Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Протеолитические ферменты зародыша пшеницы

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Протеолитические ферменты зародыша пшеницы"

^бУдАфТВЕННЬЙ КО!,«ПЕТ РСФСР ПО ДЕЛАМ НАУКИ И ВЫСШЕЙ ШКОЛЫ 1Якяс |

ВСКОВ^КИЙ СРДЕ11А ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ТЕХНОЛОГИЧЕСКИЙ ИНСТИТУТ ПИЩЕВОЙ ПРОМЫШЛЕННОСТИ

На правах рукописи АЛЬ РАХМУН АБДУЛЛАТИФ

У.ДК 664.664.53

! 1РОТЕОЛИТИЧЕСКИЕ ФЕРМЕНТЫ ЗАРОДЫША ПШЕНИЦУ 03.00.04 - биохимия

Автореферат

.цисгер'гации на соискание ученой степени кандидата биологически* наук

Москва - 1990

Работа выполнена в Московском ордена Трудового Красного Знамени тчхнологическом инсчйгуте пищевой промышленности на кафедре биохимии и зсрк.ведения.

Научный руководитель: доктор технических наук,

профессор М.П.Попов

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

профессор В.Ф.Голенков

кандидат биологических наук, И.О.Витол

Ведущая организация: Всесоюзный научно-исследовательск!

институт зерна /ВШЙЗ/, лаборатория биохимии и микробиолох

Автореферат разослан: "_" _ 1990 г.

Запита состоится "_"_1990 г. на заседании специализированного совета К063.51.06 Московского ордена Трудово: Красного Знамени технологического института плшевой промышленности по адресу: 125080, Москва, Волоколамское шоссе, 11,

С диссертацией, можно ознакомиться в библиотеке института

Ученый секретарь Специализированного совета кандидат химических наук, доцент

Н.В.Зотчик

ОБЩ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Одно из направлений в совершенствовании [ереработки зерна связано с комплексным использованием сырья, жлючая глубокую переработку побочных продуктов мукомольного ]роизводства. Современные методы помола позволяют выделять в зиде отдельной фракции зародыш шеницы. В нем содержится целый гамплекс биологически активных соединений, представлявших больной практический интерес.

Так, из предварительно обезжиренных зародышей можно получать препараты протеолитических ферментов. При этом липидная фракция может быть также использована для получения, например» токоферола и других чрезвычайно ценных липидных компонентов.

В настоящее время основным источником протеаз являются микроорганизмы. Новым и доступным источником протеолитических ферментов могут быть зародыши пшеницы, в которых, по литературным данным, сосредоточено до 20 % общего количества нейтральных протеаз зерновки. . .

Цель и задачи исследования:

- изучение свойств протеолитических ферментов зародыша пшеницы;

- разработка схемы получения препаратов протеаз из зародыша пшеницы и их характеристика;

- изучение взаимодействия 'лотеолитических ферментов зародыша пшеницы с белковыми ингибиторами протеаз зерновки пшеницы;

- характеристика распространенных сортов пшеницы САР по комплексу показателей, включавших комплекс "протеазы - кнгибито- . ры протеаз".

Научная новизна. Исследованы нейтральные протеазы зародыша пшеницы» Выделено две фракции нейтральных протеаз - протеаза I и

протеаза П. Показано, что протеаза 1 и протоаза П идентичны или очень близки по всем показателям, но различаются по своей растворимости. Протеаза I растворяется в воде, протеаза П не растворяется в воде, а растворяется в растворе 0,35 л—ной .

Изучено взаимодействие нейтральных протеаз зародыша и зерновки пшеницы, а также трипсина с белковыми ингибиторами протеаз пшеницы. Показано, что в зародыше пшеницы локализованы ингибиторы, имеющие преимущественное сродство к трипсину, а в остальной части зерновки сосредоточены ингибиторы, имеющие высокое сродство к собственным протеолитическим ферментам. Высказано предположение, что ингибиторы протеаз зародыша пшеницы выполняют преимущественно защитную функцию, а ингибиторы протеаз других частей зерновки выполняют преимущественно регуляторную функцию,

Практическая ценность: разработана схема получения препаратов протеолитических ферментов из обезжиренного зародыша пшеницы. Предложена новая схема выделения белковых ингибиторов протеаз из зерна пшеницы^ Дозволяющая получить две фракции ингибиторов, различающихся по взаимодействию с нейтральными протеазами пшеницы и трипсином.

Проведено комплексное исследование трех широко распространенных сортов пшеницы САР, на основе которого открывается возможность широкого изучения богатого разнообразия пшениц местных сортов Сирийской Арабской Республики. •

Достоверность гртучэнных результатов определяется комплексностью проведенных исследований, использованием современных методов анализа и воспроизводимостью полученных результатов.

Аттпобашш-^пботц. Материалы исследования докладывались на УП конференции Молодых ученых /Москва, 1988, МТИГЩ/, на У конференции по органической химии и-технологии /Москва, 1989, МВД/,

2

Всесоюзной научной конференции "Пути повышения качества зер-и зернопродуктов, улучшения ассортимента крупы, муки и хлеба" осква, 1989, ВНШЗ/.

Публикации. Ш материалам диссертации опубликовано 3 работы.

Объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора лите-туры, экспериментальной части и выводов.

Работа изложена на 114 страницах машинописного текста и лючает 11 таблиц п 23 рисунка.

Список использованной литературы содержит 172 наименова-й, в том числе 81 на иностранных языках.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В работе были использованы зародыши, полученные с кельком-ната при переработке пшеницы, ,не содержащей дефектных зерен, ежий зародыш обезжиривали путем трезрсратной экстракцией н-гек-ном при комнатной температуре.

Исследования проводились также на образцах сортового зерна зницы САР. Показатели качества зерна определяли согласно ЗТам: 10842-75, 10840-64, 13586-1-68, 10845-75, 10847-74.

Клетчатку определяли по методу Кюшнера и Гакека; восстанав-)ашие сахара - по Бертрану, сахарозу - после гидролиза 2 %-тюй 1яно:1 кислотой; белковый и небелковый азот - по Къельдалю.

Содер.тлние растворимых фракций белка определяли по методу ри. Активность протеаз определяли методом Ансона го начальной рости гидролиза сывороточного альбумина.

Выделение белковых ингибиторов протеаз проводили по Шаявн-/1580/ :: Ибрагимову /1987/.

Молекулярную кассу нейтральных протеаз зародыша паеницы оп-

ределяли методом гельфильтрацик на колонке о сефадексом & -75 с параметрами = 123 = 40 мл. Фракции элюата

собирали на коллекторе фракций фирмы СКВ- (Носй/с^оъ /Швеция/ Регистрацию оптической плотности элюата проводили на автоматическом регистраторе при длине волны 280 ны.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУДДЁНИЕ Получение препаратов птютеаа

Разработанная схема получения препаратов нейтральных про-теаз из зародыша пшеницы /рис. 1/ основана на характеристиках этих ферментов, полученных Шаненко /1980/ и серии предварительных исследований, проведенных нами, с использованием'в качестве исходного материала обезжиренных зародышей пшеницы.

Предварительные опыты показали, что из обезжиренного зародыша пшеницы протеолитические ферменты могут быть экстрагированы как водой, так и раствором сода. Водой экстрагируется около 75 % ферментов, а раствором соды дополнительно извлекается еще 25 % от их общей активности.

По предложенной схеме получено два препарата протеаз. Про теаза-1, растворимая в воде, и протеаза-П, нерастворимая в воде , но растворимая в растворе соды.

Характеристика препаратов протеаз

Препараты протеаз были охарактеризованы по следующим пока зателям: оптимум рН, температурный оптимум, термостабильность, взаимодействие с активаторами и ингибиторами, в том числе с ин гиб::торлл:и белковой природы, определенна молекулярной массы. Е лученние результаты представлены на рисунках 2а.,б,в,г и таблице 1.

ОБЕЗИРЕНШЙ ЗАРОДШ

экстракция водой 1 : 15'

Центрифугирование при 4000 об/мин1 Ч4\

Осадок

экстракция 3,35^-ной содой

Центрифугирование при 4000 об/мин

Центрифугат .Осадок

/отбрасывается/

Подкисление до рН = 4,0

0/

Осадок

Центрпфугат

Подкисление до рН = 4,0

Це нтрифугирование при 6000 об/мин

ентрифугат /отбрасывается/

Обезвоживание спиртом, ацетоном

Центрифугирование при 6000 об/мин

ПРОТЕАЗА 1

{ентрифугат ''отбрасывается/

Осадок. ■

обезвоживание спиртом и ацетоном.

ПРОТЕАЗА П

Рис. 1. Схема получения препаратов ферментов из зародыша пшеница

Таблица 1.

Влияние температуры на активность препаратов протеаз зародыша пшеницы

Активность препаратов протеаз -]--—

Протеаза - Т ! Протеаза - П

ДА2зо. 6Д>! % от макс. I ДАзео» еД-! % от маю

1. 40 0,270 81 0,195 74

2. 50 0,330 100 0,240 90

3. 55 0,330 100 0,265 100

4. 60 0,230 70 0,265 100

5. 65 0,215 65 0,170 64

6. . 70 0,190 • 57 0,155 58

7. 80 0,030 9 0,050 • 19

Оба препарата протеаз имеют одинаковый оптимум рН,равны! 6,75 /рис. 2а/ и очень близкий температурный оптимум /табл. 1/.

Ингибитор Кунитца в концентрациях, обеспечивавдих эффектив ное подавление активности трипсина, не снижает активности цро-теаз исследуемых препаратов /рис. 26/. Специфичный ингибитор се риновых протеаз фенилметилсульфонилфторид /<ШСФ/ подавляет акти ность трипсина и не взаимодействует с препаратами протеаз из за родыша пгаеницы /рис. 2в/. Таким образом; можно сказать, что ней ральные протеазы зародыша не относятся к ферментам серинового т па.

Дистеин в концентрации, повышающей активность папаита в дв раза, практически не оказывает активируыцего действия на исслвд мне препараты /ркс. 2г/. Как отмечала Шаненко, нейтральные прот

о

7 8 РН

СП

а

ф.

е*

о &

>4

О О а

8 о к

н о

100

' 80

60

40 20

0

Г

\

\

> N.

--С

2 б 1

0.2 0,4 0,6 ингибитор Кунитца, мг/ыл

«а о

о к о к

е-о

100 80 60 40 20 0

0,91 1,82 Ф1.1СФ, мг/мл

12 3 цистеин, мг/ыл

Рис. 2. Характеристики препаратов протеаз

1 - протеаза-1; 2 - протеаза-П; 3 - трипсин; 4 - папаин.

Влияние рН /а/; взага/одействие протеаз с ингибитором Ку-нг.тца /б/, <Н.'.С$ /в/, цистеином /г/

зы пшеницы нельзя отнести к ферментам тиолового /цистеинового/ типа. Пэ-видимому, этот вывод следует расцространить на протеазы зародыша пшеницы.

Этилендиаминтетраацетат /ЭДГА/ в малых концентрациях /0,05 мг/мл/ активирует препараты протеаз на 30 - 50 %, фи увеличении концентрации ЭДТА его активирупцее действие снижается. Можно предполагать, что препараты протеаз содержат ионы металлов, оказывающих ингибирупцее действие на них. Связывание этих ионов ЭДТА и приводит к повышению активности ферментов.

Хлорид натрия в концентрации 1,0 : 1,5 % снижает активность протеаз в два раза.

Взаимодействие препаратов ггоотеаз с белковыми И^гибцтпрями ртцщ

Как известно, белковые ингибиторы протеаз при взаимодействии с ферментами образуют неактивные комплексы.

Эксперименты проводились в двух вариантах. Белковые Ингибиторы были выделены по методу Шаненко из целого зерна пшеницы и из зародыша. Полученные результаты представлены на рис. 3. Суммарная фракция ингибиторов, выделенная из целого зерна пшеницы, проявляет более выраженное сродство к собственным протеазаы, по сравнению с трипсином /рис. За/.

В то же время ингибиторы протеаз из зародыша пшеницы более интенсивно взаимодействуют с трипсином и сравнительно слабо - с препаратами протеаз /рис. 36/.

Полученные данные позволяют говорить о избирательной локализации ингибиторов в зерновке пшеницы. В зародыше преимущественно сосредоточены ингибиторы, подавляющие активность трипсина. Следовательно, этим ингибиторам присуща прежде всего защитная

Рпс. 3. Взаимодействие препаратов протеаз с белковыми

ингибиторами пшеницы 1 - протеаза I; 2 - протеаза П; 3 - трипсин

Рис. 4. Определение молекулярной массы протеаз зародыша

пшеницы

функция, направленная на подавление чужеродных цротеаз.

В зерновке пшеницы в целом преобладают ингибиторы, проявляющие специфичность к собственным протёазам зерна пшеницы. Их функция должна быть связана прежде всего с регуляцией действия протеолитических ферментов, сосредоточенных в эндосперме и связанных с запасным? белками.

Определение молекулярной массы гшотеаз зародыша

Определение молекулярной массы проводили методом гельфильт-рации на колонке с сефадексом в -75. Известно, что объем элоции вещества с колонки прямо пропорционален логарифму молекулярной массы. Молекулярную массу определяли графическим методом в координатах ; М /рис. 4/. Калибровку колонки щюводо

белками-метчиками с известной молекулярной массой /табл. 2/.

Таблица 2

Определение молекулярной массы нейтральных цротеаз .

.......... 1 т Белок ! ! Молекулярная масса ТГ' " "Т {Объем выхода, i Ve » мл } Vo . i МЛ j v*/v.

Цитохром 12300 95 40 2,37

Хиыотрипсиноген 25000 82 40 2,05

Альбумин сывороточный бычий 67000 44 40 1,20

Цротеаза I 56000 55 40 1,37

Протеаза П 56000 55 40 1,37

Объем элюции у протеази I к протеазы П Сил одинаковый и сбответствопал молекулярной массе'5GOOO Д.

При сопоставлении полученных характеристик протеаз I и П ' г:о'. комплексу показателе!! /табл. 3/ всего необходимо ot.v.c-

Таблица 3

Характеристика препаратов протеаз из зародыша пшеницы •

Показатель ¡„зЙрения! Протеаза 1 | Цротеаза П \

1. Внешний вид порошок белого цвета

2. Выход % 8 6

3. Содержание белка % 84 42

' 4. Активность ПЕ на г препарата на г белка 90 110 46 110

5. Снижение активности при хранении при + 4° С 2 мес. % 12 9

7 мес. % 30 12

6. Молекулярная масса Д 56000 56000

7. Оптимум рН 6,75 6,75

8. Оптимум температуры. 0 С 50 - 55 50 - 60

9. Термостабильность после прог. 10 мин 60° % 75 83

10. Ингибитор Кунитца % 100 100

11. <ШСФ ' % 100 • 100

12. ЭДГА 0,05 мг/мл % 137 150

13. 14. Цистами 3 мг/мл '• % Л>яс{2 % % 110 73 115 66

15.. Белковые ингибиторы пшеницы 2 мг/мл % 40 30

15. Белковые ингибиторы зародыша 2 мг/мл % 90 80

тить одинаковые или очень близкие значения по всем исследованным параметрам. Это позволяет говорить о том, что ьн имеем дело с

одним ферментом, представленным двумя функциями, различающими« формами связи с другими белками зародыша пшеницы,

ХАРАКТЕРИСТИКА СИРИЙСКОЙ ШЕНИЩ

Для САР характерно большое разнообразие местных сортов пшеницы, составляющих в совокупности богатый природный генофон; Объектами исследования служили образцы трех широко распростра» ных сортов пшеницы САР. Их характеристика представлена в таблице 4.

Особое внимание при изучении сирийской пшеницы мы уделили комплексу "цротеазы - ингибиторы протеаз". Выделение ингибитор' проводили по разработанной нами схеме /рис. 5/, позволяющей ра делить их на две фракции. Фракция I извлекается водой, фракция дополнительно экстрагируется раствором сода.

Состояние белкового комплекса пшеницы в значительной степ ни определяется соотношением протеолитических ферментов и их белковых ингибиторов. Мы охарактеризовали имеющиеся образцы си рийской пшеницы по этим показателям /рис. 6 а,б,в/.

Из полученных данных следует, что в зерне пшеницы преобла дает фракция ингибиторов /И-Ц/, прочно связанных с белковым ко лексом и не растворяющихся в воде /рис. 6 а и б/. Ш силе ингв бирувдего действия они примерно вдвое превосходят активность в гибиторов, растворимых в воде /И-1/.

В образце пшеницы, пораженной клопом-перепашкой /сорт Шаъ /рис, 6в/, отмечается более высокая активность ингибиторов про теаз и примерно в два раза возрастает ингибирующая способное« водорастворимой фракции И-1. Таким образом, поражение зерновю пшеницы клопом черепашкой сопровождается не только кардинальт изменением протеолитического комплекса зерна, но и столь же <д

Характеристика сирийской пшеницы

! Масса 'Натура,'Белок,!Крахмал,!Восстанав- !Саха-!Клет- ! Золь- ¡Сырая [Показатель „ ¡1000 зе-! ! ! !лив.сахара,!роза,!чатка,!ность,!клейко-! ИДК-1.

гьенлцц !peHf г I г/л I JS I % \ % ^ \*% ! % ! % ¡вина, %\ ,

1. Хураны 35,66 938,0 12,0 66,48 0,19 4,55 3,18 2,22 40,70 82,4

/твердая/

2. Шам - 1 52,68 824,0 10,49 67,60 0,21 3,64 3,47 2,38 не отмыва- -

/мягкая/ ется х

3. Zypu с 69 /твердая/ 835,0 15,64 65,10 t 3,86 2,84 2,04 30,25 99,4

Сорт Шам - 1 содержал зерновки, пораженные клопом черепашкой

РАЗМОЛОТОЕ ЗЕРНО

экстракция водой 1 : 5

Осадок

Центрифугирование при 4000 об/мин

У X

Центрифугат

экстракция содой. 1 : 5

нагревание до 90е 15 мин

Центрифугирование при 4000 об/мин

Центрифугирование при 6000 об/мин

ч / Ч

Центрифугат

Осадок Осадок /отбрасывается/

центрифуга: /ингибитор :

осаждение прогеаз подкисление до рН 4,0

Центрифугирование при 6000 об/мин

Осадок /протеазы/

центрифугат /ингибитор п/

Рис. 5. Схема выделения ингибиторов протеаз

1 - ингибитор-1; 2 - ингибитор-П а - сорт Хураны; б - сорт Жури; в - сорт Шам-1

щественной перестройкой системы ингибиторов протеаз.

ВЫВОДЫ

1. Разработана схема получения двух препаратов протеол! ческих ферментов из обезжиренных зародышей пшеницы: протеаз! и протеазы П. Цротеаза 1 экстрагируется водой, протеаза П н< растворяется в воде и извлекается после экстракции протеазы раствором соды. Выход препаратов составил 8 % и 6 % соответ венно от массы обезжиренного зародыша.

2. Цроведено комплексное исследование выделенных препа тов протеаз. Определены следующие показатели: оптимум pH и температуры, термостабшгьность, взаимодействие с активатора и ингибиторами; взаимодействие с ингибиторами протеаз белке природы /ингибитор Кунитца, ингибиторы протеаз зерновки и s родыша пшеницы/.

3. Показана гомогенность препаратов протеаз при фракц] ровании на колонках с сефадексом -75. Определена молак; нал масса протеаз зародыша пшеницы, равная 56000. Это знач( молекулярной массы совпадает с ранее полученными данными д. нейтральных протеаз зерновки пшеницы /Шаненко, 1980/ и ней ральных протеаз, выделенных из клейковинного комплекса пше /Ихсанова, 1985/.

4. Сделано предположение, что цротеаза 1 и протеаза Е

представляют собой один фермент, но связанный с разными бе

выми комплексами, Цротеаза I находится во фракции альбумин

а протеаза П - связана с другими белками зародыша, не раст щимися в воде.

5. Предложена новая схема выделения белковых ингибитс

теаз из зерна пшеницу, позволяющая получить два фракции ин-иторов протеаз, различающихся по своему сродству к трипсину сбственным протеазам пшеницы. .

6. Определена локализация ингибиторов протеаз в зерповко ницы. Ингибиторы трипсина преимущественно сосредоточены в одше, а ингибиторы собственных протеаз локализованы глав-

образом в ьндосперыэ.

7. Дана характеристика трех широко распространенных в

Ш сортов пшеницы, с использованием как традиционных методов лиза, так и новых подходов к характеристике комплекса "прозы - ингибиторы протеаз".

Список опубликованных работ по теме диссертации

Асадова М.Г., Альрахмун Абдуллатиф, Шаненко Е.О., Потов jU.II. Протеолнтические ферменты зародышей пшеницы. 7 Московская Конференция по органической химии и технологш. Всесоюзное химическое общество имени Д.И.Менделеева. Иосква, 1989, с. 141.

Альрахмун Абдуллатиф

1олучение препаратов протеаз из зародышей пшеница. Зсессюэгая научная конференция ВНИИЗ "Пути повышения качества ?ерка и зерпопродуктов, улучшения ассортимента крупы, муки ! хлеба"

КШЗ, Москва, 1989, с. 56

.садова М.Г., Альрахмун Абдуллатиф, Попов М.П., Шаненко Е.Ф. 'готеолнтгпеские Ферменты зерна пзеницы [еп. м., з::н;:ти, 1^59, и, с. 159