Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Противовирусная функция сывороточных и экзогенных нуклеаз

ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Противовирусная функция сывороточных и экзогенных нуклеаз"

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ СССР ВСЕСОЮЗНЫЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ГРИППА

На правах рукописи УДК 616.988:577.155:576.8.097.3

МАКСИМОВИЧ

Михаил Борисович

ПРОТИВОВИРУСНАЯ ФУНКЦИЯ СЫВОРОТОЧНЫХ И ЭКЗОГЕННЫХ НУКЛЕАЗ 03.00.06. — вирусология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

//К /¿у /".'? /-¿у &

М ОЗ. Ж

ЛЕНИНГРАД — 1988

iis.. л »ква

тдел циссортацийк

ОНЦАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ гуальность проблем». Решениями ХХУП съезда КПСС, а

также принятыми ЦК КПСС и Советом Министров СССР Основными направлениями развития охраны здоровья населения и перестройки здравоохранения СССР в 12 пятилетке и на период до 2000 года определено усиление профилактической направленности медицинской науки. Реализация этих указаний может быть осуществлена путем углубления познаний патогенеза и совершенствования средств и методов профилактики и лечения.

Вирусные заболевания продолжают оставаться ведущими в инфекционной патологии людей. Специфическая терапия, ограничивающаяся применением иммуноглобулинов, является, по-оущеотву, бессильной, а иногда переводит острую инфекцию в хроническую (О.Г.Аид-напаридзе,1968). Вакцивопрофилактккя относительно ряда инфекций, в том числе и гриппа, не оказывает выраженного защитного действия дане при ежегодной иммунизации ( J.P.Sparks, 1979; А.Б.Satin, 1979; T.SonogucM е.а., 1986). При контролировании напряденнос-ти искусственного иммунитета, основную роль в настоящее время придают антителам к поверхностным антигенам вирусов. Между тем важнейшими показателями пандемичности штаммов является не антигенная структура, а биологическая вирулентность и токсичность (А.А.Смородинцев и др.,1981), которые могут быть не связанными ■с поверхностными антигенами. Внсказывалооь предположение о том, что недостаточная эффективность вакцинации при некоторых ви- . русных инфекциях может быть обусловлена еще не установленными и неучитываемыми особенностями их патогенеза (П.Н.Косяков,1975; в.ИоггЪу, 1984), в котором видную роль могут играть ферментные системы (П,Н.Косяков,1974). Однако ни участие-ферментных систем организма в патогенезе большинства заболеваний, вызываемых ви~ русами, ни материальные субстраты их патогенности неизвестны.

В естественных защитных механизмах непммунного и-иммунного организма большую роль играют неспецифические факторы, среди которых редко называют ферментные системы, в частности'системы нуклеаз, функция которых может кал нигилировать генетические потенции вирусного генома, так и способность их реализации.

¿.Р.ЗауДЛвку (1961) и Н.М.Негг1оП (1961) независимо, друг от друга сформулировали гипотезу о противовирусной функции сывороточных нуклеаз, но до сих пор эта гипотеза не доказана,

Обнаружение ингибиции панкреатической рибонуклеазой (ШК-ааой) вируса гриппа ( .Х.ЬеС1егк,1957) положило начало систематическому изучению действия экзогенных нуклеаз на вирусы теплокровных, особенно интенсивно проводившееоя в нашей стране благодаря инициативе^ Р.И.Салганйкп. В литературе имеются экспериментальные и клинические, данные,. кйк положительно оценивающие щ противовирусное действие, особенно в комбинации со специфическими антителами, так и отрицающие его. Единого мнения по этому вопрооу нет и поныне.

Цель и задачи исследования. Целью работы является изучение эффективности изолированного и в кооперации оо специфическими иммуноглобулинами противовирусного действия эндогенных оывороточ-ных и экзогенных панкреатических нуклеаз, а также состояния активности этих ферментов в сыворотке крови при ДНК- и РНК-вируо-ных инфекциях.

Задачи исследования состояли в следующем.

1. Разработать методику искусственного стимулирования лекарственными веществами активности сывороточных нуклеаз.

2. а экспериментах изучить влияние повышения активности сывороточных нуклеаз, а также комбинированного действия этих ферментов и специфических иммуноглобулинов на резистентность к заражению ДНК- и РНК-геномными вирусами.

- -

3. Изучить участие сывороточных нуклеаз и их естественных, ингибиторов при взаимодействии иммунного и яеиммунного организма с ДНК- и РНК-геномными вирусами и сопоставить полученные данные с интерфероне- и антителогене'зом.

А. В экспериментах in vitro.и in vivo на моделях ДНК- и RtK-геномннх вирусов изучить эффективность изолированного и комбинированного противовирусного действия экзогенных панкреатических нуклеаз и специфических иммуноглобулинов, выяснить целесообразность и разработать рациональную тактику применения этих препаратов для лечения вирусных заболеваний.

Выполнение этих задач-*/ было осуществлено с применение« комплекса вирусологических, биологических, биофизических и биохимических методик.

Проведенные исследования позволили вынести на защиту сле-дуклцие основные положения!

- доказательства закономерного участия в патогенезе ДНК-« ТНК-вирусных заболеваний сывороточных нуклеаз, повышение активности которых в кооперации со специфическими антителами существенно увеличивает резистентность, что дает возможность отнести эти ферментные системы к неспецифическим противовирусным факторам организма, а учитывая данные литературы об участии ■нуклеаз в течении вирусных заболеваний у растений* рассматривать

Исследования выполняли в лабораториях; физиологии вирусов Одесского НИИ вирусологии и эпидемиологии им.И.И.Мечникова, вирусных инфекций Львовского НИИ эпидемиологии и микробиологии, отделе регуляции биосинтеза низкомолекулярных соединений Львовского отделения ин-та биохимии АН УССР. Автор приносит сердеч- ' тую благодарность за помощь в проведении исследований и соавторство; в публикациях сотрудникам этих институтов: М.С.Парфеновой, С.П.Лисовой, В.А.Тишечкиной, В.И.Картузовой, Ю.М.[Павловскому, М.Д.Луцику, А,И.Урин, М.М.Козловскому, З.Г.Кушниру, В.А.Лукъян-чику.

нуклеазную защитную реакцию организма, наряду о интерфероноге-незом, как филогенетически древнюю общебио-;огичеокую закономерность;

- доказательства способности вирусов гриппа А формировать ингибитор оывороточной РИКазы хозяина, иммунологически товдест-венный с вирусспецифическим антигеном, участвующий в патогенезе инфекции, подавляющий защитную нуклеазную реакцию организма путем комплексообразования о ферментом и рассматривающийся как один из факторов патогенности указанных вирусов, а также обоснование предположения о возможном наличии у других вирусов позвоночных подобных факторов патогенности, сходных по действию, но отличающихся антигешю;

- установление особенности патогенеза гриппозной инфекции, состоящей в подавлении активности свободной сывороточной РНКазы и механизма этого явления, а также факта отсутствия защиты против него в искуоотвенном иммунитете, индуцированном живой и убитой цельновирионной вакциной;

- доказательства усиления защитной эффективности искусственного противогриппозного иммунитета в эксперименте путем включения в вакцину антигена гриппозного ингибитора РНКазы;

- разработанный, клинически апробированный й рекомендованный, в том числе и рядом клиницистов, принцип этиопатогенетичео-кого лечения вирусных заболеваний путем комбинированного применения панкреатических нуклеаз и иммуноглобулинов;

- разработанные цитоморфологические методы ускоренной лабораторной диагностики аденовирусных заболеваний, титрования инфекционности аденовирусов и антиоывороток к ним.

Научная новизна работы. Показана неизвестная ранее принципиальная возможность искусственного стимулирования активности сывороточных нуклепз лекарственными веществами.

- Лпсрвыо в экспериментах доказано, что в патогенезе

да- и гак-вирусных заболеваний закономерно участвуют сывороточные нуклеазы, повышение активности которых в кооперации оо специфическими антителами существенно усиливает резистентность организма и это позволило отнести указанные ферменты к неспецифическим факторам противовирусной резистентности; а с учетом данных литературы об участии подобных ферментов в развитии вирусных заболеваний у растений - рассматривать нуклеазную реакцию организма, как филогенетически древнюю общебиологическую закономерность.

- Установлена неизвестная ранее одна из особенностей патогенеза гриппа, состоящая в подавлении активности защитной нук-леазной реакции и раскрыт механизм этого явления.

- Впервые выявлено, что иммунитет, индуцированный живыми и убитыми гриппозными вакцинами не создает невосприимчивости к подавлению защитной нуклеазной реакции при заражении вирусом.

• - Обнаружена неизвестная ранее способность вирусов гриппа А индуцировать формирование ингибитора сывороточных нуклеаз хозяина, иммунологически тождественного о вирусспецифическими антигенами и рассматривающегося как один из факторов патогенности. Указанный фактор получен в частично очищенном и концентрированном виде, определены механизм его действия, иымуногенные, сенсибилизирующие и другие свойства.

- Впервые показано, что добавление антигена гриппозного ингибитора нуклеаз хозяина к цельновирионной убитой гриппозной вакцине в эксперименте существенно повышает защитную эффективность индуцированного иммунитета. Однако препараты ингибитора, полученные примененными споообеми, анафилактогенны.

- Впеовые обоснован объективный цитоморфологический метод титрования инфекционности аденовирусов и ускоренной лабораторной диагностики аденовирусных заболеваний.

- Получены данные о противовирусном действии экзогенных панкреатических нуклеаз и о значительном потенцировании защитного эффекта при комбинированном действии нуклеаз и специфических иммуноглобулинов. В экспериментах обоснован принцип лечения вирусных заболеваний путем комбинированной аппликации нуклеаз и специфических иммуноглобулинов, а также разработана тактика введения нуклеаз.

Практическое значение работы. Рекомендован для практического здравоохранения разработанный метод ускоренной цитоморфологичес-кой диагностики аденовируоных заболеваний, позволяющий сократить ороки лабораторной диагностики до 2-3 суток при внесении в культуру клеток даже слабо инфекционного материала. Для использования в вирусологических лабораториях санэпидстанций и научно-исследовательских институтов рекомендован цитоморфологйческий метод титрования инфекционноети аденовируоов и антисывороток к ним, не уступающий по точности методу бляшек под агаровым покрытием, но более простой по технике исполнения и не требующий дефицитных высокоочищенных ингредиентов.

Для лечения вирусных пневмоний у детей раннего возраста рекомендован принцип метода комбинированной терапии путем аппликации нуклеаз и титрованного гамма-глобулина. Применение указанного лечения, согласно данным, утвержденной в ВАК клинико-экспе-риментальной кандидатской диссертации (Л.П.Черноброва,1901), позволило более чем в 4 раза сократить лихорадочный период, уменьшить продолжительность интоксикации нервной системы втрое, выявления физикальных изменений в легких - вдвое, в два раза уменьшить число осложнений и сократить продолжительность пребывания больных в стационаре.

Этот метод рекомендован и другими клиницистами (А.А.Андру-

щук,1980) и включен в руководство для педиатров и пульмонологов (0.Л.ПереладоЕа,1980). Соответствующие материалы используются при чтении лекций в Одесском и Казанском медицинских институтах. В соответствии о планом внедрения МЗ УССР, с целью популяризации разработанного принципа лечения, в г.Одессе проведен межобластной семинар для педиатров, благодаря чему метод применяется в лечебных учреждениях, что подтверждено актами о внедрении.

Разработка по ци том отологической диагностике аденовирусных заболеваний внедрена в практику работы ряда областных вирусологических лабораторий, о чем имеются соответствующие документы.

Апробация работа и публикации. Диссертация апробирована на заседаниях Ученых Советов Одесского НИИ вирусологии и эпидемиологии им. И.И.Мечникова 17.05.65 и Львовского ШИ эпидемиологии и микробиологии 22.08.85 г. Результаты исследований докладывались на ХУ1 научной сессии института полиомиелита и вирусных энцефалитов АМН СССР (Москва,1967), третьей республиканской конференции по проблеме "Научные основы вакциннооывороточного дела" (Харьков,1969), республиканской научно-практической конференции по .диагностике, профилактике и лечению гриппа (Одесса,1972), четвертом, пятом и шестом съездах Украинского микробиологического общества (Киев,1975; Днепропетровск,1980; Донецк,1984), заседаниях Одесского и Черновицкого филиалов общества эпидемиологов и .микробиологов (1975,1976), заседании Львовского филиала Всесоюзного общества микробиологов (1985), третьем Украинском биохимическом съезде (Донецк,1977), деоятом Украинском съезде микробиологов, эпидемиологов и паразитологов (Киев,1980), шестом мезду-народном симпозиуме социалистических стран по интерферону (Львсв, 1980), первой конференции вирусологов Казахстана (Алма-Ата,1982), седьмом съезде Всесоюзного микробиологического общества (Алма-Ата,1985).

Работа выполнена в ооответотвии о 5 НИР, утверждавшимися МЗ УССР в планы Одесского и Львовского НИИ.

По теме диссертации опубликовано 36 статей в центральных отечественных и других, в том чиоле меэдународных изданиях, а также двое, утвержденных МЗ УССР, методических рекомендаций "Использование цитоморфологического критерия для ускорения лабораторной диагностики аденовирусных заболеваний, а также с целью титрования аденовирусов и вяруснейгрализующих антител" и "Методические рекомендации по лечению вирусных пневмоний у детей".

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 306 страницах машинописи, соотоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, заключения и выводов. Она иллюстрирована 53 таблицами и .24 рисунками. Указатель литературы включает наименования 211 статей отечественных авторов и 429 иностранных.

Материал и методы исследования. Работа проведена с использованием различных ДНК- и РНК-геномных вирусов в экспериментах на культуре клеток, куриных эмбрионах, лабораторных животных и наблюдениях на людях. Использовались следующие вирусы, методы и материалы.

В и р у о ы . FIIK-геномные: вирусы гриппа, адаптированные к белым мшиам (А/Ленинград/32/49-ílONl или 1ШИ по новой классификации, А/Виктория/72-i:?N2 , A/Pr/8/32-ном ) и неадаптированные (А/Сингапур/1/57- К2Н2 , А/Гонконг/3/69-Н5Ы2 ), вакцинные штаммы (А/Гонконг/1/68-нзнг и А/Виктория/35/72/50- нзнг ); ви-руо фиксированного бешенства (штамм "Москва" 3249 и 3251 пассажей); вирус уличного бешенства (штамм "Мочалин"). ДОК-геномные: вируо герпеса простого (штамм Л2); вирус осповакцины (штамм Б—51)j вирус нейровакцины; аденовирусы 4,6,7 и 12 серотипов.

Клетки. Использовали перевиваемые культуры клеток Hela FL и L , внрнщипаемые в пенициллиновых флаконах на покровных

стейлах или без них, а также первично трипсинизированные клетки эмбриона кролика.

Животные. Для экспериментов использовали кроликов породы Шиншилла, весом в 1,5-2,0 кг, короткошерстных морских овинок, весом 350-400 г, беспородных белых мышей, весом 15-17 г, белых крыо, весом в 200-250 г, а также 9-11 дневные куриные эмбрионы.

Титрование вирусов. Адаптированные к мышам вирусы гриппа, фиксированного и уличного бешенства, а также герпеса простого титровали на белых мышах путей соответственно интраназального (под раушнаркозом), внутримышечного и интраце-ребрального заражения о обработкой результатов по Риду и Менчу или по Керберу, Неадаптированные к мышам вирусы гриппа, а также вирусы оопо- я нейровакцины титровали на куриных вибрионах по индукции соответственно гемагглютининов (ГА) или оспообразующих единиц.

Титрование аденовирусов. Для указанных вирусов разработан оригинальный цитоморфологичеокий метод. Исходной предпосылкой для него явились не включенные в диссертацию исследования, подтвердившие специфичность морфогенеза внутриядерных аденовируоных включений (М.Б.Макаимович,1965,1967,19и8). Теоретическим обоснованием послужили описанные в настоящей работе исследования. Они показали, что в окрашенных акрвдиновнм оранжевым клетках на покровных стеклах, зараженных десятикратными разведениями аденовируса типа 4, подсчитываемое о помощью люминесцентного микроскопа количество клеток о аденовирусными включениями (на 1000 из моноолоя) возрастает в динамика наблюдения и на 3 сутки отрох'о коррелирует (г = 0,996^0,004) с исходными разведениями вируса. Определение инфекционного титра в

®%0 осуществляли по методу Рида и Менча или Кербера. При низкой инфекционности, не учитываемой указанными методами, ее можно точно определить в инфекционных единицах (ИЕ), за которые принимаются клетки с аденовирусными включениями. Цитоморфологичес-кий метод испытан и оказался пригодным для определения нейтрализующего титра аденовирусных антисывороток.

Так как аденовирусные внутриядерные включения появляются (на 2-3 сутки) гораздо раньше, чем выраженный цитопатический эффект после заражения малой дозой вируса, указанный метод рекомендован для ускоренной лабораторной диагностики аденовирусных ваболеваний.

Титрование антител и интерфе-р о н а . Аденовирусные оыворотки титровали общепринятым опосо-бом на клетках Hela о учетом ЦПЭ и цитоморфологичес'ким методом. Титры антигемагглютшшнов (АГА) вирусов гриппа и осповакцини определяли по стандартной методике торможения гемагглютинации (РТГА). Перед исследованием сыворотки обрабатывали прогреванием и периодатом калия или риванолом. Титр кроличьего и мышиного он- . вороточного интерферона определяли на гомологичных клетках по предотвращению ЦПЭ в 50$ культур клеток, зараженных 100 1ВДг;0 вируса везикулярного стоматита (штамм "Индиана") через 24 часа после обработки титруемым материалом. Результаты учитывали через 48 ч.

Специфические серопрепараты. Антисыворотки к вирусу гриппа А/Ленинград готовили путем двукратной комбинированной иммунизации кроликов или внутрибрюшинной вакцинацией белых крыс формалинизировенинм вирусом. В РТГА кроличьи . антисыворотки имели титр: 1:640 - 1:1280, крысиные -1:2048. Использовали лошадиные антионворотки к аденовирусам и и 6 серотипов с титром 1:640 - 1:1260 к 10 ТЦ%0. приготовленные

Одесским предприятием по изготовлению бакпрепаратов; коммерческий антирабический гаша-глобулин Харьковского ИБС с титром 1:6000 - 1:16000 к 100 ЛД50. Применяли специально' оттитрованную серию коммерческого гамма-глобулина, содержавшую в I мл 300 нейтрализующих доз к 300 ЛД50 вируса герпеса простого при титровании путем интрацерабрального заражения.

Анафилактогенность изучали на морских свинках путем внутривенных разрешающих инъекций десятикратно, пяти - и двух о половиноюкратно увеличенной дозы белка через месяц после внутрикожной сенсибилизации 20 мкг белка изучаемого вещества. Безвредность определяли на беспородных белых мышах. .

Биохимические методы* Показатели активности слабощелочных (рН 7,5) и кислых (рН 5,0) свободных оыво-роточных РНКази и ДНКазц определяли по методикам, описанным B.C.Шалот (1964), Р.И.Татарской и др. (1966) с выражением в оптических единицах (ОЕ) в I мл. Показатели связанной и суммарной РНКазы рН 7,5 определяли по методике j.s.Eoth (1958) о выражением показателей связанной РНКази в ОЕ/мл или процентах относительно суммарного фермента. Методики определения показателей РЖазы после экспериментальной проверки были модифицирс ванн относительно объемов ингредиентов.

С целью изучения изменения активности оывороточных нуклеаз при экспериментальных вирусных инфекциях определяли соответствующие показатели до заражения и регулярно после заражения животных, индивидуально, не менее, чем у 20-30 особей на каадом этапе. Для контроля определяли те же показатели в такие же сроки у незараженних животных, взятых из одного стада с опытными. Полученные показатели из одноименных групп объединяли, обрабатывали методами вариационной статистики и учитывали в виде средних

величин.

Для определения таких же показателей у людей под наблюдением находились две группы учащихся в возрасте 17-18 лет (всего ЮЗ человека). Первой группе (57 человек) производили троекратную иитраназальную аппликацию коммерческой живой гриппозной вакцины из вируса гриппа А/Викторкя/35/72/50 НЗН2 с титром ТО7,4 1ЦЦ0/ /0,1 мл. Второй группе вводили плацебо (лиофилизированная неза-раженная аллан*оионвя жидкость о пептоном и моНомицином, как в вакцине). Соответствующие показатели определяли э индивидуальных сыворотках крови, взятой из пальца. Возможность кратковременных контактов между группами нельзя было исключить.

Определение ингибитора нуклеаз осуществляли путем введения исследуемого вещества в ревкцию фермент-суботрат в объеме, равном объему фермента. Реакции проводили со стацдартннйи навесками ферментов и субстратов. О наличии внгибиторных свойств судили по уменьшению активности фермента относительно контроля, в который исследуемое вещество не вводили. Результаты выражали в процентах ингибиции или в ОЕ/мл.

В этих реакциях использовали РНКаэу завода медицинских препаратов Ленинградского мясокомбината с активностью 7 ЕА по Кунит-цу в I иг и ДНКазу фирмы The British Drug Houses LTD активностью 25-30& кристаллического вещеотва, а также РНК из печени крупного рогатого скота с удельной экстинкцией 21-23 ОЕ/мл и ти-муоную ДНК о гиперхромным эффектом 23%, изготовленные СКТБ ЕАВ СО АН СССР.

При изучении in vitro или in vivo противовирусного действия нуклеаз готовили растворы ферментов на 0,01 М фосфатном буфере рН 7,5 (с добавлением 0,015 Me 2+ в опытах о ДНКазой) и вводили в эксперимент РНКаэу с конечной концентрат!ей на I мл куль-

- 13 -

туральной среди или I г массы животного - 2 ЕЛ по Кунитцу; ДНКазу - по 50 мкг.

Фракционную преципитацию сульфатом аммония осуществляли по модифицированному метолу j.s.Both(I958), предложенному для выделения, очистки и концентрации ингибитора ШКазы из печени крыс, Модификация состояла в изменении условий центрифугирования и введении дополнительных процессов диализа.

Белок определяли по Лоури, нейраминвдазу - по D.Aminoff (1961).

Биофизические методы, Седиментационные исследования осуществляли путем ультрацентрифугирования (ротор 3x35 центрифуги УАС-601 или РПУ-35 центрифуги УЩ1-65; 28000 -33000 об/мип; 6 часов) изучаемого материала в 15-60$ линейном градиенте сахарозы (по весу) на 0,01 М фосфатном буфере pü 7,5;

NaCl 0,01 М. Фракции собирали перистальтическим насосом со дна пробирки.

Обработку ультразвуком (УЗ) с помощью прибора УЗДН-1 проводили в открытой насадке при 44 кГц и 0,6 вт/см в течение 15 минут.

Облучение ультрафиолетовыми лучами (УФЛ) жидкого материала со слоем глубиною в 0,4 см осуществляли при помощи лампы БУФ-30 с расстояния 15 см, в течение 15 минут.

Спектрографию производили на спектрофотометре марки UV-wie (Carl Ceiss, Jena)в пределах 200-350 нм.

Основные положения работы и их обсуждение. В первой серии экспериментов изучали возможность искусственного стимулирования сывороточных нуклеаз для определения возможного противовирусного действия этих эндогенных ферментов. Известно, что парентеральное введение в организм чужеродных нуклеиновых кислот индуцирует повышение . активности сывороточных нуклеаз. Однако нуклеиновые кис-

лоты не могли быть использованы для указанной цели, так как имеется много сообщений об интерфероногене'зе и других механизмах неферментагивиого характера, оказывающих противовирусное действие после аппликации нуклеиновых кислот. В настоящей работе впервые показано, что троекратное, с интервалом & одни сутки, введение гвдрохлористого пилокарпина в дозе 10 мкг/мышь обусловливает, по крайней мере, в течение б оуток (срок наблюдения) повышение активности сывороточной ДНКазы I (но не РНКазы) на 60$. Введение секретина не оказывало стимулирующего действия на активность сывороточных нуклеаз. Установлено также, что однократная подкожная аппликация 0,4 мл 0,01 М гъ (ио^)г, не оказывая влияния на показатель суммарной РНКазы, на 50% повышает активность свободного фермента за очет освобождения из связанного состояния. В экспериментах показано, что соответствующая концентрация Рв2+ не оказывает прямого воздействия на вирус гриппа. .Эти результаты давали возможность приступить к изучению влияния повышения активности сывороточных, нуклеаз на резистентность к вирусным инфекциям.

Исследование проводили путем ежедневного определения ЛД50 иа различных группах белых мышей, которым через 30 Минут пооле инграцеребральиого заражения десятикратными разведениями вируса простого герпеса, производили стимулирование сывороточной ДНКазы I или вводили гамма-глобулин с высоким титром специфических антител или осуществляли обе манипулявии одновременно. Результаты этого эксперимента показали следующее.

Изолированное повышение активности сывороточной ДНКазы I оказывало достоверный защитный аффект на ранних этапах инфекции, но он был неполноценным, так как начиная с 10 суток после заражения отличия ЛДГ,0 в опытных и контрольной группах (без стимулирования фермента) становились нсдостосорными. Изолированное дейат-

вие специфического иммуноглобулина ни на одном из этапов не оказало достоверного защитного действия. При комбинировании искусственного повышения активности сывороточной ДНКазы и введения иммуноглобулина логарифмический показатель ЛД50 в опытной группе до конца наблюдения (14 оутки) был достоверно (Р<0,01) меньшим, чем в контроле, а антилогарифм разиицы меаду ними свидетельствовал о повышении резистентности животных к интрацеребральному заражению вирусом герпеса простого в S раз.

Титрование инфекционности вируса гриппа А/1енинград/32/49-н0Ш показало, что стимулирование активности сывороточной ГОКазы ионами Рв2+ достоверно (Р<0,01) повышает резистентность мышей к заражению в 50 раз.

В проведенных опытах трудно исключить прямое влияние на вирусы пилокарпина. Однако в литературе нет никаких данных о такой возможности. Вместе с тем повышение активности сывороточных нук-леаз этим препаратом документировано проведенными исследованиями, Изложенное позволяет рассматривать полученные результаты как доказательства неспевдфичаской противовирусной функции сывороточных нуклеаз, не одинаковой при различных вирусных инфекциях, но в кооперации со специфическими антителами оказывающее достоверную защиту и в тех случаях, когда изолированное действие антител не эффективно.

Изучение участия нуклеаз в патогенезе ДНК- и ИК-вирусных заболеваний показало следующее.

После заражения неиммунных кроликов вирусом осповакцины в сыворотке животных выявлялась активность интерферона о максимумом (4,3+1,0 iog2 )'на второй неделе и последующим онижением. Тавдэ на второй неделе, на-высоте формирования накожных пустул, отмечалось повышение активности сывороточной ДНКазы I, достоверно превышавшее как исходное значение, так и соответствующий показатель у

животных контрольной, незвраженной группы (9,6+0,8 ОЕ/мл против 6jlf0,8 и 3,8±1,0; Р<0,01), На повышенном уровне активность ДНКазы сохранялась в течение одной недели, а в процессе подсыхания пустул и отпадения корочек на 4 неделе - нормализовалась. После повторного заражения, на фоне иммунитета, индуцированного месяц назад первой аппликацией вируса, повышение активности сывороточной ДНКазы I (12,8+1,6 ОЕ/мл против 5,IfO,4 в контроле) отмечалось на первой неделе, происходило параллельно с нарастанием титра интерферона (4,3+0,6 log2 ) и сохранялось более продолжительный срок. На 4 неделе активность сывороточной ДНКазы I нормализовалась. Высокий, к моменту повторного заражения титр АГА (5,1±0,1

log2) продолжал увеличиваться вплоть до 4 недели. После повторного заражения формирование пустул было выражено значительно слабее или не происходило. Первичное и повторное заражение не обусловливало закономерных изменений активности кислой ДНКазы П.

У морских свинок неиммунных и иммунных в результате заражения вирусом оаповакшшы активность сывороточной ДНКазы I также повышалась соответственно до 20,6^2,8 и 21,7+0,8 ОЕ/мл против 6,7+1,2 и 13,7+2,4 перед первым и повторным заражением, достоверно превышая как исходное значение, так и показатель у незараженных животных (11,4+2,4 ОЕ/мл; 0,01). Так же, кок и у кроликов закономерных изменений в активности кислой ДНКазы выявить не удалось.

Совсем иная картина наблюдалась после заражения кроликов вирусом нейровакцяны, обусловливавшего гибель животных. При этом активность сывороточной ДНКазы I выражение падала, достигая минимальных значений на 5 сутки, перед гибелью животных (3,1±0,2 OS/мл против 6,0+0,3 в контроле и 6,1+0,8 перед заражением; Р<0,01).

Исследования на модели ДНК-геномных вирусов при заражении различных лабораторных животных показали, что при благоприятном течении йн]окнии активность сывороточной ДНКазы 1 возрастает, при

неблагоприятном - падает.

По аналогии с этими исследованиями можно было ожидать, что при инфекции РНК-геномных вирусов будут наблюдаться сходные изменения в активности сывороточной РШСазы рй 7,5. И действительно, при смертельной гриппозной инфекции в результате заражения большими дозами вируса А/Ленинград/32/49, уже на вторые сутки отмечалось достоверное падение активности свободной сывороточной РНКазы. На 5-6 сутки, перед гибелью животных, показатель активности этого фермента составлял всего около 40% от исходной величины и контроля (9,7+1,3 ОЕ/мл против соответственно 22,0+1,7 и 22,3^2,0; Р<0,01), Параллельно с этим отмечался выраженный, достоверный рост показателей суммарной и связанной РНКази (соответственно 55,0^1,9 и 44,7±3,1 ОЕ/мл против 43,0+2,4 и 20,8+ ±2,9 в контроле; Р<0,01). Следовательно падение активности свободной сывороточной РНКази происходило за счет связывания ингибитором, хотя в кровь направлялось повышенное количество фермента.

Результат этого опыта совпадал о данными, полученными при смертельных исходах инфекции вируса нейровакцины. Однако в экспериментах с субклинической гриппозной инфекцией выявилось, что изменения активности сывороточной РНКазн не соответствуют тем, которые происходят при благоприятно протекающих инфекциях вируса осповакцшш. У мышей, зараженных малой дозой (0,5 ДЦ^д) вируса гриппа А/Ленинград/32/49, от которой они не погибали, наблюдался не рост, а достоверное падение активности овободной сывороточной РНКазы рН 7,5 до 11,8+1,6 ОЕ/мл против 26,6+3,6 в контроле. Причем отмечалось также достоверное падение кислой ЛЖазы (19,7+ +4,7 ОЕ/мл против 65,6±9,8; Р<0,01) и ДНКазы I (56,8±9,0 против 115,7+12,7; Р<0,01). Заражение мышей неадаптированным к ним ■ вирусом А/Гонконг/1/68 также вызывало некоторое снижение активности свободной сывороточной РНКазы, хотя ее показатели не от-

- 18 -

личались достоверно от контроля.

У мышей, иммунизированных живой или убитой гриппозной вакциной, из которых пооледняя индуцировала титр АГА 1:320, последующее заражение гомологичным вирусом, невзирая на индуцирование интерфероногенеза (3,9^0,4 1ое2 ) и дальнейшее усиление антите-логенеза, вызвало достоверное падение активности свободной сывороточной РНКазы до 18,2+1,3 ОЕ/мл против 27,1+0,6 в контроле; Р<0,01) за счет значительного возрастания показателя связанного фермента (20,2^1,8 ОЕ/мл против 3,6+1,3 в контроле; Р<0,01), хотя показатель суммарного фермента возрос (37,4±1,2 ОЕ/мл против 29,8±1,1 в контроле; Р< 0,01).

У добровольцев после первой аппликации живого вакцинного вируса гриппа А/Виктория/35/72/50 произошло значительное, на падение активности свободной сывороточной РНКазы pH 7,5 (II,8+ ±1,4 ОЕ/мл против 47,3jrl,7 перед иммунизацией; Р<0,01) при одновременном троекратном возрастании показателя связанного фермента (32,6+1,4 против 9,6±2,1 перед иммунизацией; Р<0,01). После второй аппликации того же вируса, произведенной 2 недели спустя, уровень активности сывороточной РНКазы оставался достоверно более низким, чем перед первой вакцинацией. Еще через 2 недели, после третьей аппликации живого вакцинного вируса, отмечена вторая волна значительного падения активности свободной сывороточной РНКазы (16,3+1,5 ОЕ/мл против 47,3+1,7 перед иммунизацией; Р<0,01) при одновременном возрастании показателей связанной (46,Ь+1,7 ОЕ/мл против У,6+2,1) и суммарной РНКазы (71,5+1,9 ОЕ/мл против 53,8+3,6 перед иммунизацией). Между тем, достоверно возросший к моменту третьей аппликации титр АГА свидетельствовал об активно протекавшем иммуногенезе.

В контрольной группе добровольцев, исключить контакты которой с группой шмувизированных живой вакциной было невозможно,

на третьей неделе после начала наблюдения отмечена одна волна падения активности свободной сывороточной РНКазы, сопровождавшаяся последующим достоверным нарастанием титра АГА к антигенам нзыг о 2,4^0,3 log2 до 4,5iO,5 (Р<0,01). Это свидетельствовало о естественном заражении добровольцев вирусом гриппа, сходным о вакцинным.

Если состояние после первой аппликации вакцинного вируса можно рассматривать как субклиническую инфекцию в неиммунном организме, то в результате третьей аппликации живой вакцинный вирус был введен в иммунный организм. Следовательно искусственный иммунитет, индуцированный живой гриппозной вакциной у людей не обеспечил защити от подавления активности РНКазы после аппликации живого вируса.

Таким образом, результаты этих исследований свидетельствуют о защитной противовирусной функции сывороточных нуклеаз, особенно в кооперации со специфическими антителами и закономерное участие этих ферментов в патогенезе ДНК и РНК-вируоных заболеваний. Следовательно сывороточные нуклеазы являются одним из факторов неспецифической противогриппозной резистентности. В литературе имеются данные (H.IIurghleiu, 1970; Р.В.Мартынова и др., I97G; В.Г.Райфман и др.,1981,1985; K.Matsushita а.а., 1983) об участии эндогенных нуклеаз в развитии вирусных заболеваний растений. Учитывая изложенное выше, нуклеазную реакцию противовирусной защиты организма можно рассматривать, как филогенетически древнюю общебиологическую, закономерность,

В процессе гриппозной инфекции, даже субклгнической, в эксперименте и у людей происходит подавление активности свободной сывороточной РНКазы за счет связывания ингибитором и организм не в состоянии компенсировать дефицит ее активности, хотя в кровь направляется повышенное количество фермента. Эта впервые обнару-

- 20 -

женнал нами, неизвестная ранее особенность патогенеза гриппа, подтверждена и клиницистами (А.Н.Головченко и др.,1978; Т.М.Якименко и др.,1981). У белых мышей при гриппе подавляется также активность ДНКазы I и кислой РНКазы. Причем иммунизация живой вакциной людей и убитой - лабораторных животных не предотвращала этого явления при последующем заражении, что ослабляет защитную эффективность искусственного иммунитета.

В соответствии о полученными данными, на заражение вирусами организм реагирует прежде воего факторами неспецифической резистентности - возрастанием титра интерферона и повышением активности оывороточных нуклеаз и только после этого подъемом титра антител. По скорости воз! лкновения реакция сывороточных нуклеаз совпадает с динамикой титра интерферона. Однако подавление активности РНКазы при выраженном интерфероногенезе после заражения вирусом гриппа мышей, иммунизированных убитой вакциной, свидетельствует о самостоятельности этих двух факторов неспеци-фичеокой резистентности.

При всей природной целесообразности защитных механизмов трудно предположить, чтоды подавление нуклеазной реакции при гриппе было связано с процессами, контролируемыми организмом. Скорее можно думать, что это явление обусловлено действием вируса. Исходя из указанного были предприняты исследования с целью изучения возможного наличия ингибитора РНКазы в культурах вирусов гриппа А/Ленинград/32/49-НОШ и А/Виктория/72 - НЗК2.

Четкую биохимическую активность ингибитора панкреатической РНКазы, изолированную от инфекционного вируса, удалось обнаружить в вершинных фракциях сахарозного градиента после ультрацентрифугирования концентрированных на эритроцитах аллантоисяых культур обоих вирусов. В кентроле (аналогично обработанная аллантоис-ная жидкость незараженных эмбрионов) низкая активность ингибито-

ра РНКазы выявлялась только в придонных фракциях. Таким образом седиментационный метод позволил выявить ингибитор РНКазы в ал-лантоисных культурах вирусо.в гриппа А и отделить его от инфекционное™ и "куриного" ингибитора указанного фермента.

В дальнейшем, из аллантоисных культур тех же вирусов удалось получить ингибитор РНКазы и методом фракционной преципитации сульфатом аммония. Однако при этом методе ингибитор РНКазы из вирус-содержвщего материала не всегда удавалось отделить от "куриного", так как в ряде случаев таким же методом можно било получить ингибитор из незараженной аллантоисной жидкости.

Обойми методами получено свыше 70 серий препаратов ингибитора РНКазы. Установлено, что при взаимодействии со стандартной навеской панкреатической РНКазы ингибитор из вируссодержащего материала даже в концентрированном виде, подавлял ее активность не более, чем на 80%. С целью стандартизации такое подавление было условно принято за 10 единиц активности (ЕА). Определение в препаратах удельной активности (на 100 мкг белка) позволяло проводить последующие исследования в сопоставимых условиях. В зависимости от получения методами седиментации или преципитации препараты характеризовались концентрацией ингибитора соответственно в 138,4 раза или 55,1 раз, содержанием белка 101,0+16,4 мкг/мл и 81,0+ +7,1 мкг/мл, отсутствием инфекционности и нейраминидазной актив-* ности, небольшими припоями ГА и комплементешэывающего антигена.

Активность изучаемого ингибитора полностью инактивировалась в-результате хранения в растворе при + 4°С в течение 24-48 часов, прогревания при +50°С в течение 30 минут, обработки формальдегидом (0,2%) и этиловым эфиром. В лиофилизиропанном виде он сохранял активность в течение Года хранения при +4°С (срок наблюдения). Воздействие ультразвука и ультрафиолетовых лучей повышало его

- 22 -

активность. Ингибитор был.недиализуем. В активных препаратах присутствовал белок, определяемый по Лоури, при спектрофотоыетрии в пределах 200-350 нм преобладало поглощение при 280 нм. Актив- • ность ингибитора инактивировалась этиловым эфиром. Это свидетельствует о том, что для функции ингибитора необходимы белок и ли-пиды и не исключает его липопротеиновый состав.

Действие 0,2 М NaCl не оказывало влияния на подавление ингибитором активности панкреатической РНКазы in vitro но изменение ионной силы путем увеличения молярности HaCl до 0,3 М препятствовало подавляющему действию. Следовательно взаимодействие между ингибитором и ферментом имеет электростатическую природу, возможно сопровождающуюся гидрофобными связями.

При внутривенном введении мышам 100 ЕА яативного ингибитора уже через 2 часа активность РНКазы в их оыворотке снизилась относительно контроля в среднем на 50%, а у отдельных животных до нулевых значений. После обработки in vitrqrawix сывороток ионами свинца активность РНКазы значительно повышалась, В соответствии с современным уровнем знаний это свидетельствует о том, что изу-' чаемый ингибитор подавляет активность сывороточной ГНКазы за счет образования недеятельного комплекса, который, в присутствии ионов свинца распадается с освобождением ферментативно активной РНКазы.

При одновременном вводе в реагирующую смесь стандартного раствора РНКазы и 5 ЕА ингибитора конечный выход продуктов• гидролиза РНК (по Д Eggg) уменьшается сравнительно о контролем примерно на 40$, а логарифмическая фаза реакции сокращалась с 30 до 15 минут. Прединкубация ингибитора с РНК обусловливала более низкий уровень кинетической кривой реакции, чем прединкубация ингибитора с ферментом. Это, по-видимому, свидетельствует о том, что ' ингибитор образует комплекс как с ферментом, так и о субстратом.

- 23 -

Такой механизм описан (G.Mosigí976) для кодируемого фагом Т4 белка Альбертса - ингибитора хозяйских рестриктаз.

Возможное наличие антигенных свойств у ингибитора РНКазы из культуры вируса гриппа А/Ленинград/32/49 определяли путем изучения пулов сывороток трех групп крыс. Первый пул - нормальная крысиная сыворотка; второй - сыворотка крыс, иммунизированных формалянизировэнным препаратом изучаемого ингибитора из культуры вируса гриппа А/Леялнград/32/49, содержащим примесь ГА; третий -сыворотка крыс, гипериммунизированных цельновирионной гомологичной формолвакциной. В шести повторных исследованиях установлено следующее. Обработка препаратов нативного ингибитора нормальной крысиной сывороткой нё оказывала влияния in vitro на биохимическую активность взятых в опыт 8 ЕА ингибитора. Антиингибиторная сыворотка о титром АГА 1:512 полностью нейтрализовала такую же активность в разведении не менее, чем 1:100 (выше не разводили). Параллельное исследование гипериммунной антивирусной сыворотки (титр АГА 1:2048) выявило, что в разведении 1:10 она частично нейтрализовала ингибитор, не оказывая никакого влияния в разведении 1:100.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что изучаемый ингибитор из культуры вируса гриппа обладает антигениостью. В антииигибиторной сыворотке индуцированная способность нейтрализовать биохимическую активность ингибитора проявлялась в разведении не менее, чем 1:100 и составляла 1/5 часть от титра АГА (1:512). В антивирусной - такая способность проявлялась в разведении не выше, чем 1:10 и составляла всего 1/200 часть от титра АГА (1:2048). Это свидетельствует об отсутствии ойдих антигенов у ингибитора и гемагглютиняна. Низкий титр антииигибиторной способности в сыворотке к цельным вирионям объясняет причину отсутствия защиты от подавления РНК-азы -при заражении на фоне искус-

ствеиного иммунитета, показатели напряженности которого учитываются только по титру АГА,

Изучаемый ингибитор мог иметь вирусное происхождение или куриное, так как все исследования производились о аллантоиоными культурами вирусов. Кроме того он мог быть продуктом хозяина, в качестве реакции на инфекцию. В первом случае он должен иметь вирусный антиген, во втором - куриный, в третьем - антиген хозяина, в условиях проведенных экспериментов - мышиный.

Опыты показали, что заражение мышей вирусом А/Л.ецикград/32/49 на фоне иммунизации антигеном ингибитора из культуры этого вируса обусловливало на подавление, а достоверное повышение активности свободной сывороточной РНКазы (до 21,6+2,3 ОЕ/мл против 12,4± ¿0,7 перед заражением; Р<0,01), Причем удельный вес связанного фермента значительно снизился и составлял <16,2^6,8$ от суммарной РНКазы против 70,0^5,8$ перед заражением. Следовательно иммунизация указанным материалом предотвратила связывание свободной РНКазы ингибитором. :

У животных, иммунизированных аналогично приготовленным препаратом из незараженной аллантоисной жидкости (кури::ый белок) заражение тем же вирусом вызвало подавление активности сывороточной РНКазы до 5,4+1,3 ОЕ/мл против 15,0+2,7 перед.заражением, а удельный вес связанного фермента возрос до 87,0-^8,7$ против 57,5+6,3 перед заражением. При подавлении активности сывороточной РНКазы после заражения контрольных неиммунизированных животных и отсутствии изменений активности фермента у параллельно исследованиях незаряженных животных (вторая контрольная группа), полученные данные не могут являться результатом случайности.

Таким образом, проведенные эксперименты показали, что ингибитор из вируссодержащего материала индуцирует, а из незараженной аллантоисной жидкости не индуцирует невосприимчивость у мышей к

подавлению сывороточной РНКазы после заражения вирусом гриппа. Это позволяет отвергать куриное происхождение антигена изучаемого ингибитора, и свидетельствует о его иммунологическом тождестве с вирусспецифическим антигеном, ответственным за подавление активности РНКазы. Маловероятно предположение о том, что невосприимчивость у животных могла возникнуть вследствие гипотетической общности антигенов изучаемого и хозяйского (мышиного) ингибиторов. В этом случае иммунизация мышей идентичным антигеном не должна индуцировать защитные иммунные реакции против него. Поэтому в дальнейшем изучаемый ингибитор будет именоваться гриппозным.

Многочисленность антигенной иерархии вирусов гриппа А обусловливала актуальность изучения вопроса об иммунологических отношениях между гриппозными ингибиторами нуклеаз хозяина, полученными из культур вирусов различной антигенной структуры. Выяснение этого вопроса было основано на определении защитного эффекта относительно сывороточной РНКазы, индуцированного антигенами ингибиторов нуклеаз вирусов А/Ленинград/32/49-1ЮН1 и А/Виктория/72-113112 при перекрестном заражении этими вирусами. Контролями служили группы неиммунизированных мышей, зараженных указанными вирусами и незаряженных.

Проведенные эксперимента показали, что иммунизация мышей антигеном ингибитора нуклеаз вирусов А/Ленингрпд/32/49 индуцировала одинаково полноиен'-;»! защитный эффект против пошячения активности РНКазы после заражения как гомологичным, так и гетероло-гичпым вирусами. В обоих случаях на всех этапах 5 суточного наблюдения активность свободной сывороточной гаКаэн нарастала, а показатели связанного фермента снижались. Иммунизация животных антигеном ингибитора РИКаз^ вируса А/Виктория/72-н*®2 также обеспечивала полноценную защиту относительно действия на сывороточную РНКазу гомологичного вируса. После,заражен ил гетерологичннм пя~ .

- 26 -

русом показатель связанной РНКазы на всех этапах наблюдения хотя несколько повысился, но достоверно не отличался от исходного значения. Следовательно степень связывания сывороточной РНК-азы была значительно уменьшена. На 5 сутки активность свободной сывороточной ШКазы несколько превышала исходное значение, хотя на 2 сутки отмечалось кратковременное снижение этого показателя. Подавление активности свободной сывороточной РНКазы после заражения контрольных неиммунизированных мышей и отсутствие изменений ферментативной активности у контрольных незараженных животных - исключает случайнооть полученных результатов.

Следовательно между ингибиторами РНКазы отдаленных в антигенном отношении вирусов гриппа А -нош и выявлена выраженная иммунологическая общность, хотя, по-видимому, имеются и незначительнее отличия.

Полученные данные свидетельствуют о том, что иммунизация гриппозным ингибитором нуклеаз опоообствует мобилизации нуклеаэ-ной реакции организма при гриппозной инфекции, чего не происходит после иммунизации живыми и убитыми гриппозными вакцинами. Кроме того установлено, что при комбинированном действии сывороточных нуклеаз и специфических антител происходит значительное уоиленив противовирусного эффекта. Исходя из этого можно думать, что добавление антигена гриппозного ингибитора нуклеаз к гриппозной вакцине может усиливать защитную эффективность индуцированного иммунитета. С целью изучения такой возможности в экспериментах была сопоставлена защитная эффективность искусственного иммунитета, индуцированного только убитой вакциной из вируса А/Денин-град/32/49 и комбинацией этой вакцины о антигеном гриппозного" ингибитора нуклеаз, приготовленного из культуры того же вируса. Исследование проводили путем сопоставления выживаемости после заражения единой дозой вируса достаточно больших групп иммунизи-

рованных и неиммунных животных (по 60 мышей), а также сравнением результатов определения ЛД^0 на аналогичных группах. Определяли эффективность при внутривенном и подложном введении вакцины, при заражении вирусом через одну и две недели после иммунизации.

Проведенные исследования показали следующее. В результате комбинированной иммунизации как при внутривенной, так и подкожной аппликации вакцины, титр АГА не отличался от индуцированного только убитой вакциной. При обоих способах введения комбинированная вакцина обусловливала достоверно больную выживаемость животных, чем только, убитая вакцина. Так, в результате заражения через неделю после внутривенной иммунизации (инфицирующая доза 2500 ДД50) в группе вакцинированных комбинированно выжило 35,0+ ±6,1$. животных (индекс защиты 31,5%), среди иммунизированных только убитой вакциной - 15,0±4,5$ (Р<0,01; индекс защиты 9,09$), а в контроле - 5,0+2,5$; при заражении через 2 недели после подкожной иммунизации (доза заражения 250-300 ЛД^д) выжило соответственно 96,712,5; 78,6+2,3 и 30,0+5,9$ (Р относительно контроля для обеих групп <0,01; индекс защиты соответственно 95,3$ и 69¡4$). В соответствии о антилогарифмом разности логарифмических показателзй ЛД50, определенных на указанных группах мышей, комбинированная вакцинация повышала резистентность животных в тысячи раз (3162 раза), а только убитая вакцина - не более, чем в 100 (77 раз).

Полученное в экспериментах усиление защитной эффективности искусственного противогриппозного иммунитета в результате применения препаратов гриппозного ингибитора РНКазы отавило вопрос об их практическом использовании. Однако специально проведенные исследования показали, что'~все изученные серии препаратов оказались внсокоанафилактогенными и обусловливали смертельные анафилак-

тические шоки у морских овинок. Причем, анафилактогенность, по-видимому, связана с вирусным белком, так как разрешающая инъекция неразведанной аллантоиской жидкости незараженных эмбрионов животным, сенсибилизированным препаратом ингибитора, не вызвала анафилактического шока.

Таким образом, препараты гриппозного ингибитора нуклеаз, приготовленные примененными методами, оказались непригодными для практического использования. Оцнако полученные данные раскрывают неиспользуемый резерв совершенствования гриппозных вакцин путем включения в их состав антигена описанного ингибитора, освобожденного от енафилактогена.

Выявленные стимуляторы активности сывороточных нуклеаз обладают нежелательным побочным действием и их нельзя рекомендовать для лечения вирусных заболеваний у людей. Вместе с тем экзогенные панкреатические нуклеазы лишены этой особенности. Поэтому дальнейшее изучение противовирусной активности нуклеаз с целью выяснения целесообразности применения их на практике проведено с использованием именно таких ферментов;

Эксперименты с аденовирусами различных сэротипов, проведенные путем подсчета цитоморфологическиы методом клеток с аденовирусными включениями (свыше 50 наблюдений) показали, что на всех промежуточных этапах 144 часового наблюдения ив конечном результате, при культивировании в присутствии ДНКазы количество пораженных клеток достоверно (Р<0,01) сокращалось на 50$ сравнительно о контролем, а в присутствии ДЙКазц и специфических антител -на 75-80$, Культивирование в среде с РИКазой не оказывало влияния на накопление аденовирусов.

Сходные данные получены при определении накопления ГА в условиях культивирования вируса гриппа А/Сингапур/1/57- нгиг в куриных эмбрионах с введенной в аллантоисную полость РИКазой. При

этом ГА выявлялись в аллантоисной полости на 6-12 часов позжа, чем в контроле, а титр их был на 1,5-1,0 iog2 ниже. ДНКаза не оказывала влияния на этот процесс.

В результате титрования вируса гриппа А/Ленингрвд/32/49 на различных группах мышей, одной из которых через 30 минут после заражения вводили только специфическую антисыворотку с титром АГА 1:640, второй - начинали трехдневный куро панкреатической РНКазой (на I г веса 8 ЕА по Кунитцу за 4 инъекции в сутки), третьей - оба препарата комбинированно, оказалось следующее. По антилогарифму отличий показателей ДЦ^д в опытных и контрольных группах аппликация только РНКазы повысила резистентность в 18,6 раз (Р(0,05), только антисыворотки - в 114,8 раз (Р<;0,05), а комбинированное введение указанных препаратов - в 239,9 раз (Р<0,01), Анализ полученных результатов дисперсионным методом по двухфокторяому комплексу выявил четкий потенцирующий эффект при комбинированном действии антител и нуклеаз.

Результаты, полученные на модели только одной гриппозной инфекции не могли быть перенесены на другие вируоння заболевания. Поэтому новая серия исследований была проведена на модели инфекции вирусов фиксированного и уличного бешенства. Условия изучения эффективности применяемых средств на моделях указанных инфекций являются гораздо более жесткими, чем на модели гриппа. В этих экспериментах отрабатывав чоь также тактика аппликации ИКазы,

Опыты на модели инфекции*у мышей вируса фиксированного бешенства (с учетом поправок на естественную резистентность) показали следующее. Введение через 30 минут после заражения (5 Д1%д) только антирабического гамма-глобулина (в дозе, адекватной для человека) предотвратило гибель 18,5+3,7$ животных (индекс защиты 20,0$). Комбинированная аппликация РНКазы (tm I г массы 8 ЕА по Кунитцу за 4 инъекции в оутки) и однократна антирабического гамма-глобу-

л и. на обусловила оптиыальний эффект при введении фермента в течение 3 суток. В этих условиях била предотвращена гибель b5,5¿9,0# (индекс защиты 60,1$) животных, что достоверно (Р^0,01) втрое превышает эффективность введения только гамма-глобулина. Продление курса нуклеазы до 4 суток увеличивало выживаемость животных несущественно, а сокращение - значительно уменьшало эффективность, Парентеральной введение в течение 3 суток одной только РНКазы обусловило выживание несколько большего, но статистически несущественного количества животных, чем в контроле. Титрование на фоне однократной аппликации иммуноглобулина дозы РНКазы и периодичвости ее введения в течение 3 суток показало, что при условии введения через каждые С часов первоначально избранную суточную дозу в 8 ЗА по Кунитцу на I г массы можно сократить в 4 раза без изменения эффективности. При увеличении продолжительности интервалов между введениями фермента эффективность снижалась, а при условии введения суточной дозы с интервалами в 24 часа - не отличалась достоверно от действенности только гамма-глобулина.

Проверка объективности разработанной тактики комбинированного введения фермента и иммуноглобулина была осуществлена при заражении мышей вирусом уличного бешенства в высокой дозе (100 Д%0). В этом эксперименте в контроле погибли все животные, после введения только гамма-глобулина выжило 6,6$ (индекс защиты 6,5$ - препарат не эффективен), а после комбинированного введения гамма-глобулина и РНК-азы выжило 56,6$ мышей (индеко защиты 36,6$). . -

Таким образом вышеизложенные исследования, проведенные in vitro и in vivo свидетельствуют о наличии противовирусной активности у экзогенных панкреатических и эндогенных сиво-

роточннх нуклеаз. Изолированное действие одних только нуклеаз не.при всех инфекциях одинаково эффективно. По-видимому, это свидетельствует о неодинаковой роли нуклеаз в патогенезе различных вирусных заболеваний. Однако при веек испытанных инфокциях в случае комбинированного действия нуклеаз и специфических иммуноглобулинов отмечалась выраженная эффективность, проявлявшаяся в увеличении выживаемости животных, даже в тех случаях, когда каждый из этих препаратов сам по себе оказывался бессильным.

Вншеизложенныв данные являлись экспериментальным обоснованием принципа этиопатогенетической терапии вирусных заболеваний. Клиническая апробация этого принципа, проведенная в клинике педиатрии Одесского мединститута при лечении пневмоний вирусной этиологии у детей раннего возраста, показала его высокую эффективность, описанную в разделе "Практическое значение работа".

Суммируя наиболее существенные результаты проведенных исследований можно отметить следующее.

- Получены доказательства противовирусной функции енворо-точных нуклеаз,. являющихся одним из участников патогенеза вирусных заболеваний у лабораторных животных и людей, что лает возможность отнести эти эндогенные ферментные системы к неопецифи-ческим факторам противовирусной резистентности и рассматривать их функции, как филогенетически дроянюю общебиологлческую закономерность.

- Установлена неизвестная ранее особенность патогенеза гриппозной инфекции, состоящая в подавлении активности свободной сывороточной ШКаэи, рпскрнт механизм этого явления и показано, что иммунизация живой и убитой целыювяриенной гриппозной вакциной не предотвращает его.

- Вперяне чкяш/енп способности вирусов гриппа А штудировать

формирование ингибитора сывороточных нуклеаз хозяина, имыуноло-гнчеоки тождественного с вирусспецифическим антигеном, подавляющего защитную нуклеазную реакцию организма путем комплексо- • образования о ферментом и рассматривающегося, как один из факторов патогенности вирусов гриппа.

- Раскрыт неиспользуемый в настоящее время резерв повышения защитной эффективности искусственного противогриппозногоь иммунитета путем включения в состав вакцины антигена гриппозного ингибитора нуклеаз после его освобождения от анафилактогенности.

- Обоснован в экспериментах принцип и тактика комбинированного применения экзогенных панкреатических нуклеаз и специфических иммуноглобулинов для этиопатогенетической терапии вирусных инфекций, оказавшийся полезным практически, что подтверждено успешным применением при лечении вирусных пневмоний у детей раннего возраста.

Для дальнейшего изучения проведенные исследования ставят вопрос об очиотке от анафилактогена гриппозного ингибитора нуклеаз, о его принадлежности к структурным или неструктурным белкам вириона или вирусмодафицированным белкам хозяина, о способ,-ности формировать ингибиторы нуклеаз другими вирусами теплокровных.

выводи

I. Доказано закономерное участие в патогенезе ДНК- и РНК-вирусных заболеваний сывороточных нуклеаз, повышение активйооти которых в кооперации со специфическими антителами существенно повышает резистентность к заражению и рассматривается, как общебиологическая, филогенетически древняя закономерность. Выявлены коррелягия и отличие в изменениях активности нуклеаз и интерферона при вирусных инфекциях, свидетельствующие о самостоятельное- • ти этих факторов естественной неспецифичеокой резистентнооти.

- 33 -

2. Установлена неизвестная ранее особенность патогенеза гриппа, состоящая в подавлении активности свободной сывороточной слабощелочной РНКазы, невзирая На повышенное направление ее в кровь, и раскрыт механизм этого явления, заключающийся в образовании недеятельного комплекса фермент-ингибитор, диссоциирующего в присутствии ионов рв2+ с высвобождением биохимически активного фермента.

3. Отделен от инфекциокиости, частично очищен и концентрирован ингибитор панкреатической и онвороточной РНКазы хозяина из культур вирусов гриппа А/Ленингррд/32/',9- ПОН1 и А/Виктория/ "2- H3H2J установлено, что механизм деЁогвия ингибитора состоит в образовании, за счёт электростатических сил недеятельного фермент-ингибиторного комплекса.

4. Иммунологическая активность ингибитора доказана обнаружением способности обусловливать при иммунизации образование антисывороток, нейтрализующих In vitro его биохимическую функцию, а иммунологическая идентичность о вирусспецифическим антигеном - вмявлением невосприимчивости к подавлению сывороточной Р1Жазы,при заражении вирусом гриппа животных, иммунизированных указанным антигеном. Установлены сенсибилизирующие свойства полученных препаратов ингибитора, иммунологические связи и отличия ингибиторов нуклеаз вирусов гриппа А отдаленных антигенных групп.

5. Биологическая фунгшля описываемого гриппозного ингибитора нуклеаз состоит в подавлении неспецифнческой защитной нуклеазной реакции организма, что позволяет рассматривать его, как один из факторов патогенности вирусов гриппа А.

6. В экспериментах v. наблюдениях на людях показано, что иммунизация живой и убитой цельновирионной вакциной против

гриппа не предотвращает подавления защитной нуклеаэной реакции при последующем заражении и это рассматривается как определенный недостаток индуцированного иммунитета.

7. Иммунизация убитой гриппозной вакциной с добавлением антигена гриппозного ингибитора нуклеаз существенно усиливает в эксперименте защитную эффективность искусственного иммунитета. Включение в состав вакцины антигева описанного ингибитора нуклеаз, освобожденного от анафилактогена, может быть перспективным при совершенствовании гриппозных вакцин.

8. В экспершецтах о использованием ДНК- й РНК-геномных вирусов показано противовирусное действие экзогенных панкреатических нуклеаз, в комбинации со специфическими иммуноглобулинами достоверно усиливающее лечебно-профилактический эффект и в тех случаях, когда изолированное применение этих препаратов не аффективно.

9. Разработан принцип рациональной тактики комбинированного применения РНКазы и специфических иммуноглобулинов о целью этио-натогенетичеокой терапии вирусных -инфекций, эффективность которого подтверждена на практике при лечении острых респираторных заболеваний и пневмоний вирусной этиологии у детей раннего возраста.

Практические рекомендации. Проведенные исследования позволяют рекомендовать широкое использование следующих приемов и • методов.

Применение в комплексной этиопатогенетической терапии вирусных заболеваний разработанного принципа комбинированного введения специфических иммуноглобулинов и панкреатических нуклеаз. Тактика аппликации указанных ингредиентов состоит в 1-2 кратной '

инъекции иммуноглобулина о интервалом в 3-4 суток, а также введения принятых (М.Д.Мошковский,1985) доз ферментов (РНКазы или ДНКазы соответственно при РНК- или ДНК-вирусных заболеваниях) в течение не менее 3-4 суток о аппликацией суточной дозы за 6 раз о интервалами в 4 часа. Более подробное изложение находится в изданных "Методических рекомендациях по лечению вирусных пневмоний у детей" (Одесса,1973).

Использование цитоморфологического метода титрования адеяо-вирусов, соответствующих антисывороток и ускоренной диагностики аденовирусных заболеваний. Принцип этого метода при титровании инфекционности аденовирусов состоит в подсчете при микроскопи-ровании клеток со специфическими внутриядерными включениями (на 1000 из монослоя) в окрашенных гематоксилин-эозином или акридиновым оранжевым препаратах клеточных культур, зараженных 10 кратными разведениями титруемого вируса с последующей обработкой по Риду и Меичу иж Керберу. При титровании аятисывороток клетки заражаются вирусом, предварительно нейтрализованным серийными разведениями испытуемой сыворотки.

■ Для ускоренной диагностики аденовирусных заболеваний клетки заражаются материалом от больного.

Учет результатов.во всех случаях осуществляется на 2-4 сутки. Детально методы описаны в 'Методическом письме по использованию цитоморфологического критерия для ускоренной диагностики аденовирусных заболеваний, а также с целью титрования аденовирусов и вируонейтрализущих антител" (Одесса,1968).

- 36 -

Материали диссертации опубликованы р следующих работав

1. Использование цитоморфологического критерия для титрования противоаденовирусных сывороток. -В кн.:Вопросы производства вакцин и сывороток. Харьков,1968,т.П, с.17-19 (М.Б.Максимович, М.С.Парфенова).

2. Использование количественного учета цитоморфологических изменений для характеристики инфекционного процесса, вызываемого аденовирусами в культуре ткани. Сообщение I. Изучение динамики инфекции аденовируса типа 4 в культуре амниотических клеток. -Вопр.вирусол. ,1968,4,0,415-421 (М.Б.Максимович,' М.С.Парфенова).

3. Использование количественного учета цитоморфологических изменений для характеристики инфекционного процесса, вызываемого аденовирусами в культуре ткани. Сообщение П. Объективный метод учета титров инфекционных свойств аденовирусов а нейтрализующих антител. -Воир. вирусол. ,1.968,6, 0.694-699 (М.Б.Максимович, М.С.Парфенова),

4. К механизму ингибирую.цего действия ДНКазы на аденошру-. cu. -В кн.¡Общая вирусология, №8 (18), М.,I968,c.II8-I20 (и.Б.Мак-оимович, С.П.Лисовая, Л.М.Трубина).

5. Методическое письмо по использованию цитоморфологического критерия для ускорения диагностики аденовирусных заболеваний, а также с целью титрования аденовирусов и вируснейтрализую-щих антител. -Одесса,1968,20с. (М.Б.Мвкоимоеич, М.С.Парфенова).

6. Изучение интер- и пострепродуктивного распространения, инфекции фиксированного вируса бешенства in vivo - Вопр.вирусол., 1969,6,с.717-722 (М.Б.Максимович, Э.М.Пугач, А.А.Кравченко).

Investigation of inter- and postreproductive spread of infection with fixed rabies virus in vivo. -Virology Abetra.,1970, v.287. M.B.Maksimovich, E.M.Pugach, A.A.Kravchenko,

- 37 -

7. Эффективность комбинации антирабического гамма-глобулияя и РНКазы при экспериментальном бешенстве. -В кн.'.Материалы ХУТ научн.сесс. ин-та полиомиелита и вирусн.энцеф., М.,1969,0.62-63 (Н.Б.Максимович, Э.М.Пугач, А.А.Кравченко).

8. Изучение интер- и пострепродуктивного распространения инфекции фиксированного вируса бешенства. -Сб.реф.НИР,серия 04, 1969,4,0.12 (М.Б.Максимович).

9. К механизму ингибирущего действия ШКазн на вирус гриппа. -В кн. ¡Грипп И респираторные вирусные инфекции.Киев,1970,в.З,

с.30-45 (М.Б.Максимович, С.И.Лисовяя, Р.С.Тарасенко, Е.Н.Кондра-шева).

10. Методические рекомендации по лечению вирусных пневмоний

у детей. -Одесса,1973, 12о (М.Б.Максимович, Т.М.Якименко, Л.П.Черноброва, М.С.Парфенова).

11. Активность нуклезз и уровень антител в организме, зараженном ДНК содержащими вирусами. -Сб.реф.НИР и ОКР,сер.22,1973, 5, 0.45 (М.Б.Максимович).

12. Тактика вмешательства в распространение инфекции фиксированного и уличного вирусов, бешенства. -Вопр.вирусол.,1974,1,

с.104 (М.Б.Максимович, М.С.Парфенова, Э.М.Путач и др.).

13. Активность сывороточной ДНКазы I, как защитный фактор организма при инфекциях, вызванных ДНК-геномными вирусами. -I. микробиол. (Москва),1^74,II, с.58-63 (М.Б.Максимович, С.П.Лисо-вая, М.С.Парфенова).

Tha activity of serum DÜaea I as a pfcofcective factor in organism in infection caused by DNA virusss.-Nuclois Acida Atistre., 1975, 5N2435,p.I37. M.B.Makeimvich.M.S.Parfanova.S.P.Lisovaya.

14. Активность сыв^оточннх нуклеаз, как гуморальный фактор защиты организма при вирусных инфекциях. -В кн.:Тр.1У съезда микроб.Украины, Киев,1975,с.288-269 (М.Б.Максимович, М.С.Парфе-

нова, С.И.Буковецкий).

15. Влияние изолированного действия нуклеаз и антител на течение вирусных респираторных инфекций. -В кн.:Бирусн и вирусн.■ заболевания, в.2, Киев,1974, с.12-15 (М.С.Парфенова, Я.ПДарно-брова,' М.Б.Максимович и др.).'

16. Роль сывороточных ЙИСаэ в иммунитете против гриппа. -Сб.реф.НИР и ОКР,1975,13, с.28 ■Ш.Б.Максимович).

• 17. Искусственное стимулирование активности эндогенной 'РНК-азы. -В кн.¡Вирусы и вирусн.заболевания, в.4, Киев,1976, с,30-32 (С.И.Буковецкий, М,Б.Максимович, М.С.Парфенова).

18. Участие ингибитора в регуляции активности сывороточной РНКазы при формировании иммунитета против гриппа. -Ж.микробиол. (Москва),1976,6,0.37-41 (М.С.Парфенова, М.Б.Максимович, С.И.Буковецкий и др.).

19. Защитная роль повышения активности сывороточной ШКазн при экспериментальном гриппе. -В кн.:Вирусы и вирусн. заболевания, в.6, Киев,1976, с.46-48 (М.Б.Максимович, Л.П.Черноброва,, М.С.Парфенова).

20. В1руси та нуклеази. -М1кроб1ол.журн.,1977,1,с.37-44 (М.Б.Максимович, М.С,Парфенова, Н.И.Зацепин). ,

21. Роль нуклеаз сироватки кров1 в патогенез1 в1русних зах~ ворювать. -В кн. :Ш Укр.б1ох1м. з'1зд, Тези симп.доп. .Донецьк, 1977, 0.128-129 (М.Б.Максиыович, М.С.Парфенова, В.А.Тишечкина).

22. 1нгШтор РНКази I, аооцНований з в1 русом грипу. ч Там «е. Тез.стенд.пов1дом.,с.209-210 (М.Б.Максимович, М.С.Парфенова, В.А.Тишечкина),

23. Влияние компонентов вириона гриппа на активность сывороточной РНКазы. -Сб.реф.НИР и ОКР,1977,18, с.28 (М.Б.Максимович),

24. Сывороточная РНКаза при экспериментальной иммунизации

против гриппа формалинизированной вакциной. -В кн.:Вируси и вирусы. заболевания,в.6, Киев, с,43-46 (М.В.Максимович, М.С.Парфенова, В.А.Тишечкина).

25. Особенности нуклеазной реакции в посгвакциональном иммунитете, обусловленном живой и убитой'вриппозной вакциной. -В кн.: Тез.докл.Всес.сямп* "Защитные механизмы естественного, приобретенного, и поотвакционвльного противовирусного иммунитета",Л.,1978, 0.82-83 (М.В.Максимович, М.С.Парфенова, В.А.Тишечкина).

26. Влияние повышения активности эндогенной сывороточной ДНКазы на резистентность белых мышей к вирусу простого герпеса. -Минробиол.жури, 1979,41,4, с.542-545 (М.В.Максимович, М.С.Парфенова, В.А.Тишечкияа).

■27.. Изменения активнооти эндогенных сывороточных ШКяэ, как особенность патогенеза гриппа. - В кн. :Вирусн и вирусн. заболевания, в.8, Киев,1980, с.68-71 (М.Б.Максимович, М.С.Парфенова, В.А.Тишечкина и др.).

28. Механизм токсического действия вирусов гриппа А и В на противовирусную нуклеазную реакцию организма. -В кн.:У съезд Укр.микроб.об-ва. Тез.докл., Днепропетровск,1980, Киев, "Наукова думка",1980, с.240-241 Ш.Б.Максимович).'

29. Высокоэффективная вакцинация против гриппа на основе этиопатогенетичвского подхода. -В кн.:Тез.докл.Х Укр.съезда микроб.эпид. и паразитол., Киев,1980,с.100-102 (М.Б.Максимович).

30. Динамика активности интерферона, нуклеаз и антигемагглю-тининов, как факторов защити в патогенезе вирусных инфекций.

-В кн.гТез.Мевдународного симп.соц.стран по интерферону, Льяоэ, 1980, с.25 (М.Б.Максимович).

31. Роль сывороточной РНКазы рН 7,5 в невосприимчивости к гриппу. -В кн.:Вирусы и вирусн.заболевания, в.9, Киев,1991,

с.85-88 (М.Б.Наксимович).

32. Ингибитор РНКазы вируса гриппа, его свойства и биологическое значение. -В кн.:Конф.вирусол.Казахстана. Тез.докл. "Наука", Алма-Ата,1982, с.162-165 (М.Б.Максимович, М.С.Парфенова,■ В.А.Тишечкина и др.).

33. Изучение биохимических, биофизических и антигенных свойств гриппозного ингибитора РНКазы. -В кн.:УТ съезд Укр.ыикроб. об-ва. Тез.докл.,Киев, "Наукова думка:,1984, с.206-207 (М.Б.Максимович, З.Г.Кушнир, В.А.Лукьянчун).

34. Сывороточные нуклеаза, как неспецифические противовирусные факторы и их роль в искусственном противогриппозном иммунитете. -Вопр.вирусол.,1984,6,с.682-687 (М.Б.Максимович).

35. Ингибитор хозяйских рестриктаз - токсический фактор патогенности вирусов микро- и макроорганизмов. -В кн.:УП съезд Всеооюзн.микроб.об-ва. Тез.докл.,т,5, Алма-Ата, "Наука", 1985, с.21 (М.Б.Максимович).

36. Гриппозный ингибитор сывороточной рибонуклеазы хозяина. -Вопросы вирусол.,1986,6, с. 562-567 (М.Б.Мокоимович).