Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Физиолого-биохимическая характеристика ответа семян гороха на тепловой стресс в период прорастания

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Физиолого-биохимическая характеристика ответа семян гороха на тепловой стресс в период прорастания"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ОРДЕНА ЛЕНИНА ИНСТИТУТ БИОХИМИИ им. А.Н. БАХА

РГЗ од

^ т г. V ■ на правах рукописи

АРАБОВА ЛИДИЯ ИВАНОВНА

УДК 571.123; 571.1

ФИЗИОЛОГО-БИОХИМИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ОТВЕТА СЕМЯН ГОРОХА НА ТЕПЛОВОЙ СТРЕСС В ПЕРИОД ПРОРАСТАНИЯ.

03.00.04 - биологическая химия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА - 1996

Работа выполнена в лаборатории метаболизма азота и биосинтеза белка у рутений Института биохимии им. А.Н. Баха Российской Академия Наук.

Научный руководитель: доктор биологических наук

H.A. Гумилевская.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

профессор P.C. Шакулов, кандидат биологических наук A.C. Степанов.

Ведущая организация: Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН.

Защита диссертации состоится нюня ШЧв г в_часов

на заседании Снециализироваииог Совета (К 002.9fi.01) по присуждению ученой степени кандидата биологических паук в Институте биохимии им. А.Н. Баха РАН (1 17071, Москва, Ленинский проспект, 33. корн 2.).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологической литературы РАН (Москва, Ленинский проспект, 33, кори. 1).

Автореферат разослан " 18 " мая 19% г.

Ученый секретарь Специализированного Сонета, доктор биологический паук

М.И. Молчанов

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы: Семена растений в период прорастания часто оказываются в неблагоприятных внешних условиях и испытывают действие различных экологических стрессов, которые негативно влияют на их всхожесть и энергию прорастания, а также на рост, развитие и продуктивность растений. Одним из наиболее важных факторов внешней среды, регулирующих процессы жизнедеятельности на всех стадиях развития растения, является температура. Семена, находящиеся в состоянии вынужденного покоя, обычно способны прорастать в широком диапазоне температур. Однако, постоянная температура набухания вблизи 40°С для семян многих видов растений оказывается критической и затрудняет прорастание (Thompson, 1978; Bewley, Black, 1984). Действие длительного теплового стресса на метаболизм прорастающих семян исследовано пока мало и преимущественно на семенах однодольных растений, адаптированных к условиям жаркого климата. Молекулярные механизмы негативного действия повышенной температуры на прорастание и причины неспособности клеток оси перейти к росту растяжением при высокотемпературном набухании пока остаются неясными и требуют дальнейших исследований.

В то же время известно, что кратковременное повышение температуры на 8-10°С выше оптимальной температуры роста вызывает в растительных клетках, как и в клетках животных и микроорганизмов, быстрые временные и обратимые изменения в экспрессии генов, приводящие к индукции синтеза специфической группы полипептидов - белков теплового шока (БТШ) и ослаблению или прекращению синтеза нормальных клеточных белков (Key et al., 1985, Nagao et al., 1986). Универсальность и консерватизм ответа на тепловой шок свидетельствуют о его важной роли в физиологии клетки. Имеется много данных о наличии положительной корреляции между синтезом БТШ и проявлением термальной устойчивости или термотолерантности у растений. Предполагается, что накопление БТШ в клетке является существенным фактором защиты от тепловых повреждений (Kimpel, Key, 1985а; Lindquist, 1986; Nagao et al., 1986).

Из общих представлений о характере клеточного ответа на кратковременный тепловой стресс следует, что в набухающих семенах в случае действия повышенных температур синтез нормальных клеточных белков и их мРНК должны быть временно замещены синтезом БТШ и их мРНК. Но такая ориентация клеточной активности входит в противоречие с метабо in чески ми задачами, выдвигаемыми программой прорастания, которая предусматривает максимальное развитие белок-с/штезирующей активности, синтез всех типов РНК, восстановление нативной структуры клеточных мембран и формирование функционально-активных митохондрий. Очевидно, что набухающие семена оказываются в сложной ситуации при действии повышенных температур: с одной стороны, они должны защитить себя от неблагоприятного действия теплового стресса и инициировать для это-о синтез

БТШ, а с другой стороны, решить проблему собственно прорастания, т.е. перейти к реализации новой генетической программы к обеспечить синтез необходимых для этого клеточных белков и их мРНК. Изучение ответа на тепловой стресс в период прорастания семян представляет общебиологический интерес, так как способствует раскрытию регуляторных механизмов экснрессни генов, пониманию биохимических основ прорастания и молекулярных механизмов адаптации и устойчивости клеток к повреждающим воздействиям внешней среды.

Несмотря на определенные успехи в этой области, многие вопросы пока остаются нерешенными. Открытым остается вопрос о способности зародыша поддерживать необходимый для прорастания уровень белкового синтеза и осуществлять само прорастание при действии короткого и длительного теплового стресса, о характере взаимосвязи между тсрмоустойчивостыо семян в период прорастания и их способностью индуцировать ответ на ТШ, а также между качеством семян и силой их ответа на ТШ при прорастании. Неизвестны молекулярные механизмы негативного действия длительного теплового стресса на процесс прорастания. Мало изучены в этом отношении семена бобовых растений. В связи с этим представляло интерес исследовать действие теплового стресса на процесс прорастания семян бобовых растений и на ключевые метаболические события, участвующие в его подготовке, на такие как мобилизация запасных отложений в осевых органах и на синтез белка in vivo.

Цель и задачи исследования: Целыо данной работы была физиолого-биохимнчсская характеристика ответа семян гороха Pisum sativum L. на кратковременный и продолжительный (хронический) тепловой стресс на начальных стадиях прорастания, в период. подготовки зародыша к возобновлению ростовой активности. Были поставлены следующие конкретные задачи: 1) исследовать действие короткого и длительного теплового стресса на процесс прорастания; 2) изучить влияние короткого и длительного теплового стресса на мобилизацию запасных отложений в осевых органах зародыша; 3) оценить действие короткого и длительного теплового стресса на уровень трансляции in vivo в зародышевых осях; 4) исследовать илняпие короткого и длительного теплового стресса на картину синтезируемых in vivo нолинептидои в зародышевых осях.

Научная новизна и практическое значение работы: В результате проведенного исследования впервые охарактеризовано действие кратковременного и хронического теплового стресса на процесс прорастания семян гороха, на мобилизацию белковых отложений в осевых органах зародыша и на синтез белка in vivo. Выявлена значительная термочувствнтслыюсть осевых органов зародыша к хроническому действию теплового стресса. Физиологическим отпетом на непрерывное действие повышенных температур (36-40°С) является прогрессивное угнетенно процесса прорастания. Присутствие семенной кожуры повышает термочувствнтслыюсть осевых органов зародыша Кратковременный ТШ (2-4 ч, 40"С) на всех стадиях прорастания хорошо

переносится зародышем и ие влияет на его прорастание. Установлено, что ранний нротсолнз в осях не зависит от присутствия семенной кожуры и семядолей и полностью подавляется при высокотемпературном (40ЛС) набухании. Термочувствителыюсть процесса мобилизации собственных запасных отложений в осях может быть одной из причин негативного действия повышенных температур на прорастание семян. Обнаружено стимулирующее действие ТШ па начальный синтез белка. Клетки осевых органов отвечают на короткий ТШ синтезом полного набора БТШ с первых часов набухания за счет трансляции нреформированных мРНК н новосинтезированных мРНК. Большинство "нормальных" мРНК не имеют, трансляционных ограничений при TIJJ, и на всех стадиях прорастания сив тез БТШ сопровождается активным синтезом основной массы полипептидов, продуцируемых осями при нормальны" температурные условиях. Эта особенность ответа на ТШ может способствовать гщаптации метаболизма зародыша к неблагоприятным внешним условиям, повышать его термоустойчивость и обеспечивать завершение прорастания. При хроническом высокотемпературном стрессе клетки осевых органов не способны осуществить саморегулируемое превращение индукции БТШ и возвратиться к нормальной картине экспрессия генов, обеспечивающей прорастание. Общий уровень синтеза белка при этом не является критическим для прорастания. В результате проверенной работы получены новые данные о ключевых процессах метаболизма, участвующих в подготовке прорастания, и действии теплового стресса на эти процессы.

Апробация работы: Основные результаты работы были доложены на III съезде Всероссийского Общества Физиологов Растений (г.Санкт-Петербург, 1993), на конкурсе на лучшую научную работу ¡995 года (3-ья премия).

Публикации: По материалам диссертации опубликовано 6 печатных работ.

Структура и объем работы: Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной час"!, заключения, выводов и списка цитированной литературы. Работа изложена на стр. машинописного текста, иллюстрирована_рисунками и_ таблицами. Список

литературы включает __ работ.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ ■ ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объект. Работу проводили на семенах гороха Pisutn sativum L. сорта "Бега", предоставленных НИИССОК, хранившихся при 10-12°С после сбора урожая не более 1-2 лет. В некоторых случаях использовали сорта "Изумруд", "Бптю! ', "Смарагд", "Богатырь", 'Адагумский" и "Победитель". Семена гороха сорта "Победитель" хранились при комнатной температуре более 5 лет. Все использованные семена имели хорошую (более 90%) всхожесть в момент постановки опыта.

Условия прорастаиия. Для получения целых зародышей сухие семена стерилизовали с поверхности 10% гинохлоритом кальция в течение 2 мин, отмывали холодной проточной водой в течение 1 ч, споласкивали бидистил-лированной водой, обсушивали фильтровальной бумагой,-отбирали равные по величине неповрежденные семена и удаляли вручную семенную кожуру. Полученные таким образом целые зародыши гороха проращивали при соответствующем температурном режиме в термостате в темноте в стерильных чашках Петри, помещенных в кюветы, прикрытые стеклом. Средой для прорастания служила бидистиллированная вода, содержащая хлорамфени-кол (50 мкг/мл). Хлорамфеникол в концентрации 50 мкг/мл не влиял на развитие проростка, включение и поглощение меченых аминокислот (Скаженник, 1982). Бидистилироваиную воду и пипетки автоклавировали. Стерилизованные с поверхности иитактные семена проращивали аналогичным образом. В опытах с изолированными зародышевыми осями последние отделяли от зародышей после 1,5 или 2 ч набухания и проращивали, как описано, в чашках Петри на влажной фильтровальной бумаге.

Постановка опытов но действию повышенных температур на нропесс прорастания. Были использованы три варианта тепловой обработки: 1) Короткий тепловой шок (4 ч, 40°С) в различное время после начала набухания при 28°С в течение 48 ч. 2) Тепловой стресс различной продолжительности. Зародыши и семена набухали в течение нервы\ 4, 8, 12, 15 или 24 ч при 40°С, после чего их переносили на 28°С и следили за прорастанием до 72 ч от начала набухания. 3) Непрерывный тепловой стресс. Зародыши или семена проращивали при постоянной температуре в 25, 28, 34, 36, 38 или 40°С в течение 72 ч.

Опенка процесса прорастания. Влияние повышенных температур па прорстстание оценивали по его действию на проклсвыванис и на динамику роста зародышевого корешка. О завершении прорастании иптактпых семян судили по ироклевывашпо (Веш1еу, 1982). Пр.; использовании целых зародышей, т.е. семян с удаленной семенной кожурой, о завершении прорастания судили на основании увеличения длины зародышевого корешка. Полная длина зародышевого корни под семенной кожурой у только наклюнувшихся интактпых семян составляла 4,5-5,5 мм. Па этом основании набухшие ;шродыши с эквивалентной длиной корпя считали завершившими прорастание пли "проклюнувшимися". Порции интактпых семян или целых зародышей (по 50 штук) в 2-3 повторпостях проращивали, как описано выше, при соответствующей температуре и периодически оценивали процент прорасг мня но числу проклюнувшихся семян или зародышей. Одновременно с этим измеряли д.шну растущего корня и дифференцировали материал ао атому показа гелю на 4 группы,'для чего оценивали процент семян с длиной проклюнувшегося корпя до,2.ям'(1), от, 2 до 5 мм (2), ог 5 до 15 мм (3) и ог 15 до 2Г> мм (1) или процент зародышей, у которых кореш, удлинялся на указанную величину'.•''Критерием и оценке. г-коросш нрорлп.ншя служила величина

Тбо , то есть время, необходимое для прорастания 50% зародышей (или семян).

Условия мечсиия белков in vivo. Для инкубации с меткой о. жрали 7 зародышей, обсушивали их фильтровальной бумагой (если зародыши предварительно набухали), помещали в стерильные чашки Петри (с1=25мм) с 3 мл стерильной бидистиллироваиной воды, содержащей хлорамфеникол (50 мкг/мл) и меченые аминокислоты, прикрывали крышками и инкубировали в темноте при соответствующей температуре в течение необходимого времени. В качестве меченых предшественников использовали з;58-метионин отечественного производства с удельной активностью 8,5 ПБк/моль в количестве 1,85-2,59 МБк/мл инкубационной среды или смесь 15-ти равиомер-номеченых ыС-аминокислот или 14С-гидролизат (1,37 ГБк/мАтом С производства фирмы Chernapol ЧСФР) в количестве 2,24 МБк/мл. После окончания времени инкубации с меткой зародыши отмывали от инкубационной среды большим объемом холодной дистиллированной воды, а в опытах с •^S-mcthohiihom дополнительно 0.1% раствором немеченого мстионина, про-' сушивали на фильтровальной бумаге, отделяли зародышевые оси от семядолей и замораживали в жидком азоте.

Получение суммарного препарата белка осей. Замороженные оси (6-7 шт.) гомогенизировали в холодной 10% ТХУ, выдерживали гомогенат в ледяной бане в течение часа, собирали ТХУ-осаждаемый материал центрифугированием (6000 об/мин, 15 мин), трижды промывали его холодной 7% ТХУ и трижды холодным ацетоном, после чего растворяли в 1 мл буфера для образца, содержащего 8 М мочевину, 2% ДС-Na, 5% 2-меркаптоэтаиол, 62,5 мМ трис-НС1-буфера, рН 6.8, 1 мМ фенилметилсульфонилфторид (ФМСФ) и 0.01% бромфеноловыи синий. Пробы прогревали 3-4 мин при 100°С , охлаждали, удаляли центрифугированием (6000 об/мин, 10 мин) нерастпорившийся небелковый материал. Надосадочную жидкость использовали для анализа суммарного белка зародышевых осей методом ДС-Na-' электрофореза и для измерения включения меченых аминокислот в белок.

Получение альбуминовой и глобулиповой сЬоакиий. Суммарные соле-растворимые белки экстрагировали 1 М NaCl и 0.1 М трис-HCl буфере рН 8,0, содержащим 1 мМ ФМСФ, на холоду в течение 2 ч при перемешивании. После центрифугирования при 15000 об/мин в течение 20 мин, экстракт диализовали на холоду в течение 48 ч. Водорастворимые белки (альбумины) отделяли от выпавших в осадок глобулинов центрифугированием при 20000 g в течение 20 мин. Осадок глобулинов промывали 2 раза холодной дистиллированной .юдой. Препараты альбуминов и глобулинов для электрофореза готовили, как описано выше, используя для этого осаждение белков ТХУ, ее удаление ацетоном и г>а-творсние осадков в буфере для образца.

Субклеточное фракционирование осей. Замороженные оси измельчали в 0,25 мМ растворе сахарозы, приготовленном на буфер (50 мМ Трис-НС1 рН 7,4-7,6, 25 мМ КС1, 10 мМ Mg-ацстата), содержащем 1 мМ ФМСФ.

Гомогснат фильтровали через 4 слоя марли и центрифугировали 10 мин при 3000 g, а затем 20 мин при 20000 g. 20000 g-осадок суспендировали в среде для гомогенизации, промывали однократным псрсосаждснисм и ресуснен-дировали в той же среде. Белки 20000 g-центрифугата и 20000 g-осадка осаждали ТХУ и готовили препараты для электрофореза, как описано.

Определение ердержания белка проводили по методу, основанном на связывании красителя амидового черного 10В с белком, фиксированным на фильтровальной бумаге Ватман ЗММ с помощью ТХУ и количественной элюции связавшейся краски (Bramhall ct.al.,1969; Скаженник и др., 1981).

Измерение включения и поглощения меченых аминокислот. Радиоактивность в ТХУ-осаждаемой фракции определяли методом бумажных дисков (Mans, Novelli, 1961). Материал наносили на диски фильтровальной бумаги Ватман 3 ММ, отмывали по стандартной схеме (холодная и горячая Т/о ТХУ, смесь спирта с эфиром и эфир). Радиоактивность измеряли в сцинтилляционном счетчике Intertechnlque SL-30 или SL-4000 и выражали в нмн./мин/мг бел1 . ТХУ-растворимую фракцию собирали количественно и доводили объем до 10 мл. Аликвоты (20 мкл) наносили на диски фильтровальной бумаги Ватман 3 ММ. Диски прогревали при Й0°С для удаления ТХУ и определяли радиоактивность. Рассчитывали суммарную радиоактивность кислоторастворимой фракции и гмражали се в ими./мин/мг белка ткани. Сумма ТХУ-растворимой и ТХУ-осаждасмой радиоактивности, выраженная в имп./мин/мг белка» может служить мерой общего поглощения метки тканью. Процент, который составляет радиоактивность, включенная в белок, от общего количества радиоактивности, поглощенной тканью, может служить мерой относительного включения и выражать долю, которую составляет включение от поглощения.

1-мерньн" ДС-Ма-гель-электрофорсз. Э. х'ктрофорез проводили в присутствии 0,1% ДС-Na, как описано рапсе (Скаженник и др., 1981), используя геленые пластины с градиентом концентрации акриламида 10-20% при рН 8,8 в разделяющем геле и 6% акриламида нри рН 6,8 в концентрирующем геле. Электродным буфером служил трис-глициновый буфер рН 8,3, содержащий 0,1% ДС-Na. Электрофорез проводили при постоянной силе тока в 25-30 мА в течение 6-7 ч при 4-(>°С. Все реактивы для электрофореза нерекрнсталлнзовыг «ли. Меченые белки выявляли радиоавтографически, используя рентгеновскую пленку РМ-1 или РМБ отечественного производства. Фотографии получали контактным способом. Для общей характеристики полннентидов и их обозначения при анализе картины белкового » лп-теза оценивали приблизительно величину кажущейся молекулярной массы интересующих нас компонентов. Для этого строили калибровочную кривую зависимости логарифма молекулярной массы маркерных белков от их элгк-трофоретнчсскон подвижности. В качестве маркерных белков использовали наборы белков фирмы Pharmacia и Serva, наборы, метилированных ИС: белкон фирмы AmiTsliam и препараты некоторых ферментов.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1.Действие повышенных температур на прорастание.

Было исследовано два типа высокотемпературного воздействия - короткое (2 - 4 ч в различное время после начала набухания) и длительное (непрерывное или хроническое). Для учета возможных сортовых различий анализировали семена нескольких сортов гороха, а для учета возможной роли отдельных структур семени использовали интактные семена, целые зародыши (семена, лишенные семейной кожуры) и изолированные зародышевые оси. Оценивали действие теплового стресса на проклевывание и на последующий рост корня.

1.1 Действие короткого теплового шока на прорастание. Наблюдения за прорастанием зародышей, подвергнутых кратковременному (2-4 ч, 40°С) ТШ в любое время в период между началом набухания и проклевыванием, показали, что во всех случаях "короткий тепловой стресс оказывался переносимым, не препятствовал возобновлению роста и лишь слегка задерживал проклевывание и немного замедлял начальное развитие проростка.

1.2 Действие непрерывного теплового стресса на прорастание. Результаты количественной оценки действия непрерывного теплового стресса на прорастание и динамику роста осевых органов у сорта Вега представлены на рис. 1 и 2. Аналогичное исследование было проведено еще на 2-х сортах семян гороха. Как видно из данных рис. 1, 2 набухание при повышенных температурах угнетает процесс прорастания и раннего роста не только целых зародышей, но и иатактных семян. Семенная кожура не защищает зародыши гороха от теплового стресса и даже наоборот, ее наличие усиливает негативное действие повышенных температур на процесс прорастания. Удаление семядолей и проращивание изолированных осей на воде при 28°С (рис. 3) приводит к тому, что они своевременно достигают размеров, адекватных размерам осей в проклюнувшихся или проросших зародышах (4,55,5 мм), однако, дальнейший их рост прекращается. При 40°С прорастание изолированных осей полностью подавляется, их размер остается на уровне, достигаемом осями набухших, но не проклюнувшихся семян (3 мм).

Таким образом, из представленных данных следует, что температура в 28°С при использованных нами условиях проращивания является оптимальной как для проклевывания, так и для дальнейшего роста проростка. Зародышевые оси семян гороха обнаруживают значительную чувствительность к продолжительному непрерывному действию повышенных те-нера-тур в период, предшествующий проклевыва'..ию, и практически неспособны возобновить рост при 40°-набухании. Прорастание как интактных семя:,, так и целых зародышей замедлялось в той или иной степени при незначительном повышении температуры набухания (34 -36°С) и < щестьенно угнеталось или совсем не происходило при 38 и 40°С. Максимальная температура прорастания, допускающая проклевывание не менее 50% семян ("ли зародышей) находится между ',' 38°С. Интактные семена более термоиувстви-

зародаши

семена

12 24

время прорастания

Рис.1. Температурные кривые прорастания целых зародышей и ин-тактных семян гороха сорта Вега. Зародаши и семена проращивали непрерывно при указанной температуре.

72 час

зародаш

семена

60

60

18 ч

Л,

24ч

X.

Щи.

■ I 1.111-

48ч

25° 60

28»

лГ

Ль

36°

38'

I т I

60

60

1234 1234 1234

40° 20

. п 111 о

24 ч

П 11 I

П 11 I

48 ч

Ж

ль

Лхи

72 ч

Рис.2. Динамика рос-25° та корня у зародашей и семян гороха сорта _ Вега при различных температурах набухания. В указанное 28' время после начала •

набухания измеряли _ длину корня и определяли процент ое-мян с длиной проклюнувшегося корня ¡_а_ до 2 мм (I), от 2 мм ,,0 до 5 мм (2), от 5 мм 36 до 15 мм (3), от 15 ; П Ги мм до 25 мм (4) от общего числа анализированных семян, и процент зародашей, ~4о° У которых корень удлинился на указан-

38'

1234 1234 1234 НУЮ ВвЛИЧИНу.

им

20

10

§ к

/

(^-ОЛО—1

группы

о о

•л...........

2 ■)

I, Н 10 о! -+.•

м т :2

V-/ (»п

ч

Рис.3. Изменение длины зародышевого корня при прораста- 0 нии. й- Целые зародаши при §8 ;

2- изолированные оси при 280;

3- изолированные оси при 28 в

присутствии 0,1 мМ; 4- 0,5 мМ;

5- ГкМ; 6- 5 мМ <ШСФ£ 7- изолированные оси при 40 .

I- полная длина зародышевого корня в проклюнувшихся семенах, II --время видимого прирастания (проклешвадшя) при 28 .

I г

* 1

тельны, чем целые зародыши, а рост проклюнувшегося корня более чувствителен к длительному тепловому стрессу, чем процесс проклевывания.

1.3 Действие теплового стресса различной продолжительное, л на прорастание. Далее мы попытались определить, какая продолжительность теплового стресса в 40°С является критической и оказывает необратимое инги-бирующее действие на способность семян прорастать и развивать проросток при последующем после стресса возврате к оптимальной температуре. Для этого зародыши различных сортов гороха подвергали тепловому стрессу (40°С) с момента начала набухания на протяжении первых 8, 10, 12, 15 или 24 ч, после чего переносили на 28°С и следили за их прорастанием до 72 ч от начала набухания. Полученные результаты показали, что, в большинстве случаев, шок в течение первых 8 часов набухания задерживает проклевывание на 8-10 ч, но последующий рост осевых органов проходит нормально, и через 72 ч они догоняют в развитии контрольные прорости. Исключение составили семена сорта Победитель, которые утрачивали жизнеспособность после 8 ч ТШ. Т1И в течение перзых 15 ч набухания оказался критическим для прорастания зародышей семян сорта Битюг и Смарагд и полностью препятствовал прорастанию зародышей этих сортов при последующем их переносе на нормальную температуру. Несколько большая термоустойчивость была обнаружена у зародышей и семян сорта Бега, Богатырь и Адагумский. Так, целые зародыши и интактные семена сорта Вега, перенесенные ¡га 28°С после набухания в течение первых 15 ч при 40°С, прорастали на 80-90%, но с определенной задержкой (»-чс. 4). Таким образом, продолжительность начального теплового стресса в 40°С, ведущая к потере жизнеспособности, может колебаться у набухающих зародышей различных сортов гороха от 8 до 20 часов. Пока остается неясным, являются ли различия в температурной чувствительности процесса прорастания, обнаруженные у различных сортов гороха, проявлением их генотшшческих особенностей или же следствием различий в качестве или силе использованных партий семян. Но тем не менее очевидно, что набухание при 40°С в течение первых 10 - 15 ч для зародышей некоторк*' сортов гороха не оказывается летальным. При возврате таких зародышей к нормальной температуре они способны прорасти, но для этого им требуется не меньше времени, чем зародышам, исходно набухавшим при ¿8°С. На основании этого молено предположить, что тепловой стресс з период набухания подавляет ряд ранних метаболических процессов, имеющих отношение к прорастанию, и при возврате к нормальной температуре эти процессы могут и должны быть вновь воспроизведены, чтобы произошло прорастание. Этим может объясняться задержка прорастания при переносе на 28°С после действия теплового шока различной продолжительности, а также замедл~ние прорастания при суп'е-роптимальных температурах набухания (34, 36°С).

1.4 Заключение. Таким образом, короткий ТШ в любое время от начала нябухания до проклевывания практически не влияет ла прорастание зародышей. У испытанных нами сортов семян гороха, несмотря на опреде-

зародыши_ семвна

Рис.4. Действие теплового стресса (40 ) различной продолжительности на последующее прорастание зародашей (Г) и семян ill) гороха сорта Бега нри 28u. I- Непреравное набухание при 28"; 2- набухание при 40 в течение первых §ч; З-Юч; 4- 12ч; 5- 15ч при 40 ^последующей инкубацией при 28 . На шкале указаны часа от начала набухания зародышей или семян.

РиЬ.5

k

Р8

: •vrj' Ш

р- f ~.ii

; © И

:«в1з

J si is.

— , „ • Ш. -

■•, if * ..

fc: if* ft •а» «•■•» U.,» ■«■»

ililia

f» *-«■ ?4 t*

ы ш ut ьш

*** vv mi.

■ ■ *>* ...

t*> v mi

f! I й Й

•«* r :: f

3 4 5 6

Рис.6

" 'W'^Tf

L 1 * v 1 -67 -iif i'Hi"^'

60 - j " J'

43

■Щ- 1

" '35 4Й- I

30 - ¿.j,>

-ЧГГ J* —ЧГ

I, t

20 -

тя?

we,

12 3

Рис.5. Распределение окрашенных белков осевых органов гороха сорта Победитель (I) и Вега (II) в ПААГ после Би5- электрофореза. Целые,.зародыши набухали перше 4ч (1-3) и 20ч (2.1,6} при 28° (1-4), при 40е7 (6); 17ч при 28° + 4ч при 40° (5).

Рис.6. Распределение окрашенных белков осевых органов . гороха сорта Вега в ПААГ после Ь05 -электрофореза. Изолированные оси набухали первые 4ч (I) и 17ч (2,3) пр.! 28° (12) или 40° (3)

Точками обозначены белки, содержание? которых снихается еа укаьакво» время наОухания.

* ■ П

ленные сортовые различия, общим физиологическим ответом на повышение температуры набухания в пределах 28-40°С является прогрессивное угнетение процесса прорастания. Сходным образом реагируют на повыи-лше температуры набухающие семена кукурузы (Riley, 1981), салата (Takcba, 1990) и других видов растений (Thompson, 1973; Bevvley, Black, 1982). Очевидно, что хронический или непрерывный тепловой стресс в период, предшествующий началу роста зародыша, делает клетки осевых органов зародыша ire способными преодолевать неблагоприятные последствия теплового воздействия и восстанавливать нормальный клеточный метаболизм, необходимый для успешного прорастания. На основании этого можно предположить, что какие-то ранние метаболические процессы, существенные для гпорастания, подавляются при повышенной температуре набухания. Однако, можно видеть, чтс глохое прорастание при повышенной температуре не может быть следствием нарушения процесса поглощения воды сухими зародышами (рис. 7). Механизм негативного действия повышенных температур на процесс прорастания пока остается неясным, и поиски мета-болических звеньев, ответственных за термочувствителышсть процесса прорастания, сохраняют свою актуальность.

Результаты, полученные на зародышах кукурузы, дают основание считать, что процессы дыхания, поглощения воды и окислительного фосфори-лировашш не могут лимитировать процесс прорастания при повышенных температурах и что следствием высокотемпературного набухания (41°С) является снижение активности ферментов, участвующих деградации запасных отложений (Riley, 1981; Basra et al., 1989).

2. Действие теплового шока на мобилизацию белковых отложений.

Существует точка зрения, что на стадии набухание - проклевывание клетки зародышевой оси используют собственные запасы для своих метабо- ' лическнх потребностей, а мобилизация семядольных отложений происходит позже, на стадии проклевывание - всходы (Bain, Mercer, 1966; 1966а; Murrey, 1984). Таким образом, процесс мобилиз: щи собственных запасных отложений в органах зародышевой оси, очевидно, играет важную роль в подготовке прорастания. Тем не менее, ппямых данных о раннем распаде белков в осях зародышей двудольных растений пока очень мало, а в отношении семян гороха этот вопрос длительное время оставался открытым (Murrey, 1979). Практически ничего неизвестно о действии короткого и длительного теплового стресса на этот процесс. В связи с этим была поставлена задача выяснить: 1) происходит ли распад белков в зародышевых осях гороха в период, предшествующий видимому прорастанию; 2) зависит ли ранний протеолиз т осях от присутствия др;*"1 : структур семени; 3) и какова чувствительность этого процесса к короткому и длительному тенлово: ¡у стрессу. Для решения этих задач был«- предпринято исследование полипен-тидпго состава суммарного белка зародышевых осей м^. годом одномерного

электрофореза в денатурирующих условиях на различных стадиях прорастания.

2.1 Изменения в полинептилном составе суммарного белка осевых органов. Анализ суммарного белка осевых органов, взятых в различное время после начала набухания зародышей, показал, что полинсптидный состав не остается постоянным в ходе развития и претерпевает заметные изменения ко времени начала роста, то есть за период набухания и лаг-фазы прорастания. Это выражалось в существенном снижении относительного содержания или в полном исчезновении рада полипептидов, относящихся, в основном, к преобладающим наиболее ярко окрашенным белковым компонентам (рис.5). При сравнении белков зародышевых осей после 4 и 20 ч набухания у сорта Победитель обнаружено около 20 компонентов с молекулярными массами от 125 до 13 кД, содержание которых изменяется наиболее значительно фис. 5 и табл. 1). Более детальное исследование характера этих изменений во времени показало, что около половины из отмеченных выше полипептидов расходуется быстро и их содержание заметно сокращается уже через 6-8 ч после начала набухания, то есть ко времени завершения гидратации целого зародыша. Остальные белки используются органами зародышевой оси медленнее и исчезают постепенно ко времени начала роста. Анализ альбуминовой и глобулиновой фракций суммарных солерастворимых белков, полученных после 6 и 20 ч набухания зародышей, показал, что среди быстрорасходуемых белков преобладают альбумин^, а медленно потребляемые белки, в основном, представлены глобулинами (табл. 1).

2.2 Изменения в полинептилном составе суммарного белка при проращивании изолированных осей. Как отмечалось выше, изолированные оси достигают длины в 5 мм через 17-19 ч после набухания при 28°С и соответствуют по величине осям проклюнувшихся семян или зародышей (рис. 3). На этом рост корня в изолированных осях прекращается, в то время как в целых зародышах корень продолжает интенсивно удлиняться. Таким образом, изолированные оси способны завершить видимое прорастание, выражающееся в проклевывании. К этому времени в компонентном составе суммарного белка изолированных осей происходят заметные изменения (рис. 6). Так, снижается содержание почти всех доминирующих нолипеитидов, при этом многие из них исчезают почти полностью. Это относится к поли-нептидам с кажущимися молекулярными массами 130, 72, 64, 33, 27, 24 и 23 кД. Относительное содержание других белков заметно сокращается (8683, 52-48, 43, 15 и 12 кД). Изолированные оси после 17 ч набухания при 28°С и оси в составе целого зародыша дают одинаковую картину изменений в содержании отдельных полипептидов, свидетельствующих о частичном протеолизе собственных белков за время, предшествующее видимому прорастанию. Таким образом, мобилизация белков в зародышевых осях семян гороха происходит при нормальной температуре набухания и не зависит от наличия семенной кожуры или присутствия семядолей. Существует точка зрения, что мобилизация белков в осях происходит лишь и том случае,

Таблица 1. Характеристика полипентидов, содержание которых заметно снижается спустя 6-8ч (1) или 15-20ч (2) после начала набухания при 28°С.

Rr Мол. масса, кД 1 2

0.10 125

0.16 86 А

0,17 82 А

0.21 70 Г

0.23 65 А

0.29 52 Г

0.30 50 Г

0.31 48 Г

0.34 43 Г

0.36 Г

0.41 34 А

0.42 32 Г

0.45 30 Г

0.49 26 А

0.51 24 Л

056 21 А

0.57 20 А

0.58 19 А

0.63 16 А

0.68 13 А

6 12 18 24 30 36 42 48 54 ч Рис.7 Увеличение-сырого веса (1,%) семян гороха сорта Вега в процессе набухания при 28°С (1), 40°С (2) и 28°С в присутствии 5 мМ ФМСФ (3). 4 - кривая прорастания (11,%) при 28°С.

Примечание. А-альбумины; Г-глобулины.

(•ели растущей оси необходимо преодолеть сопротивление, оказываемое семенной кожурой и слоем эндосперма. При отсутствии этих преград потребление собственных запасных белков не требуется д.^т завершения видимого прорастания (Takeba, 1990). Это положение, выдвинутое при исследовании семян салата, очевидно, не является универсальным. Результаты, полученные нами на зародышах и изолированных осях гороха, говорят о том, что частичный протеолиз белков в осевых органах гороха на начальных этапах прорастания це зависит от присутствии семенной кожуры или семядолен.

Прежде считалось, что ранний распад белков в осях гороха не так обширен, как в осях фасоли и вигны, и затрагивает малое число полипентидов (Murray, 1979; 1984). В результате проведенных исследований нам удалось показать, что начальный рост зародышевой оси гороха происходит на фоне заметного снижения в содержании многих (около 20) белковых компонентов альбуминовой и глобулиновои природы. На этом основании их можно отнести к белкам, выполняющим функцию запасных отложений, используемых клетками осевых органов в период набухания и лаг-фазы прорастания, то есть до начала потребления запасных отложений' семядолей. Как следует из данных, полученных в нашей лаборатории ранее, количественные и качественные изменения в полнпептидном составе белка семядолей обнаруживаются позже, спустя, но крайней мере, 37-40 ч после начала набухания зародыша при 28°С (Скажснпик и др., 1981). Далее мы попита-

Л'ись выяснить, как протекает мобилизация запасных белковых отложений в осях при действии повышенных температур.

2.3 Влияние длительного и короткого теплового шока па мобилизацию белков в зародышевых осях. Сравнение зародышей гороха, набухавших в течение первых 4 или 5 ч при 28 или 40°С, показало, что короткий начальный ТШ не приводит к каким-либо количественным или качественным изменениям в полипептидпом составе белков осей. Через 8 ч после начала набухания при 28°С наблюдалось снижение относительного содержания некоторых полипептидов. Если же зародыши проращивали в течение первых 8 ч при шоковой температуре (40°С), то изменения в содержании отдельных компонентов, вызванные нормальным ходом развития, в атом случае не наблюдались. (Соответствующие фотографии окрашенных гелей давы в диссертации.) Как уже отмечалось выше, через 20 ч после начала набухания (т.е. ко времени завершения лаг-фазы и нача.;у роста зародышевого корешка) около 20 белковых компонентов либо полностью I. чезали из состава суммарного белка зародышевых осей или же их содержание резко сокращалось. В зародышах, набухавших при 40°С в течение 20 ч, эти изменения в компонентном составе белков осевых органов не наблюдались, ч картина распределения была идентична картине, наблюдаемой у зародышей, набухавших в течение 5 ч при 28°С (рис. 5). При длительном высокотемпературном набухании (17 ч, 40°С) изолированных осей гороха (сорт Вега) никакие изменения в полипептидах суммарного белка не обнаруживались. В зародышах, проращиваемых в течение 24 ч при 34 или 38°С, картина белкового распада в осях занимала промежуточное положение между тем, что происходит при нормальном развитии (28°С), и тем, что набло-дается при набухании при 40°С, то есть наблюдается четкая обратная зависимость распада белковых отложений от температуры. Из полученных данных следует, что при повышенной температуре клетей зародышевой с«;и утрачивают способность использовать свои белковые запасные отложегия. Следует отметить, что пм по себе ТШ любой длительности не вызывает изменений в картине распределения окрашенных полипептидов, которые свидетельствовали бы об усиленном протеолизе клеточных белков.

2.5 Заключение. Метаболическое развитие осевых органов зародышей гороха в период, предшествующий проклевыванию, сопровождается активным распадом в них собственны}; белковых запасов. Ранний протеолиз в осях не зависит от наличия семенной кожуры или семядолей. Тепловой стресс в период набухания и лаг-фазы прорастания вызывает метаболические изменения, в результате которых тормозится или прекращается катаболизм запасных отложений. Глубина этих изменений пропорциональна длительности теплового воздействия. Четкая корреляция негативного действия высокотемпературного наб; :ания на прорастание и на раннюю мобилизацию белков в осях зародышей гороха дает основание полагать, что плохое прорастание при повышенных температура: может быть обусловлено или опосред' зано неспособностью клеток оси катаболизировать свои белки.

3. Действие повышенных температур на синтез белка in vivo в осях.

Синтез белка является ключевом процессом прорастания и его быстрое возобновление в клетках набухающих зародышей строго обязательно для развития ростовой активности. Однако, не вполне ясно, что же нужно для прорастания : определенный уровень обновления и накопления имеющихся белков или синтез специфических для прорастания полинептидов. Изучение синтеза белка in vivo при длительном ТШ, блокирующем прорастание, .может быть одним из подходов для решения этого вопроса. Исходя из представлений о стабильности БТШ и возможности их синтеза в период созревания семени, можно предположить, что в сухих семенах присутствуют БТШ. Вопрос заключается в следующем: достаточно ли запаса БТШ в сухих зародышах для защиты клеток от возможных тепловых повреждений в период прорастания или же необходим их синтез в ответ на повышение температуры и если "да", то как рано клетки зародыша гороха способны индуцировать такой ответ? И далее, в какой мере синтез нормальных клеточных белков чувствителен к действию короткого ТШ? Изучение трансляционных изменений в ответ на короткий ТШ в период прорастания может способствовать решению этих вопросов. В связи с этим были поставлены задачи: изучить действие короткого и длительного ТШ на общий уровень трансляции in vivo и на картину белкового синтеза в осях гороха на ранних стадиях прорастания.

3.1 Влияние короткого ТШ на уровень трансляции in vivo. Как видно из данных рис. 8, повышение температуры до 40°С при контакте сухих зародышей с водой не препятствовало быстрому возобновлению трансляционной активности в клетках зародышевой оси. Более того, короткий ТШ (2 ч, 40°С) заметно стимулировал включение меченых аминокислот в белок осей в первые часы набухания. Повышение температуры до 40°С в первые 2 ч набухания увеличивало у сорта "Вега" включение в белок в 2-2.5 раза по сравнению с включением при 28°С . Поглощение при этом возрастало лишь на 50-60%. В итоге, уровень относительного включения в осях "шокированных" зародышей был на 40-60% выше, чем в контрольных. Если зародыши подвергали действию ГШ (40°С) в течение первых 4 ч набухания с одновременным предоставлением меченых аминокислот, то удельная радиоактивность белков в осях была на 50-70% выше, чем у контрольных зародышей; относительное включение возрастало на 28-30%. На основании этого можно сказать, что повышение температуры набухания до 40°С, действительно, стимулировало начальный синтез белка в осях гороха сорта "Вега", и это не было следствием действия теплового стресса на поглощение меченых аминокислот. В период лаг-фазы прорастания короткий ТШ не оказывал существенного влияния на уровень общего синтеза белка в осях. В период массового нроклевывания (17-20 ч после начала набухания)

1-о

с

Б 11 Ё «Г

о

\

N.

0-г 4-6 7-9 10-12 15-17 1?-19 20-22 время набухания, час

Рис. 8 Дейсгоие ТШ на синтез белка в осях на разных стадиях прорастания зародышей гороха. В указанное врегч после начала нао/хания при 28°С зародыши инкубировали и присутствии 35£>-метион|1на в течение 2 ч при 28°С или 40°С, после чего измеряли включение метки в белок осей.

Рис. 9 Влияние повышенных температур на начальный синтез белка в осях набухающих зародышей гороха.

Сухие зародыши инкубировали в присутствии 353-мегаонина в течение первых 4 ч при температурах: 25, 28, 34, 36, 38, 40, 42 и 45 °С, после чего измеряли включение метки в белок осей. Сорта: 1 - "Вега", 2 - "Смарагд", 3 - "Изумруд", 4 - "Битюг", 5 - "Адагумский", 6 - "Богатырь", 7 - "Победитель".

28 34 38 Г 45 °С

температура набухания

вновь происходило незначительное усиление in vivo трансляционной активности в ответ на действие короткого ТШ (рис. 8) .

Для выявления возможных сортовых различий в ответе на ТШ, была исследована температурная чувствительность начального синтеза белка у 7 сортов семян гороха. На рис. 9 можно видеть, что во всех случаях, за исключением одного, повышение температуры до 40-42°С в первые часы набухания стимулировало в той или иной степени начальный синтез белка в осях. Об этом свидетельствует уровень удельной радиоактивности и величина относительного включения при 40°С, которые составляли в зависимости от сорта (или партии семян) 120-170% и 120-140% от контроля соответственно. Температура максимального синтеза белка в осях на ранних стадиях прорастания значительно превышает оптимальную температуру роста (28°С) н в зависимости от сорта семян находится в пределах 38-40°С. И лишь при температуре, превышающей 42°С, короткий ТШ оказывал заметное ингибирующее действие на трансляцию. Очевидно, что клетки осевых органов зародышей способны поддерживать активный синтез белка при более высокой температуре, чем проростки (Key et al., 1983). Это указывает на существенную термоустойчивость аппарата трансляции на ранних стадиях прорастания семян. Исключение составили семена сорта "Победитель", у которых короткий ТШ (4 ч, 40°С) вызывал снижение общего синтеза белк... Ранее в пашей лаборатории было показано, что эти семена хорошо прорастет при 28°С, однако быстро теряли жизнеспособность, если время начального ТШ возрастало до 6-8 ч (Чумикина и Гумилевская, 1990). Зародыши других испытанных сортов, у которых ТШ стимулировал начальный синтез белка, были более устойчивы к действию ТШ в период набухания и прорастали при переносе на 28°С после набухания при 40°С в течение первых 10-12 ч ("Битюг" и "Смарагд") или 15-17 ч ("Бо;атырь", "Адагумскии", "Вега"). В настоящий момент трудно сказать с определенностью, является ли повышенная термочувствительность синтеза белка и прорастания у семян сорта "Победитель" проявлением их генотипнческих особенностей, или же она связана с длительным (6-7 лет) хранением данной партии семян при комнатной температуре и возмо. .пым снижением качества семян .

а-Амаиитин вызывал глубокое, но не полное подавление начального синтеза белка в условиях ТШ (табл. 2).

Таблица 2. Влияние а-аманитина на синтез белка в осевых органах набухающих зародышей гороха Pisum sativum L.

Время на- Период мс- Иншбнрованмс, % Нечувствительная к дей-

бухания, ч ЧС1ШЯ, ч- 280 40° ствию а-аманнтина трансляция в первые часы иабухаш'Ч зароды-

0-3 1-2 13 - 27 40-45 шей при 40°С может ныть обус-

0-5 1-5 40 - 55 "41-48 ловлена функционированием за-

0-6 4-6 64 - 70 74-80 пасенных мРНК, кодирующих

0-9 Г 7-9 70 87-89 синтез BTLII. О наличии таких

i к

мРНК в сухих семенах свидетельствует ряд прямых и косвенных данных полученных на зародышах гороха (Vierling, Sun, 1989; Чумикина, Гумилев екая, 1990), пшеницы (Helm, Abernethy, 1990) и сорго (Howarth, 1990).

3.2 Влияние короткого ТШ на картину белкового синтеза в осях набухающих зародышей. Чтобы оценить влияние ТШ на картину белкового сии теза, мы исследовали абор полипептидов, синтезируемых in vivo осями i первые часы набухания зародышей при 28 и 40°С, используя для этих це лей методы ДС-Ма-гель-электрофореза и радиоавтографии. Было проанализировано большое число радиоавтограмм, полученных в опытах с различ ными сортами гороха при варьировании'времени экспонирования рентгеновских пленок, количества анализируемого белка и вида меченого предше CTBCi .шка. Для более полного выявления различий в картине белкового синтеза, порождаемых ТШ, были анализированы суммарные белки осей и фракций клеточных структур гомогената осей (20000 g-осадок) и постмито-хондриального экстракта (20000 g-центрифугат); а также водорастворимая (альбуминовая) и водонерастворимая (глобулиновая) фракции суммарных солерастворимых белков осей. Полученные результаты можно суммировать следующим образом. В профиле белков, синтезируемых осями в первые часы набухания при 28 или 40°С, наблюдается большое сходство. Это обусловлено синтезом большого числа электрофоретически сходных белков при нормальной и повышенной температурах. Наряду с этим, во всех без исключения случаях, при ТШ в осях появлялись иолинептиды, синтез которых либо совсем не регистрировался при 28°С, либо происходил на очень низком уровне. На этом основании данные полипептиды были отнесены к группе БТШ. Среди них были выявлены как ВМ, так и НМ БТШ, типичные для клеток растений. При фракционировании гомогената осей методом дифференциального центрифугирования большинство ВМ БТШ были обнаружены в 20000 g-центрифугате, а НМ БТШ - преимущественно во фракции 20000 g-осадка. Все БТШ хорошо экстрагируются солыо. Большинство из них относятся к белкам глобулинового типа (водонерастворимые), но наряду с этим имеются и БТШ альбуминового типа (водорастворимые). В на боре ВМ БТШ набл-сдается большое сходство у зародышей семян различных сортов гороха. Для группы НМ БТШ характерна некоторая вари:-бельность. Относительное содержание отдельных БТШ та: же варьирует в зависимости от сорта семян. В определенной мере все вышесказанное иллюстрирует табл. 3. (Соответствующие контактные снимки радиоавтогрпмм представлены в диссертации.) Таким образом, зародышевые оси способны отвечать на короткий ТШ синтезом полного набора БТШ с первых часов набухания*.

Чтобы оценить степень зависимости начального синтеза БТШ от ij¡ н-скринции, были анализированы зародыши, набухавшие при 40UC в при сутст: tu а-аманитнна. Полученные результаты показали, что гишез

Таблица 3.

Белки теплового шока зародышевых осей гороха Pisum sativum L.

Na "Победитель" "Изумруд" "Смарагд" "Битюг" "Be га"

Rf kD Rf kD Rf kD Rf kD Rf kD

1 0.09 150 0,09 150 0,09 150 0,08 150 0,08 150

1а 0,12 118 0,12 118 0,12 118 0,12 118 0,12 118

2 0,148 90 0,148 Ш 0.15 SQ 0,145 82 0,146 Ш

3 0,19 ZB 0,18 80 0,19 za 0,18 flQ 0,18 BQ

4 0,20 та 0.20 ТА 0,20 ТА 0,20 1A 0,20 1A

5 0.216 Ш 0,215 Z0 0,218 za и,217 Ш 0,213 za

5а 0,224 И 0,22 62 0,225 68 0,225 68 0,224 68

6 0,24 64 0,24 64 0.23 65 0,235 64 0,23 64

7 0,34 43 0,34 43 0,34 43 0,34 43 0,34 43

в 0,37 38 0.36 39 0,36 39 0,35 40

0,39 35 0,38 35

9 0,44 30 0,45 29-30 0,43 31 0,44 30 0,44 30

10 0,45 29 - 0,44 30 - 0,45 29

0.46 28

0,48 27 0,47 27

11 0,50 25 0,49 26 0,49 2§ 0,49 2§ 0,50 25

12 0,55 22 0,556 22 - - 0,546 22,5

13 0,58 23 0,58 20 0,58 20 0,58 20 0,576 201

14 - - 0,595 JJL5 0.595 12.5 0.586 18

15 0,60 1L5 0,60 17.5 0,60 1L5 0,60 1L5

16 0,61 16,5 0,61 16,5 0,61 16,5

0,617 13 0,615 16 0,617 15

0,62 15 0,62 15 0,62 15 0,62 15 0,62 15

0.63 Н 0,63 14 0,63 14 0,63 14

17 0,65 12 0,65 13 0,64 13 0.65 12

большинства БТШ в первые часы набухания не нуждается в транскрипции и может происходить, хотя и с меньшей интенсивностью, в присутствии а-аманитина. Это свидетельствует о наличии [¡реформированных шоковых мРНК в сухих семенах, способных транслироваться при повышенных температурах, то есть в условиях ТШ. Преформированные шоковые мРНК достаточно стабильны и могут функционировать в условиях подавления транскрипции на протяжении не менее б часов при 40°С. Тем не менее, синтез отдельных БТШ не обнаруживается при набухании сухих зародышей при 40°С в присутствии а-аманитина (БТШ N б, 7, 9, 10, 11, 14, 15, 17), синтез других протекает с меньшей интенсивностью. (Соответствующие фотографии радиоавтограмм приведены в диссертации.) Это свидетельствует об участии повосинтезировапных "шоковых" мРНК в синтезе БТШ и означает, что ответ на ТШ происходит в полном объёме и сопряжен не только с трансляцией преформированных "шоковых" мРНК, но и i транскрипцией генов ТШ. Далее, были исследованы основные условия индукции синтеза БТШ в ответ на повышение температуры. Время ТШ, достаточное для обнаружения индукции полного набора БТШ, составляет 30 - 60 мин, но максимальное проявление ответа наблюдается через 2-4 часа теплового воздействия. Синтез некоторых БТШ наблюдается при 34 - 36°С, но максимальный синтез происходит при 40 - 42°С. Время и температура максимальной индукции у отдельных БТШ различны, что указывает на некоординированный характер регуляции их синтеза. При возврате шокированных зародышей к нормальной температуре синтез большинства БТШ прекращается через 2 - 4 ч, что свидетельствует об обратимом характере индуки.ш синтеза БТШ. Как и следовало ожидать, БТШ в осях гороха оказались cia-бильными белками. Известно, что индукция синтеза БТШ у растений часто происходит на фоне снижения синтеза нормальных клеточных .белков (Nagao et al., 1986; Кеу et al., 1983). Полученные нами результаты показали, что на всех стадиях развития от начала набухания до проклевыва шя индукция синтеза БТШ происходит одновременно с возобновлением или продолжением синтеза основной массы "нормальных" клеточных белкоя. Это означает, что при ТШ не действует механизм трансляционной дискриминации в отношении мРНК, которые транслируются in vivo при нормальной температуре на начальных стадиях прорастания. Эта особенность ответа на ТШ может играть важную роль в обеспечении жизнеспособности зародыша и проростка при прорастании в неблагоприятных условиях и, возможно, объясняет усиление общего синтеза белка в условиях повышенных температур и отсутствие действия короткого ТШ на прорастание. Таким образом, в ответе на короткий ТШ у прорастающих зародышей гороха обнаруживаются как черты сходства, так и ряд особенностей, отличающих эти ткани от других растительных систем.

3.3 Влнянне"длительного ТШ на уровень трансляции in vivo в набухаюшнх зародышах. Измерение скоро ли включения меченых аминокислот в различное времл пс еле начала набухания зародыша при 28 или 40°С показало,

что непрерывное высокотемпературное набухание в течение 20-22 ч не приводит к полному подавлению синтеза белка (рис. 10, 11). Следовательно, неспособность таких зародышей возобновить ростовую активность не обусловлена отсутствием белок-синтезиругощей активности, как это имеет место, например, при набухании в присутствии ингибитора синтеза белка пикло-гексимида (рис. 12). Ко времени видимого прорастания, которое не происходит при 40°-ном набухании, синтез белка в осях, измеряемый по включению меченых аминокислот, составляет около 40% от уровня, достигаемого при нормальном набухании, которое завершается проклевыванием. Можно предположить, что такой пониженный уровень общего белкового синтеза недостаточен для обеспечения процессов, связанных с прорастанием, и является причиной, лимитирующей его. Однако, попытка обнаружить корреляцию между уровнем общего синтеза белк и прорастанием оказалась мало успешной. Результаты, представленные на рис. 12, говорят о том, что через 17 ч набухания при температурах 34, 36, 38 и 40°С регистрируется почти одинаковый уровень включения меченых аминокислот, который составляет 40-50% от контрольного уровня. Однако, как было показано выше (рис. 1), при 34 и 36°С зародыши гороха прорастают, хотя и немного медлегиее, а при 40°С прорастание полностью подавляется. На основании этого можно заключить, что максимальный уровень трансляции, который достигается при оптимальной температуре набухания в 28°С, не является обязательным условием для перехода клеток к росту растяжением, но возможно, регулирует скорость этого процесса. Сходная картина наблюдалась и при оценке действия осмотического шока на прорастание и синтез белка в осях гороха (ОсИ'АйиПа, Вс\у1су, 1989). Вполне вероятно, что критическим для прорастания является не абсолютный уровень синтеза белка а экспрессия определенных генов, т.е. синтез специфических белков, необходимых для подготовки процесса прорастания. Экспрессия этих генов, возможш подавляется при 40°-пом набухании. Изучение действия длительного ТШ на картину белкового синтеза может быть одним из подходов в исследовании этого вопроса.

3.4 Влияние длительного ТШ на картину белкового синтеза. Анализ белков, синтезируемых па разных стадиях прорастания, свидетельствует о постепенном переходе от картины, характерной для первых часов набухания, к картине, типичной для более поздних стадий. Синтез многих "ранних " нолипептидоц (не менее 12-ти) прекращается или ослабевает. Наблюдается синтез новых белков (не менее 20-тн) и одновременно продолжается синтез иолипептидов, не регулируемых развитием в этот период. Это свидетельствует о существенных изменениях в экспрессии генов в осях за период времени между началом набухания н началом р<хтл зародышевой) корешка, т.е. проклевымаппем. Эги данные хорошо согласуются с результатами, полученными другими авторами при более детальном анализе карш-ш.1 белковой». синтеза в осях гороха'.во время прорастания (1-<1оп«1е. Ней 1еу, 1!)(Н~>): Н зародышах. набухавших непрерывно, при 10''(". и.ги мши;)

■'-9 10-12 15-17 17-19 время набухания, час

Рис 10. Влияние высокотемпературного набухания на скорость белкового синтеза в осях. В указанное время после «аяалаЛнабухания при 28» üi.n 40 зародаши сорта Вега инкубировало* в присутствии смеси С-амино-кислот в течение 2-х часов при соответствующей температуре, после чего измеряли включение метки в белок осей.

240

220

3 100 &

»

g мо

м О

и

m

а

о &

100

60

20

Рис И

4 12 20

время набухания (час)

100-

S,

ь g 75 К

е-< о

Я 50 W ш И" О

в

25

10

* 3

30

35

40

—г—

45

Рис. 12 температура, С

Рис.11. Зависимость синтеза белка в осях от продолжительности набухания зародышей при 40 . 0 0 В указанное время после начала набухания при 20 или 40 зародаши инкубировали в присутствии меченых аминокислот в течение 4ч при соответствующей температуре. Включение в белок при 40 выражали в % от включения при 28. На рисунке представлены данные многих опытов с 4 сортами гороха.

Рис.12. Синтез белка в осях после длительного набухания зародышей при повышенных температурах.

Зародазш (сорт Бега), набухавшие в течение первых 17ч при указанных температурах,- были инкубированы в присутствии 5- метионина 2 ч при соответствующей температуре. Результаты выоажали в % от контроля. I- уровень включения в белок лосле набухания при различной температуре. 2- пос.-. . нчбухания при 28 в присутствии еС-аыанииша (7 мкг/мл) 3- после набухания в присутствии ца..логексиыида (50 ыкг/ыл).

и экспрессии генов, связанные с развитием, не наблюдались, а псе главные БТШ продолжали синтезироваться в течение, по крайней мерс, 20 ч. Это свидетельствует о большой стабильности или о продолжительной транскрипции некоторых шоковых мРНК в зародышевых тканях семян.

3.5 Заключение. Таким образом, короткий ТШ на ранних стадиях прорастания не оказывал цнгибирующего действия на трансляцию в осевых органах зародыша и даже стимулировал включение меченых аминокислот в первые часы набухания и п период проклевывания. Усиление общего синтеза белка в ответ на короткий ТШ ранее наблюдали в набухающих зародышах кукурузы (Riley, 1981), сорго (Howarth, 1989) и в семядолях созревающих семян сои (Altschulcr, Mascarenhas, 1982). Синтез БТШ при ТШ в осях происходил с первых часов набухания одновременно с возобновлением (или продолжением) синтеза основной массы полнпептидов, продуцируемых клетками при нормальной температуре набухания. Существует точка зрения, что относительная устойчивость трансляции и транскрипции "нешоковых" мРНК к действию повышенных температур в период созревания семян имеет определенный физиологический смысл, т.к. благодаря этому обеспечивается полное завершение развития семени и накопления в нем запасных отложений, необходимых для успешного прорастания и формирования полноценного проростка (Altschuler, Mascarenhas, 1982; Mascarenhas, Altschulcr, 1У85). Мы полагаем, что в прорастающих семенах устойчивость трансляции in vivo "нешоковых" мРНК в сочетании с индукцией синтеза БТШ при кратковременном действии ТШ создает предпосылки для преодоления зародышем неблагоприятных температурных условий и сохранения им способности к прорастанию. БТШ обеспечивают защиту клеточных структур и белковых компонентов от термоиндуцируемых повреждений, а продолжение синтеза нормальных клеточных белков ..одготавливает клетки к росту растяжением и способствует успешному завершению прорастания. Этим можно объяснить отсутствие действия короткого ТШ (4-5 ч, 40°С), создаваемого в любое время от начала напухания до проклевывания, на процесс прорастания.

Ответ на ТШ у зародыше.! не обнаруживает временного характера. Клетки осевых органов зародыша, в отличие от других биологических систем, не способны осуществить саморегулируемое прекращение индукции генов БТШ и возвратиться к нормальной картине экспрессии генов в условиях длительного теплового воздействия. Это может быть одной из причин плохого прорастания нрн длительном тепловом стрессе. Биологическое значение этой особенности ответа на продолжительный тепловой стресс клеток осевых органов зародыша пока не очевидно. Однако, если учесть, что процессы, связанные с ростом, делением и дифференнировкои клеточ корня н стебля, происходящие после проклевывания, по нашим наблюдениям, более термочувствительны, чем само нроклевышшне, то станет ясным, что разрешение проклевывания при сохранении неблагоприятных температурных улоний í жет привести к гибели проростка. В таком случае можно пред-

и

положить, что неспособность клеток зародыша к саморегулируемому прекращению индукции генов ТШ и восстановлению транскрипции и трансляции в нужных количествах нормальных клеточных белков в условиях продолжающегося ТШ может иметь биологический смысл,, т.к. предохраняет зародыш от прорастания при наличии неблагоприятных для развития проростка условий.

ВЫВОДЫ

1. Зародышевые оси семян гороха проявляют значительную чувствительность к действию хронического теплового стресса на начальных этапах прорастания. Рост осевых органов оптимален при 28°С, замедляется при 34 - 36°С .1 почти полностью подавляется при 38 - 40°С. Максимальная температура прорастания находится между 36 и 38°С. Присутствие семенной кожуры повышает термочувствительность осевых органов.

2. Кратковременный тепловой стресс (2 или 4 ч, 40°С) на всех стадиях прорастания хорошо переносится зародышем и не влияет на его способность прорастать.

3. Метаболическое развитие осевых органов зародышей гороха в период, предшествующий началу их роста, сопровождается активным протео-лизом собственных белковых отложений. Этот процесс не зависит от присутствия семенной кожуры или семядолей и полностью подавляется при 40°- набухании. Термочувствительность процесса мобилизации запасных отложений в осях может быть одной из причин негативного действия повышенных температур на прорастание семян.

4. Аппарат трансляции в зародышевых осях гороха достаточно термоустойчив и способен обеспечить быстрое возобновление синтеза белка при повышенной (40 - 42°С) температуре набухания. Температура максимального синтеза белка при этом значительно превышает оптимальную температуру роста (28°С) и находится в пределах 38 - 40°С. Клетки осевых органов на всех стадиях прорастания способны поддерживать активный синтез белка при более высоких температурах, чем проростки, при действии короткого ТШ.

5. Клетки осевых органов способны отвечать на короткий тепловой шок синтезом полного набора БТШ с первых часов иабухашы при участии запасенных и новосинтезированных мРНК. Большинство "нормальных" мРНК не имеют трансляционных ограничений при ТШ, и на всех стадиях прорастания синтез БТД1 сопровождается активным синтезом основной массы полипеп^нДов, продуцируемых осями при нормальных условиях развития. Способность клеток осевых органов зародыша в ответ на тепловой Ш'>ч поддерживать на высоком уровне синтез нормальных клеточных белков ( одновременным синтезом полного набора БТШ может адаптировать метаболизм з..,юдыша к неблагоприятным внешним условиям, повышать его тер-моустончнвость и способствовать завершению прорастания. Это объясняет действие короткого теплового шока на прорастание.

6. При хроническом тепловом стрессе отсутствуют изменения в экспрессии генов, характерные для нормального развития. Синтез белка снижается на 50 - 60%, но это не является критическим для прорастания. При длительном тепловом стрессе клетки осевых органов не способны осуществить саморегулируемое прекращение индукции БТШ и возвратиться к нормальной клеточной активности, обеспечивающей прорастание, в результате этого зародыш удерживается от прорастания в неблагоприятных внешних условиях.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Чумикина Л.В., Арабова Л.И., Зимин М.В., Гумилевская H.A. Действие повышенных температур на прорастание зародышей гороха Pisum Sativum L.- Физиология растений, 1993, т.40, N1, с.106-109.

2. Гумилевская H.A., Чумикина Л.В., Арабова Л.И., Зимин М.В. Действие теплового шока на мобилизацию белковых отложений в осевых органах набухающих зародышей гороха Pisum Sativum L.- Физиология растении, 1993, т.40, N1, с.110-116.

3. Гумилевская H.A., Чумикина Л.В., Арабова Л.И., Зимин М.В., Шатилов В.Р. Характеристика ответа семян гороха Pisum Sativum L. п \ продолжительный тепловой стресс в период прорастания. - Прикладная биохимия и микробиология, 1995, т.31, N1, с. 92-102.

4. Чумикина Л.В., Арабова Л.И., Шатилов В.Р., Гумилевская H.A. Действие теплового стресса на прорастание и мобилизацию белковых отложений н зародышевых осях гороха Pisum Sativum.- Тез. докл., III съезд ВОФР, 1993, г.Санк-Петербург, с. 42.

5. Гумилевская H.A., Чумикина Л.В., Арабов; Л.И., Шатилов В.Р. Действие теплового шока на синтез белка в набухающих зародышах гороха Pisum Sativum L.- Тез. докл., III съезд ВОФР, 1993, г.Санкт-Пстербург, с. 18.

6. H.A. Гумилевская, Л.В. Чумикина, Л.И. Арабова/М.В. Зимин, [З.Р.Шатилов. Действие повышенных температур на синтез белка в осях набухающих зародышей гороха Pisum sativum L. 1. Действие кратковременного теплового шока. - Физиология растений, 1996, т. 43, N2, с.

Полнисано в печать 14. 0i})(i Формат 60/84/16 Объем: 1,5 пл. Тираж <30экч. Цена договорная Закат N? 2,0