.

155. Shi G.-P., Sukhova G.K., Grubb A. et al. Cystatin C deficiency in human atherosclerosis and aortic aneurysms // J. Clin. Invest. 1999. -Vol. 104 (9).-P. 1191-1197.

156. Sottrup-Jensen L., Birkedal-Hansen H. Human fibroblast collagenase-a-macroglobulin interactions // J. Biol. Chem. 1989. - Vol. 264. - P. 11539-11542.

157. Stoka V., Turk B., Turk V. Lysosomal cysteine proteases: structural features and their role in apoptosis // Life. 2005. - Vol. 57 (4/5). - P. 347-353.

158. Suares A., Viejo G., Navascues C. A. Prevalencia de marcadores frente a los virus A, B, C de la hepatitis en la poblation de Gijon entre 26 y 65 anos de edad. // Gastroenterol. Hepatol. 1997. - Vol. 102. - P. 1259-1268.

159. Sukhova G.K., Wang B., Libby P. et al. Cystatin C deficiency increases elastic lamina degradation and aortic dilatation in apolipoprotein E-null mice // Circ. Res. 2005. - Vol. 96. - Vol. 368375.

160. Sukhova G.K., Zhang Y., Pan J.-H. et al. Deficiency of cathepsin S reduces atherosclerosis in LDL receptor-deficient mice // J. Clin. Invest. 2003. - Vol. - 111. - P. 897-906.

161. Takahata T. et al. Cotreatment with interferon-alpha and -gamma reduces liver fibrosis in a rat model // Hepatol. Res. 2004. - Vol. 28(3). -P. 146- 154.

162. Takeuchi M., Fukuda Y., Nakano Y. et al. Elevation of serum cystatin C concentration in patients with chronic liver disease // Eur. J. Gastroenterol. 2001. - Vol. 13 (8). - P. 951-955.

163. Tanney D.C., Feng L., Pollock A.S., Lovett D.H. Regulated expression of matrix metalloproteinasese and TIMP in nephrogenesis // Dev. Dyn. 1998. Vol. 213. P. 121-129.

164. Turk B., Turk D., Salvesen G.S. Regulating cysteine protease activity: essential role of protease inhibitors as guardians and regulators // Curr. Pharm. Des. 2002. - Vol. 8. - P. 1623-1637.

165. Turk D., Guncar G. Lysosomal cysteine proteases (cathepsins): promising drug targets // Acta Crystallographica Section D. 2003. -D59. -P.203-213.

166. Turk V., Bode W. The cystatins: protein inhibitors of cysteine proteinases // Fed. Eur. Biochem. Soc. Lett. 1991. - Vol. - 285. - P. 213-219.

167. Uchijima M., Sato H., Fujii M., Seiki M. Tax Proteins of HTLV-1 and -2 induce expression of the gene encoding erithroid-potentiating activity (tissue inhibitor of metalloproteinasase-1; TIMP-1) // J. Biol. Chem. -1994. Vol. 269. - P. 14946-14950.

168. Usova T.A., Poteryaeva O.N., Falameyeva O.V. et al. Serum cystatin C in murine tumors treated by combinations of cycloposphamide with Ukrain or glucans // Int. J. Immunother. 2003. - Vol. 19. - 135- 140.

169. Usova T.A., Poteryaeva O.N., Pospelova T.I., Korolenko T.A. Serum cystatin C in patients with hemoblastosis // Int. J. Immunother. 2003. -Vol. 19.-P. 61-65.

170. Van Damme P., Vorsters A. Hepatitis B control in Europe by universal vaccination programmes: the situation in 2001. // J. Med. Virol. 2002. - Vol. 67. - N. 3. - P. 433-439.

171. Van Eijk M., van Roomen C. P. A. A., Renkema G. H. et al. Characterization of human phagocyte-derived chitotriosidase, a component of innate immunity // International Immunology. 2005. -Vol. 17.- P. 1505-1512.

172. Visse R., Nagase H. Matrix metalloproteinases and tissue inhibitors of metalloproteinases: structure, function, and biochemistry //Circ Res. -2003. Vol. 92(8). - P. 827-839.

173. Wasselius J., Hakansson K., Abrahamson M., Ehinger B. Cystatin C in the anterior segment of rat and mouse eyes // Acta Ophtalmologica Scandinavica. 2004. - Vol. 82. - P. 68-75.

174. Webb D.J., Roadcap D.W., Dhakephalkar A., Gonias S.L. A 16-amino acid peptide from human alpha2-macroglobulin binds transforming growth factor-beta and platelet-derived growth factor-BB // Protein Sci. -2000. Vol. 9. - P. 1986 - 1992.

175. White P. A., Pan Y., Freeman A. J. et al. Quantification of Hepatitis C Virus in Human Liver and Serum Samples by Using LightCycler Reverse Transcriptase PCR. // J. Clin. Microbiol. 2002. - Vol. 40. - N. 11. - P. 4346-4348.

176. Wiederandes B., Oelke B. Accumulation of inactive cathepsin D in old rats. // Mech. Ageing Dev. 1984. v. 24, № 3. p. 265-271.

177. Woitas R.P., Stoffel-Wagner B., Flommersfeld S. et al. Correlation of serum concentration of cystatin C and creatinine to inulin clearance in liver cirrhosis // Clinical Chemistry. 2000. - Vol. 46 (5). - P. 712-715.

178. Yan S., Sloane B. Molecular regulation of human cathepsin B: Implication in Pathologies // Biol. Chem. 2003. - Vol. 384. - P. 845854.

179. Zarski J. P., Mc Hutchison J., Bronowicki J. P. et al. Rate of Natural Disease Progression in Patients with Chronic Hepatitis C. // J. Hepatol. -2003.-Vol. 38. -P. 307-314.