Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Растворимые белки зародышей пшеницы в связи с жизнеспособностью семян

ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Растворимые белки зародышей пшеницы в связи с жизнеспособностью семян"

* *

л V

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ИНСТИТУТ ФИЗИОЛОГИИ РАСТЕНИЙ имени К.А. ТИМИРЯЗЕВА

Специализированный Совет К 002.45.01

На правах рукописи

АНГЕЛОВА Веселина Стоянова

РАСТВОРИМЫЕ БЕЛКИ ЗАРОДЫШЕЙ ПШЕНИЦЫ В СВЯЗИ С ЖИЗНЕСПОСОБНОСТЬЮ СЕМЯН

Специальность 13.00.12 - физиология растений

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 1993

Работа выполнена в Ордена Трудового Красного Знамени Институте физиологии растений имени К.Л.Тимирязева РАН.

Научный руководитель: кандидат биологических наук В.П.ХОЛОДОВА

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор А.Н. ПАВЛОВ

кандидат биологических наук Г.С. КАРАСЕВ

Ведущее учреждение - Всесоюзный научно-исследовательский институт растениеводства имени Н.В.Вавилова ВАСХНИЛ.

Защита состоится " 1993 г. в 'А-' часов на

заседании Специализированного совета К 002.45.01 по присуждению ученой степени кандидата . биологаческих наук при Институте физиологии растений имени К.А.Ткмирязева РАН по адресу: Россия, 127276 Москва, ул.Ботаническая, 35.

С диссертацией мо:хно ознакомиться в библиотеке Института физиологии растений имени К.А.Тимирязева РАН 'по адресу: 119435, Москва, ул. Малая Пироговская, дом1.

Автореферат разослан "

ГО .

Учсныи сехретарь Специализированного совета канъшт биологических наук

Л.И.СЕРГЕЕВА

Актуальность проблемы. Семена является важнейшим источником сохранения видового разнообразия высших растений. Высокое содержание запасных белков в сеценах растений, используемых не только при формировании проростка, но также и в качестве ценного пищевого и кормового продукта/ привело к тому, что эти белки подверглись разностороннему изучению (Осборн,

1935: ХолодсЕа, 1363, 1364; Конарев, 1980; Кретоаич,1981; »

Павлов, 1967,1934; Соболев, 19S2, 1985; Совинов, 1985; Kasard3 et al.,1976; Payne , Rhodes,1932; "Miflin et al. 1933). Напротив, данные, касающиеся состава, механизмов образования и утилизации белков, отличных от запасных, • или как принято их называть у злаков "растворимых белков" (Конарев, 1980; Payne,Rhodes, 1982), лишь фрагментарны, хотя именно эти белки имеют первостепенное значение для реализации программы прорастания. В этом плане семена пшеницы является удобной модельной системой для изучения биохимической организации разных тканей и органов растений. Это обусловлено тем, что ПЕ9НИЦЗ (как и большая часть алаков) имеет специфику, эаклвчащуюя в двойной системе белковых запасов:; белки эзродмзэ, выполняющее роль запасов первой очереди, и белки эндосперма, обеспечивающие последующий рост проростка (Хзвкиа, 1382; Клли, 1995). Растворимые белки имеют существенное значение для поддержания жизнеспособности зародышей, и обеспечения их нормального функционирования при прорастании (Никслсва, Гайдзрджиега, 1387; ChoAt.Bewley, 1987), т.е.. эти бел¡си могут быть использованы как маркеры посевных качеств семян (Уэгайр, 1982; Гайдэрджиева.с соавт., 1990, 1991)..

Таким обрагом, изучение ■ состава растворимых белков' зародышей семян пшеницы и га биосинтеза и утилизация

- г -

представляется актуальным как в теоретическом плане, так и 'для решения ряда практическая вопросов, связанных с поддержанием ««неспособности семян. Цель и задачи исследования. Цель работы заключалась в изучении фракционного состзеэ и электрофоретического спектра растворимых белков зародышей семян пшеницы и некоторых их функций в связи с жизнеспособностью. В качестве основного подхода был исг.ольэован сравнительный анализ жизнеспособных

и нежизнеспособных семян. ■

»

Исходя из цели работы, были поставлены следующие задачи. ■

1. Подобрать условия наиболее полкой экстракции растворимых

белков кз зародышей жизнеспособных и нежизнеспособных семян пшеницы.

2. Изучить количественный и качественный состав растворимых белков эародыпей'жизнеспособных и нежизнеспособных семян пеэнкцы на начальных этапах прорастания, ньчиная с момента, когда удается выделить зародыш, и до 24 ч от начала набухания.

3. Игучить ряд метаболических процессов в зародышах жизнеспособных и нежизнеспособных семян пшеницы на начальных этапах прорастания и при потере жизнеспособности.

4. Изучить состав растворимых белков зародышей семян ппзницы но время формирования и созревания зерновки и выявить, какие белки непосредственно связаны с прорастанием.

^дуц.'ая новизна. В реззгльтаге исследований выявлены условга полной экстракции растворимых бёлков из зародыаей семян пеоницы разной жизнеспособности. Выявлены и охарактеризованы некоторые белки, имеюгцие прямое откоиеииэ к начальны.! процессам прорастания. Показана динамика изменения

. *" - 3 -

легсгиноЕой и .протеолитической активности на ранних этапах прорастания. Установлена косреляцкя иежду снижением колгоества растворимы! белков, падением протеолитической и исчезновением лектиновой активности и потерей жизнеспособности. Обнаружено, что большая часть выявленных белков присутствует в зародыже на ранних этапах развития зерновки, что, по всей видимости, является одним на факторов, обусловливающих способность зародыша к прорастанию. Проделанная работа является предпосылкой для более полного понимания механизмов начального этапа прорастания семян.

Практическая значимость. Установленная в настоящей работы корреляция медцу содержанием растворимых белков и жизнеспособность» семян может быть использована в качестве основы • непрямого метода тестирования посевных качеств семян. Апробация работы. Основные результаты работы представлены на Еторсм съезде. ВМ>Р (Минск 1990). Результаты работы докладЬЬ вались нз едегсдннх семинарах лаборатории физиологии запаса-

органов И!1? РАН, а такде на семинарах лаборатории регу-ляторных механизмов прорастания семян ИФР ЕАН (София, май 1991; июль 1992) и отдела молекулярной биологии ВИР (Санкт-Петербург, октябрь 1992)

Публика;*?;;?. По теме диссертации опубликовано 3 научные работы. Структура работы. Диссертационная работа состоит из введения, обэсра литературы, описания методов исследования, изложения полученных результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка литература

М

Диссертационная рэбота изложена на страницах машинописного текста, содержит 18 рисунков,- 5 таблиц. Список ли-

тературы включает 2W наименований, иа которых на ино-'странном языке.

ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Основная часть работы проведена на озимой пшенице сорта Заря, некоторые эксперименты на яровой пшенице сорта Це-линная-ЮСилейкая.

Растения вырзциваля в камере фитотрона ИФР. Семена выделяли от колоса на разных этапах развития, а именно - 9-10; 16-17; 20-21; 27-28; '32-33; 39-40 и 46 дней после цветения.

I

Прорацлвзнке семян проводили на влажной фильтровальной бумэге в чаоках Пэтри при 20ÖC. Пробы отбирали через 2, 6 и 24 ч набухания. 'В опытах с использованием радиоактивной метки зерновки, набухавшие в течение 2. В и 24 ч в стандартных условиях, на последние 2 часа иэ указанных периодов переносили на смесь 14С-аминокислот (10 мкКи/мл) (фирма Аиероам, Англия) с добавлением 10 мкг/мл хлорамфе никола.

Искусственное состаривание семян проводили по методике, описанной Фсканавым (Фоканов,1°8б). Всхожесть и энергию прорастания определяли по ГОСТу 12038-84. НизнеспосоСность семян определяли тетразольным методом по ГОСТу-12033-82.

Белки экстрагировали двукратно БОмМ Ка-фосфатныы буфером рК 7,5 , в добавкой 8мМ КЕг. Экстракты отделяли центрифугированием 39 мин при 13000 g. Суммарный объем экстрагента в ■10-50 раг превыл&л массу навески. Для разделения глобулинов и альбуминов проводили диализ против дистиллированной воды в течение 24 ч при 44С. Белки в по/.ученных фракциях осаждали 20'i ТлУ, доводя конечную концентрацию ТлУ до 10%. Осадок растворяли в Q,5N NaOK и измеряли концентрацию белка методом Jiypn с соавт. (Lowry et al., 1551), используя в качестве

- Б -

стандарта БСА.

Протеолитическую активность щелочных (сериновых) проте-аэ определяли по методу Кунитца (Kunitz, 1947), используя .казеин в качестве субстрата. Эа условную единицу активности 'протеаэ (Ед) принимали то количество фермента, которое вызывает увеличение оптической плотности ТХУ фильтрата при 280

* а

нм на 1 единицу. Удельную активность выражали как число Ед на 1 мг белка.

При тестировании лектинозой активности получение эритроцитов и их трилсиниэирование проводили по методу Алекеидге с ссавт. (1933). Реакцию гемагглютинации осуществляли при комнатной температуре, результат регистрировали через два часа с, момента начала микротитрования. Ге маг г лет инируюяую активность рассчитывали по минимальному количеству белка,' вызывавшего агглютинацию' трипсшшзированных эритроцитов кролика (в мкг/зародыи).

Электрофорез белков проводили в 12,5%-ном ПААГ по методу Лэнмли (Laemnli, 1Э70). Гели окрашивали кумасси. При ■электрофоретическом анализе протеолитических ферментов в качестве сополимеризованного субстрата использовали гкелатин.

Флюорографию после электрофореза проводили с использованием в качестве сцинтиллятора 10-16Х раствор ПШ в ледяной уксусной кислоте (Остерман, 1983).

Все количественные определения проводили в 2-3 кратной биологической и 3 аналитических повторностях.

Статистическую обработку результатов проводили с по-мсвдю компьютерной програьйюй t-test.

* РЕЗУЛЬТАТЫ И ОЕСУВДЕШЗ

1. Некотогые методические аспекты выделения, растворимых бед-

■ - 6 -

ков из зародышей семян пшеницы разной жизнеспособности.

При экстрагировании растворимых белков из. цельных зерновок . пользуются как последовательной экстракцией дистиллированной водой и солевыми растворами, так и сразу солевыми растворами с высокой конной силой (Осборн, 1935; Гаввилюк и др., 1973). Однако неясно, насколько эти условия пригодны для полного извлечения белков эашдыша.

С другой стороны, деструктивные перешны, происходящие с белками во время старения', приводят к избиениям стоуктуры

I

белков, в результате чего ьшлаэт иашняться их растворимость. Таким образом, имеется' основания ожидать, что условия выделения белков из семян, потерявшее жизнеспособность, могут значительно отличаться от условий, оптимальных для «изнеспо-собных семян. Шатому вторая задача состояла в том. чтобы установить оптимально условия выделения белков из зародьшй нежизнеспособных семян.

Для экстракции белков использовали несколько ваоиавтов методики - как последовательную экстракцию бугром и солевым раствором, так и непосредственно солевыми растворами разной концентрации (табл.1). - .

Результаты количественного анализа растворимых белков зародышей жизнеспособных семян пшеницы после выделения саз-ными растворами показали, что при первой экстракции буфером или солевыми растворами выделялось намного больше белка по сравнению с его количеством, выделяемы« при применения этих растворов для доэкстрагироваяия растительного материала .после буферной вьггяжки. Зато обдае количество белка. В1^щенно-го буфером с последующим доэкстрагироваяием 0,5 и 1И НаС1 на том же буфере, превышало количества белка, экстрагированного

сразу этика растворами. Однако количество белка, экстрагированного сразу 2Ы ЫаС1 на фосфатном буфере, было достоверно меньше по сравнению с общим количеством белка, экстрагированного фосфатным буфером с последующей экстракцией 2М НаС1. Таблг-гца 1. Содерлание белка (мкг на 1 зародыш) .в зародышах жизнеспособных и нежизнеспособных семян после экстракции

ч

разными растворами.

Варианты Семена'

жизнеспособные нежизнеспособные

Фосфатный буфер (рН 7,5) после чего: . 0.5М ЫаС1 на фосфатном буфере (рН 7,5) 1!£ НзС1 на фосфатном буфере (рН 7,5) 2>г.НаС1 на фосфатном буфере (рН 7.5) 134,5 + 2,5 18,0 ± 2,0 17,5 ± 2,5 20,5 + 4,5 47,5 + 4,5 8,5 + 0,5 14,0 + 2,0 17,5 + 0,5

0,5М КзС1 на фосфатном буфере (рН 7,5) 133,5 + 1,5 71,0 + 7,0

1М «¡з-Л на фосфатном буфере (рН 7,5) 141,0 + 2,0 61,0 + 2,0

¿Ы НаЛ на фосфатном буфере (рН 7,5) 88,0 + 1,0 56,5 +2,5

что касается белков зародышей нежизнеспособных семян, то. как видно из табл. 1, обдее их содержанке сильно снизилось по сравнению с жизнеспособными. Шесте с тем,аналогично жизнеспособным семенам из нежизнеспособных только часть белков выделялась при первой (буферной)

" — - 8 -

экстракции, и необходимо было проводить доэкстрагироваиие солевыми растворами. Заметно меньшее количество белка, выделяемого при использовании после буфера раствора О,БЫ НаС1, вынуждает рекомендовать применять для доэкстрагирования растворы большей ионной силы (1 или 2Ы). Напротив, когда солевые растворы использовали для первой экстракции, обнаружена тенденция более полного извлечения белка О.БУ раствором, существенно меньшее количество извлекается 2М раствором НаС1.

Резюмируя изложенное, можно сказать, что для белков зародышей жизнеспособных семян оптимальной является экстракция фосфатном буфером (БОмМ; рН.7,5) с последующей' . экстракцией 2М НаС1, в то время как для белков зародыша нежизнеспособных семян кроме этой экстракций . юяяо использовать и экстракцию сразу 0,6М или 1Ц КаС1.

Следует также указать , что применение в качестве первого экстрагента 2М МаС1 , что является стандартной процедурой при извлечении белков двудольных, не может быть рекодан-, довано для экстракции белков зародышей семян -пшеницы, так как вызывает осажде'ние значительной части белков. 2. Изменение состава растворимых белков зародышей семян глазницы на начальных этапах прорастания и при потере жизнеспособности.

Основная задача этого этапа работы состояла в выявлении белковых компонентов, детерминирующих формирование и потерю ■ способности семян к прорастанию.

а. Изменение количественного состава белков зародышей .'лэиеспособных и'нежизнеспособных семян пшеницы.,

Б качестве исходных служили семена после 2 ч набухания, . так К2К из них удавалось вычленить зародыш целиком. Уже в

. 9 -

этот период содержание бежа в зародышах нежизнеспособных семян было в.2 раза ниже, чем в зародышах жзшнеспособкых. В ходе эксперимента в набухающих семенах содержание растворимых белков заметно уменшалось, при расчете на зародыш чере&-сутки от начала набухания их осталось менее 2/3 .от исходного-(табл. 2).

г .

Т?.5линз 2. Содержание белка (мкг на 1 зародыш) в зародышах, жизнеспособных и нежизнеспособных семян пшеницы.

Время набухания, ч Жизнеспособные _ Нежизнеспособные

2 162,6+3,0 71,0+3", 6

6 167,0+5,9 81,6+3,2

24 96,0+0,6 43,0±2,0

Сильнее содержание растворимых белков снижалось в зародышах искусственно состаренных семян. На 24 ч набухания в них обнаруживалось лишь бОХ'-от исходного количества. В результанте к концу эксперимента содержание белка в зародышах нежизнеспособных семян было в 2,2 раза ниже, чем в жизнеспособны;.:;, б. Изменение качественного состава белков зародышей жизнеспособных. и нежизнеспособных семян пшеницы.

■ Качественный состав белков изучали с помощью электрофореза в денатурируккдих условиях. В составе белков удалось различить 34 полосы, их которых доминирующйми являлись три- -с »юл. массами 19, 35, и Б5 кДа. В ходе 24-часового прорастания качественных изменений в белковом спектре не произошло, для оценки количественных различий гели после электрофореза сканировали (рис.1), по плоивди. пиков определяя содераание бели в каждой полосе.

Поскольку ошибка при измерении шторных компонентой на. дбнситограмме превосходила их различия между образцами, для-

• целей сренкенил пришлось ограничиться данным;: лишь для нескольких основных или сильно изменяющихся полипептидов (рис.2).

Оказалось, что уле в первые часы набухания в жизнеспособных семенах сильно снижалось относ1ггельное содержание белка с мол. массой 56 к Да, к 24 ч его содержание составляло всего 35% от исходного. Напротив, наблюдалось относительное у^гелпче.чне количества компонентов с мол. массой 31,6 и Е? кДа.

Рис. 1. Денситограммы растворимых' белков зародкпгй, жизнеспособных {$) и нежизнеспособных (£) семян пшеница й - после 2 часов, 0-6 часов, £ - 24 часов'.набухания.

У - 55 кДа, 2-45 кДз, 3 - 35 кДз, 4-31,5 кДз,' В - 27 кДа.

Компонентный состав белков зародышей семяя, потерявшее всхолесть в результате искусственного старения, с основной повторил спектр белков ■ жиэкеспосйбных семян (рис. - 1,2): Количественные различия между жизнеспособными . и нежизнеспособными семенами ко второму часу набухания ьыузгилкгь как в снижении вклада нескольких мкпорньп;

" - 11 -

компонентов (рис. 1), так и а падении относительного содержания белка с мол. массой 45 кДа (рис. 2).

Рис. 2. Относительное содердзние белка пяти основных пмсоз после 2 (светлые столбики), 6 (штриховые) и 24 (темные) часов набухания, а - лнэнеспоссбные семена; б - неггаэ неспособные. Нумерация пептидов как на рис.1. .

Различия усилились в ходе набухания. Так, у нежизнеспособных семян полипептид с мол. массой 45 кДа, относительный уровень которого сильно упал уле после искусственного старения, . епэ более снизился и к концу эксперимента содержание его составило всего половину от уровня на 2 ч набухания. Наконец, качественные различия 'между жэнеспособными и нежизнеспособными семенами проявлялись в том, что 3 полосы из области 20-30 кДз, к 24 ч совсем исчезли (рис.-#). е. Изменение фракционного состава белгав зародылей лизнеспо-собних и нелизнеспособких семян пшеницы

Фракционный состав белков изучали после диализа. 6'е-лко*-

еых экстрактов. ■ Электрофоретический спектр глобулинов показал, что в зародышах жизнеспособных семян глобулины . -представлены 3 полосами , соответствущиаипептидам с мол. массой 56, 35 и 19 кДа (рис.3). Зги полипептиды являются основными в общем спектре белков (ср. рис.1).

Качественной разницы между глобулинами зародышей жизнеспособных и нежизнеспособных семян, не обнаоужено. Все остальные, полосы в элекпюфоретическом спектре растворимых белков зародыша пшеницы соответствовали альбуминовым белкам.

6 24 2 6 24

2

■»■уулгг-

94 . 67,

43 Ъ..

30'

( <

20,, | 14*1

С I

Рис. 5. &лектрофореграмма глобулинов зародышей жизнеспособных (а) и нежизнеспособных (б) семян пшеницы после' 2,6 и 24 ч набухания.

3. Некоторые метаболические изменения. происхЬдядше в заро-рыдзх семян пшеницы на начальных этапах прорастания и при потере жизнеспособности.

Данные о метаболических изменениях, происходящих в семенах во время прорастания (Мэйер, 1982; Гумилевская, 1990; Обручева , 1991; Бигш, 1994), сводятся .в основном к иссле-

■ - 13 -

дованию метаболизма семян целиком и эатоагивают вопрос' о мобилизации веществ и дальнейшем их использованием растущим проростком (Зайнтрауб с соавт., 1990; Белозерский с соавт., 1590; ОакБ, 1983; НагаЬа1а а1.. 1983). Однако растворимые бедси зародышей •злаков значительно отличаются от запасных Селяйв эндосперма, их метаболизм слабо изучен и в болыйшс-'' тве работ исследованы более поздние этапы пггарастания (уже в фазе роста проростка)(вгге1огак а1.4 .1982; 0аЪ1а;еС а1, 1983). Поскольку наша цель состояла в выявлении тех метабо- ■ лкческих изменений,, которые происходят на начальных этапах прорастания, были изучены изменения белков зародышей семян пшеницы в период от начала набухания до про клевьгв алия пер-, вичного корешка. • . а. Синтез белка в зародышах семян пшеницы на начальных этапах прорастания и при. потере жиэвеспособноотк. . .

, ' Включение 14С-аминокислот в белковые компоненты ёарСзды» . шей жизнеспособных семян началось уда с самого начала набухания (интервал 0-2 часа) (данные не приведены), но значительно более интенсивный синтез белка обнаоуживался к концу эксперимента.

На рис. .4 видно, что в интервале между 22 и 24 часами в зародышах аизнеспособных семян включение метки пооисходило в ■ 14 белковых полос, среди которых преобладали относительно высокомолекулярные ко.ионенты в области '45-68 кДа. В (.меньшем . размере паоисходил синтез нескольких нйзкомолекулярнкх пЬли-пэптэдов (мол.масса 19-42 кЛз). Однако не-наблюдалось синтеза основных запасных глобулинов зародышей семян пшеницы смол. гассзми .36 и 55 кДэ. В зэродкшах искусственно состаренных с е.'.*-ЛН включения метки в бт>лки не сбнарутралось совсем.

| - 14 -

¡Рис. 4. Денситограмма раство-'римых белков зародышей сеыяй .пшеницы после электрофореза в ' денатурирующих условиях (1) и ¡последующей флюорографии (2).

•"'аАА А ^ А

" " " 3020 14 *Д

84 67 43

б. 31змененк9 протеолитической активности на начальных этапах прорастания и при потере миаиеспссобности.

1

1

I

I

I I

б .24 . 72

БР01Я НАБУХАНИЯ, Ч ;......

Глс. 6. Изменение активности шэлочяой протеаэы зародышей жизнеспособных (светлые сголбнкй) и нежизнеспособных (ааштрихс)-¿анные столбики) семян пшеницы.. '

Гидролитическая активность галочкой псотеазы эа(5одизей жизнеспособных семян проявлялась в первые же часы набуханая и постепенно возрастала, увеличиваясь на 40£ к 6 ч и на ШХ к 72ч (рис.5). Значительной оказалась активность склочной прстезгы зародышей нежизнеспособных семян к-2 ч набуханий,%а к 5 происходило еще большее увеличение активности этого фар-" мента. Напротив, к 24 ч активность падала до уровне 2 Ч Я й дальнейшем продолжала снижаться. К 72 ч гидролитическая активность палочной протеаэы зародышей нежизнеспособна* ' ееУСШ была уже в 2 раза меяьие по сравнению с 2 ч.

При электрофоретическом изучении спектров г^ЛоЧйоЛ tipo-теззы установлено, что в зародышах жизнеспособных й ПОТвеяа-Eiiíx всхо.т.есть семяя-после 2 и.б ч набухалжя фермент Представлен одним компонентом, ииесда иол. массу 45 кЛа (рИс. в, ср. с рис. 2). ' . .

Рис. б.'эяектрйфзрёпяеския ййеКтр фЯЗчййх протеаз йародькьей жга неспособных

(1) И Нежизнеспособных

(2) ОёМяй пшеницы после 2, 6 1! 24 ч набухания. .

94 67 43 30 20 tí

- 16 -

К 24 чу зародышей жизнеспособных семян появлялись три новые изофермента'с ¡.юл. массой 116; 1D5 и 96 кДа. В зародышах потерявших всхожесть семян новые изофорш протеазы не обнаруживались.

в. Изменение лактиновой активности растворимых белков зароды-• шей семян пшеницы на начальных этапах прорастания 'и при потере жизнеспособности.

toit видно из рис.", к 2 ч набухания лектиновая активность экстрактов растворимых белков зародышей жизнеспособных семян довольно высока. К 6 ч набухания наблюдалось падение активности в 3 раза по сравнении с 2 ч, а 24 ч характернзо-

...........ВРЕМЯ НАБУХАНИЯ. .4

Рис. 7. Лектиновая активность растворимых белков зародышей , ':"

лизнеспособны? (сплошная линия) и нежизнеспособных (преры- "7

вистая линия) семян пшеницы. • - _ - ■

Э!ссгракты растворимых белков, полученных I» зародыаэй ,.

нежизнеспособных семян, .только после 2 ч набухания характв-

ч

ркэовзлксь значительной лектиновой активностью. К 6 ч она

- 17 -

резко падала и к 24 ч уже не обнаруживалась совсем. • 4. Изменение состава растворимых белков зародышей семян пшеницы в процессе развития зерновки.

а Изменение количественного и качественного состава оасгво1 ришх белков зародышей семян пшеницы на разных этапах развития зерновки. •- .

В ходе развития зерновки заметно увеличивалось содержание растворимых белков (табл. 3). Вслед за довольно низким количеством белка зародышей в возрасте 16-17- дней "после цветения следовало резкое увеличение содержания белка. За 3-5 дней после цветения оно возрастало в 6 раз по сравнении с 16-17 днем. В дальнейшем происходило значительно более медленное увеличение количества белка (ецэ на 4.07.), которое оставалось после 39-40 дня практически неизменным до конца созревания ( 48 дней после цветения).

Таблица 3. Содержание белка в зародышах сешн пшеницы на разных этапах развития зерновки

Дни после цветения Белок на 1 зародыш (мкг)

16-17 18± 6

20-21 103± 7

27-28 . 94+13

39-40 - 139+16

.46 143+10

Как видно из рис. 8, спектр растворимых белков зародышей семян пшеницы формируется очень 'рано. Качественных изменений до Конца созревания практически не- наблюдалось. Напротив, в 'течение развития зерновки произошли довольно четкие количественные кзмэненил отдельных компонентов (рис. .9)...

Как видно из рис.9,- на 16-17 день после цветения боль-

пая доля белка принадлежала двум основным пептидам с юл. массой 66 и "35 кДа, которые, как уже отмечалось , являпся основными глобулинами зародышей пшеницы. При этом содержание глобулина с мол. массой 35 кДа в 2 раза превосходило

содержание глобулина с мол. массой 56 кДа. а б_ в г р __

94

" .« 67

^ ^ » 43

£ « » 4 •

» Ь -т

У г *

30

20 .. 14

Рис. 8. Спектр растворимых

белков зародышей - семян

пшеницы на разных этапах

развития зерновки.

а .- 16*1? дней б - 20-21 £ - 27-28 г - 32-33 д - 39-40 в - 46

40

30

10

о

□ 16-17 дней

ЕЗ 20-21

® 27-28 0 32-33 ШГ 39-40 Ш 46

Рис.9. Содержание белка пяти основных пиков на разных этапах развития зерновки. Относительное количество белка в каждом пике выражали в У. по отношению к общей площади всех пиков. Нумерация пептидов как на рис. 1.

- 19 -

Особенно резкие изменения происходили с пептидом с мох массой 56 кДа, количество которого в два раза увеличи-. лось на этапе 20-21. день после цветения. К 27-28 дню происходило дальнейшее увеличение относительного количества этого Белка (на ¿/07. по отношению к 2Р-23 дня) и в дальнейшим практически не менялось до конца созревания. Хэтя и наблюдалось-' некоторое уменьшение относительного количества полипептида с шх массой 35 кДа вплоть до 27-28 дня, но на фоне обпэ.го увеличения содержания растворимых белков (таОх ,3) в-этот • ■период его абсолотное количество значительно увеличивалось. 1Ьслэ Дней после цветения происходило некоторое увели-

чение относительного количества этого полипептида, особенно четко выраженное в конце созревания. Отчетливые изменения происходили и с пептидом с мох массой 45 кДа, который, как уже отмечалось, -'является щелочной протеазой зародыгай пшеницы. Количество этого белка возрастало на; каждом из отмеченных этапов после цветения. Шнее заметные изменения происходили с пептидами с мохшссай 31,5 и 27 кДа. б. Изменение лектшовой активности растворимых белков'зароды- • кей семян пшеницы на-разных этапах развития зерновки

В ходе' развития зародьпей ппеницы наблпдалось значительное изменение в лекгиновой активности белковых антрактах (рис.10). В период 9-10 дней после цветения она составляла 94.2 мкг на 1 зародыш (данные .не приводятся). К 16-17 дням после цгетения наблюдалось раакоё'увеличение лектшюЕОй активности (рис. 10). Она составляла 0,28.пег на 1 зародка , 'что приблизительно г 100 раз больше по сравнения с предыду-. сим периодом. ' К 20-21 дню после цветения активность снижалась в 6 раз по отнешэшш к 16-17 дня, по вновь возрастала к

£7-28 дню после цветения, достигая уровня 16-17 дня, продолжая увеличиваться до 39-40 дней после цветения. Далее 'до конца созревания уровень лектиновой активности растворимых белков зародыша практически не менялся.

ко

№ аз-

ай!

16-17 20-21' 27-28 39-40 46

ДНИ после'цветения

Рис. 10. Лектиноваяактивность 'растворимых белков зародышей семян пшеницы на разных этапах развития зерновки.

, ■ ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Полученные результаты показывают, что в жизнеспособных семенах пшеницы метаболическая активность в зародышах инициируется очень рано, почти сразу вслед за началом набухания. В комплексе изменений, происходящих с белками зародышей «из-неспособных семян на ранних этапах прорастания, удалось обнаружить некоторые, играющие, на наш взгляд, особую роль в .этот период. К ним можно отнести: быстюе расходование,запасного глобулина с мол. массой Б6 кДа , а также значитель-. ное увеличение протеолитической.и лектиновой активности.. Высокая протеолитическая активность, обнаруживаемая екэ. к 2 часу набухания в эародыищ жизнеспособных■ семян, • вероятно, ; обусловлена переходом этих ферментов из латентного в актив--

ное состояние (Яаракеева и др., 1983; Хисарова и др., 1987). Однако дальнейшее увеличение протеолитической активности, видимо, происходив уже за счет синтеза поотеаз de novo. Подтверждением этого является включение меченых аминокислот з области 45 кДа, где, по нашим данным, выявляется щелочная протеаза зародыша пшеницы . Появление новых изоформ этого ' фермента в более высокомолекулярной области, по всей видимости, происходит за счет синтеза их de novo. В значительной мере меняется и лектиновая активность растворимых белков за- • родыпей жизнеспособных семян пшеницы на начальных этапах прорастания. Высокая лектиновая активность в первые часы набухания, вероятно, связана с активацией синтезированного во время развития зерновки АЗП (Peumans et al., 1982), которому отводится основная роль среди лектинов зародыша пшеницы (Mishkmd et al/. 1932; Stinissen et al.. 1983; Raikhel et ai. ,1934). Сильное увеличение лектиновой'активности к 24-. наблюдаемое в зародышах только жизнеспособных семян, может быть обусловлено возобновлением синтеза этого гликопоотешга на начальных этапах посрастания, как это было показано на семенах пшеницы (?еи.т£П£ et al. ,1982).

В комплексе изменений, являющихся результатом искусственного старения зерновок пшеницы, удалось вычленить те, которые в' наибольшей мере могут быть ответственны за потерю in жгзнеспособности. К ним можно отнести значительное снижение сбвдго содержания растворимых-белков, в основном за счет ум?Hiпения количества'функциональных альбуминов клетки. К этим б ел: сам относятся три из изоФерментов р?яочиыя гтпогенз,-кмсгшно. мол. массы 115, 105 и S6 кДа, гатсрые, в отличие от гягаяэспособшяс семян, яэ скяггзвдттгся к 24 чяоу пророста-

ния, что и является одной из вероятных .причин значительного падения протеолитической активности в нежизнеспособных семенах к этому времени. Второй группой функциональных белков' являются лектины,-исчезновение активности которых может бить еще одной из причин потери жизнеспособности семян.

Большая часть выявленных нами белков присутствует в зародыше на ранных этапах развития зерновки, что и обусловливает способность зародыш к прорастанию ещр на этапе формирован:'-} зерновки. Характерно, что глобулин с мох массой Б6 кДз синтезируется и накапливается быстрее, чем глобулин с иол. массой 35 кДа, накопление которого происходит до самого . конца созревания. В то же время распад глобулина с мол.. массой- 56 кДа во время прорастания происходит раньше, чем глобулина с мол. массой 35 кДа. Таким образом, динамика накопления и мобилизации запасных глобулинов зародышей пшеницы в значительной степени похожа на динамику накопления и рас-• ходования глиадинов эндосперма злаков (Павлов и др., 1975; Заироэ, 1987). В ходе развития'зерновки значительно увеличивалось количество полипептида с мол. массой 45 кДа. Как уле отмечалось, этот белок является щелочной протеаэой зародыша пшеницы и значительное увеличение ее количества в конце созревания, вероятно, сопряжено с латентизацией этого фермента.

ВЫВОДЫ

1'. Оптимальными условиями выделения растворимых белков зародышей жизнеспособных и нежизнеспособных семян пшеницы является экстракция фосфатным буфером рН 7,5 с последущиы доэкстрагированием 2М МаС1. ... -••'•.

2. Потеря зерновками жизнеспособности сопровождается 4 значительным снижением содержания растворимых белков зароды-

- 23 -

шей, усиливающимся в ходе набухания семян.

3. Спектр растворимых белков зародышей как жизнеспособных , так и нежизнеспособных семян в ПЛАТ в присутствии ДЦС-Na образован 34 компонентами, из которых 3 полипептида с мол. массой 20-30 кДз исчезают у нежизнеспособных семян к 24 часу набухания. •. . •

; 4. Нз основании Экстрагируемости солевыми растворами, массового содержания, накопления при формировании .семян.- й быстрой траты на начальных этапах их прорастания сделан вы-' вод, что. белки с мол. массой 55. 35 и 19 кДа являются основными запасными глобулинами зародышей.

Б. Синтез растворимых белков в эаоодышах жизнеспособных семян начинается уже ,в течение первых двух часов набухания, увеличиваясь к 24 часам в основном за счет включения 14С-аминокислот; в высокомолекулярные компоненты белкового спектра. В зародышах нежизнеспособных семлн синтез белка н§ обнаруживается.

6. Щелочная протеаэа зародыхей зрелых семян представлена одним пептидом с мол. массой 45 кДз, через 24 часа' набухания у жизнеспособных зародышей появляются еще 3 изоформы и области 115-95 кДз, о синтезе их de novo свидетельствует включение метки из 14С-зминокислот.

7. Активность щелочной протеазы, близкая по величине у зародышей жизнеспособных и нежизнеспособных семян в пешзке часы нзбухан.'м, у жз:знеспосббных*.к 24 Часам значительно увеличивается, тогда как'у нежизнеспособных снижается почти в 3 '.раза.. - ' ' . -

Э. В зародышах сеьлн пшеницы показана значительная лек-т'п;о23л активность. После падения к 6 часам набухания у

неспособных семян лектиновая активность, к 24 часам восстанавливается, у нежизнеспособных исчезает полностью. Соответствующее по времени исчезновение нескольких полос белко-еого спектра у ■ нежизнеспособных зародышей в области 20-20 кДэ. мэ.чьо рассматривать как подтверждение их лектиновой при-роди. . ' (

'3.//в ранних стадиях развития семян на растении, еще до появления способности зародышей к прорастанию полностью формируется весь спектр растворимых белков, тогда как количество белка продолжает увеличиваться до конца созревания.

10. В качестве основы для разработки метода непрямого тестирования посевных качеств семян пшеницы шгут Сыть использованы следугщ;е отличия нежизнеспособных семян от низ-неспособных : пониженное содержание растворимых белков, исчезновение полипептидов в области 20-30 кДа, отсутствие новых изофоры протеазы, снижение протеслитической и исчезновение лектиновой активности.

Список работ опубликованных по теме диссертации:

1. Ангелона а С., Ц^чланашвили В. Я Сравнительное исследование ускоренно и естественно состаренных се млн ппеницы. Второй съезд ВОФР (Минск 24-29 сентября 1990г.). Тез. докл. Шсква. 1992. С. 13.

2. Ангелова В. С., Щутпанашвили а И., Холодова RIL Электрофоретический спектр растворимых белков зародысей семян птеницы в связи с жизнеспособностью//й!Экологкя растений. 1993. Т. 40. N 2.-С. 271.

3. Ангелова В. С., Холодова а С. Выделение растворимых белков на зародышей семян пвеницы разной жизнеспособности//

v Физиология растений. 1993. N 6. (в печати).