Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Эффекты ингибирования фосфодиэстеразы 4 на блеомицин-индуцированный фиброз легких в мышах

ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидат биологических наук, Удалов, Сергей Борисович, Гиссен (Германия)

Президиум ВАК Минобрнауки России (решение от

Чачальник отдела

Э-

62 11/54

ЭФФЕКТЫ ИНГИБИРОВАНИЯ ФОСФОДИЭСТЕРАЗЫ 4 НА БЛЕОМИЦИН-ИНДУЦИРОВАННЫЙ ФИБРОЗ ЛЕГКИХ В

МЫШАХ

Оригинальная диссертация поданная на факультет Медицины в рамках удовлетворения требований к получению степени доктора философии на факультетах Медицины и Ветеринарной медицины Университета им. Юстуса Либиха города Гиссен

соискатель Удалов, Сергей

место рождения город Омск, Россия

город Гиссен 2009 год

Работа выполнена на факультете Медицины Университета им. Юстуса Либиха города Гиссен Директор / председатель:

доктор медицинских наук, профессор Вернер Зеегер (Werner Seeger)

Научный руководитель и член диссертационной комиссии:

доктор биологических наук, профессор Ральф Шермули (Ralph Schermuly)

Рецензент и член диссертационной комиссии:

доктор медицинских наук, профессор Тобиас Вельте (Tobias Welte) Член диссертационной комиссии:

доктор биологических наук, профессор Ральф Миддендорфф (Ralf Middendorff)

Председатель диссертационной комиссии:

доктор биологических наук, профессор Мартин Динер (Martin Diener)

Дата защиты докторской диссертации: 12 октября 2009 года

Подпись соискателя:

I. Содержание

I. Содержание...............................................................................I

II. Список иллюстраций................................................................IV

III. Список условных сокращений...................................................VI

IV. Резюме..................................................................................X

1. Введение.................................................................................1

1.1. Фиброз легких..................................................................1

1.1.1. Характеристики фиброза легких.............................2

1.1.2. Молекулярные аспекты фиброза легких...................6

1.1.3. Экспериментальный фиброз легких........................9

1.1.4. Прогноз и лечение фиброза легких...........................11

1.2. Фосфодиэстеразы......................................................... 14

1.2.1. Обзор РБЕ4......................................................15

1.2.2. Белковая структура РБЕ4......................................15

1.2.3. Характер экспрессии РБЕ4..................................17

1.2.4. Роль РБЕ4.......................................................17

1.2.5. Ингибиторы РБЕ4 и их клиническое применение......19

1.3. РБЕ4 и фиброз.............................................................22

2. Цель исследования....................................................................24

3. Материалы и методы...............................................................25

3.1. Материалы..................................................................25

3.1.1. Оборудование...................................................25

3.1.2. Реагенты и материалы.........................................27

3.1.3. Программное обеспечение...................................30

3.2. Методы.....................................................................31

3.2.1. Лабораторные животные.......................................31

3.2.2. Человеческий материал.......................................31

3.2.3. Индуцирование фиброза легких.............................32

3.2.4. Экспериментальные группы..................................32

3.2.5. Выделение белка...............................................33

3.2.6. Вестерн блоттинг..............................................................34

3.2.7. Выделение РНК.................................................36

3.2.8. Синтез кДНК.....................................................38

3.2.9. Полимеразная цепная реакция в реальном времени .... 39

3.2.10. Цитологический анализ бронхоальвеолярного лаважа (БАЛ)..................................................................40

3.2.11. Измерение эластичности легких............................41

3.2.12. Гистологические исследования............................42

3.2.13. Определение содержания коллагена......................43

3.2.14. Анализ выживаемости.......................................44

3.2.15. Статистический анализ данных............................44

4. Результаты...............................................................................45

4.1. Анализ экспрессии PDE4 при фиброзе легких.......................45

4.2. Физиологический эффект ингибирования PDE4....................49

4.3. Эффект ингибирования PDE4 на альвеолярное содержание воспалительных клеток....................................................................50

4.4. Эффект ингибирования PDE4 на легочные

маркеры воспаления...................................................................... 53

4.5. Эффект ингибирования PDE4 на функцию легких.................56

4.6. Эффект ингибирования PDE4 на патологию легких...............58

4.7. Эффект ингибирования PDE4 на легочное содержание коллагена.....................................................................................60

4.8. Эффект ингибирования PDE4 на общую выживаемость.........61

5. Обсуждение............................................................................63

5.1. Блеомицин-индуцированный фиброз легких........................63

5.2. Экспрессия PDE4 при фиброзе легких.......................................63

5.3. Ингибирование PDE4 in vivo...........................................65

5.4. Эффект ингибирования PDE4 на инфильтрацию воспалительных клеток...................................................................66

5.5. Эффект ингибирования PDE4 на экспрессию маркеров воспаления.....................................................................68

5.6. Эффект ингибирования PDE4 на позднюю фазу легочного фиброза......................................................................................69

5.7. Возможные механизмы анти-фиброзного действия

ингибиторов РБЕ4.........................................................................71

6. Список литературы...................................................................74

7. Декларация.............................................................................88

8. Благодарности................................................................................89

II. Список иллюстраций

Рис. 1. Текущая классификация интерстициальных заболеваний

легких

Рис. 2. Гистологические изображения нормального легкого и легкого

пациента с ИФЛ

Рис. 3. Легкое на конечной стадии фиброза («сотовое легкое»)

Рис. 4. Нарушения межклеточных взаимодействий при фиброзе

легких

Рис. 5. Методы индуцирования экспериментального фиброза легких

Рис. 6. Гидролиз цикличных нуклеотидов фосфодиэстеразами

Рис. 7. Функциональная структура белков семейства РОЕ4

Рис. 8. Химическая структура силомиласта

Рис. 9. Экспрессия генов РБЕ4 на уровне мРНК в легких мышей

Рис. 10. Экспрессия генов РБЕ4 на уровне белка в легких мышей Рис. 11. Экспрессия генов РБЕ4 на уровне мРНК в легких человека Рис. 12. Экспрессия генов РБЕ4 на уровне белка в легких человека Рис. 13. Эффект ингибирования РЭЕ4 на вес тела здоровых мышей Рис. 14. Эффект ингибирования РБЕ4 на общее число клеток БАЛ Рис. 15. Эффект ингибирования РБЕ4 на число макрофагов,

лимфоцитов и нейтрофилов в БАЛ Рис. 16. Эффект ингибирования РБЕ4 на легочную экспрессию гена

тага

Рис. 17. Эффект ингибирования РБЕ4 на легочную экспрессию гена

нлр

Рис. 18. Эффект ингибирования РБЕ4 на легочную экспрессию гена 1Ь6

Рис. 19. Эффект ингибирования РОЕ4 на эластичность легких Рис. 20. Эффект ингибирования РБЕ4 на эластичность легких (после нормирования)

Рис. 21. Эффект ингибирования РОЕ4 на патологические изменения в легких

Рис. 22. Эффект ингибирования РЭЕ4 на патологические изменения в

легких (гистологическая картина) Рис. 23. Эффект ингибирования РБЕ4 на легочное содержание коллагена

Рис. 24. Эффект ингибирования РБЕ4 на общую выживаемость Рис. 25. Возможный механизм анти-фиброзного действия ингибитора РБЕ4

Рис. 26. Возможный механизм анти-фиброзного действия ингибитора РБЕ4 (упрощенно)

III. Список условных сокращений

AM альвеолярный макрофаг

БАЛ бронхоальвеолярный лаваж

БЛМ блеомицин

БСА бычий сывороточный альбумин

ДНК дезоксирибонуклеиновая кислота

ДПЗЛ диффузные паренхиматозные заболевания легких

ДСН додецилсульфат натрия

ДТТ дитиотреитол

Ед единица

ИЗЛ интерстициальное заболевание легких

ИИП идиопатическая интерстициальная пневмония

ИФЛ идиопатический фиброз легких

кДНК комплиментарная ДНК

контр контроль

мРНК матричная РНК

ОИП обычная интерстициальная пневмония

ОТ-ПЦР ПЦР сопряженная с обратной транскрипцией

ПААГ полиакриламидный гель-электрофорез

пр. против

ПСА персульфат аммония

ПЦР полимеразная цепная реакция

РНК рибонуклеиновая кислота

Трис трис(гидроксиметил)аминометан

ФЛ фиброз легких

ХОБЛ хроническое обструктивное заболевание легких

ЦНС центральная нервная система

ЭДТА этилендиаминтетрауксусная кислота

6MWD расстояние пройденное за 6 минут тест прогулки

АС аденилатциклаза

АКАР белки-якоря А киназы

AMP аденозин 5'-монофосфат

ANO VA дисперсионный анализ (ANalysis Of VAriation)

ATP аденозин 5'-трифосфат

ATS Американское торакальное общество

сАМР циклический аденозин 3'-5'-монофосфат

cGMP циклический гуанозин 3'-5'-монофосфат

СВР CREB-связывающий белок

Стах максимальная концентрация в плазме

CRE элемент ответа на сАМР

CREB CRE-связывающий белок

Ct пороговый цикл

dNTP дезокси-1Ч(аденозин, гуанозин, цитозин, тимидин, или

урацил)-трифосфат

Dlco диффузионная способность монооксида углерода

dATP дезоксиаденозин 5'-трифосфат

dCTP дезоксицитозин 5'-трифосфат

dGTP дезоксигуанозин 5'-трифосфат

dUTP дезоксиуридин 5'-трифосфат

ЕМТ эпителиально-мезенхимальный переход

ERK киназа регулируемая внеклеточными сигналами

ERS Европейское респираторное общество

FDA министерство по лекарственным средствам и пищевым

продуктам США

Ga активированная Ga субъединица G-белка

GPCR G-белок связанный рецептор

HRP пероксидаза хрена

IC5Û половина максимальной концентрации ингибирования

IL интерлейкин

КС1 хлорид калия

КН2РО4 дигидрофосфат калия

LR соединяющая область

LPS липополисахарид

МАРК митоген-активируемая протеин киназа

МЕК MAPK/ERK киназа

MgCl2 хлорид магния

ММР матриксная металлопротеиназа

МРО миелопероксидаза

NaCl хлорид натрия

Na2HP04 гидрофосфат натрия двухводный

NCBI Национальный центр биотехнологической информации

США

NE нейтрофильная эластаза

NF ядерный фактор

NO оксид азота (II)

PAI ингибитор активатора плазминогена (PAI)

PASMC гладкомышечная клетка легочной артерии

PBS фосфатный буфер

PDGF тромбоцитарный фактор роста

PDE фосфодиэстераза

PGE2 простагландин Е2

PILD педиатрический интерстициальный фиброз легких

РКА протеинкиназа А

PMSF фенилметилсульфонилфлорид

ROS активные формы кислорода

ROX 6-карбоксил-Х-родамин

SEM стандартная ошибка среднего

siRNA короткая интерферирующая РНК

ti/2 период полувывода

TBS трис-буфер

TBST трис-буфер содержащий Tween

TEMED тетраметилэтилендиамин

TF тканевый фактор

TGF трансформирующий фактор роста

TLC общая емкость легких

TLR толл-подобный рецептор

TNF фактора некроза опухоли

UCR вышележащие консервативные области

иБв урацил-ДНК-гликозилаза

\VD-HBE хорошо-дифференциированный бронхиальный

эпителий

IV. Резюме

Фиброз легких (ФЛ) является необратимым и большей частью неизлечимым заболеванием, причины которого часто остаются неизвестными. Фосфодиэстераза 4 (РЭЕ4) вовлечена в процессы воспаления, клеточной пролиферации, дифференциации и миграции, известные важностью своей роли в тканевом фиброзе. Таким образом, целью настоящего исследования являлось определение уровня экспрессии генов РЭЕ4 в условиях ФЛ и исследование эффектов ингибирования РБЕ4 на функциональные, гистологические и биохимические параметры экспериментального ФЛ.

Фиброз легких был индуцирован фиброгенным агентом блеомицином в мышах линии С57ВЬ/6М. Генная экспрессия различных изоформ РБЕ4 была проанализирована на уровне мРНК и белка в легких как с экспериментальным ФЛ, так и с ФЛ человека. Животные получали курс терапии селективным ингибитором РВЕ4 силомиластом или плацебо. Результаты лечения оценивались посредством общего и дифференциального цитологического исследования бронхоальвеолярного лаважа (БАЛ), измерения эластичности легочной ткани, количественного гистологического анализа и измерения содержания коллагена в легочной ткани. Кроме этого, был осуществел анализ генной экспрессии фактора некроза опухоли а (ЮТа), интерлейкина 1р (1Ы(3) и 1Ь6 в ткани легких. Наконец, была оценена общая выживаемости животных по окончании исследования.

Анализ экспрессии генов РОЕ4 показал значительное повышение ее уровня для изоформы РЭЕ4, специфичной для воспалительных процессов в легких как с экспериментальным, так и с человеческим ФЛ. Терапия силомиластом привела к значительному уменьшению общего числа воспалительных клеток, числа альвеолярных макрофагов и лимфоцитов, но не нейтрофилов, в БАЛ на ранней воспалительной стадии ФЛ у мышей (4-й и 7-й день эксперимента). Содержание мРНК ТОТ а, но не 1Ы[3, было также снижено силомиластом, тогда как уровень мРНК 1Ь6 был значительно повышен. На более поздней стадии ФЛ (14-й и 24-й день) мыши, получавшие силомиласт, демонстрировали улучшение легочной функции и

меньшую степень фиброза в сравнении с группой, не получившей лечения. Содержание коллагена в легочной ткани и общая выживаемость были также частично восстановлены силомиластом.

Результаты нашего исследования предполагают, что селективное ингибирование РБЕ4 подавляет раннюю воспалительную стадию и потенциально ослабляет более позднюю стадию ФЛ в экспериментальной модели и таким образом может представлять собой дополнительную терапевтическую возможность для больных ФЛ.

1. Введение 1.1. Фиброз легких

Фиброз легких представляет собой группу заболеваний, которые включают в себя постепенное замещение нормальной архитектуры легкого соединительной тканью и клетками мезенхимы (рубцевание). Так или иначе, это сопровождается изменениями в легочном интерстиции - тканевом пространстве между слоями эндотелия капилляров и эпителия альвеол. Типичные симптомы ФЛ включают в себя одышку, непродуктивный (сухой) кашель и повышенную утомляемость [1-3].

Согласно новой классификации, предложенной Американским торакальным обществом (ATS) и Европейским респираторным обществом (ERS) в 2002 г. (Рис. 1), ФЛ охватывает категорию заболеваний, названных «идиопатические интерстициальные пневмонии» (ИИП), которые в свою очередь являются частью более обширной группы «диффузных паренхиматозных заболеваний легких» (ДПЗЛ), или иначе «интерстициальных заболеваний легких» (ИЗЛ). Наиболее часто встречающейся формой ИИП является идиопатический фиброз легких (ИФЛ) [4].

ИЗЛ Респираторный бронхиолнт

Криптогенная организующаяся пневмония_

Лимфоцнтарная интерстициальная пневмония

Рис. 1. Текущая классификация интерстициальных заболеваний легких по ATS/ERS

[4, перевод].

Десквамативная интерстициальная пневмония_

Острая инте рстициальная пневмония

Неспецифическая интерстициальная пневмония_

ИФЛ является заболеванием неизвестной этиологии, поражающим чаще всего мужчин, с частотой появления около 20 на 100 ООО человек [5]. По меньшей мере, 5 ООО ООО человек страдают этим заболеванием по всему миру с более чем 200 000 случаев только в США [1]. В США смертность от ФЛ возрастала в период с 1970 до 1990-х годов и сильно возросла с 1990 годов [6]. ИФЛ может встречаться у людей любого возраста, однако большинство пациентов имеют возраст 40-50 лет на момент диагноза [1] и риск сильно повышается с возрастом [2]. ФЛ, точнее «педиатрический интерстициальный фиброз легких» (PILD) также был диагностирован у детей в возрасте до одного года [7]. В большинстве случаев этиология ФЛ остается неизвестной и по определению наиболее часто встречающейся формой ФЛ является идиопатический (т.е. «неизвестной причины») фиброз легких, или ИФЛ [2, 4]. Факторами риска для развития ФЛ выявленными на настоящий момент являются хроническое вдыхание асбеста, деревянной и металлической пыли [8], высокие дозы ионизирующего излучения [9] и токсичность, ассоциированная с применением лекарственных средств [10].

1.1.1. Характеристики фиброза легких

Функция внешнего дыхания

Пациенты с ФЛ демонстрируют снижение уровня газообмена (Dlc0) и уменьшение общей емкости легких (TLC), что находит свое отражение в 6MWD-TecTe (расстоянии, пройденном за 6 минут тест прогулки). Кривые давление-объем (эластичность легких) указывают на возросшее давление при инспирации, указывая на ригидность, нерастяжимость легких [2-3,1112].

Бронхоалъвеолярный лаваж

Бронхоальвеолярный лаваж (БАЛ) полученный от больных ФЛ содержит повышенное число воспалительных клеток (цитоз). В

особенности, в легких пациентов с ФЛ наблюдается высокое число гранулоцитов (нейтрофилы) и моноцитов (активированные макрофаги), а также повышение уровня цитокинов и факторов роста для фибробластов. В некоторых случаях также наблюдается увеличение числа лимфоцитов [2,1221].

Морфология

Снимки легких пациентов с ФЛ, полученные с помощью рентгенографии грудной клетки или компьютерной томографии, содержат уменьшение прозрачности по типу «матового стекла», что указывает на области уплотнения и очаги фиброза [3,22]. Биопсия или исследование легочной ткани post mortem выявляет присутствие хронического воспаления. Каждое ИЗЛ имеет собственное гистологическое проявление (паттерн), которым в случае ИФЛ является обычная интерстициальная пневмония (ОИГ1) [4], характеризующаяся утолщенным интсрстицием с инфильтрацией воспалительных клеток. Области фиброза состоят из масс соединительной ткани, где коллаген является основным компонентом [24], и так называемых «фокусов фибробластов». Последние представляют собой плотные структуры с параллельно расположенными миофибробластами, но видимому являющимися центрами развивающейся патологии (Рис. 2).

• 5=»

Д г.: . ■ М

Рис. 2. Гистологические изображения нормального легкого (слева) н легкого пациента с ИФЛ (справа).

На срезе, полученном с фиброзного легкого видно скопление миофибробластов, увеличение х200.

Со временем, очаговый фиброз переходит в стадию массивного разрушения структуры ткани. На поздних этапах ФЛ наблюдается так называемое «сотовое лег