Роль протеаз различных классов в развитии остеопороза у крыс

Венедиктова, Анастасия Александровна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Роль протеаз различных классов в развитии остеопороза у крыс
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Роль протеаз различных классов в развитии остеопороза у крыс"

На правах рукописи

БЕНЕДИКТОВА Анастасия Александровна

РОЛЬ ПРОТЕАЗ РАЗЛИЧНЫХ КЛАССОВ В РАЗВИТИИ ОСТЕОПОРОЗА У КРЫС

03.00.04 - биохимия 14.00.16 - патологическая физиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

- з ДЕК 2009

Новосибирск - 2009

003486863

Работа выполнена в Научно-исследовательском институте физиологии Сибирского отделения Российской академии медицинских наук и в Новосибирском научно-исследовательском институте травматологии и ортопедии Федерального агентства по высокотехнологичной медицинской помощи

Научные руководители:

доктор медицинских наук,

профессор Короленко Татьяна Александровна

доктор медицинских наук Фаламеева Ольга Викторовна

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук,

профессор Колпаков Аркадий Ростиславович

доктор биологических наук Макарова Ольга Петровна

Ведущая организация:

Федеральное государственное учреждение «Российский научный центр «Восстановительная травматология и ортопедия» им. академика Г.А. Илизарова Росмедтехнологий»

Защита состоится «_»_2009 г. в_час на заседании

диссертационного совета Д 001.034.01 при Научно-исследовательском институте биохимии СО РАМН (630117, г. Новосибирск, ул. Академика Тимакова, 2)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Научно-исследовательского института биохимии СО РАМН (630117, г. Новосибирск, ул. Академика Тимакова, 2)

Автореферат разослан

2009г.

Ученый секретарь диссертационного < кандидат биологических наук

Русских Г. С.

Общая характеристика работы

Актуальность темы. Остеопороз - одно из наиболее распространенных метаболических заболеваний скелета - представляет собой серьезную медицинскую и социальную проблему (Цейтлин, 2002; Марченкова, 2000) из-за невозможности его выявления на ранних стадиях, сложности лечения, частых осложнений в виде трудно срастающихся переломов.

В основе развития данной патологии лежит нарушение ремоделирования костной ткани. Костное ремоделирование является процессом, благодаря которому происходит рост и постоянное обновление костной ткани. В норме ремоделирование костной ткани включает в себя процесс резорбции участка «старой» кости остеокластами и обязательный, достаточный для заполнения резорбционных лакун, процесс биосинтеза компонентов костного матрикса остеобластами. Сдвиг баланса ремоделирования в сторону резорбции является наиболее частой предпосылкой разрежения костной ткани и развития остеопороза.

Концентрация кальция и фосфора, а также активность тартрат-резистентной кислой фосфатазы в сыворотке крови до сих пор используются для оценки состояния процессов резорбции костной ткани как показатели деятельности остеокластов, а активность щелочной фосфатазы - для оценки процессов формирования и деятельности остеобластов (Камышников, 2002). Эти простые и недорогие методы диагностики обладают рядом недостатков, главными из которых являются невысокая информативность, низкая специфичность, а также существующие противоречивые данные об их изменении при развитии остеопороза (Баранов, 2002).

После растворения гидроксиапатитов происходит расщепление органических компонентов костного матрикса с участием протеолитических ферментов остеокластов. Ключевая роль в этом процессе принадлежит цистеиновой протеазе катепсину К (ВиЫигщ е1 а1., 2004; ВиЫигщ й а1., 2006). Предполагают, что он вовлечен в развитие остеопороза различного генеза, в том числе - сенильного и развивающегося у женщин в постменопаузальном периоде (ВиЫш^ е1 а1., 2004; ВиЫип§ ^ а1., 2006). Также показано участие матриксных металлопротеаз (ММП) первого, второго, седьмого, девятого, тринадцатого типа в ремоделировании костной ткани, однако сведения об их участии в резорбции кости противоречивы (Уаапапеп е1 а1., 2000; Нои Р. е1 а1., 2004; НеппкБеп К. а1., 2006). К настоящему времени не изучена степень вовлеченности катепсина К и ММП в патогенез разных вариантов остеопороза и не определена возможность использования сывороточной активности катепсина К и ММП в качестве прогностических маркеров.

развития многих патологий (Фаламеева, 2003; Ярыгина, 2005; Юзько, 2007) и, вероятно, могут усугублять течение основного заболевания. Контроль за активностью протеаз, попавших в кровоток из различных органов и тканей осуществляется а2-макроглобулином (а2-МГ) и агантитрипсином (агАТ). А2-макроглобулин обладает свойством захватывать и ингибировать все известные классы пептидаз (Веремеенко, 1998). Комплексы а2-макроглобулина с протеазами элиминируются из крови в течение 2 минут (Зорин, 2004), поэтому активность а2-макроглобулина в сыворотке отражает ее ингибиторные возможности. Кроме того, а2-МГ осуществляет транспорт различных цитокинов, в том числе - трансформирующего фактора роста Р, стимулирующего остеобласты и подавляющего активность остеокластов. Однако, после связывания с протеазами, комплексы цитокин-ингибитор-протеаза опознаются макрофагами печени как элементы, подлежащие деградации, поэтому происходит их захват и расщепление. Таким образом, цитокины могут не достигать клеток-мишеней.

Изменения активности а2-МГ и агАТ как резервов, способствующих адаптации организма при усилении резорбции костной ткани, а также возможность частичной передачи функций инактивации протеаз от одного ингибитора другому при усилении резорбции костного матрикса не изучались. Это особенно актуально при исследовании сенильного остеопороза, поскольку старение организма сопровождается усилением катаболических процессов, увеличением проницаемости в том числе, -лизосомальных мембран из-за окислительных повреждений. Кроме того, естественный процесс старения приводит к возникновению различных заболеваний, что существенным образом влияет на возникновение и течение остеопороза в этом возрасте. В частности, установлено, что развитие остеопороза у пожилых людей происходит на фоне болезней печени (Nakano, 1996; Kissler, 2002; Катикова, 2004). Печень является центральным органом в обеспечении организма пластическим материалом. Функциональные возможности печени в значительной мере определяются способностью осуществлять биосинтез и деградацию различных белков (Шкурупий, 1989). В печени происходит биосинтез сывороточных ингибиторов протеаз а2-МГ и агАТ, a также деградация их комплексов с протеазами в лизосомах. 90% внутриклеточного лизосомального протеолиза реализуется за счет согласованного действия катепсинов В, L, D (Рывняк, 2004). Поэтому изменение активности этих протеаз в печени может определять системные последствия, во-первых, из-за возможного нарушения пластической функции печени, а во-вторых, - из-за возникшего дисбаланса протеазы/ингибиторы в организме.

являться подходящей моделью для исследования сенильного остеопороза, поскольку развитие остеопороза у этой линии крыс сопровождается такими проявления старения, как усиление катаболизма белка, активация свободнорадикального окисления, нарушениями в работе печени из-за развивающихся фиброзных изменений, характерных для стареющего организма.

Еще одной распространенной формой остеопороза, а потому актуальной для исследования на животных-моделях, является остеопороз, развивающийся вследствие эстрогеновой недостаточности. Если постменопаузальный остеопороз активно изучается и более или менее успешно лечится, то остеопороз, вызываемый эстрогеновой недостаточностью у лиц женского пола в молодом возрасте изучен не достаточно хорошо. Особенную значимость этой проблеме придает то, что от формирования костной ткани в детском и подростковом возрасте зависит прочность костной ткани у взрослых. Значительную сложность в лечении остеопороза, развивающегося в молодом возрасте, представляет выбор препаратов лечения, поскольку препараты для взрослых обладают побочными эффектами, оказывающими влияние на рост и развитие молодого организма (Шварц, 2002; Фаламеева, 2008). Ранелат стронция (PC), применяемый для лечения постменопаузального остеопороза, способствует увеличению минеральной плотности костной ткани (МПКТ). В опытах in vivo и in vitro (Atkins, 2009), а также проспективных исследованиях (Meunier, 2004) он проявил себя не только как ингибитор резорбции, но и как стимулятор формирования костной ткани. Тем не менее, влияние PC на процессы резорбции костной ткани при лечении ОП в молодом возрасте не изучено.

Целью настоящей работы явилось изучение роли изменений в системе протеаз и их сывороточных ингибиторов в развитии разных форм остеопороза и влияния ранелата стронция на активность протеаз в костной ткани при развитии остеопороза на фоне эстрогеновой недостаточности.

В соответствии с целью были поставлены следующие задачи:

1. Исследовать особенности изменения активности катепсина К и матриксных металлопротеаз (ММП) в костной ткани и сыворотке крови у животных при остеопорозе различного генеза и их взаимосвязь с плотностью костной ткани.

2. В эксперименте исследовать концентрацию кальция, фосфора, активность щелочной и тартрат-резистентной кислой фосфатаз в сыворотке крови в зависимости от формы остеопороза и оценить их диагностическое значение в сравнении с диагностическим значением сывороточной активности катепсина К.

3. Изучить изменения активности катепсинов В, L, D в печени и катепсин L-подобной активности в сыворотки крови у быстро стареющих крыс линии OXYS до и после появления признаков остеопороза.

4. Оценить изменения активности сывороточных ингибиторов аг антитрипсина и а2-макроглобулина при различной активности цистеиновых и металлопротеаз в костной ткани, печени и сыворотке крови экспериментальных животных.

5. Изучить влияние ранелата стронция в составе препарата «Бивалос» на исследуемые параметры при остеопорозе у крыс, развивающегося в результате эстрогеновой недостаточности.

Научная новизна

Выявлено, что повышение активности катепсина К и снижение активности остеобластов является общей чертой сенильного остепороза у крыс линии ОХУБ и остеопороза, развивающегося у самок крыс \Vistar после овариэктомии. Активность катепсина К в сыворотке крови отражает активность резорбционного процесса. Установлено, что при сенильном остеопорозе у преждевременно стареющих крыс ОХУБ активность катепсина К в костной ткани позвоночника повышается в меньшей степени, чем при развитии остеопороза у овариэктомированных самок крыс 'МБ1аг. Показано, что активность ММП до манифестации остеопороза у крыс ОХУБ снижена по сравнению с группой контроля в отличие от остеопороза, вызываемом овариэктомией у самок крыс Wistar, при котором активность ММП в костной ткани не изменяется.

Показано, что остеопороз у крыс линии ОХУБ протекает на фоне усиления активности катепсинов Ь и Б в печени и катепсин Ь-подобной сыворотки крови на отдельных этапах онтогенеза по сравнению с крысами \Vistar аналогичного возраста. Показано увеличение активности сывороточного ингибитора а2-макроглобулина при одновременном снижении активности протеаз в кровяном русле у преждевременно стареющих крыс ОХУБ.

Установлено, что на ранних сроках после овариэктомии наблюдается сдвиг баланса ремоделирования в сторону процессов формирования костной ткани позвоночника и бедренной кости. На момент достижения максимума количества жировой ткани и массы крыс приходится максимум МП позвоночника и бедренной кости и начало снижения МПКТ скелета в целом. На более поздних стадиях после овариэктомии наблюдается усиление процессов формирования костной ткани в отделах скелета, на которые приходится меньшая физическая нагрузка. Одновременно с этим происходит замедление процессов формирования в костной ткани позвоночника и бедренной кости и усилением резорбтивных процессов этих отделах скелета, что выражается в снижении их минеральной плотности.

задерживается формирование костной ткани в бедренной кости и, одновременно, усиливается формирование в переферических отделах скелета. Увеличение объемов ремоделирования костной ткани под действием РС приводит к уменьшению активности ММП и а2-макроглобулина в сыворотке крови.

Научно-практическая значимость

Результаты исследования выявляют неодинаковую степень вовлеченности протеаз в ремоделировании костной ткани при развитии разных форм остеопороза. Исходя из этого, определение их активности позволяет подобрать более адекватную схему лечения остепороза. Поскольку активность катепсина К в костной ткани и сыворотке крови увеличивается задолго до манифестации остеопороза, определение его активности в сыворотке крови может быть использовано для ранней диагностики данного заболевания.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Увеличение активности катепсина К в костной ткани у преждевременно стареющих крыс ОХУБ и у овариэктомированных самок крыс \Vistar является причиной избыточной резорбции костного матрикса, что вместе со снижением активности остеобластов приводит к развитию остеопороза.

2. Активность катепсина К в сыворотке крови является показателем усиленной резорбции костной ткани при развитии остеопороза и может быть использована в качестве диагностического маркера.

3. Дополнительным фактором в развитии сенильного остеопороза у преждевременно стареющих крыс линии ОХУБ является нарушение соотношения протеазы/ингибиторы протеаз в организме.

4. Введение ранелата стронция в дозе 200 мг/кг молодым овариэктомированным самкам крыс \Vistar вызывает нарушение естественных механизмов сохранения костной плотности на ранних этапах после овариэктомии.

Апробация работы Результаты работы доложены на Съезде физиологов Сибири, Томск, 2005; на Физиологическом Съезде, Москва, 2007; на конференции молодых ученых Института физиологии СО РАМН, Новосибирск, 2007; на конференции молодых ученых, посвященной патологии позвоночника, Новосибирск, 2008; на Всероссийской конференции молодых ученых «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины», Москва 2008; на Съезде физиологов Сибири, Барнаул, 2008.

Структура и объем диссертации Диссертация состоит из введения, четырех глав, включающих литературный обзор, материалы и методы исследования, результаты исследования, обсуждение результатов, после которых следуют заключение, выводы и список цитируемой литературы, содержащий 272 источника, в том числе 201 зарубежный. Работа изложена на 166 страницах машинописного текста, содержит 7 таблиц и 23 рисунка.

Публикации По теме диссертации опубликовано 10 работ, из них 2 статьи опубликованы в изданиях, включенных в перечень ВАК.

Материалы и методы исследований.

Для выяснения патогенеза остеопороза в работе использовались 2 экспериментальные модели: выведенные в Институте цитологии и генетики СО РАН самцы преждевременно стареющих крыс OXYS, и овариэктомированные самки крыс Wistar. Для изучения особенностей патогенеза остеопороза у крыс линии OXYS было проведено 3 серии экспериментов.

В первой серии экспериментов изучались возрастные показатели МПКТ у самцов крыс линии OXYS. Измерение МПКТ проводилось у животных 2-х, 4-х, 6-ти, 8-ми и 12-ти месяцев, контролем послужили самцы крыс Wistar соответствующих возрастов.

Вторая серия экспериментов, выполненная на самцах крыс OXYS, была направлена на исследование роли катепсина К и ММП в развитии сенильного остеопороза у этих животных.

Поскольку развитие сенильного остеопороза является спутником возрастных изменений в организме человека и животных, третья серия экспериментов проведена с целью изучения роли системного изменения активности протеаз, вызываемого старением, а также возможной роли изменения активности этих ферментов в функциональном состоянии печени крыс OXYS до и после развития остеопороза. Эксперименты проведены на крысах-самцах линии OXYS 3-х, 12-ти и 18-ти месяцев. Предметом исследования послужили возрастные изменения активности катепсинов В, L и D в печени и катепсин L-подобная активность в сыворотке крови.

Для изучения роли катепсина К и ММП в изменении ремоделирования костной ткани, развивающейся на фоне эстрогеновой недостаточности и влияния PC в составе антиостеопоротического препарата «Бивалос» на исследуемые показатели, была выполнена серия экспериментов на овариэктомированных самках крыс Wistar. Животным в возрасте 3-х месяцев проведена овариэктомия. Исследование минеральной плотности костной ткани (МПКТ) проводили животным до 10 месяца жизни через каждые 1-2 месяца. Часть крыс с 6-месячного возраста (через 3 мес. после удаления гонад) ежедневно получала PC в дозе 200 мг/кг в течение 2-х месяцев. В 8 месяцев (по прошествии 5 месяцев после овариэктомии) забивали всех животных, которым вводился PC, половину интактных животных и половину овариэктомированных, не получавших PC. Остальным животным продолжали измерять МПКТ для оценки наступления сроков системного остеопороза после овариэктомии.

МПКТ крыс измеряли методом дихроматической рентгеновской абсорбциометрии (DEXA) с использованием программы - «small animals», результаты выражали в г/см3. У овариэктомированных самок крыс с помощью данного метода измеряли также содержание жировой ткани в теле.

Гистологическое исследование препаратов костной ткани методом световой микроскопии выполнено с использованием микроскопа Axioskop 40 (Carl Zeiss, Германия). Костные фрагменты фиксировали в растворе 12% формалина, декальцинировали в растворе 0,5% соляной кислоты, парафиновые срезы окрашивали гематоксилином и эозином.

Для исследований использовали сыворотку крови, гомогенаты костной ткани и печени, приготовленные в 0,25М сахарозе с 1мкМ ЭДТА, pH 7,3.

Активность катепсинов В и L, а также катепсин L-подобную активность в сыворотке крови определяли с помощью флюоресцентного субстрата Z-Arg-Arg-MCA (НПО "Вектор", Россия) в соответствие с методом (Kirschke, Barrett, 1987). Активность катепсина D определяли в соответствие с методом (Wiederanders, 1982) с помощью азоказеина (Fluka, США) с использованием пепстатина - специфического ингибитора катепсина D. Активность катепсина К определяли против флуоресцентного субстрата Z-Gly-Pro-Arg-MCA (Sigma, США) по методу, предложенному Bromme (Bromme, 2002). Активность ММП определяли по методу Nagase (Nagase, 1994) против MCA-Pro-Leu-Gly-Leu-DpA-Ala-Arg-NH2 (American Peptide Co, США).

Концентрацию белка определяли по методу Bradford (Bradford, 1976).

Активность тартрат-резистентной кислой фосфатазы определяли по методу, предложенному Меньшиковым (Меньшиков, 1987) с модификациями против п-нитрофенилфосфата в качестве субстрата. Активность щелочной фосфатазы, концентрацию кальция и фосфора определяли с помощью коммерческих наборов («Вектор-Бест», Россия) в соответствие с протоколами фирмы производителя.

Активность а2-МГ и а,-AT определяли против бензоил-аргинин-этилового эфира в качестве субстрата по методу Яровой в модификации Ярыгиной (Ярыгина, 2005).

Определение общей концентрации ММП-2 в сыворотке крови проводили методом ИФА наборами R&D (США) в соответствии с протоколом фирмы-производителя.

Статистическую обработку результатов проводили с помощью непараметрических методов Манна-Уитни и углового преобразования Фишера.

Результаты исследования и их обсуждение Исследование системы протеаз и их сывороточных ингибиторов при развитии остеопорозау преждевременно стареющих крыс OXYS

Изменения минеральной плотности костной ткани у крыс OXYS по сравнению с крысами Wistar

У крыс Wistar с возрастом происходит постепенный прирост МПКТ (рис. 1). У крыс OXYS прирост МПКТ происходит медленнее и не достигает уровня значений, характерного для крыс Wistar соответствующего возраста. Различия МП у крыс OXYS отмечены с 4-х месяцев в позвоночнике и всего

скелета. Начиная с 6-ти месячного возраста, у крыс линии ОХУБ МПКТ и в позвоночнике, и в скелете в целом выходит на плато.

0,3

о 0,2

0,1

0,3

§0,2

0,1

2 4 6 8 10 12

Возраст животных, мес.

2 4 6 8 10 12

Возраст животных, мес.

Рис. 1. Возрастные изменения МПКТ всего скелета (А) и позвоночника (Б) у крыс линии ОХУ8 по сравнению с крысами \Vistar

Примечание. *р < 0,05, **р < 0,01 по сравнению с крысами \Vistar соответствующего возраста

Развитие остеопороза у крыс ОХУБ подтверждено морфологическим исследованием фрагментов тел позвонков. Показано, что у крыс ОХУБ с 6-ти месяцев определяются источенные костные балки, в некоторых участках с прерыванием трабекулярной сети, с рарефикацией кортикальной пластинки. Костные трабекулы сужены, диаметр гаверсовых каналов увеличен.

Изменения показателей у крыс \yistar и ОХУБ разного возраста, применяемых для оценки состояния ремоделирования костной ткани

Возрастных изменений в концентрации кальция и фосфора в сыворотке крови у крыс \Vistar не обнаружено (табл. 1). У молодых крыс ОХУБ в сыворотке крови увеличена концентрации кальция и фосфора. При достижении крысами ОХУБ 14-ти месяцев, концентрация кальция в сыворотке крови снижалась, принимая такие же значения, как \Vistar. Возрастных изменений в сывороточной концентрации фосфора у крыс ОХУБ не выявлено.

Возрастной динамики в активности ТРКФ у животных не обнаружено. Межлинейных различий в возрасте 3-х месяцев выявить не удалось, однако при достижении животными возраста 14-ти месяцев оказалось, что у крыс ОХУБ активность ТРКФ повышена по сравнению с крысами \Vistar в 1,6 раза, что свидетельствует об усилении процессов резорбции костной ткани у крыс ОХУБ по сравнению с крысами \Vistar.

Активность ЩФ в сыворотке крови снижалась с возрастом у крыс \Vistar на 25% и более значительно, - на 35%, у крыс ОХУБ. Значения этого показателя у крыс ОХУБ снижены по сравнению с крысами \Vistar как в молодом, так и в зрелом возрасте. Это свидетельствует об ухудшении

формирования костной ткани у крыс ОХУБ за счет снижения количества и/или активности остеобластов.

Таблица 1

Изменения показателей, у крыс 'М51аг и ОХУБ разного возраста в сыворотке крови, применяемых для оценки состояния ремоделирования костной ткани

(М±т)

Показатель \Vistar ОХУБ

3 мес. 14 мес. 3 мес. 14 мес.

Концентрация кальция, ммоль/л 2,64±0,11 2,65±0,10 3,20±0,07** 2,63±0,08*

Концентрация фосфора, ммоль/л 2,35±0,36 2,44±0,10 2,89±0,12* 2,70±0,18

Активность щелочной фосфатазы, мкмоль/мин на 1 л 499±38 375±23°° 403±26* 2б1±7*****

Активность тартрат-резистентной кислой фосфатазы, мкмоль/мин на 1 л 8,11±0,80 6,45±1,21 8,45±1,47 10,42±0,73л#

Примечание. Количество животных в группах от 5 до 8. *р < 0,05, **р < 0,01 по сравнению крысами \Vistar того же возраста # р < 0,05, ##р < 0,01 по сравнению с крысами ОХУБ в 3 месяца °°р < 0,01 по сравнению с крысами \Vistar в 3 месяца

Изменения активности катепсина К. ММП и концентрации ММП-2 у крыс ОХУБ по сравнению с крысами \Vistar Несмотря на то, что активность ТРКФ (маркера резорбции костной ткани) у крыс молодых ОХУБ не изменена относительно крыс \Vistar, активность катепсина К, основной цистеиновой протеазы остеокластов, в костной ткани позвоночника в возрасте 3-х мес. была в 2,1 раза выше у крыс ОХУБ (табл. 2), чем у крыс \Vistar, что говорит об активном разрушении костной ткани остеокластами. С возрастом активность катепсина К в костной ткани позвоночника у крыс ОХУБ имела тенденцию к снижению, а у крыс \Vistar увеличивалась.

Таблица 2

Изменение активности катепсина К и ММП в костной ткани у крыс \Vistar и _ОХУБ разного возраста (М±т)_

Показатель \Vistar ОХУБ

3 мес. 14 мес. 3 мес. 14 мес.

Активность катепсина К, нмоль/мин на 1 мг белка 0,74±0,11 1,21±0,17* 1,58±0,39* 1,09±0,16

Активность ММП, мкмоль/мин на 1 мг белка 29,29±5,95 21,46±3,18* 10,12±1,57* 21,60±3,79#

Примечание. *р < 0,05, по сравнению с крысами \Vistar в 3 месяца * р < 0,05 по сравнению с крысами ОХУБ в 3 месяца

В 3 месяца, когда у крыс ОХУБ происходила активная резорбция костного матрикса катепсином К, активность ММП в костной ткани позвоночника была снижена по сравнению с крысами более чем в 2

раза. Увеличение значений этого показателя происходило у крыс ОХУ8 в 14 месяцев, когда активность катепсина К имела тенденцию к снижению. У крыс \Vistar, - напротив, активность ММП в костной ткани с возрастом снижалась. В результате возрастных изменений в возрасте 14-ти месяцев между крысами \Vistar и ОХУБ не выявлено различий по этому показателю.

В сыворотке крови, также как в костной ткани позвоночника, у 3-х месячных крыс ОХУБ активность катепсина К выше, чем у крыс Wistar того же возраста (табл. 3). К 14-ти месяцам сывороточная активность катепсина К снижалась у животных обеих линий до одного уровня. Таким образом, активность катепсина К может быть использована в качестве маркера только начавшего развиваться сенильного остеопороза, а ТРКФ - уже развившегося.

Таблица 3

Изменение активности катепсина К, ММП а также концентрации ММП-2 в

сыворотке крови у крыс \Vistar и ОХУБ разного возраста (М±т)

Показатель У^аг ОХУБ

3 мес. 14 мес. 3 мес. 14 мес.

Активность катепсина К, нмоль/мин на 1 мл 0,82±0,02 0,55±0,02** 0,8^0,02* 0,56±0,01*##

Активность ММП, мкмоль/мин на 1 мл 4,79±0,56 9,11±4,24** 3,52±0,86* 4,24±0,34+++

Концентрация ММП-2 (активная форма + профермент), нг/мл 198±13++ 144±4 184±5 193±16++

АКТИВНОСТЬ 02-МГ, мкмоль/мин на 1 мл 4,21 ±0,19 4,28±0,27 4,73±0,59 4,89±0,40+

Активность а) -АТ, мкмоль/мин на 1 мл 20,48±5,69 22,80±7,51 16,24±3,28 17,63±3,02

Примечание. *р < 0,05, ** р<0,01 по сравнению с крысами \Vistar в 3 месяца

** р<0,001 по сравнению с крысами ОХУЭ в 3 месяца

+р < 0,05, ^р < 0,01, +++р < 0,001 по сравнению с крысами \Vistar в 14 месяцев

У крыс \Vistar при снижении активности ММП в костной ткани с возрастом, происходило снижение концентрации ММП-2 в сыворотке крови, но сывороточная активность ММП напротив, - увеличивалась. Это свидетельствует о том, что с возрастом изменяется спектр металлопротеаз, попадающих в кровяное русло. У крыс ОХУБ не обнаружено возрастных изменений активности ММП и концентрации ММП-2 в сыворотке крови, несмотря на увеличение активности ММП в костной ткани позвоночника в 14 месяцев. Таким образом, об активности ММП в костной ткани нельзя судить по сывороточной активности металлопротеаз. При сравнении животных разных генотипов оказалось, что у крыс \Vistar сывороточная

активность ММП была выше, чем у крыс ОХУБ как в три, так и в четырнадцать месяцев, а концентрация ММП-2 ниже у 14-ти месячных животных.

Эффект сниженной активности ММП в сыворотке крови в 3 месяца у крыс ОХУБ по сравнению с крысами \Vistar, вероятно, может быть объяснен низкой активностью этих протеаз в костной ткани, а в 14 месяцев - их элиминацией из кровяного русла а2-макроглобулином, активность которого увеличивалась у 14-ти месячных крыс ОХУБ. Активность а]-антитрипсина в сыворотке крови в зависимости от генотипа и возраста животных не изменялась, что, вероятно, связано с отсутствием необходимости увеличения его биосинтеза.

Изменения активности катепсинов В, ЬиРв печени и катепсин Ь-подобной активности в сыворотке крови у крыс ОХУБ до и после

появления признаков остеопороза В результате исследования установлено, что развитие и протекание остеопороза у крыс ОХУБ происходило на фоне увеличения протеолитической активности в печени и сыворотке крови. Так, у крыс ОХУБ активность в печени основной цистеиновой протеазы гепатоцитов -катепсина Ь в 3 и 18 месяцев была значительно выше, чем у крыс \Vistar (табл. 4). В 12 месяцев не было найдено различий между животными разных линий.

Таблица 4

Возрастные изменения активности катепсинов В, Ь и Б в печени и катепсин

Животные Возраст, месяцы Активность катепсина Ь (мкмоль/час на 1 мг белка) Активность катепсина В (мкмоль/час на 1 мг бежа) Активность катепсина И Азбб/час на 1 мг белка Катепсин Ь-подобная активность (мкмоль/час на 1мл)

3 7,76±0,043 11,8140,83 0,30040,021## 2,340,03

\Vistar 12 16.32il.34" 6,20±0,55+ 0,59a¿0,065 0,81±0,01+++

18 18.02il.40" 6,7940,79+ 0,31640,12** 1,0440,04+

3 17.35il.83' 12,87±0,93 0,43440,029'" 4,95±0,04""

ОХУБ 12 24.03i5.00 7,7841,55° 0,36940,040*" 0,8140,01°°°

18 27,62±1,4* 9,2242,41 0,71240,072* 2,240,66**

Примечание. *р<0,05 ** р<0,01 по сравнению с крысами Wistar того же возраста + р<0,05, ++р<0,01 +++р<0,001 по сравнению с крысами \Vistar 3 месяцев *р<0,05, **р<0,01 по сравнению с крысами \Vistar 12 месяцев °р<0,05, 000 р<0,001 по сравнению с крысами ОХУБ в 3 и в 18 месяцев л р<0,05 по сравнению с крысами ОХУБ 18 месяцев

Различий в активности катепсина В в печени между крысами \Vistar и ОХУБ не выявлено. Однако были найдены значительные изменения в активности катепсина Б, расщепляющего большие плотно упакованные

субстраты и облегчающего доступ других протеаз к субстрату. Установлено, что активность этого фермента у крыс ОХУБ в 3 месяца выше в 1,4 раза, а в 18 - в 2,2 раза по сравнению с крысами \Vistar. Характерное возрастное снижение активности катепсина Б, связанное с его инактивацией, у крыс \Vistar наблюдалось значительно позднее - в 18 месяцев, а на 12 месяцев приходился максимум его активности. У крыс ОХУБ напротив, характерное возрастное снижение активности этого фермента в печени происходило раньше и регистрировалось 12 месяцев, а к 18-ти наблюдалось усиление его активности, связанное, по-видимому, с накоплением непереваренного материала в лизосомах, и запросом на усиление экспрессии протеаз. Таким образом, показано, что у крыс линии ОХУБ на отдельных этапах онтогенеза повышена активность катепсина ЬиБв печени, что, скорее всего, означает усиление их экспрессии. Избыток протеаз в клетке представляет значительную угрозу, поскольку лабилизация мембран в ходе перекисного окисления, к которому чувствительны крысы ОХУБ, может приводить к неконтролируемой гибели клеток в значительно большем объеме, по сравнению, с тем, который мог бы вовлекаться в некроз при нормальной экспрессии протеолитических ферментов. Возможно, это и является причиной развития ранних фиброзных процессов в печени у крыс этой линии, а это в свою очередь может приводить к нарушению синтеза и утилизации сигнальных молекул (интерлейкинов и факторов роста), ингибиторов протеаз, снижению карбоксилирования глютаминовой кислоты, являющейся составным компонентом остеокальцина, таким образом, способствует прогрессированию остеопороза.

Исследование катепсин Ь-подобной активности в сыворотке крови показало, что у крыс \Vistar и ОХУБ в 3 месяца она выше, чем в 12 месяцев, причем в 3 и 18 месяцев ее активность выше у крыс ОХУБ, чем у крыс \Vistar. У близких по возрасту к 12-ти месяцам, 14-месячных крыс ОХУБ повышается активность сывороточного ингибитора протеаз аг-макроглобулина, происходит снижение активности катепсина К, а активность ММП ниже, по сравнению с крысами 'М81аг, из чего можно предположить, что снижение катепсин Ь-подобной активности в сыворотке крови у крыс ОХУБ в этом возрасте может быть связано с участием а2-макроглобулина в элиминации протеаз из кровяного русла. В 18 месяцев катепсин Ь-подобная активность в сыворотке у крыс \Vistar остается на достигнутом уровне, а у крыс ОХУБ увеличивается.

Таким образом, нами показано, что на отдельных этапах онтогенеза для крыс линии ОХУБ характерна повышенная активность протеаз в печени и сыворотке крови по сравнению с крысами \Vistar. Увеличение попадания в кровоток катепсинов Ь и Б из печени, катепсина К из костной ткани и протеаз с катепсин Ь-подобной активностью из других органов у крыс ОХУБ в 3 месяца до проявления признаков остеопороза может сдвигать баланс протеазы/ингибиторы в организме в сторону усиления протеолитической

активности и таким образом являться дополнительным условием, способствующим развитию сенильного остеопороза. Кроме того, увеличение активности протеаз в печени может приводить к нарушению ее пластической функции, поскольку протеазы повреждают паренхиму печени, что приводит у зрелых крыс ОХУБ к фиброзным изменениям (Колосова,' 2001). Это, вероятно, может также служить фактором, осложняющим течение сенильного остеопороза у этих животных.

Исследование ремоделирования костной ткани при развитии остеопороза у овариэктомированных самок крыс ИШаг Динамика изменений МПКТ после овариэктомии и на фоне введения ранелата стронция

У интактных самок крыс \Vistar до 10-ти месяцев происходит постепенное накопление МП скелета в целом (рис. 2 А).

У самок после овариэктомии рост МП скелета чередовался со спадами. В возрасте 4-х месяцев, через 1 месяца после овариэктомии МП выше, чем у интактных животных на 19%. В возрасте 5-ти месяцев (через 2 месяца после удаления гонад) МП снижалась и соответствовала МП интактных 5-месячных самок. С 5-ти до 7-ми месяцев у овариэктомированных крыс (через 3 и 4 месяца после удаления гонад) снова происходил рост МП скелета до значений, характерных для интактных самок аналогичного возраста. К 8 месяцам (через 5 месяцев после удалиния гонад) у овариэктомированных крыс МПКТ скелета оставалась на прежнем уровне, однако продолжающийся рост МП скелета у интактных животных обеспечил разницу МП между группами животных на 11%. Значение МП скелета у овариэктомированных самок по сравнению с самками контрольной группы оставалось сниженным на 11% и к 10-месячному возрасту, через 7 месяцев после удаления гонад. Введение РС в дозе 200 мг/кг овариэктомированным самкам не влияло на МП скелета в целом.

Динамика изменений МПКТ позвоночника у животных в группе контроля характеризовалась постепенным медленным приростом этой величины (рис. 2 Б).

У овариэктомированных животных с 4-х до 7-ми месяцев МПКТ позвоночника не изменялась. С 7-ми (через 4 месяцев после овариэктомии) до 8-ми месяцев (через 5 месяцев после овариэктомии) происходило ее увеличение с последующим снижением к 10-ти месяцам (через 7 месяцев после овариэктомии). В возрасте 7-ми месяцев МПКТ позвоночника интактных самок превышала МПКТ позвоночника овариэктомированных. В 8 месяцев у овариэктомированных крыс наблюдался максимум МПКТ позвоночника, при этом ее значения совпадали с МПКТ позвоночника интактных животных (рис. 1 Б). Введение РС овариэктомированным самкам в течение 1-го месяца увеличивало МПКТ позвоночника до значений, превышающих МПКТ позвоночника у крыс контрольной группы (рис. 2 Б).

Однако через 2 месяца введения РС МПКТ позвоночника стала ниже, чем у контрольных и овариэктомированных животных, которым РС не вводился.

0,18л 0,16 3 0,14

"С:

0,12-

? 1 / А

4(1) 5(2) 7(4) 8(5) 10(7)

0,18-

0,16

0,14

4(1) 5(2) 7(4) 8(5) 10(7)

Всараст]м«х1ък(ср0кп0слвсев(мэ<п]м«41№с Всорасг)меат>к (срок посте овариэккж^,мес.

0,24

0,20

0,16

--■--Овариэктомированные

1 ;

л* — •—Овариэш>мированные+РС200 мг/кг * * Интаетные

4(1) 5(2) 7(4) 8(5) 10(7) Возраст животных (срок после овариэктомии), мес.

Рис. 2. Сравнение динамики прироста минеральной плотности костной ткани скелета (А), позвоночника (Б) и бедренной кости (В) у интактных и овариэктомированных самок крыс \Vistar и влияние введения РС в дозе 200 мг/кг на этот показатель

Примечание. *р < 0,05, по сравнению с предыдущим измерением МПКТ у интактных самок крыс \Vistar

#р < 0,05, ##р < 0,01, по сравнению с предыдущим измерением МПКТ у овариэктомированных самок крыс \Vistar л р < 0,05, лл р < 0,01, по сравнению с интактными самками

+р<0,05, по сравнению с предыдущим периодом измерения МПКТ у овариэктомированнных самок крыс \Vistar, получавших РС в дозе 200 мг/кг « р < 0,01, по сравнению с овариэктомированными самками аналогичного возраста

Особенностью накопления МПКТ в бедренной кости у интактных самок крыс \Vistar является медленный постепенный прирост с 4-х до 7-ми месяцев с последующим ускорением минерализации, происходящим между

7-м и 8-м месяцем с продолжающимся почти линейным ростом, по крайней мере, до 10-ти месяцев (рис. 2В). МП бедренной кости у овариэктомированных животных увеличивалась с 5-ти до 8-ми месяцев (через 2-5 месяцев после удаления гонад), а затем снижалась. При этом в возрасте 4-х, 7-ми, 8-ми месяцев (через 1, 4, 5 месяцев после овариэктомии) МП бедренной кости оперированных крыс превышала МП бедренной кости интактных. В возрасте 5-ти и 10-ти месяцев (через 2, 7 месяцев после удаления гонад) у овариэктомированных крыс значения МП бедренной кости не отличались от значений интактных.

У овариэктомированных животных, которым вводился РС через 1 месяц после терапии МП бедренной кости увеличивалась по сравнению с интактными самками и не достигала значений этого показателя, характерных для овариэктомированных крыс, не получавшим РС. Через 2 месяца после начала введения РС МП бедренной кости соответствовала МП у интактных самок.

Изменения росто-весовых показателей овариэктомированных самок крыс УУ^аг их взаимосвязь с МПКТ

Удаление яичников приводило к увеличению количества жировой ткани, и как следствие - к увеличению массы тела крыс (рис. 3 А, Б).

Введение РС в дозе 200 мг/кг в течение 1-го месяца снижало массу тела (рис. 3 А) и процентное содержание жировой ткани в теле овариэктомированных крыс (рис. 3 В), благодаря чему значения этих показателей становились такими, как у интактных животных соответствующего возраста. Данный эффект сохранялся к концу 2-го месяца использования препарата.

У интактных животных имела место положительная корреляционная связь между общей МПКТ и массой крысы (г=0,76, р<0,05). У овариэктомированных самок в возрасте 4-х месяцев (через 1 месяц после овариэктомии) МПКТ скелета крыс коррелировала с массой жировой ткани (г=0,78, р<0,05) и с МПКТ позвоночника (г=0,76, р<0,05). При этом не было выявлено корреляции между минеральной плотностью скелета и массой крыс, судя по корреляционной зависимости, масса крыс определялась в большей степени массой жировой ткани (г=0,78, р<0,05).

Через 7 месяцев после удаления гонад было обнаружено, что минеральная плотность скелета в целом коррелирует с МПКТ позвоночника и бедренной кости (г=0,68, р<0,05), а масса тела - с количеством жировой ткани (г=0,70, р<0,05). При этом не было выявлено корреляции МПКТ с количеством жировой ткани, характерной для более раннего периода после овариэктомии что может говорить о неспособности организма животных поддерживать МПКТ за счет увеличения силовой нагрузки и гормонов, выделяемых жировой тканью, несмотря на ее значительное содержание в теле. Напротив, между содержанием жировой ткани и МПКТ позвоночника и скелета в целом была обнаружена отрицательная корреляция (г= - 0,60,

р<0,01). Это может свидетельствовать о том, что на этот период резервные возможности организма, обеспечивающие дифференцировку и активность остеобластов на необходимом уровне исчерпаны, а увеличение активности катепсина К поспособствовало запуску процесса дифференцировки клеток-предшественниц по пути адипоцитов, а не остеокластов.

350

1 280

210

4(1) 5(2) 7(4) 8(5) 10(7) Возраст животных (срок после овариэктомии), мес.

100

Т1

% ? 60

п>

Р-

К 1

#Л

* г

4(1) 5(2) 7(4) 8(5) 10(7)

Возраст животных (срок после овариэктомии),мес.

28 24 20 16 12

#«

А-.-

Л"

Возраст жи^о^ны^с^ок п!с)|е ов^ф^эетгон!^), ■

• Овариэктомированные Овариэктомированные+РС200 мг/кг Интактные

Рис. 3. Динамика изменений массы самок крыс \Vistar (А), массы жировой ткани (Б), и процентного содержания жировой ткани в теле (В) в зависимости от экспериментальных воздействий

Примечание. *р < 0,05 по сравнению с предыдущим периодом в группе контроля Л р < 0,05 по сравнению с предыдущим периодом у овариэктомированных самок крыс # р < 0,05, # #р < 0,01 по сравнению с контролем

*р< 0,05, <<р< 0,01 по сравнению с овариэктомированными самками крыс, получавших РС в дозе 200 мг/кг

Изменение активности катепсина К и ММП в костной ткани и сыворотке крови у самок крыс \Vistar У овариэктомированных самок крыс увеличение активности

катепсина К в в 4 раза костной ткани позвоночника и в 15 раз бедренной кости по сравнению с интактными (табл. 5) происходило до снижения МПКТ этих отделов скелета.

Изменение активности катепсина К и ММП в костной ткани различных отделов скелета у самок крыс \Vistar в зависимости от экспериментальных _ воздействий (М±ш)_

Показатель Животные

Интактные Овариэктомированные Овариэктомиро-ванные+РС, 200 мг/кг

Активность катепсина К в позвоночнике, нмоль/мин на 1 мг белка 0,84±0,22 3,30±0,57** 3,85±1,71*

Активность катепсина К в бедренной кости, нмоль/мин на 1 мг белка 0,31±0,08 # 4,70±1,11** 4,87±1,93*

Активность ММП в позвоночнике, мкмоль/мин на 1 мг белка 10,72±3,32 15,65±2,83 12,83±3,87

Активность ММП в бедренной кости мкмоль/мин на 1 мг белка 3,14±0,56## 4,87±1,98# 3,19±0,71#

Примечание. Количество животных в группах от 9 до 10.

*р < 0,05, **р < 0,01 по сравнению с интактными самками крыс \Vistar

# р < 0,05, ##р < 0,01 по сравнению с величиной данного показателя в костной ткани

позвоночника

Активность ММП в костной ткани позвоночника не имела различий между группами экспериментальных животных. Активность ММП в костной ткани бедренной кости не имела различий по средним во всех трех группах животных, однако овариэктомированные самки, независимо от введения РС различались с интактными самками по распределению (ф=1,72, р<0,05 и Ф=1,69, р<0,05 соответственно). Введение РС в дозе 200 мг/кг овариэктомированным самкам не влияло на активность катепсина К и ММП в костной ткани позвоночника и бедренной кости.

При сравнении активности катепсина К в разных отделах скелета оказалось, что активность этой цистеиновой протеазы в костной ткани позвоночника у интактных самок выше, чем в бедренной кости, а у овариэктомированных животных активность катепсина К в этих отделах скелета была одинаковой. Это может говорить о том, что отсутствие гонад приводит к системному усилению резорбции костной ткани и к нарушению механизмов, поддерживающих более низкий уровень резорбции костной ткани в бедренной кости в норме. Общая активность ММП была выше в костной ткани позвоночника, чем в бедренной кости во всех группах животных.

Увеличение активности катепсина К в костной ткани у овариэктомированных самок, коррелировало с увеличением его активности в сыворотке крови (табл. 6), что может быть использовано для ранней диагностики остеопороза, вызываемого эстрогеновой недостаточностью.

Активность ММП в сыворотке крови увеличивалась после овариэктомии. Концентрация ММП-2 в сыворотке крови увеличивалась после овариэктомии. Введение РС не влияло на концентрацию ММП-2, но снижало активность ММП в сыворотке крови. Это было вызвано, скорее всего, элиминацией ММП из кровяного русла а2-макроглобулином, активность которого снижалась при введении препарата. Активность агАТ оставалась у животных неизмененной, несмотря на различные экспериментальные воздействия.

Таблица 6

Изменение активности катепсина К, ММП, ингибиторов протеаз аг-МГ и аг

АТ и концентрации ММП-2 в сыворотке крови у овариэктомированных _ самок крыс Д¥1$1аг (М±ш)_

Показатель Животные

Интактные Овариэкто-мированные Овариэктомиро-ванные+РС, 200 мг/кг

Активность катепсина К, нмоль/мин на 1мл 0,87±0,18 1,25±0,13* 1,22±0,24

Активность ММП, мкмоль/мин на 1мл 2,48±0,45 4,5б±0,33*** 3,39±0,42*#

Концентрация ММП-2 (активная форма +профермент), нг/мл 92,00±2,75 140,00±8,02** 153,57±4,46*

Активность а2-МГ, мкмоль/мин на 1 мл 4,11 ±0,23 3,87±0,15 3,55±0,33*

Активность оц-АТ, мкмоль/мин на 1 мл 32,59±3,24 33,10±1,79 34,50±2,61

Примечание: количество животных в группах от 9 до 10.

*р < 0,05, **р < 0,01, ***р < 0,001 по сравнению с интактными самками крыс \Vistar # р <0,05 по сравннению с овариэктомированными самками, не получавшими РС

Изменения показателей, применяемых для оценки состояния ремоделирования костной ткани, у овариэктомированных крыс Wistar Несмотря на усиление резорбции костной ткани у овариэктомированных крыс, концентрация кальция у животных всех трех групп была на одном уровне (табл. 7), что свидетельствует о способности организма овариэктомированных животных поддерживать концентрацию кальция в пределах нормы за счет кальций-регулирующих гормонов. Введение РС в дозе 200 мг/кг увеличивало концентрацию фосфора в сыворотке крови, снижая отношение концентрации кальция к концентрации фосфора. Возможно, в этом случае сказывался кальций-замещающий эффект стронция.

Изменения показателей, у овариэктомированных крыс \Vistar в сыворотке крови, применяемых для оценки состояния ремоделирования _ костной ткани (М±ш)_

Показатель Животные

Интактные Овариэкто миро-ванные Овариэктомиро-ванные+РС, 200 мг/кг

Концентрация кальция, ммоль/л 2,33±0,10 2,26±0,13 2,26±0,12

Концентрация фосфора, ммоль/л 2,30±0,21 1,96±0,10 2,32±0,10#

Концентрация кальция/ концентрация фосфора 1,08±0,13 1,16±0,05 0,97±0,03#

Активность щелочной фосфатазы, мкмоль/мин на 1 л 293,9; <Ъ 175,0: Q?s304,7 202,2; * Q25I6U: Q75244,6 348,9; * * Q25177,9: Q75401,9

Активность тартрат-резистентной кислой фосфатазы, мкмоль/мин на 1л 10,74; СЬ9,12: Q7511,82 9,21; ** Q255.70: Q7510,95 14,28; * " Q2510,98: Q7517,94

Примечание. Данные по концентрации кальция и фосфора представлены как М±ш, данные по активности ЩФ и ТРКФ - как медиана и 25-й и 75-й квартили. Количество животных в группах от 8 до 10.*р < 0,05, **р < 0,01 по сравнению с интактными самками крыс # р <0,05 по сравннению с овариэктомированными самками, не получавшими PC

Активность ЩФ и ТРКФ в сыворотке крови у животных после овариэктомии снижалась, что говорит о нарушении ремоделирования костной ткани, но судить о том, что при этом преобладает резорбция можно только по увеличению активности катепсина К.

Введение овариэктомированным самкам PC приводило к увеличению активности ЩФ на 13% по сравнению с интактными самками и на 63% по сравнению с овариэктомированными, не получавшими PC. Повышение активности ЩФ в сыворотке крови у овариэктомированных самок, получавших PC, сопровождалось увеличением активности ТРКФ на 20% по сравнению с интактными самками и на 38% по сравнению с овариэктомированными крысами, не получавшими PC. Таким образом, можно заключить, что введение PC увеличивало скорость обновления костной ткани у овариэктомированных крыс, усиливая как формирование, так и резорбцию.

Сравнение развития разных форм остеопороза у крыс

Несмотря на общие черты развития двух исследуемых форм остеопороза, такие как увеличенная активность катепсина К в костной ткани и сыворотке крови, снижение сывороточной активности щелочной фосфатазы и в конечном итоге снижение минеральной плотности скелета, механизмы развития остеопороза у крыс OXYS и овариэктомированных самок крыс Wistar различны.

Полученные данные показали, что развитие остеопороза у крыс ОХУБ происходит на фоне увеличения протеолитической активности в печени и сыворотке крови. Это, вероятно, связано с накоплением непереваренного материала в лизосомах крыс и как следствие - с увеличением экспрессии протеаз, играющих первостепенную роль в деградации белка - катепсинами Ь и Б. Вместе с тем, чувствительность крыс ОХУБ к окислительному стрессу и лабилизация мембран лизосом, вероятно, создавало предпосылки не только к усилению протеолитического статуса организма, но и к развитию фиброзоподобных изменений в печени зрелых крыс (Колосова, 2001), что вело к ухудшению снабжения костной ткани пластическим материалом, факторами роста. Тем не менее, эти события могли иметь место уже при развившемся остеопорозе у крыс ОХУБ, поскольку в молодом возрасте фиброзных изменений у крыс ОХУБ не обнаружено. Таким образом, нарушения функции печени лишь могут усугублять развитие остеопороза в пожилом возрасте, но не являться его причиной.

Быстрая потеря костной массы у крыс ОХУБ при активности катепсина К меньшей, чем у самок крыс \Vistar после овариэктомии, скорее всего связана со снижением активности и/или количества остеобластов в костной ткани, о чем свидетельствует сниженная активность щелочной фосфатазы. Кроме того, увеличение протеолитической активности в печени, сыворотке, костной ткани у крыс ОХУБ может приводить к изменению транспорта цитокинов и факторов роста за счет связывания транспортирующего их а2-макроглобулина с протеазами, благодаря чему эти комплексы захватываются клетками печени и подвергаются деградации в лизосомах.

Медленное развитие системного остеопороза у самок крыс \Vistar после овариэктомии, не смотря на значительную активность катепсина К в костной ткани, может объясняться протекторным эффектом увеличенной за счет содержания жировой ткани массы крыс. Снижение активности щелочной фосфатазы свидетельствует об уменьшении количества и/или активности остеобластов в скелете овариэктомированных самок, но не отражает усиления синтетических процессов, происходящих в физически наиболее нагружаемых отделах скелета - в позвоночнике и бедренной кости. Тем не менее, это ясно видно по результатам денситометрии.

Таким образом, можно заключить, что катепсин К играет важную роль в развитии остеопороза, но проявления этого заболевания зависит не только от его активности, поскольку обнаружено, что при наличии определенных адаптационных возможностей, манифестация остеопороза может значительно отодвигаться во времени.

Выводы

1. Изменение активности катепсина К, матриксных металлопротеаз в костной ткани и сыворотке крови, а также их сывороточного ингибитора а2-макроглобулина у крыс при развитии остеопороза зависит от формы остеопороза, длительности его течения.

2. Повышение активности катепсина К в костной ткани предшествует снижению минеральной плотности костной ткани при развитии сенильного остеопороза у крыс ОХУБ и остеопороза, вызванного эстрогеновой недостаточностью у овариэктомированных самок крыс Wistar. Определение активности катепсина К в сыворотке крови может являться маркером резорбции костной ткани на раннем этапе развития остеопороза до снижения костной плотности.

3. Определение активности катепсина К является более информативным способом для оценки состояния резорбции в период до снижения минеральной плотности костной ткани, чем определение концентрации кальция, фосфора и активности тартрат-резистентной кислой фосфатазы. Определение активности тартрат-резистентной кислой фосфатазы как маркера резорбции лучше использовать для диагностики сенильного остеопороза на стадии, когда возможно определение его наличия с помощью денситометрии.

4. Развитию сенильного остеопороза у крыс ОХУБ способствует усиление активности катепсинов ЬиОв печени из-за нарушения ее пластической функции, а также увеличение протеолитической активности в сыворотке крови из-за нарушения соотношения протеазы/ингибиторы в организме.

5. Динамика изменений минеральной плотности костной ткани у овариэктомированных самок крыс \Vistar отличается нестабильностью и зависит от изменения массы животных. Наибольшей зависимостью от массы обладают высоко нагружаемые отделы скелета, в то время как менее нагружаемые в большей степени зависят от биосинтеза эстрогенов жировой тканью. Крысы ОХУБ характеризуются сниженными значениями минеральной плотности костной ткани по сравнению с крысами \Vistar.

6. Введение ранелата стронция ежедневно в дозе 200 мг/кг молодым овариэктомированным самкам крыс Wistar сначала способствует формированию костной ткани, а затем усиливает резорбцию костной ткани и потерю костной плотности.

Список опубликованных работ

1. Изменение активности катепсинов В, L и D в печени у крыс Wistar и преждевременно стареющих крыс OXYS разного возраста / А.А. Бенедиктова, О.В. Фаламеева, Н.Г. Колосова, М.А. Садовой, Т.А. Короленко // Бюллетень СО РАМН. - 2007, №3. - С. 127 -132.

2. Cathepsin К and matrix metalloproteases activities in bone tissue of the OXYS and Wistar rats during the development of osteoporosis / A. A. Venediktova , O.V. Falameeva , N.G. Kolosova, M.A. Sadovoj, T.A. Korolenko // Biochemistry (Moscow) Supplement Series B: Biomedical Chemistry. - 2009. -Vol.3, N4.-P. 393 -398.

3. Бенедиктова A.A., Фаламеева O.B., Короленко Т.А., Колосова Н.Г. Роль лизосомальных протеиназ в развитии остеопороза у крыс OXYS // П Конгресс по остеопорозу, Ярославль, 2005. - С. 37.

4. Активность аспартильной протеазы катепсина D в печени у крыс при старении / Бенедиктова А.А., Фаламеева О.В., Юзько Ю.В. // Тезисы докладов Съезда физиологов Сибири, Томск, 2005. - С. 111.

5. Изменение активности лизосомальных протеаз — катепсинов В и D в печени у крыс при старении / А.А. Бенедиктова, О.В. Фаламеева, Т.А. Короленко, Н.Г. Колосова // XX Съезд физиологического общества им. И. П. Павлова, Москва, 2007. - С. 176.

6. Cysteine proteases cathepsin В and L and aspartic proteases cathepsin D in liver of ageing Wistar and OXYS rats /А. A. Venediktova , O.V. Falameeva, N.G. Kolosova, M.A. Sadovoj , T.A. Korolenko // Book of abstracts VI European congress of gerontology and geriatrics. - S. Petersburg, 2007. - P.75.

7. Активность катепсина К и металлопротеаз в костной ткани у крыс OXYS при развитии остеопороза / А.А. Бенедиктова, О.В. Фаламеева, Н.Г. Колосова, М.А. Садовой, Т.А. Короленко // Материалы конкурса молодых ученых ГУ НИИ физиологии СО РАМН. - Новосибирск, 2007. - С. 3 - 4.

8. Активность катепсина К и металлопротеаз у овариэктомированных самок крыс Wistar при развитии остеопороза / А.А. Бенедиктова, О.В. Фаламеева // Молодые ученые в развитии современной науки. Материалы II международной научно-практической конференции по вертебрологии и смежным дисциплинам. - Новосибирск, 2008. - С. 30. - 31.

9. Активность катепсина К и металлопротеаз в костной ткани и сыворотке крови у овариэктомированных самок крыс Wistar при развитии остеопороза / А.А. Бенедиктова, О.В. Фаламеева, М.А. Садовой, Т.А. Короленко // Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины. Материалы Всероссийской конференции молодых ученых. - Москва, 2008. -С. 252.

10. Активность ферментов костной ткани и а2-макроглобулина в сыворотке крови у крыс при развитии остеопороза // Тезисы докладов Съезда физиологов Сибири, Барнаул, 2008. - С. 81.

Список сокращений

аг АТ - арантитрипсин

а2-МГ - а2-макроглобулин

ММП - матриксные металлопротеазы

ММП-2 - матриксная металлопротеаза второго типа

МП - минеральная плотностьО

МПКТ - минеральная плотность костной ткани

ОП - остеопороз

РС - ранелат стронция

ТРКФ - тартрат-резистентная кислая фосфатаза ЩФ - щелочная фосфатаза

Соискатель

Бенедиктова А.А.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Венедиктова, Анастасия Александровна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР.

1.1. Строение, функции и состав костной ткани.

1.2. Процесс ремоделирования костной ткани.

1.3. Регуляция активности остеобластов и остеокластов.

1.3.1. Влияние ростовых факторов и цитокинов на активность остеобластов и остеокластов.

1.3.2. Регулирующее влияние гормонов на клетки кости.

1.3.2.1. Влияние кальций-регулирующих гормонов.

1.3.2.2. Влияние женских половых гормонов на созревание и активность клеток костной ткани.

1.4. Механизм резорбции костного матрикса остеокластами.

1.4.1. Роль катепсина К в резорбции костного матрикса.

1.4.1.1 .Строение и функции катепсина К.

1.4.2.2. Регуляция активности катепсина К.

1.4.2. Значение кислой фосфатазы остеокластов в резорбции костной ткани.

1.4.3. Значение матриксных металлопротеаз в резорбции костной ткани.

1.4.3.1. Строение и функции матриксных металлопротеаз остеокластов.

1.4.3.2. Регуляция активности ММП.

1.5. Роль сывороточных ингибиторов протеаз аг-макроглобулина и ai-антитрипсина в инактивации протеаз в организме.

1.6. Ремоделирование костной ткани при остеопорозе.

1.6.1 .Эпидемиология и классификация остеопороза.

1.6.2. Изменения ремоделирования костной ткани при разных видах остеопороза

1.6.2.1. Возрастной аспект развития остеопороза.

1.6.2.2. Остеопороз, вызванный дисфункцией гонад.

1.6.3. Лечение остеопороза.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Лабораторные животные.

2.2. Экспериментальные модели.

2.3. Методы исследования.

2.3.1. Двухэнергетическая рентгеновская абсорбциометрия.

2.3.2. Забор и хранение материала, подготовка проб к определению изучаемых параметров.

2.3.3. Морфологическое исследование костной ткани.

2.3.4. Биохимические методы исследования.

2.3.4.1. Определение активности катепсинов В, L, D, К и катепсин L-подобной активности.

2.3.4.2. Определение активности ММП.

2.3.4.3. Расчет активности катепсинов и ММП.

2.3.4.4. Определение общей концентрации ММП-2 в сыворотке крови.

2.3.4.5. Определение концентрации белка.

2.3.4.6. Определение концентрации кальция и фосфора в сыворотке крови.

2.3.4.7. Определение активности фосфатаз в сыворотке крови.

2.3.4.8. Определение активности сывороточных ингибиторов протеаз.

2.3.4.9. Статистическая обработка результатов.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

3.1. Возрастные морфофункциональные изменения костной ткани у крыс Wistar и OXYS.

3.1.1. Показатели минеральной плотности костной ткани у крыс разного возраста

3.1.2. Морфологические изменения в костной ткани позвоночника у крыс OXYS по сравнению с крысами Wistar.

3.1.3. Биохимические изменения, отражающие метаболизм костной ткани у крыс Wistar и OXYS.

3.1.3.1. Изменения активности катепсина К и ММП у крыс OXYS по сравнению с крысами Wistar.

3.1.3.2. Изменение концентрации кальция и фосфора в сыворотке крови у крыс Wistar и OXYS.

3.1.3.3. Активность щелочной и татрат-резистентной кислой фосфатазы в сыворотке крови у крыс Wistar и OXYS.

3.1.3.4. Активность а2-макроглобулина и щ —антитрипсина в сыворотке крови у крыс Wistar и OXYS.

3.2. Возрастные изменения активности катепсинов В, L и D в печени и катепсин L-подобной активности в сыворотке крови у крыс Wistar и OXYS.

3.3. Изменение показателей ремоделирования костной ткани. у овариэктомированных самок крыс Wistar.

3.3.1. Динамика изменений минеральной плотности костной ткани. после овариэктомии и на фоне введения ранелата стронция.

3.2.2. Изменения метрических показателей овариэктомированных самок крыс Wistar их взаимосвязь с МПКТ.

3.3. Биохимические изменения, отражающие метаболизм костной ткани у овариэктомированных самок крыс и введении им ранелата стронция.

3.3.1. Изменение активности катепсина К и ММП в костной ткани у самок крыс Wistar.

3.2.2. Изменение активности катепсина К и матриксных металлопротеаз в сыворотке крови у самок крыс Wistar.

3.3.3. Концентрация кальция и фосфора в сыворотке крови у овариэктомированных крыс Wistar.

3.3.4. Активность щелочной и татрат-резистентной кислой фосфатазы в сыворотке крови у самок крыс Wistar.

3.3.5. Активность ингибиторов протеаз аг-макроглобулина и ai-антитрипсина в сыворотке крови у овариэктомированных крыс Wistar.

3.5.6. Корреляционные отношения между изучаемыми параметрами у самок крыс Wistar при различных экспериментальных воздействиях.

3.3. Сравнение развития разных форм остеопороза у крыс.

ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

4.1. Развитие остеопороза у крыс линии OXYS.112.

4.2. Развитие остеопороза у овариэктомированных самок крыс Wistar.

4.3. Сравнительный анализ патогенеза двух различных форм остеопороза.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Роль протеаз различных классов в развитии остеопороза у крыс"

Остеопороз - одно из наиболее распространенных метаболических заболеваний скелета - представляет собой серьезную медицинскую и социальную проблему [31, 63] из-за невозможности его выявления на ранних стадиях, сложности лечения, частых осложнений в виде трудно срастающихся переломов [63].

В основе развития данной патологии лежит нарушение ремоделирования костной ткани. В норме ремоделирование костной ткани включает в себя процесс резорбции участка «старой» кости остеокластами и обязательный, достаточный для заполнения резорбционных лакун, процесс биосинтеза компонентов костного матрикса остеобластами. Сдвиг баланса ремоделирования в сторону резорбции является наиболее частой предпосылкой разрежения костной ткани и развития остеопороза [41].

Резорбция костной ткани сопровождается высвобождением кальция, фосфора и тартрат-резистентной кислой фосфатазы (ТРКФ), а биосинтез -щелочной (ЩФ) в сыворотку крови. Эти показатели до сих пор используются для оценки состояния процессов резорбции костной ткани как показатели деятельности остеокластов, а активность щелочной фосфатазы - для оценки процессов формирования и деятельности остеобластов [59]. Эти простые и недорогие методы диагностики обладают рядом недостатков, главными из которых являются невысокая информативность, низкая специфичность, а также существующие противоречивые данные об их изменении при развитии остеопороза [35].

При резорбции костной ткани после растворения гидроксиапатитов происходит расщепление органических компонентов костного матрикса с участием протеолитических ферментов остеокластов. Ключевая роль в этом процессе принадлежит цистеиновой протеазе катепсину К [100, 211]. Предполагают, что он вовлечен в развитие остеопороза различного генеза, в том числе - сенильного и развивающегося у женщин в постменопаузальном периоде [100, 211]. Также показано участие матриксных металлопротеаз (ММП) первого, второго, седьмого, девятого, тринадцатого типа в ремоделировании костной ткани, однако сведения об их участии в резорбции кости противоречивы [154, 192, 245]. К настоящему времени не изучена степень вовлеченности катепсина К и ММП в патогенез разных вариантов остеопороза и не определена возможность использования сывороточной активности катепсина К и ММП в качестве прогностических маркеров.

Логично предположить, что заболевание, связанное с усилением активности протеаз может смещать баланс протеазы/ингибиторы в организме в сторону протеаз за счет выхода протеаз в кровяное русло. Изменение этого баланса, как показали исследования последних лет, создают условия для развития многих патологий [57, 68, 70] и, вероятно, могут усугублять течение основного заболевания. Контроль за активностью протеаз, попавших в кровоток из различных органов и тканей осуществляется а2-макроглобулином (а2-МГ) и оц-антитрипсином (агАТ). А2-макроглобулин обладает свойством захватывать и ингибировать все известные классы пептид аз [11]. Комплексы а2-макроглобулина с протеазами элиминируются из крови в течение 2 минут [43], поэтому активность а2-макроглобулина в сыворотке отражает ее ингибиторные возможности. Кроме того, а2-МГ осуществляет транспорт различных цитокинов, в том числе трансформирующего фактора роста (3, стимулирующего остеобласты и подавляющего активность остеокластов. Однако, после связывания с протеазами, комплексы цитокин-ингибитор-протеаза опознаются макрофагами печени как элементы, подлежащие деградации, поэтому происходит их захват и расщепление. Таким образом, цитокины могут не достигать клеток-мишеней.

Изменения активности а2-МГ и а!-AT как резервов, способствующих адаптации организма при усилении резорбции костной ткани, а также возможность частичной передачи функций инактивации протеаз от одного ингибитора другому при усилении резорбции костного матрикса не изучались. Это особенно актуально при исследовании сенильного остеопороза, поскольку старение организма сопровождается усилением катаболических процессов, увеличением проницаемости в том числе, -лизосомальных мембран из-за окислительных повреждений. Кроме того, естественный процесс старения приводит к возникновению различных заболеваний, что существенным образом влияет на возникновение и течение остеопороза в этом возрасте. В частности, установлено, что развитие остеопороза у пожилых людей происходит на фоне болезней печени [20, 201 218]. Печень является центральным органом в обеспечении организма пластическим материалом. Функциональные возможности печени в значительной мере определяются способностью осуществлять биосинтез и деградацию различных белков [66]. В печени происходит биосинтез сывороточных ингибиторов протеаз сь-МГ и arAT, а также деградация их комплексов с протеазами в лизосомах. 90% внутриклеточного лизосомального протеолиза реализуется за счет согласованного действия катепсинов В, L, D [50]. Поэтому изменение активности этих протеаз в печени может определять системные последствия, во-первых, из-за возможного нарушения пластической функции печени, а во-вторых, - из-за возникшего дисбаланса протеазы/ингибиторы в организме.

Для установления особенностей этиопатогенеза заболеваний в настоящее время большое значение придается исследованиям на животных-моделях. Адекватность модели определяется ее приближенностью к процессам, происходящим в организме человека. Крысы OXYS могут являться подходящей моделью для исследования сенильного остеопороза, поскольку развитие остеопороза у этой линии крыс сопровождается такими проявления старения, как усиление катаболизма белка [17], активация свободнорадикального окисления [28], нарушениями в работе печени из-за развивающихся фиброзных изменений [14], характерных для стареющего организма.

Еще одной распространенной формой остеопороза, а потому актуальной для исследования на животных-моделях, является остеопороз, развивающийся вследствие эстрогеновой недостаточности. Если постменопаузальный остеопороз активно изучается и более или менее успешно лечится, то остеопороз, вызываемый эстрогеновой недостаточностью у лиц женского пола в молодом возрасте изучен не достаточно хорошо. Особенную значимость этой проблеме придает то, что от формирования костной ткани в детском и подростковом возрасте зависит прочность костной ткани у взрослых [4]. Значительную сложность в лечении остеопороза, развивающегося в молодом возрасте, представляет выбор препаратов лечения, поскольку препараты для взрослых обладают побочными эффектами, оказывающими влияние на рост и развитие молодого организма [58, 64]. Ранелат стронция (PC), применяемый для лечения постменопаузального остеопороза, способствует увеличению минеральной плотности костной ткани (МПКТ). В опытах in vivo и in vitro [238], а также проспективных исследованиях [247] он проявил себя не только как ингибитор резорбции, но и как стимулятор формирования костной ткани. Тем не менее, влияние PC на процессы резорбции костной ткани при лечении остеопороза в молодом возрасте не изучено.

В соответствии с целью были поставлены следующие задачи:

4. Оценить изменения активности сывороточных ингибиторов al-антитрипсина и а2-макроглобулина при различной активности цистеиновых и металлопротеаз в костной ткани, печени и сыворотке крови экспериментальных животных.

Научная новизна

Выявлено, что повышение активности катепсина К в костной ткани и снижение активности остеобластов является общей чертой сенильного остепороза у крыс линии OXYS и остеопороза, развивающегося у самок крыс Wistar после овариэктомии. Активность катепсина К в сыворотке крови отражает активность резорбционного процесса. Установлено, что при сенильном остеопорозе у преждевременно стареющих крыс OXYS активность катепсина К в костной ткани позвоночника повышается в меньшей степени, чем при развитии остеопороза у овариэктомированных самок крыс Wistar. Показано, что активность ММП до манифестации остеопороза у крыс OXYS снижена по сравнению с группой контроля в отличие от остеопороза, развивающегося после овариэктомии у самок крыс Wistar, при котором активность ММП в костной ткани не изменяется.

Показано, что остеопороз у крыс линии OXYS протекает на фоне усиления активности катепсинов L и D в печени и катепсин L-подобной сыворотки крови на отдельных этапах онтогенеза по сравнению с крысами Wistar аналогичного возраста. Показано увеличение активности сывороточного ингибитора а2-макроглобулина при одновременном снижении активности протеаз в кровяном русле у преждевременно стареющих крыс OXYS.

Впервые показано, что введение ранелата стронция в дозе 200 мг/кг молодым овариэктомированным самкам крыс увеличивает скорость и объем ремоделирования костной ткани. На первом этапе это выражается в значительном увеличении формирования костной ткани позвоночника и бедренной кости. На втором этапе усиливается резорбция в позвоночнике, задерживается формирование костной ткани в бедренной кости и, одновременно, усиливается формирование в переферических отделах скелета. Увеличение объемов ремоделирования костной ткани под действием PC приводит к уменьшению активности ММП и а2-макроглобулина в сыворотке крови.

Научно-практическая значимость

Основные положения, выносимые на защиту

1. Увеличение активности катепсина К в костной ткани у преждевременно стареющих крыс OXYS и у овариэктомированных самок крыс Wistar является причиной избыточной резорбции костного матрикса, что вместе со снижением активности остеобластов приводит к развитию остеопороза.

3. Дополнительным фактором в развитии сенильного остеопороза у преждевременно стареющих крыс линии OXYS является нарушение соотношения протеазы/ингибиторы протеаз в организме.

4. Введение ранелата стронция в дозе 200 мг/кг молодым овариэктомированным самкам крыс Wistar вызывает нарушение естественных механизмов сохранения костной плотности на ранних этапах после овариэктомии.

Апробация работы

Результаты работы доложены на Съезде физиологов Сибири, Томск, 2005; на международном Приполярном конгрессе, Новосибирск, 2006; на Физиологическом Съезде, Москва, 2007; на конференции молодых ученых Института физиологии СО РАМН, Новосибирск, 2007; на конференции молодых ученых с международным участием, посвященной патологии позвоночника, Новосибирск, 2008; на Всероссийской конференции молодых ученых «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины», Москва 2008; на Съезде физиологов Сибири, Барнаул, 2008.

Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из введения, четырех глав, включающих литературный обзор, материалы и методы исследования, результаты исследования, обсуждение результатов, после которых следуют выводы и список цитируемой литературы, который содержит 272 работы, в том числе 201 зарубежную. Работа изложена на 166 страницах машинописного текста, содержит 7 таблиц и 23 рисунка.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Венедиктова, Анастасия Александровна

ВЫВОДЫ

2. Повышение активности катепсина К в костной ткани предшествует снижению минеральной плотности костной ткани при развитии сенильного остеопороза у крыс OXYS и остеопороза, вызванного эстрогеновой недостаточностью у овариэктомированных самок крыс Wistar.

3. Определение активности катепсина К в сыворотке крови может являться маркером резорбции костной ткани на раннем этапе развития остеопороза до снижения костной плотности, чем определение концентрации кальция, фосфора и активности тартрат-резистентной кислой фосфатазы. Определение активности тартрат-резистентной кислой фосфатазы как маркера резорбции лучше использовать для диагностики сенильного остеопороза на стадии, когда возможно определение его наличия с помощью денситометрии.

4. Развитию сенильного остеопороза у крыс OXYS способствует усиление активности катепсинов L и D в печени из-за нарушения ее пластической функции, а также увеличение протеолитической активности в сыворотке крови из-за нарушения соотношения протеазы/ингибиторы в организме.

5. Динамика изменений минеральной плотности костной ткани у овариэктомированных самок крыс Wistar отличается нестабильностью и зависит от изменения массы животных. Наибольшей зависимостью от массы обладают высоко нагружаемые отделы скелета, в то время как менее нагружаемые в большей степени зависят от биосинтеза эстрогенов жировой тканью. Крысы OXYS характеризуются сниженными значениями минеральной плотности костной ткани по сравнению с крысами Wistar.

6. Введение ранелата стронция ежедневно в дозе 200 мг/кг молодым овариэктомированным самкам крыс Wistar не влияет на величину активности катепсина К и матриксных металлопротеаз в костной ткани позвоночника и бедренной кости. Ранелат стронция сначала способствует процессам формирования в костной ткани позвоночника и бедренной кости, а затем усиливает резорбцию костной ткани в этих отделах скелета, индуцируя потерю костной плотности.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

К настоящему времени известно, что ремоделирование костной ткани в норме представляет собой тонкий сбалансированный процесс, нарушение которого может приводить к различным заболеваниям. В частности, сдвиг баланса в сторону резорбции в течение длительного времени может повлечь за собой развитие остеопороза. Патогенез остеопороза активно изучается. Установлены факторы риска его развития, в значительной степени изучены механизмы влияния различных эндогенных факторов, такие как гормоны, цитокины, факторы роста на клетки костной ткани. Агентами, непосредственно влияющими на резорбцию костной ткани, являются протеазы остеокластов. В ряде исследований продемонстрировано, что за резорбцию костной ткани ответственен катепсин К — высоко активная протеаза остеокластов. Имеются основания считать, что его избыточная активность может приводить к остеопорозу. Тем не менее, несмотря на увеличение концентрации катепсина К в сыворотке крови у больных остеопорозом по сравнению со здоровыми людьми, степень вовлеченности катепсина К в развитие различных форм остеопороза не изучена. Данные о роли ММП в резорбции кости неоднозначны, считается, что они могут способствовать ей. Существуют также данные, принимая во внимание которые, можно сделать противоположные выводы. Таким образом, эта проблема диктует необходимость проведения дополнительных исследований.

В настоящее время в деградомике принято считать, что нарушение баланса протеазы/ингибиторы в организме приводит к различным заболеваниям. В этом отношении изучались цистеиновые протеазы и ММП и их специфичные эндогенные ингибиторы - цистатины и ТИМП при самых разных заболеваниях, в то время как роль универсальных сывороточных ингибиторов а 1-антитрипсина и а2-макроглобулина в нейтрализации протеаз на организменном уровне в частности при остеопорозе не изучалась, хотя а2-МГ, выполняя транспортную и защитную функцию цитокинов и факторов роста, является важным звеном в развитии эффектов, запускаемых этими агентами в клетках-мишенях, в частности в остеобластах и остеокластах, не говоря уже о прямой роли этих ингибиторов в предотвращении поражения белков выходящими в кровяное русло протеазами. Это становится тем более актуальным, учитывая то, что при заболеваниях, вызываемых дисбалансом протеаз и их специфичных ингибиторов, концентрация последних часто снижается.

Поскольку сенильный остеопороз часто развивается на фоне других заболеваний, сопутствующих старению, а также показана связь остеопороза и состояния печени, возник вопрос о том, что является первичным, а также о том, какие механизмы способствуют этому. У преждевременно стареющих крыс OXYS фиброзные изменения печени развиваются позже остеопоротического поражения костной ткани, однако высокий уровень активности протеаз в печени и сыворотке крови в определенные возрастные периоды может способствовать как развитию фиброза, так и остеопороза за счет изменения пула транспортируемых факторов роста а2-макроглобулином, уровень активности которого увеличивается у крыс OXYS с возрастом.

Последние несколько лет внимание исследователей в качестве антиостеопоротического препарата в постменопаузе привлек PC, однако его действие на молодые организмы не было изучено до конца.

Наше исследование показало, что высокая активность катепсина К предшествует манифестации остеопороза как у преждевременно стареющих крыс OXYS, выбранных нами в качестве модели сенильного остеопороза, так и у молодых овариэктомированных самок крыс Wistar. Показано также, что в обоих случаях у животных-моделей снижается активность ЩФ в сыворотке крови, что свидетельствует о снижении способности к формированию костной ткани у животных. Увеличение активности катепсина К в сыворотке крови у животных происходит на фоне увеличения его активности в костной ткани, поэтому этот показатель может служить маркером резорбции костной ткани до манифестации остеопороза у молодых животных. Несмотря на сходства патогенеза остеопороза разных форм, существуют также ярко выраженные отличия: при сенильном остеопорозе крыс OXYS повышение активности катепсина К в костной ткани позвоночника менее выражено, чем у овариэктомированных самок, однако манифестация остеопороза у них наступает раньше. Были найдены также отличия и в активности ММП в костной ткани, если у овариэктомированных самок общая активность ММП в костной ткани после овариэктомии не изменялась, то у молодых крыс OXYS она была ниже по сравнению с контрольной группой и выше у взрослых крыс. Это говорит о том, что у модельных животных при развитии разных форм остеопороза реализуются различные механизмы его развития.

Учитывая, что у крыс OXYS с возрастом увеличивается активность а2-МГ можно говорить о необходимости детального исследования его роли в развитии остеопороза как ингибитора протеаз и переносчика цитокинов и факторов роста, тем более, что, как показали наши данные, снижение его активности в случае введения овариэктомированным самкам PC в дозе 200 мг/кг происходит на фоне уменьшения МПКТ.

Введение PC в дозе 200 мг/кг овариэктомированных крысам если и снижало скорость резорбции, то только за счет ММП и не во всех отделах скелета. Несмотря на увеличение активности ЩФ в сыворотке крови при этом, было показано, что МПКТ позвоночника и бедренной кости к исходу 2-го месяца терапии было снижено по сравнению с не леченными животными. Кроме того, PC вызывал перераспределение МПКТ в скелете.

Таким образом, можно заключить, что катепсин К действительно играет важную роль в развитии остеопороза, но проявления этого заболевания зависит не только от его активности, поскольку обнаружено, что при наличии резервов у молодых организмов, его манифестация может значительно отодвигаться во времени даже не смотря на более высокую активность этого фермента по сравнению с той, которая проявляется при сенильном остеопорозе у крыс OXYS.

На наш взгляд представляется перспективным детально исследовать роль конкретных ММП в различных отделах скелета, поскольку полученные данные хоть и говорят об их изменениях, однако, не позволяют сделать столь четких выводов, как в отношении катепсина К. Кроме того, результаты исследования свидетельствуют о том, что ремоделирование в разных отделах скелета идет неодинаково, а вскрытие механизмов подобного рода, вероятно, сможет предсказать возможное место перелома и усилить профилактические меры более специфично, например, подобрать режим и характер физической нагрузки. То, что ремоделирование в одно и то же время в костях идет неодинаково ставит под сомнение безопасность нетоксичных ингибиторов катепсина К как возможных препаратов против остеопороза, поскольку в таком случае костная ткань перестанет обновляться должным образом в нецелевых отделах скелета.

Также, на наш взгляд имеет смысл изучить деятельность остеобластов при развитии изучаемых форм остеопороза, поскольку от их активности напрямую зависит формирование костной ткани, и остеоцитов, осуществляющих транспорт веществ между клетками.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Венедиктова, Анастасия Александровна, Новосибирск

1. Аруин Л. И. Апоптоз и патология печени / Л.И. Аруин // Росс. ж. гастроэнтерол. гепатол. колопроктол. - 1998. — №2. - С. 6— 10.

2. Барановская Е.И., Кирпиченок Л.Н., Супрун Л.Я. Активность протеиназ и их эндогенных ингибиторов в плазме крови и эндометрии больных эндометриозом // Материалы конференции «Структура и функция протеолитических ферментов». 2000.

3. URL: http://medi.ru/pbmc/8800506.htm (Дата обращения: 22.12.2005).

4. Беневоленская Л.И. Миакальцик (кальцитонин лосося) для интраназального введения в лечении и профилактике остеопороза. // Остеопороз и остеопатии. 1999. - №2. - С. 9 — 17.

5. Беневоленская Л.И. Руководство по остеопорозу. М.: 2003. 524 с.

6. Будова А.П., Балашов А.Т. Опыт использования остеоденситометрии в педиатрической популяции Мурманской области // Материалы II конференции «Проблема остеопороза в травматологии ортопедии». — 2003.-С. 8-9.

7. Буеверов А.О. Апоптоз и вирусные гепатиты / А.О. Буеверов // Вирусные гепатиты: Достижения и перспективы. 2001. - № 1(11). - С. 12-14.

8. Буйкин С.В., Пузырев В.П. Альфа1-антитрипсиновая недостаточность. Перспективы скрининга. // Бюл. СО РАМН. 2004. - Т. 111, № 1. - С. 92 -97.

9. Бурдыгина Н.В. Минеральная плотность костной ткани по данным двухфотонной рентгеновской денситометрии и нейтронно-активационного анализа у жителей гг. Москвы и Обнинска. // Автореф. дисс. канд. мед. наук. М., 2000.

10. Васильев А.В. Активность катепсинов у различных животных в норме и при изменении характера питания // Автореф. дисс. канд. биол. наук. М., 1979.

11. Веремеенко К.Н., Голобородько О.П., Кизим А.И. Протеолиз в норме и при патологии. Киев, 1988.

12. Влияние ингибиторов плазмы крови на активность сериновых и цистеиновых протеиназ / Веремеенко К.Н., Кизим А.И., Терзов А.И. и др. // Укр. биохим. журн. 1998. - Т. 70, № 6. - С. 35^12.

13. Громакова И. А. Лизосомальный протеолиз: влияние старения и инсулина / И.А. Громакова, О.А. Коноваленко // Биохимия. 2003. - Т. 68,№7.-С. 772-775.

14. Дедух Н.В., Зупанец И.А. Факторы риска и механизмы развития остеопороза. В кн.: Остеопороз: эпидемиология, клиника, диагностика, профилактика и лечение. Харьков: Золотые страницы, 2002. С.60 65.

15. Динамика структурно-функциональных изменений митохондрий гепатоцитов преждевременно стареющих крыс линии OXYS / Н.Г. Колосова, С.В. Айдагулова, Г.И. Непомнящих и др. // Бюл. экспер. биол. 2001. - 132, № 8. - С. 235 - 240.

16. Дубровин С.М., Муромцев А.В., Новикова Л.И. а2-макроглобулин: современное состояние вопроса // Клин. Лаб. Диагн. 2000. - №6. - С. 3. -7.

17. Ершов К. И. Протеогликаны и минеральный состав костной ткани крыс в норме и при развитии остеопороза // Дисс. канд. биол. наук. Новосибирск, 2008.

18. Изменение активности катепсинов В, L и D в печени у крыс Wistar и преждевременно стареющих крыс OXYS разного возраста / Бенедиктова А.А., Фаламеева О.В., Колосова Н.Г. и др. // Бюл. СО РАМН. 2007. -№3(125).-С. 127-132.

19. Каркищенко Н.Н. Альтернативы биомедицины. Т. 1. М.: ВЕК, 2004. 320 с.

20. Каркищенко Н.Н. Основы биомоделирования. М.: ВПК, 2004. 600 с.

21. Катикова О.Ю. Болезни печени в пожилом возрасте: клинические проявления, особенности патогенеза, лечение // Клиническая геронтология. 2004. - №7. - С. 1- 10.

22. Колосова Н.Г., Куторгин Г.Д., Сафина А.Ф. Особенности минерализации костной ткани преждевременно стареющих крыс OXYS // Бюл. экспер. биол. мед. 2002. -Т. 133, №2. - С. 203 - 206.

23. Корнилов Н.В., Михайлов С. А., Малинин B.JI. Определение минеральной плотности костной ткани подростков и юношей Санкт-Петербурга с целью ранней профилактики остеопороза // Травматология и ортопедия России. 2004. - № 1. - С. 36 - 43.

24. Короленко Т.А. Катаболизм белка в лизосомах. Новосибирск: 1990. 192 с.

25. Косягин Д.В. Аминокислотный состав белка протеогликанов суставного хряща человека в норме и при дегенерации // Укр. биохим. журнал. -1984 Т. 56, №5. - С. 549 -551.

26. Крысы OXYS как модель сенильной катаракты / Колосова Н.Г., Лебедев П.А., Айдагулова С.В., Морозкова Т.С. // Бюлл. экспер. биол. мед. -2003. Т. 136, №10. - С. 467 - 471.

27. Лечение постменопаузального остеопороза миакальциком назальным аэрозолем. / Скрипникова И.А., Лепарский Е.А., Оганов B.C. и др. // Остеопороз и остеопатии. - 2001. — №1. - С. 16-19.

28. Локшина Л.А. Протеолитические ферменты в процессах онкогенеза // Вопр. Мед. Химии. 1991. - Т. 37, № 7. -С. 15 - 21.

29. Лоскутова Л.В., Колосова Н.Г. Эмоциональный статус и способность к однократному обучению крыс линии OXYS с наследственно повышенной продукцией радикалов кислорода // Бюл. экспер. биол. мед. -2000.-Т. 130, №8.-С. 155- 158.

30. Меньшиков В.В. Лабораторные методы исследования в клинике. М.: Медицина. 1987. 368 с.

31. Мякоткин В.А., Беневоленская Л.И. / В.А. Мякоткин, Л.И. Беневоленская // Научно-практическая ревматология .— 2005. №1. -С.

32. Насонов Е.Л. в кн.: Руководство по остеопорозу / под ред. Беневоленской Л.И. С. 346- 362.

33. Особенности изменений биохимических маркеров костного ремоделирования у детей в возрастном аспекте / Баранов А.А., Щеплягина Л.А., Баканов М.И. и др. // Медицинский научный и учебно-методический журнал 2002. - № 6. - С. 131-148.

34. Особенности острофазного ответа при различных вариантах воспалительных процессов придатков матки / С.В. Шрамко, В.Н. Зорин, Л.Г. Баженова, P.M. Зорина. // Бюллетень Сибирской медицины. 2007. - № 1. - С. 105-110.

35. Остеопороз у детей: учебное пособие. / Коровина Н.А., Творогова Т.М., Гаврюшова Л.П. и др. М.: 2005. 50 с.

36. Поворознюк В.В., Григорьева Н.В. Менопауза и костно-мышечная система. Киев: 2004. 512 с.

37. Постменопаузальный остеопороз, контрацепция и заместительная гормонотерапия / В.Н. Прилепская, А.В. Ледина, О.И. Малышева, К.А. Дрожжина // Consilium medicum. 2000. - Т. 2, №6. - С. 257- 260.

38. Преждевременно стареющие крысы OXYS как модель сенильной катаракты человека / Колосова Н.Г., Лебедев П.А., Фурсова А.Ж. // Успехи геронтологии- 2003. — Т. 12.-С. 143-148.

39. Принципы патогенетически обоснованного лечения первичного остеопороза. Пособие для врачей. // Балберкин А.В., Колондаев А.Ф. и др. М.: 2002. 20 с.

40. Пузырев В.П., Савюк В.Я. Молекулярные основы и клинические аспекты недостаточности a i-антитрипсина // Пульмонология. 2003. - Р. 105.-115.

41. Рансбергер К. В сб.: Опыт и перспективы системной энзимотерапии. Киев: Фада ЛТД, 2003. С. 5-18.

42. Ригтз Б. Л, Мелтон Л. Д. Остеопороз. Этиология, диагностика, лечение. СПб.: «Невский диалект». 2000. 560 с.

43. Родионова С.С. Гистоморфометрия в диагностике остепороза. В кн: Руководство по остеопорозу. Под ред. Беневоленской Л.И. С. 304 320.

44. Родионова С.С., Колондаев А.Ф., Соколов В.А. Результаты использования препарата «Остеогенон» у пациентов с различной патологией опорно-двигательного аппарата // Остеопороз и остеопатии. -1999. -№ 1.-С. 43-45.

45. Рожинская Л.Я., Марова Е.И., Дзеранова Л.К. Остеопенический синдром при нейроэндокринных заболеваниях в кн.: Нейроэндокринология под ред. Маровой Е.И. Ярославль: 1999. С. 423 -484.

46. Рожинская Л.Я., Беляева А.В., Белая Ж.Е. Ранелат стронция (Бивалос) -препарат двойного действия на костную ткань; новые подходы к лечению остеопороза // Остеопороз и остеопатии. —2006. — № 1. — С. 32 — 37.

47. Роль процессов свободнорадикального окисления в патогенезе инфекционный болезней / А.П. Шепелев, И.В. Корниенко, А.В. Шестопалов, А.Ю. Антипов// Вопр. Мед. химии. 2000. - № 2. URL http://medi.ru/pbmc/8800202.htm (Дата обращения 19.04.09.)

48. Рывняк В.В., Рывняк Е.И., Тудос Р.В. Электронно-гистохимическая локализация катепсина L в печени. // Бюл. Эксп. Биол. Мед. 2004. -Vol. 137, №1.-С. 90-91.

49. Соловьева Н.И. Матриксные металлопротеиназы и их биологические функции // Ж. Биоорганической химии. 1996. - Т. 24. - С. 217 - 226.

50. Соловьева Н.А., Гинзбург Э.Х., Казаринова Ф.С. Повышенный транспорт галактозы в клетки как причина развития наследственной галактоземии // Вопр. мед. химии 1987, Т. 33, №6. С. 41- 47.

51. Соловьева Н.А., Морозкова Т.С., Салганик Р.И. Получение сублинии крыс с признаками наследственной галактоземии и исследование их биохимических особенностей // Генетика, 1975, Т. 11, №5. С. 63- 71.

52. Структурно-функциональные изменения костной ткани позвоночника и конечностей у крыс OXYS / О.В. Фаламеева, М.А. Садовой, Ю.В. Храпова, Н.Г. Колосова // Хирургия позвоночника. 2006. - № 1. - С. 88- 94.

53. Торопцова Н.В., Беневоленская Л.И. Распространенность остео-поротических переломов позвонков у женщин с остеопенией. // Материалы III Российского симпозиума по остеопорозу. 2000. - С. 86.

54. Универсальный регулятор а2-макроглобулин / Н.А. Зорин, В.Н. Зорина, P.M. Зорина, В.Г. Левченко // Клин. Лаб. Диагн. 2004. - №11. - С. 18 -22.

55. Фаламеева О.В. Роль протеиназ лизосом и их эндогенных ингибиторов при росте и химиотерапии опухолей. . Дис. канд. мед. наук, Институт физиологии СО РАМН, Новосибирск, 2004.

56. Фаламеева О.В. Остеопения и остеопороз в детском, подростковом и юношеском возрасте. // Хирургия позвоночника. 2008. - №2. - С. 65 -72.

57. Фаламеева О.В. Научные основы профилактики остеопороза в детском, подростковом и юношеском возрасте. Дис. Докт. мед. наук, НИИ травматологии и ортопедии Росмедтехнологий, Новосибирск 2008.

58. Хасигов П.З., Подобед О.В., Грачева Т.С. Роль металлопротеиназ матрикса и их ингибиторов в процессах опухолевой инвазии и метастазирования // Биохимия. 2003. - Т. 68, № 7. — С. 869- 876.

59. Храпова Ю.В. Нормативные показатели минеральной плотности костной ткани у детей и подростков г. Новосибирска. Дис. канд. мед. наук, НИИ травматологии и ортопедии Росмедтехнологий, Новосибирск, 2007.

60. Хрящ / Под ред. В.Н. Павлова М.: Медицина, 1988. 320 с.

61. Цейтлин О.Я. Распространенность, диагностика и профилактиктика остеопороза и остеопенических переломов (на примере популяции Самарской области) // Автореф. дисс. докт. мед. наук. Самара, 2002.

62. Шварц Г.Я. Препараты витамина D в кн.: Лекарственный средства для лечения и профилактики остеопороза. М., 2002. С. 212 - 264.

63. Шварц Г.Я. Сосудистые эффекты эстрогенов и заместительная гормонотерапия климактерических расстройств // Вопр. Клин. Фармакол. 2000. -№ 3. -С.45 -50.

64. Шкурупий В.А. Ультраструктура клеток печени при стрессе. Новосибирск, 1989. 192 с.

65. Щеплягина Л.А., Моисеева Т.Ю. Проблемы остеопороза в педиатрии: возможности профилактики // Русский медицинский журнал. -2003. -Т. 11, № 27. С. 1554- 1556.

66. Юзько Ю.В. Изменения различных классов протеаз и ингибиторов протеаз как возможных сывороточных маркеров фиброза у больных хроническим вирусным гепатитом С (клинико-экспериментальное исследование) //Автореф. дисс. канд. мед. наук. Новосибирск, 2007.

67. Юренева С.В. Лечение и профилактика постменопаузального остеопороза // Consilium medicum. 2004. - Т. 6, №9.

68. URL:http://www.consilium-medicum.com/media/consilium/0409/702.sh1ml (Дата обращения: 15.04.09.)

69. A cross-sectional study of the effects of long-term percutaneous hormone replacement therapy on bone density / T. Garnett, J. Studd, N. Watson, M.A. Sawas // Obstet. Gynecol. 1991- Vol. 8 .- P. 1002 - 1007.

70. A crucial role for MMP-2 in osteocytic canalicular formation and bone metabolism К. / K. Inoue, Yu. Mikuni-Takagaki, K. Oikawa, et al. // J. Biol. Chem. 2006. -Vol. 281, №44. - P. 33814 - 33824.

71. A homologue of the TNF receptor and its ligand enhance T-cell growth and dendritic-cell function / D.M. Anderson, E. Maraskovsky, W.L. Billingsley et al. // Nature. 1997. - Vol. 390. - P. 175-179.

72. A phage display technique identifies a nwel regulator of cell differentiation / T. J. Sheu, E.M. Schwarz, D.A. Martinez et al. // J. Biol. Chem. 2003. -Vol. 278.-P. 438-443.

73. A putative role for cathepsin К in degradation of AA and AL Amyloidosis / Ch. Rocken, B. Strix, D. Bromme et al. // Am. J. Pathol. 2001. - Vol. 158. -P. 1029- 1038.

74. Age-associated change in oxidative damage and the activity of antioxidant enzymes in rats with overgeneration of free radicals / O. Sinitsina, Z. Krysanova, A. Ishenko et al. // J. Cell. Mol. Med. 2006. - Vol. 10, № 1. - P. 206-215.

75. Age-dependent changes in myocardial matrix metalloproteinase tissue inhibitor of metalloproteinase profiles and fibroblast function / M.L. Lindseya, D K. Goshorna, C.E. Squiresa et al. // Cardiovascular Research. -2005. Vol. 66 (2). — P. 410 - 419.

76. Ammann P. Strontium ranelate: a physiological approach for an improved bone quality.// Bone. 2006. - Vol. 38 (2). P. 15-18.

77. An immunohistochemical assessment of cathepsin D in gastric carcinoma: its impact on clinical prognosis / H. Allgayer, R. Babic, K.U. Grutzner et al. // Cancer. -1997.-Vol. 80, №2.-P. 179-187.

78. Autocatalytic activation of human cathepsin К / M.S. McQueney, B.Y. Amegadzie, K. D'Alessio, et al. // J. Biol. Chem. 1997. - Vol. 272, № 21. -P. 13955-13960.

79. Bain S.D., Jerome C., Shen V. Strontium ranelate improves bone strength in ovariectomized rat by positively influencing bone resistance determinants. // Osteoporos. Int. 2008.

80. URL: http://www.springerlink.com/content/203g42341t304501/fulltext.pdf (Дата обращения: 14.12.08)

81. Barrett A.J., Kirschke H. Cathepsin B, Cathepsin H, and cathepsin L // Methods Enzymol. 1981. - Vol. 80. - P. 535 - 561.

82. Beattie J., Avenell A. Trace element nutrition and bone metabolism // Nutr. Res. Rev. 1992. - Vol. 5. - P. 167 - 188.

83. Berg С. E. M., B. R. Horrocks cAMP-depenent inhibition is dominant in regulating superoxide production in the bone-resorbing osteoclasts // J. Endocrynology. 1998. - Vol. 158. - P. 311 - 318.

84. Beta 2-microglobulin induces stromelysin production by human synovial fibroblasts / K. Migita, K. Eguchi, M. Tominaga et al. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1997 - Vol. 239. - P.621 - 625.

85. Bidirectional regulation of osteoclasts function by nitric oxide synthase isoforms / M.L. Brandy, M. Hukkanen, T. Umeda et al. // Pharmacology. -1995. Vol. 92. - P. 2954 - 2958.

86. Biochemical and immunohistochemical analysis of cathepsin В, H, L and D in human melanocytic tumor / T. Kadashita, A. Yochii, T. Kimura et al. // Arch. Dermatol. Res. 1995. - Vol. 287. - P. 266 - 272.

87. Blake G.M., Foglman I. Long-term effect of strontium ranelate treatment on BMD. // J. Bone Miner. Res. 2005. - Vol. 20. - P. 1901 - 1904.

88. Bollen A.-M., Eyre D.R. Direct extraction of gelatinases from rat bone // Connect. Tiss. Res. 1993. - Vol. 29. - P. 223 - 230.

89. Bone biology, part I: structure, blood supply, cells, matrix, and mineralization / J.A. Buckwalter, M.J. Glimcher, R.R. Cooper, R. Becker // Instr. Course Lect. 1996. - Vol. 45. - P. 371 -386.

90. Bone resorption induced by parathyroid hormone is strikingly diminished in collagenase-resistent mutant mice / W. Zhao, M.B. Byrne, B. F. Boyce, S.M. Krane // J. Clin. Invest. 1999. - Vol. 103, №4. - P. 517- 524.

91. Bonewald L.F., S.L. Dallas Role of active and latent transforming growth factor fl in bone formation // J. Cell Biochem. 1994. - Vol. 55. - P. 350 -357.

92. Bradford M.M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding // Anal. Biochem. 1976 - Vol. 72. - P. 248 - 254.

93. Bronner F., Farach-Carson M.C. Bone Resorption, London: Springer, 2005. 189 p.

94. Brubaker K.D. Evidence for plasma membrane-mediated effects of estrogen / K.D. Brubaker // Calcif. Tiss. Int. 1999. - Vol. 64, №6. - P. 459 - 462.

95. Bruunsgaard H. Effects of tumor necrosis factor-alpha and interleukin-6 in elderly populations. // Eur. Cytokine Netw. 2002. - Vol. 13. - P. 389 - 391.

96. Buhlung, F., Groneberg, D., Welte, T. Proteases and their role in chronic inflammatory lung diseases. // Curr. Drug Targets. 2006. - Vol. 7. - P. 751 -759.

97. Burgoyne R.D. G proteins: control of exocytosis. // Nature. 1987. - Vol. 328 (6126). - P. 112-113.

98. Calcitriol for bone loss in patient with primary biliary cirrhosis. // S. Shiomi, Masaki K., Habu D. et al. // J. Gastroenterology. 1999. - Vol. 34. -P. 241-245.

99. Calpain is required for normal osteoclast function and is down-regulated by calcitonin. / Marzia M., Chiusaroli R., Neff L. et al. //J. Biol. Chem. 2006. -Vol. 281(14). - P. 9745 - 9754.

100. Cathepsin D protease mediated programed cell death induced by interferon-y Fas/Apo-1 and TNF-oc / Deiss L.P., Galinka H., Berissi H. et al. // EMBO J. 1996. - Vol. 15. - P. 3861 - 3870.

101. Cathepsin К a marker of macrophage differentiation? / F. Biihling , A. Reisenauer, A. Gerber et al. // J. Pathol. - 2001. - Vol. 195 (3). - P.375 - 382.

102. Cathepsin К in adipocyte differentiation and its potential role in the pathogenesis of obesity / Y. Xiao, H. Junfeng, L. Tianhong, W. et al. // J. Clin. Endocrinol. Metab. 2006. - Vol. 91 (11). - P. 4520 - 4527.

103. Cathepsin К is the principal protease in giant cell tumor of bone / J. H. N. Lindarman, R. Hanemaaijer, A. Mulder et al. // Am. J. Pathol. 2004. - Vol. 165, №2.-P. 593-600.

104. Chapman H. A., Riese R. J., Shi G. P; Emerging roles for cysteine proteases in human biology.// Annu. Rev. Physiol. -1997. Vol. 59. - P. - 63 - 88.

105. Characterisation of novel cathepsin К mutation in the pro and mature polypeptide regions causingpycnodysostosis / W-Sh. Hou, D. Bromme, Y. ZhaoetaW/J. Clin. Invest. -1999.-Vol. 103. P. 731 - 738.

106. Characterization of liver lysosomal enzyme activity in hepatocytes, Kupffer and endothelial cells during aging: effect of dietary restriction. / G. Ferland, A. Perea, M. Audet, B. Tuchweber // Mech. Ageing. Dev. 1990. -Vol. 56, №2.-P. 143- 154.

107. Chu C.T., Pizzo S.V. Receptor-mediated antigen delivery into macrophages. Complexing antigens to alpha-2-macroglobulin enhanced presentation to T cells // J. Immunol. -1993. Vol. 150. - P. 48 - 58.

108. Clinical and experimental asociation of a polymorphism of the matrix metalloproteinase-9 gene with bone mineral density in Japanese men. / Y . Yamada, F. Ando, N. Niino, H. Shimokata // Metabolism. 2004. - Vol. 53 (2). -P.135- 137.

109. Compston J. E. Sex steroids and bone // Physiological Reviews. 2001. -Vol. 81, № 1.-P. 4194-4147.

110. Cotran R.S., Kumar V., Collins T. Robbins pathologic basis of disease. 6-th ed, 1999, p. 1215- 1268. 6-th ed., 1999, p. 1215- 1268.

111. Couse J.F., Korach K.S. Estrogen receptor null mice: what have we learned and where will they lead us? // Endocr. Rev. 1999. - Vol. 20. - P. 358 -417.

112. Cuervo A.M. Autophagy: many paths to the same end // Molecular and Cellular Biochemistry. 2004. - Vol. 263. - P. 55-72.

113. Cuervo A.M., Dice F. Age-related decline in chaperon-mediated autophagy //J. Biol. Chem. 2000. - Vol. 275, № 40. - P. 31505 - 31515.

114. Cystatin C, an inhibitor of bone-resorbtion produced by osteoblasts / U. H. Lerner, L. Johansson, M. Ransjo et al. // Acta Physiol. Scand. 1997. - Vol. 161.-P. 81-92.

115. Delaisse J.M., Andersen T.L., Engsig M.T. Matrix metalloproteinases (MMP) and cathepsin К contribute differently to osteoclastic activities // Microsc. Res. Tech. 2003. - Vol. 61. - P. 504 - 513.

116. Dempster W.D. Two- and three-dimensional structural analysis or paired biopsies from osteoporotic patients before and after treatment withparathyroid hormone / W.D. Dempster, F. Cosman, E.S. Kurland // J. Bone Miner. Res.-2001.-Vol. 16.-P. 1846- 1853.

117. Dephosphorylation of osteopontin and bone sialoprotein by osteoclastic tartrate-resistent acid phosphatase / B. Ek-Rylander, M. Flores, M. Wendel, D. Heinegard // J. Biol. Chem. 1994. - Vol. 269. - P. 14853 - 14856.

118. Dickinson D.P. Cysteine peptidase of mammals: their biological roles and potential effects in the oral cavity and other tissues in helth and diseas. // Crit. Rev. Oral. Biol. Med. 2002. - Vol. 13 (3). - P. 238 - 275.

119. Different cysteine proteinases involved in bone resorption and osteoclast formation / Brage M., Abrahamson M., Lindstrom V. et al. // Calcif. Tiss. Int. 2005. - Vol. 76, №6. - P. 439 - 447.

120. Different immunolocalizations of cathepsins В, H, and L in the liver. / K. Ii, K. Hizawa, E. Kominami et al. // J. Histochem. Cytochem. 1985. - Vol. 33, №11.-P. 1173- 1175.

121. Differential release of active proteinase inhibitors by two rat mammary adenocarcinoma variants possessing different metastatic potentials / A. Neri, O. Bohoslawec, T.D. Anderson, Z.A. Tokes // Cancer Res. 1991. - Vol. 51, № 4. - P. 1318-1325.

122. Eeckhoeut Y. Possible role and mechanism of action of dissolved calcium in the bone collagen by lysosomal cathepsins and collagenase // Biochem. J. -1990. Vol. 272. - P. 529 - 532.

123. Effect of calcitonin, amylin and calcitonin-related peptide on osteoclast development /1. Cornish, K.E. Callon, U. Bava et al. // Bone. 2001. - Vol. 2.-P. 162-168.

124. Effect of parathyroid hormone on fractures and bone mineral density in postmenopausal women with оsteoporosis / R.M. Neer, C.D. Arnaud, J. R. Zanchetta et al. // N. Engl. J. Med. 2001. - Vol. 344. - P. 1434 - 1441.

125. Effect of surgical menopause and estrogen replacement on cytokine release from human blood mononuclear cells. / R. Pacifici, C. Brown, E. Puscheck et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1991. Vol. 88. - P. 5134 - 5138.

126. Effects of interleukin-1 on bone turnover in normal mice. / B.F. Boyce, T.B. Aufdemorte, IR. Garrett et al. // Endocrinol. 1989. - Vol. 125. - P. 1142 -1150.

127. Effects of progesterone оn p ostovariectomy bone loss in aged rats. / E.T. Barengolts, H.F. Gajardo, T.J. Rosol et al. // J. Bone Miner. Res. 1990. -Vol. 5, №11.-P. 1143-1147.

128. Elliott S., Hays E., Mayor M. The triterpenoid CDDO inhibits expression of matrix metalloproteinase-1, matrix metalloproteinase-13 and Bcl-3 in primary human chondrocytes. //Arthritis Res Ther. 2003. Vol. 5(5). - P. 285-291.

129. Epidermal growth factor-like ligands differentially up-regulate matrix metalloproteinase 9 in head and neck squamous carcinoma cells. / P. О Charoenrat, H. Modjtahedi, P. Rhys-Evans et al. // Cancer Res. 2000. - Vol. 60(4).-P.l 121- 1128.

130. Estrogen enhances growth hormone receptor expression and growth hormone action in rat osteosarcoma cells and human osteoblast-like cells / M.C. Slootweg, D. Swolin, J.C. Netelenbos et al. //J. Endocrinol. 1997.-Vol. 155.-P.159 — 164.

131. Estrogen modulation of osteoclast lysosomal enzyme secretion / M. Kremer, J. Judd., B. Rifkin et al.// J. Cell Biochem. 1995. - Vol. 57. - P. 271- 279.

132. Expression of cytokines and factors modulating apoptosis by human sinusoidal leucocytes / J.R. Jonsson, C.J. Edwards-Smith, S.C. Catania et al. // J. Hepatol. 2000. - Vol.32. - P.392 - 398.

133. Expression of matrix metalloproteinase-2 in the development of rat first molar tooth germ / P. Cotrim, C.R.Andrade, S. Line et al. // Braz. Dent. J. -2002.-Vol. 13.-P. 97- 102.

134. Fibroblast and neutrophil collagenases cleave at two sites in the cartilage aggrecan interglobular domain / A.J. Fosang, K. Last, V. Knauper et al. // Biochem J. 1993. - Vol. 295 (Pt 1). - P. 273 - 276.

135. Francis G. Matrix metalloproteinases regulation and dysregulation in the failing heart // Spinal. Circ. Res. 2002. - Vol. 90. - P. 520 - 530.

136. Functional heterogeneity of osteoclasts: matrix metalloproteinases participate in osteoclastic resorption of calvarial bone but not in resorption of long bone / V. Everts, W. Korper, D.C. Jansen, et al. // FASEB J. 1999. -Vol. 13.-P. 1219- 1230.

137. Furuyama N., Fujisawa Y. Distinct roles of cathepsin К and cathepsin L in osteoclastic bone resorbtion // Endocr. Res. 2000. - Vol. 26. - P. 189 - 204.

138. Furuyama N., Fujisawa Y. Regulation of collagenolytic cysteine protease synthesis by estrogen in osteoclasts// Steroids. 2000. - Vol. 65, № 7. - P. 371 -378.

139. Fusek M., Vetvicka V. Dual role of cathepsin D: ligand and protease // Biomed. Papers. 2005. - Vol. 149, №1. - P. 43 - 50.

140. Genetic kininogen deficiency contributes to aortic aneurysm formation but not to atherosclerosis / E. Kaschina, M. Stoll, M. Sommerfeld et al. // Physiol. Genomics 2004. - Vol. 19. - P. 41- 49.

141. Godang K., Ueland Т., Bollerslev J. Decreased bone area, bone mineral content, formative markers, and increased bone resorptive markers in endogenous Cushing's syndrome // Eur. J. Endocrinol. 1999. -Vol. 141. - P. 126-131.

142. Goldring S.R. Inflammatory mediators as essential elements in bone remodeling. // Calcif. Tissue Int. 2003. - Vol. 73. - P. 97-100.

143. Goto Т., Yamaza Т., Tanaka T. Cathepsins in osteoclasts // J. Electron Microscopy. 2003. - Vol. 52, №6. - P. 551 - 558.

144. Gottesman M. M. Cathepsin L and cancer // Portland Press. Proc. 1993 -Vol. 6.-P. 247-251.

145. Hak A E., Pols H.A., van Hemert A. M. Progression of aortic calcification is associated with metacarpal bone loss during menopause: a population-based longitudinal study. // Arterioscler. Thromb. Vase. Biol. 2000. - Vol. 20. - P. 1926-1931.

146. Halleen J. Tartrate-resistant acid phosphotase 5b as a marker of bone resorption / J. Halleen // Clin. Lab. 2006. - Vol. 3. - P. 1 - 9.

147. Hamburg S., M. Piers D.A., van den Berg A. P. Bone mineral density in the long term after liver transplantation // Osteoporos. Int. Vol. 11, №7. - P. 600 -606.

148. Henriksen K., Sorensen M.G., Nielsen R.H. Degradation of the organic phase of bone by osteoclasts: a secondary role for lysosomal acidification // J. Bone Miner. Res. 2006. - Vol. 21. - P. 58. - 66.

149. Hock J.M., Centrella M., Canalis E. Insulin-like growth factor I (IGF-I) has independent effects on bone matrix formation and cell replication // Endocrinol. 1988. - Vol. 122. - P. 254 -260.

150. Holtrop M.E., Caldwell N.J. Light and electron microscopic structure of bone-forming cells. Osteoblast and Osteocyte. // Bone. -1990. Vol. 1. - P. 1-39.

151. Hou W-Sh., Li Zh., Butner F.H Clevage site specifity of cathepsin К toward cartilage proteoglycans and protease complex formation // Biol. Chem. -2003. Vol. 384. - P. 891 - 897.

152. H-ras, but not N-ras, induces an invasive phenotype in human breast epithelial cells: a role for MMP-2 in the H-ras induced invasive phenotype. / A. Moon, M.S. Kim, T.G. Kim et al. // Int. J. Cancer. 2000. - Vol. 85. -P.176 -181.

153. Identification of the membrane-type matrix metalloproteinase MT1-MMP in osteoclasts / T. Sato, M.C. Ovejero, P. Hou, et al. // J. Cell. Sci. 1997. - Vol. 110(Pt 5). - P. 589-596.

154. IL-1 mediates TNF-induced osteoclastogenesis. / S. Wei, H. Kitaura, P. Zhou et al. // J. Clin. Invest. 2005. - Vol. 115. - P. 282 - 290.

155. Increased bone formation by prevention of osteoblast apoptosis with PTH / R.L. Jilka, R.S. Weinstein, T. Bellido et al. // J. Clin. Invest. 1999. - Vol. 104. - P. 439—446.

156. Increased cortical bone mineral content but unchanged trabecular bone mineral density in adult female mice lacking estrogen receptor / S. Windahl, O. Vidal, G. Andersson et al. // J. Clin. Invest. 1999. - Vol. 104, №7. - P. 895-901.

157. Increased expression of mature cathepsin В in aging rat liver. / D. Keppler, R. Walter, C. Perez, F. Sierra // Cell Tissue Res. 2000. - Vol. 302 (2). - P. 181-188.

158. Inherited multicentric osteolysis with arthritis: a variant resembling Torg syndrome in a Saudi family./ A.A1 Aqeel, W.A1 Sewairi, B. Edress, et al. // Am. J. Med. Genet. 2000. - Vol. 93 (1). - P. 11 - 18.

159. Inhibition of osteoclast differentiation and bone resorption by cathepsin К antisense oligonucleotides / T. Ishikawa, M. Kamiyama, N. Tani-Ishii et al // Molecular Carcinogenesis . 2001. - Vol. 32(2). - P.84 -91.

160. Initiation of osteoclast bone resorption by interstitial collagenase / L.S. Holliday, H.G. Welgus, C.J. Fliszar et al. // J. Biol. Chem. 1997. - Vol. 272. -P. 22053-22058.

161. Interleukin (IL)-6 induction of osteoclast differentiation depends on IL-6 receptors expressed on osteoblastic cells but not on osteoclast progenitors. / N. Udagawa, N. Takahashi, T. Katagiri et al. // J. Exp. Med. 1995. Vol. 182 (5).-P. 1461-1468.

162. Ito A., Mukaiyama A., Itoh Y. Degradation of interleukin 1(3 by matrix metalloproteinases. // J. Biol. Chem. 1996. - Vol. 271(25). - P. 14657 -14660.

163. Jorgensen L., Engstad Т., Jacobsen B.K. Bone mineral density in acute stroke patients: low bone mineral density may predict first stroke in women. // Stroke. 2001. - Vol. 32. - P. 47-51.

164. Rnook D.L. The role of lysosomal enzymes in protein degradation in different types of rat liver cells. //Acta Biol. Med. Ger. 1977 - Vol. 36 (11-12).-P. 1747-1752.

165. Koh K.K. Effects of hormone replacement therapy on coagulation and fibrinolysis in postmenopausal women. // Int. J. Hematol. -2002. Vol. 76 (2). - P.44- 46.

166. Kornfeld D., Mellman I. The biogenesis of lysosomes // Annu. Rev. Cell Biol. 1989. - Vol. 5. - P. 483- 525.

167. Lecalle F., Kaleta J., Bromme D. Human and parasitic papaine-like cysteine proteases: their role in physiology and patology and resent developments inhibitor design // Chem. Rev. 2002. - Vol. 102. - P. 4459 - 4488.

168. Lee B.S. Interaction between vacuolar H+-ATPase and microfilaments during osteoclast activation / B. S. Lee, S. L. Gluck, L. S. Holliday // J. Biol. Chem. 1999. - Vol. 274 (41). - P. 29164 - 29171.

169. Lemini C., Jaimez R., Franco Y. Gender and inter-species influence on coagulation tests of rats and mice. // Thromb. Res. 2007. - Vol. 120(3). - P. 415-419.

170. Leung D.Y. Clinical and immunologic aspects of the hyperimmunoglobulin E syndrome. / D.Y. Leung, R.S. Geha // Hematol. Oncol. Clin. North. Am. -1988.-Vol. 2.-P. 81-100.

171. Li Z., Hou W.S., Escalante-Torres C.R. Collagenase activity of cathepsin К depends on complex formation with chondroitin uslfate // J. Biol. Chem. -2002. Vol. 277. - P. 28669 - 28676.

172. Liao E.Y., Luo X.H. Effects of 17P-estradiol on the expression of matrix metalloproteinase-1, -2 and tissue inhibitor of metalloproteinase-1 in human osteoblast-like cell cultures // Endocrine. 2001. - Vol. 15 (3). - P. 291 -295.

173. Limited cleavage of extracellular matrix protein BM-40 by matrix metalloproteinases increases its affinity for collagens. / T. Sasaki, W. Gohring, K. Mann et al. // J. Biol. Chem. 1997. - Vol. 272, №14. - P. 9237-9243.

174. Localization of cathepsins B, D, and L in the rat osteoclast by immuno-light and -electron microscopy / T. Goto, T. Kiyoshima, R. Moroi et al. // Histochemistry 1994.-Vol. 101.-P. 33-40.

175. Lorenzo J. Interactions between immune and bone cells: new insights with many remaining questions. // J. Clin. Invest. 2000. - Vol. 106. - P. 749 -752.

176. Lysosomal cysteine proteases in lung: role in protein processing and immunoregulation. / F. Buhling, N. Waldburg, A. Reisenauer et al. // Eur. Respir. J. 2004. - Vol. 23. - P. 620 - 628.

177. Manolagas S.C. Birth and death of bone cells: basic regulatority mechanisms and implications for the pathogenesis and treatment of osteoporosis // Endocr. Rev. 2000. - Vol. 21, №2. - P. 115 - 137.

178. Matrix metalloproteinase 2 (gelatinase A) regulates glomerular mesangial cell proliferation and differentiation. / J. Turck, A.S. Pollock, L.K. Lee et al. // J. Biol. Chem. 1996. - Vol. 271, №25. - P.l5074 - 15083.

179. Matrix metalloproteinase-12 (MMP-12) in osteoclasts: new lesson on the involvement of MMPs in bone resorption. / P. Hou, T. Troen, M.C. Ovejero, et al. // Bone. 2004. - Vol. 34. - P. 37 - 47.

180. Matrix metalloproteinases degrade insulin-like growth factor-binding protein-3 in dermal fibroblast cultures / J.L. Fowlkes, J J. Enghild, K. Suzuki, H. Nagase // J. Biol. Chem. 1994. - Vol. 269. - P. 25742 - 25746.

181. May L.G., Gay C.V. Multiple G-protein involment in parathyroid hormone regulation of acid production by osteoclasts // J. Cell. Biochem. 1997. - Vol. 64.-P. 161 - 170.

182. McLeod J.F. Osteoporosis, cytokines and glucocorticoids // Allegry Proc. -1993. Vol. 14 (5). P. 363 - 364.

183. McQueney M.S., Amegadzie B.Y., D'Alessio K. Autocatalytic activation of human cathepsin K. // J. Biol. Chem. 1997. - Vol. 272 (21). - P. 13955 -13960.

184. Mizushima N. Autophagy: process and function //Genes and development. -2007. Vol.21. - P. 2861-2873.

185. MMP-7 promotes prostate cancer-induced osteolysis via the solubilization of RANKL / C.C. Lynch, A. Hikosaka, H.B. Acuff et al. // Cancer Cell. 2005. -Vol. 7, №5.-P. 485-496.

186. Modulation of transforming growth factor-beta production in normal human osteoblast-like cells by 17beta-estradiol and parathyroid hormone / M., Oursler, C. Cortese, P. Keeting, et al. // Endocrinol. 1991. - Vol. 129. - P. 3313-3320.

187. Molecular cloning and expression of collagenase-3, a novel human matrix metalloproteinase produced by breast carcinomas. / J. M.Freije, I. Diez-Itza, M. Balbin, et al. // J. Biol. Chem. 1994. - Vol. 269 (24). - P.16766 - 16773.

188. Nakano A., Kanda Т., Abe H. Bone changes and mineral metabolism disorders in rats with experimental liver cirrhosis. // J. Gastroenterol. Hepatol. 1996.-Vol. 11 (12).-P. 1143-1154.

189. Natural and recombinant human IL-1 receptor antagonists block the effects of IL-1 on bone resorption and prostaglandin production / P. Seckinger, J. Kelin-Nulend, C. Alander et al. // J. Immunol. 1990. - Vol. 145. - P. 4181 -4184.

190. Nmp4/CIZ regulation of matrix metalloproteinase 13 response to parathyroid hormone in osteoblasts / R. Shah, M. Alvarez, D.R. Jones et al. // Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 2004. - Vol. 287. - P.289 - 296.

191. Osteoprotegerin reverses osteoporosis by inhibiting endosteal ostpeoclasts and revents vascular calcification by blocking a process resembling osteoclastogenesis / H. Min, S. Morony, I. Sarosi et al. // J. Exp. Med. 2000.- Vol. 192, № 4. P. 463 - 474.

192. Osteoprotegerin-deficient mice develop early onset osteoporosis and arterial calcification / N. Bucay, I. Sarosi, C. R. Dunstan, et al. // Genes Dev. 1998. -Vol. 12.-P. 1260- 1268.

193. Ovarian steroid treatment blocks a postmenopausal increase in blood monocyte interleukin 1 release. / R. Pacifici, L. Rifas, R. McCracken et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -1989. Vol. 86. - P. 2398 - 2402.

194. Parathyroid hormone inhibits the expression of membrane-type matrix metalloproteinase-1 (MT1-MMP) in osteoblast-like MG-63 cells / X.-H. Luo, E.Y. Liao, S. Xin, X.-P. Wu // J. bone miner, metab. 2004. - Vol. 22, № 1. -P. 19-25.

195. Parfitt A.M. Osteonatal and hemi-osteonatal remodeling: spatial and temporal framework for signal traffic in adult human bone // J. Cell. Biochem.- 1994. Vol. 55. - P. 273 - 286.

196. Pivotal role of cathepsin К in lung fibrosis. / F. Biihling, C. Rocken, F. Brasch et al.// Amer. J. Pathol. 2004. - 164(6). P. 2203 - 2216.

197. Potent and selective cathepsin L inhibitors did not inhibit human osteoclast resorption in vitro / I.E. James, R.W. Marquis, S.M. Blake et al. // Biochem. J.- 2001. Vol. 276 (15). - P. 11507 - 11511.

198. Progesterone regulates bone balance by antagonizing the inhibitory effects of estrogen on bone turnover / I.U. Schmidt, G.K. Wakley, R.T. Turner et al. // Calcif. Tiss. International 2000. - Vol. 67. P. 47 - 52.

199. Pro-inflamotory cytokines induce expression of mmatrix-metabolizing enzymes in human cervical smooth muscle cells / M. Watari, H. Watari, M.E. DiSanto et al. // Am. J. Pathol. 1999. - Vol. 154. - P. 1755 - 1762.

200. Proteolytic activity of human osteoclast cathepsin К / Bossard M. J., Tomaszek T.A., Thompson S.K., Amegadzie B.Y. // J. Biol. Chem. 2008. -Vol. 283 (21).-P. 12517- 12524.

201. Radiological findings in NAO syndrome. / L. Al-Otaibi, S.M. Al-Mayouf, M. Majeed et al. // Pediatr. Radiol. 2002 - Vol. 32(7).- P. 523- 528

202. Rapid activation of MAP kinase by estrogen in the bone cell line / H. Endoh, H. Saski, K. Maruyama // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1997. - Vol. 235.-P. 99- 102.

203. Regional bone loss after orthtopic liver transplantation in inbred rats: the role of hepatic denervation/ H.J. Kissler, R.G. Erben, R. Henning et al. // Calcif. Tiss. Int. 2002. - Vol. 71. - P. 193 - 202.

204. Regulation of matrix m etalloproteinase-9 and inhibition of tumor invasion by the membrane-anchored glycoprotein RECK. / Takahashi C, Sheng Z, Horan TP et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1998. Vol. 95(22). - P. 13221 - 13226.

205. Release of biological activities from quiescent fibronectin by a conformational change and limited proteolysis by matrix metalloproteinases. / F. Fukai, M. Ohtaki, N. Fujii et al. // Biochem. 1995. - Vol. 34. - P. 11453 -11459.

206. Role of a2-macroglobulin in fever and cytokine responses induced by lipopolysaccharide in mice / A.V. Gourine, V.N. Gourine, Y. Tesfaigzi, et al. // Am. J. Physiol. Regulatory Integrative Сотр. Physiol. 2002. - Vol. 283. -P. 218-226.

207. Romas E., Gillespie M.T., Martin T.J. Involvement of receptor activator of NFkappaB ligand and tumor necrosis factor-alpha in bone destruction in rheumatoid arthritis // Bone. 2002. - Vol. 30. - P. 340-346.

208. Roubenoff R. Catabolism of aging: is it an inflammatory process? //Curr. Opin. Clin. Nutr. Metab. Care. 2003. - Vol. 6. - P. 295-299.

209. Saneshige S., Mano H., Tezuka K. Retinoic acid directly stimulates osteoclastic bone resorption and gene expression of cathepsin K/OC-2 // Biochem. J. 1995. - Vol. 309 ( Pt 3).- P. 721 - 724.

210. Sasaguri Y., Mori Y. Degradation of interleukin 1 by matrix metalloproteinases //J. Biol. Chem. 1996. - Vol. 271. - P. 14657 - 14660.

211. Sato T. The migration of purified osteoclasts through collagen is inhibited by matrix metalloproteinase inhibitors / T. Sato, N. Taekker, J.-M. Dalaisse // J. Bone. Miner. Res. 1998. - Vol. 13, №1. -P. 59 - 65.

212. Serum tartrate-resistant acid phosphatase isoforms in rheumatoid arthritis / H.Yaziji, A.J. Janckila, S .C. Lear et al. // Clinica Chimica Acta. 2002. -Vol. 320 (1-2).-P. 49-58.

213. Significance of cathepsin В accumulation in synovial fluid of rheumatoid arthritis / Y. Hashimoto, H. Kadegawa, Y. Narita et al. // Biochem. Biophys. Comm. 2001. - Vol. 283, № 2. - P. 384 - 397.

214. Skoryna S .С. E ffect of oral supplementation w ith stable strontium // С an. Med. Assos. Journal. 1981. Vol. 125. - P. 703 - 712.

215. Sleyster E.C., Knook D.L. Relation between localization and function of rat liver Kupffer cells. //Lab. Invest. 1982. - Vol. 47, Issue 5. P. 484- 490.

216. Soluble cathepsin K: a novel marker for the prediction of nontraumatic fractures? / G. Holzer, H. Noske, T. Lang et al // J. Lab. Clin. Med. 2005 -Vol. 146(1)-P. 45-46.

217. Spatial organization of microfilaments and vitronectin receptor avp3 in osteoclasts / P.T. Lakkakorpi, M.H. Helfrich, M.A. Horton, H.K. Vaananen // J. Cell Scince. 1993. - Vol. 104. - P. 663 - 670.

218. Spatial organization of microfilaments and vitronectin receptor аурз in osteoclasts / P.T. Lakkakorpi, M.H. Helfrich, M.A. Horton, H.K. Vaananen // J. Cell Scince. 1993. - Vol. 104. - P. 663 - 670.

219. Strontium ranelate does not stimulate bone formation in ovariectomized rats. / R.K. Fuchs, M.R. Allen, K.W. Condon et al. // Osteoporos. Int. 2008. -Vol. 19.-P. 1331-1341.

220. Strontium ranelate reduces the risk of vertebral fracture in young postmenopausal women with severe osteoporosis / C. Roux, J. Fechtenbaum, S. Kolta et al. // Ann. Rheum. Dis. 2008.

221. URL http://ard.bmj.com/cgi/content/abstract/ard.2008.094516vl (Дата обращения 20.08.2008)

222. Strontium ranelate treatment of human primary osteoblasts promotes an osteocyte-like phenotype while eliciting an osteoprotegerin response. / GJ. Atkins, KJ. Welldon, P. Halbout, D.M. Findlay // Osteoporos. Int. 2009. -Vol. 20 (4).-P. 653-664.

223. Succassful detection of active osteoclasts in situ by systemic administration of an osteoclast-specific monoclonal antibody / T. Kukita, A. Kukita, L. Xu, T. Iijima // Calc. Tissue Int. 1998. - Vol. 64. - P. 148 - 153.

224. Tartrate-resistant acid phosphatase isoform 5b as serum marker for osteoclastic activity / Janckila A.J., Takahashi K., Sun S.Z. et al. // Clin. Chem. 2001. - Vol. 47. - P. 74 - 80.

225. Teitelbaum S.L. Osteoclasts, integrins, and osteoporosis. // J. Bone Miner. Metab. 2000. - Vol. 18. - P. 344-349.

226. The bone lining cell: its role in cleaning Howship's lacunae and initiating bone formation / V. Everts, J.M. Delaisse, W. Korper et al. // J. Bone Miner Res. 2002- Vol. 17. - P. 77 - 90.

227. The cell biology of osteoclast function / H.K. Vaananen, H. Zhao, M. Mulari, J.M. Halleen // J. Cell Sci. 2000. - Vol. 113. - P. 337 - 381.

228. The effect of strontium ranelate on the risk of vertebral fracture in women. / Meunier P.J. Roux C., Seeman E. et al. // N. Engl. J. Med. 2004. - Vol. 350. -P. 459-468.

229. Effect of parathyroid hormone on fractures and bone mineral density in postmenopausal women with osteoporosis / R.M. Neer, C.D. Arnaud, J.R. Zanchetta et al. // N. Engl. J. Med. 2001. - Vol. 344. - P. 1434 - 1441.

230. The membrane-anchored MMP inhibitor RECK is a key regulator of extracellular matrix integrity and angiogenesis. / J. Oh, R. Takahashi, S. Kondo et al. // Cell. 2001- Vol. 107. - P. 789 - 800.

231. The N-terminal domain of tissue inhibitor of metalloproteinases retains metalloproteinase inhibitory activity / G. Murphy, A. Houbrechts, M.I. Cockett et al. // Biochem. 1991. - Vol. 30. - P. 8097 - 8102.

232. The prevalence of vertebral fractures in mild ankylosing spondylitis and their relationship to bone mineral density. / D. Mitra, D.M. Elvins, D.J. Speden, A.J. Collins // Rheumatology. 2000. - Vol. 39. - P. 85 - 89.

233. Thyroid function of mouse cathepsins B, L and К / B. Fridrichs, C. Tepel, T. Reinhesckel et al. //J. Clin. Invest. 2003. - Vol. 111.- P.1733 - 1745.

234. TIMP-2 over-expression reduces invasion and angiogenesis and protects B16F10 melanoma cells from apoptosis / P. Valente, G. Fassina, A. Melchiori et al.// Int. J. Cancer. 1998. - Vol. 75. - P. 246 - 253.

235. Tissue inhibitor of matrix metalloproteinase-1 (TIMP-1) distribution in normal and pathological human bone / S. Bord, A. Homer, C.A. Beeton et al. // Bone. 1999. - Vol. 24. - P. 229 - 235.

236. Treatment of Osteoporosis with MMP Inhibitors / S. Williams, J. Barnes, A. Wakisaka et al. // Annals of the New York Academy of Sciences. 2006. -Vol. 878.-P. 191 -200.

237. Troen B. R. The regulation of cathepsin К gene expression // Ann. N. Y. Acad. Sci.-2006.-Vol. 1068.-P. 165- 172.

238. Tumor necrosis factor-a-associated lysomal permeabilisation is cathepsin В dependent / N.W. Werneburg, M.E. Guicciardy, S.F. Bronk et al. // Am. J. Gastrointest. Liver Physiol. 2002. - Vol. - 283. - P. 947 - 956.

239. Turk В., Turk V., Turk D. Structural and functional aspects of papain-like proteinases and their protein inhibitors // Biol. Chem. 1997. - Vol. 378. -P.141 -150.

240. Turner R.S., Evans G.L., Cavolina J.M. Programmed administration of PTGsincreases bone formation and reduces bone loss in hindlimb-unloaded ovariectomized rats. // Endocrinol. Metab. 1998. - Vol. 131 (10). - P. 4086 -4091.

241. Vaaraniemi J.M., Halleen J., Salo J.J. Intracellular machinery for matrix degradation in bone-resorbing osteoclasts // J. Bone. Miner. Res. 2004. -Vol. 19.-P. 1432-1440.

242. Van Berkel T.J.C., Kruijt J.K., Koster J.F. Identity and activities of lysosomal enzymes in parenchymal and non-parenchymal cells from rat liver. // Eur. J. Biochem. 1975. - Vol. 58. - P. 145 - 152.

243. Visse R., Nagase H. Matrix metalloproteinases and tissue inhibitors of metalloproteinases: structure, function, and biochemistry // Circ. Res. 2003. -Vol. 92.-P. 827-839.

244. Vitamin K2 (menatetrenone) for bone loss in patients with cirrhosis of the liver. S. Shiomi, S. Nishiguchi, S. Kubo et al. // Am. J. Gastroenterology. -2002. Vol. 97. - P. 978 - 998.

245. Walsh. N. C., Gravallese E. M. Bone loss in inflammatoiy arthritis: mechanisms and treatment strategies. // Curr. Opin. Rheumatol. 2004. - Vol. 16.-P. 419-427.

246. Wiederanders В., Oelke B. Accumulation of inactive, cathepsin D in old rats // Mech. Ageing Dev. 1982. - Vol. 24, №3. - P. 265 - 271.

247. Wiederanders В., Kaulmann G., Schilling K. Function of propeptide parts in cysteine proteases // Current protein and peptide Scince. 2003. - Vol. 4. - P. 309-326.

248. Yamaguchi M., Oishi H., Suketa Y. Zinc stimulation of bone protein synthesis in tissue culture // Biochem. Pharmacol. 1988. - Vol. 137. - P. 4075-4080.

249. Yamashita D., Dodds R.A. Cathepsin К and the design of inhibitors of cathepsin K. // Current Pharmaceutical Design 2000. - Vol. 6 (1). - P. 1 -24.

Информация о работе

Венедиктова, Анастасия Александровна
кандидата биологических наук
Новосибирск, 2009
ВАК 03.00.04

Диссертация

Роль протеаз различных классов в развитии остеопороза у крыс - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему Роль протеаз различных классов в развитии остеопороза у крыс ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Роль протеаз различных классов в развитии остеопороза у крыс"

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Венедиктова, Анастасия Александровна

Введение Диссертация по биологии, на тему "Роль протеаз различных классов в развитии остеопороза у крыс"

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Венедиктова, Анастасия Александровна

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Венедиктова, Анастасия Александровна, Новосибирск

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Роль протеаз различных классов в развитии остеопороза у крыс
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия