Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Проксидантная активность противоопухолевого антибиотика блеомицина как причина развития фиброза легких

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Проксидантная активность противоопухолевого антибиотика блеомицина как причина развития фиброза легких"

. «и I V 4

На правах рукописи

ИБРАГШОВА ГАЛИНА АНВАРОША

ПРООКСЗДАНШАЯ АКТИВНОСТЬ ПРОТИВООПУХОЛЕВОГО АНТИБИОТИКА БЛЕСШЩША КА1С ПРИЧИНА РАЗВИТИЯ ФИБРОЗА ЛЕГКИХ.

Специальность С!3.00.02 - биофизика

Автореферат дасеертацяи на соискание ученой степени кандидата медицинских наук.

Москва 1996

Рабата выполнена в Российском государственной медицинском университете

Научные руководители:

доктор-мэдишзскиг наук, профессор Коркипа Л.Г. академик" РАЩ, доктор медицинских наук, профессор Величковский: Б.Т.

Официальные. оппоненты:

доктор биологических наук, профессор СштковскнЗ Д,М. кандидат медицинских наук- Егоров Д-Э.

Вздущзя организация:

^аучно-иса??едовательский институт -детской, гематологии МЗ РФ _ Вавдега состоится «^4»

_ 1995 г. з Л » час на заседание диссертационного совета К.084.14.04 в Российском государсгвегэда' ;дадицинсксм 'ЗНЕвэрситете но адресу; 117859, Москва, уд: Островитянова, I. ^ •

С дассвртациэй "ыокно ознакомиться в библиотеке ЕРМУ.

Автореферат разослан . о/ьТ^^Н/ _ 1995

г.

Ученой секретарь диссертацковного совета,

тандадат квдшрнскжх наук И.В.Бурошяозй

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность проблаш.

Антибиотик блеомицин обладает выраиеннш противоопухолевым действием к'широко используется в комбинированной химиотерапии шюсконлзточного рака легких, коггси и других злокачественных опухолей эпителия. В отличие от других противоопухолевых антибиотиков он практически не угнетает гемопозз к не обладает тглуноеуцрессяфуэдЕМ эффектом. Однако, осложнения, вызываемые блеомицином, резко ограничивают возможности его применения в терапии опухолей. Наиболее сильным побочным действием является быстро прогрессирующий фаброз легких, приводящий к возникновению дыхательной недостаточности и смерти от еимссш. В связи с этом, чрезвычайно актуальной является проблема поиска и отбора фармакологических препвратоз для профилактики и лечения патологических изменений, внзызае!.кх блэсмицином.

В настоящее-время большое внимание -уделят комплексу гипотез, сбъяснягзциз: 'механизм- натобиологической активности блеошцинз с точки зрения свободно- радикальных процессов. Полагавт, что основное цжготоксическое действие антибиотика в отношении опухолевых-клеток связано с "поврзядением ядерной ДНК супероксзд-ннми -анЕсн-радккаламЕ, которые образуется в результате взапмо-действшг"""акп5ЕЕого-"Еомштекса - ГБлм-Уе-о]* с--молекулой ДНК СРв-Ьэгхг^, 15301 »г в ■ побочное ■ фяброгевное действие обусловлено гшгерзродукцией аютшных -ферм кислорода альвеолярными макрофат«1,--мстоцита?я1и нзатрофила!.ш [СопХеу, 198б]. Различия в механизмах тукорлцидного и фиброгенного действия позволяв? надеяться на -возмогтаость поиска ггр-зшратов, избирательно подашшщих побочный эффект бдеомишна, Особый интерес для исследований в этом направлении' - представляют природные нетоксические соединения: бжфлавоноид рутин и его комплексы с

некоторыми ионами переходных металлов. Рутин получил срзвнитель- но широкое применение не только как витамин, но и лекарственный препарат. Более того, рутин не • снижает мутагенного эфЬекта антибиотика. В связи с этим его использование в качества ингибитора свободно- радикальных ■процессов, стимулированных: блеошцином -в легких, представляет особый практический интерес.

Таким образом, -актуальность работы обусловлена разработкой -теоретических 'предпосылок, ' связанных с изучением свободно-радикаль"Еыгтгооцессов--в -механизме побочного' действия блеомицина ъ системах in vitro и in vivo, для отбора оптимальных протекторов •"блеомициноЕого" -воспаления и фиброза легких. Цель и задачи иесяздования.

Основная -цель работы заключалась з выяснении роли свободно- радикальных реакций в развитии <|иОроза легких, индуцированного йлеомицином, и изыскании 'средств патогенетической профилактики этого побочного -эффекта -противоопухолевого антибиотика. Для достижения указанной цели требовалось решение слэдутажх" задач:

-■изучение влияния блеомициза на генерацию активных форм кислорода фагоцитирунздаи клеткгми; ' '

■ -определение -роли кислородных- радикалов и .. продуктов перекисного окисления" "Липидов в развитии-воспаления и-фиброза легких,- вызванных здатратрахеальнда 'введением --фюдаицина экспериментальным животным;

-подавление развития воспаления и -фиброза легких с помощьв антиоксздантов и хелаторов мвталлоз переменной валентности. Научная вешана.

• Показано, что Олеомицш в терапевтичэском■ диапазоне концент-

раций (I-Шмкг/мл) увеличивает начальную скорость и максимальную интенсивность хемилюминесцентяого ответе макрофагов и нейтрофилов на фэрболозай эфир и частицы опсонкзированвого зимозана. Усиление клэ точной хемилшинесценции блеомицином является кальций- зависимым процессом н происходит за счет преимущественной генерации • клеточными ферлентами

НАДЗН-оксидазой и лшгоксигеназой. "Показано, что интратрахеально введенный блеомицин стимулирует _ гшгерпродукциа кислородных радикалов клетками альвеолярного лавзка, выход белка в Орсяхскальвеолярное пространство, отек легких, перекисное окисление липцдов легких и приводит к развитию выраженного легочного фиброза. Хелаторы ионов талэза (дэсфзрриоксамин, 1,2-диметил- З-гидрокси-4-пиридшон) к антиоксвданты (рутин и его комплекс с медью) ингибнруют стимулированную блеомицином гшернродукцто кислородных радикалов как в системах 1л vitro, так и in vivo, а также, снижают интенсивность перекисного окисления лшщцов' в легочной ткани. На модели Олеомицинового £иброза выявлено, что рутин и его комплекс с медью снижают развитие фиброза -легких. *

Установлено, что противофиброзный эффект"рутша и Си-рутина коррелирует с частичной- (рутин) шт полной (Cu-рутин) блокадой тагорцродукцик кислородных радикалов активированными лейкоцитами' бронхо- альвеолярного пространства при любом пути и любых сроках введения антибиотика. Научно-практическое ■ зяаченаа -работы.

На основании 'свободно-радикальной гипотезы патологического действия блеодацяна, разработана система отбора средств, предотвращениях развитие "блеомицинового" фиброза. С использованием этой системы найдена 2 соединения- руган и его комплекс

с мелью, обладающие профаиактическим и лечебным эффектом при "блеомициновом" фйрозе.

В результате вышлненых исследований определена новая группа препаратов, перспективных; -для поаледундих работ по ■ изысканию средств, сшшапцих- побочное "действие блесшщина- Ими являются блокаторы- кальциевых каналов (нифедипин), -которые эффективно предотвращают потенцирование блеошщином хемзлшине сценции фагоцитов и (но литературным данным) усиливают противоопухолевой эффект антибиотика. Апробация работа. ,

Материалы диссертации доложены на 2 конгрессе по болезням органов дыхания (1991 г., Челябинск) и4 национальном конгрессе по болезням органов даяния (1994 г., Москва). Апробация диссертации' состоялась 9 сентября 1996 г. на совместном •заседании" лаборатории патогенеза - тс экспериментальной терапии пневмокониозов РГМУ и лаборатории биофизики и биохимии клеток крови -НИИ- детской гематологии Ю РФ. Публикации.

По теме диссертации опубликовано 5 работ. Структура диссертации.

Диссертация состоит из 'введения, 6 глав, выводов и библиографического указателя. . Работа тшшстрирована 26 "рисунками; количественные данные приведены в 8 таблицах. Виб лиографический " указатель " -имеет 194 наименования отечественной' и зарубежной 'литературы.

ИАЗГВРЙЫЫ-И-ИЕЩЯ

В работе были использованы слёдущие реактивы: , блеомицетина- тидрохгорвд -(экспериментальный завод Института органического синтеза Рига, Латвия)т форбол 12-дарнстат-13-аце-

таг, люминол, лвдигенин, CuZn-супероксиддасмутаза (Sigma Chemical Co., Сент-Луис, США.); 15-липоксигеваза из соевых бобов 230000 ед/мг, каталаза 65000 -ед/мг, пероксидаза грена 5000 ед/мг, ксантин (Serva, .ФЕТ); альбумин лиоф. сывороточный (Resnal,Венгрия); кислоты:- аскорбиновая, трихлоруксусная, 'фосфорная, ' хлорная, нордигкдрогуаяратоввя; диметялсульфоксид, " -руган» - "десферрюксамш (Desíeral), 1г2-диметш1-3-гидрокси-4-пиридинон (Deferiprone), реактивы отечественного производства квалификации ХЯ.' ОСЧ: Комплекс®, рутина с железом и медью были любезно предоставлены проф. И.Б- Афанасьевым и приготовлены la situ Острахович Е.А. (научно-исследовательский витаминный институт, Москва, Россия).

Экспериментальная работа проведена на беспородных крысах саодах с массой тела 180-200 г. Объектом исследования служил биологический материал, взятий у экспериментальных животных: макрофаги, нейтрофшты, ткань, легких. - ...

Ператонеальнне макрофаги крыс выделяли методом (Lehnert, 1984), альвеолярные макрофаги- (Bechard, 1988) с небольшими модификациями. Плазматические- -мембраны -фагоцитирухщих клеток выделяли'по-методу (Brom et al, 1984) с незначительными изменениями. Определение клеточного" состава -производили на мазках, фиксированных метанолом и окрашенных гематоксилин- эозином по HbxTyv -Жизнеспособность -клеток в суспензия устанавливали в тесте с трштановнм синим. -Измерение хешлгаагнесцэнцнн (ХЛ) проводили с -помощью лтаанометра ькв 1251, Швеция. Определение ■генерации -свободных радикалов -кислорода в суспензии клеток "проводили' по Измерению хемшшминесценцяк, сенсибилизированной люминолом шш лвцигешном <Ailen, 1976). Измеряли интенсивность спонтанного свечения, амшшггуду и начальную скорость развития

активированного свечения, светосумму свечения за определенный промекуток времени. Эффективность блеомицина оценивали по величине "блеомицинового" прироста интенсивности активированной ХЛ: AJ ■ = (ißjjy-1) / 1x1005, где 1блы - ашхлатуда XI активированных фагоцитов, преданкубированных с биомицином 1-без блеомицина. Кислородные радикалы определенной природы'создавали в различных химических .и ферментаташных системах: ксаятан-ксантиноксидаза, пероксидаза- пероксид водорода. Активность 15-лшгоксигеназы-- ДОГ) -соевых бобов определяли спектрофото-метрически по скорости образования' диеновых конъюгатов при окислении ЮГ арахидоновой кислоты, ХД методом (Laakso S. et al 1934). Активность зшпоксигеназа ыакрофагов определяли XI методом (Schulte-Herroruggen, 19S5) в небольшой модификации. Определение белка проводили по методу Лоури. Перекисное окисление лишздов ъ гомогенате легких изучали по образованию ТЕК-активяых продуктов. Оксипрояив в ткани легких определяли по " методу (Stegemann, 1958). Модель "блеомицинового" фиброза создавали путем интратрахвального введения I мг блеомицина в I щ 0,9% раствора NaCl (Giri, 1933). Статистическую обработку данных'производили, рассчитывая "среднее квадратичное отклонение (s) и используя -критерий t-Стьвдента.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

ВЛИЯНИЕ БЛЕШВДША НА ' ОБРАЗОВАНИЕ АКТИВНЫХ ФОШ -КИСЛОРОДА АктавировАша® -фагодкаш .

Фиброгевное действие. блеомицина имеет, вероятно, мновест-ввнвые -механизмы, ' гайшчалщие прямую тканевую -токсичность лекарства' и непрямое 'воздействие'; связанное' с развитием воспаления • mim * опосредованное образованием AffiK.

Изучение процесса генерации радикалов кислорода проводили

хемилшинвсцентным (1Л) методом с использованием: 1)различных сенсибилизаторов свэчешя (лшинол, лвдигенин); 2)антиокси-дантшос ферментов (супероксщздисмутаза, каталаза, пероксвдаза); 3)низкомаяекулярных соединений (ДОСО).

Показано, что'блеомвдин -не влияет на-интенсивность спонтанной 'ХЛ, но в -концентрации от 1,0 до 10 -мкг/мл увеличивает интенсивность лшинол- и лицигенш- сенсибилизированной ХЛ лерятонеальвнг макрофагов, - • -активированных- фэрболовым эфиром (ЗШ.) или -частицами опсонизировшного зимозана (рис.1).

Рис. 1 Зависимость ивпгсксикности (А) н ннпяльивн скорости (Б) хемииштннесияпвего ответа п^рнтопсальвш иэкрофггов ва ФМА ели знмозгд от концентр яцйл блеомшргоа.

[. Среда нтпеубацнв содержала пкмишол: (05нМ); макрофаги (0,5x10-6 нл-!) акгнввроваян форбозоаыи эфврои (50 иг/ид);

2. хгюцвгенин (0,5 мВД, ФМА; . . .

3.пюмнноп,опоовкп[роваяныв зимозая (200 юг/ид);

4. люцигенин, опозвиозав

Аналогичные результата получены для нейтрофилов и альвеолярных макрофагов. При дальнейшем увеличении концентрации блеомищша увеличение интенсивности' и не наблюдалось, более того, регистрировалось замедление развития ХЛ-свечевдя.

Для анализа механизма потенцирования4 блеомицшюм активированных лейкоцитов и вычленения радикал- генерирующих систем, участвующих в обеспечении действия антибиотика, исследовали какие радикальные формы образуются в процессе, его взаимодействия с клеткаш. Определено (рис.2), что усиление II активированных фагоцитов, возникающее в результате введения блеощщина, обусловлено преимущественной генерацией супероксвд-ного радикала. Использование СОД на 80-85% ингибирует "блеомициновый- прирост интенсивности люцигенин- и лшинол-зависимой ХЛ. —

□Ели М) И&пы4ДЫСО(Ч: ИБявШягалет ОБлм*СОД (Ч):

Рнс. 2 Влияние ингнйиторав кисларо^-завискмых реакций на увеличение блеомицяиом ннгеысиввогт лнынаал-мал симоа ХЛ. перитонеальных мякро-фягиз, «кпшаровангялх епс. замшелом.

кояцеятрадня: блеоиицнна-10 нхг/нл; СОД-2 0 юа/ил; хахадазы-ДО кхг/шц ДМСО-. 0.05М олкиозава- 200 юсг/ют

Одновременно, регистрировалось сшпгенле выхода зд из клеток. Одной из возможных причин этого, макет быть разложение перскси-

да водорода блеомицином, взаимодействие с которым, как было показано в бесклеточной' системе, сопровождается развитием длительного ХЛ-свечения.

Попытка использования каталазы, для определения роли Н2О2 в механизме действия ' блеокацина оказалась безуспешной, т.к. антибиотик изменял свойства каталазы, в результате чего, наблюдалась синергичность действия каталазы г блеомицина в потенцировании как лшинол-, . так -и лщигенин- зависимой II. Указанный эффект проявлялся только в узком диапазоне концентраций блеомицина (5,0-15 мкг/мл). При этом антибиотик, вероятно, не взаимодействует с железом активного центрв фермента. Во всяком случае, блеомицин не влиял на ингибирушие свойства каталазы в модельной б&склзточной системе пероксидаз а-Н^О0.

ШД5ЯШВ ВЖХЩШ' НА ' ДКТМВНОСТЬ вЕГИЕНТСВ ОКШЖГЕЛЫЮГО

'.СТлБОЛИЗДЛ йаГОЩСОВ.

ПслгенцироваЕЕЭ""блео?лицинпм ""дыхательного взрыва активированных ■ фагоцитов -молет быть связано с изменением активности нескольких' ферментных систем клеток. Наиболее ванными источниками генераций' актизннх форм кислорода в фагоцитах являются: 1ЙДФН-оксидазный ферментный кошлзкс; система метаболизма -арязэдоновой кислоты (А/к)-, гзэлопвроксвдазная система.

Как показано ранее, внесение блеомицина в клеточную суспензию провоцирует 'преякзтцэстеешю генерацию супероксздного радикала, кислорода. Соответственно, ■ингибкрование взидок патркя гмзлопероксидззы, ^работа которой не связана с генерацией супэроксида, не'играет суп^тзенной роли в потенцировании II

блеомицином (рис.3). Более того, наблюдалась синергичность потенцирующего действия блеоыицина и азида натрия на процесс

радикалообразовзния альвеолярными макрофагами, активированными

%

N

РасЛ Еаияаис ища натрия (N»N1) на потевцврошшие ХЛ плакированных ■ фагащпа» блеолнцинои.

Концентрация блсоиицнва-10 нкг/ил 1мМ

Среда накубацвк содержала О^иМ люмшола. Ахтякатор- опслшозан (200 мхг/нл)

п/к-псрктовеавьные макрофаги а/м-алысолярныс макрофаги н/ф-яейгрофнлы (0,5 шш/нл)

Ыи а!м ' н/ф

Блеошщин не только увеличивает интенсивность ХЛ, но и начинает ускорять ХЛ-ответ ва зимозан и 4МА сразу же после введения активатора в суспензии. Зто подтверждает гипотезу о взаимодействии блеошщина с компонентами • НАДФН-оксидазной системы, т.к. активация ферментов, метаболизирущих арахидоновую кислоту и выход арахидоната из мембраны; если эти эффекты имеют место, происходит" позднее.

Исследование _ компонентов системы метаболизма арахидоновой кислоты, проведенные на стимулированных частицами зимозана перитонеальных макрофагов с использованием НДГА (ингибитора лшоксигеназы) и асйиркна (ингибитора циклоксигеназы) (табл.1), а также ва фагоцитарной лигоксигеназе и 15-ЛОГ соевых бобов (рис.4) показали, что использование блеомицина не связано с

зимозаном.

Таблица 1. Дейстм бжеемщвм« апявнвегьляимоагтси.

Рве.4 Влияние ншцбмтр«« ферментов иетяоалнзжа аряхлдомвон кислоты ня усиление блеискцином зямозян-индуциротиюнви ХЛ щрд|оа< дм.дмт киюрофягов.

Концентрация бдсоницяна-Юикг/шг НДГА- 5x10 -5 М асяари в а-3 тг/нл дюиинода-О^иМ

добааха Э (60"), ОТЯ.СД

15-ЛОГ соевых Бобов (ЮнгЛш) ЛОГ из «еахпии-роваяных шрофи* го в ЛОГ из яктн*гр. о-знкота-вом «гаж-рофяго»

бе - Вон 8000+ 740 900± 95 •4500+ 355

Блм Юихг/мл 18000± 1650* 1290± 100« 6050± 610*»*

Фагоцитарную ЛОГ вчдеталн га нвтахт-пых вяа прсдваригашю яихубнрованных с блеоиидянои (10 юг/нл) н оп&зтгозаяон (200 шст/кл) псрктоглнкрофагов (1 шш/шг). Б(60")кзс1осу11ка ХЛ за 60 сас посте добавления линолсноаон х-ты (54 икт/кд) к ЛОГ.

* -р<0,001;«-р<0,01; *** -р<0,05

циклоксигеяазой, но сопровождается-активацией лигоксигеназы как в покоящихся, так и в активированных макрофагах. Антибиотик также не влиял на - выход арахидоната из мембранных фосфоляпидов, т.к. добавление 15-ЛОГ-соевых -бобов в суспензии фагоцитов, активированных'-ФМА, действие .которого не связано с метаболизмом арахидоновой кислоты, не усиливало интенсивность О ни в присутствии блеомицина, ни без него. Учитывая этот факт, можно сделать швод, -что генерация активных фор« кислорода в процессе-метаболизма арахидояата будет усиливаться

блеомзцином только в том случае, если происходит• активация этой системы используемым активатором (в данном случае- опсонизк-рованным зимозаном, но не ША.).

.Таким .образом, на основании полученных данных можно сделать заключение, что в -механизме усиления 'ХЯ активированных фагоцитов блеокициком "большое -значение •■"пршадлеккт, по-видимому, ВДЗй-оксидазной ^системе фагоцитов. 'Гакке имеет место активация липоксигеназы. . Не -исклотена. -возможность изменения функционирования некоторых антаоксидантэдх ферментов, например;--каталазы; •которая в присутствия: -антибиотика-оказывает прооксвдантное действие.

РОЛЬ ИОНОВ КАЛЬЦИЯ И 2ЕЛЕЗА В НШНИЗШ ГЕНЕРАЦИИ

КИСЛОРОДНЫХ РАДИКАЛОВ ФАГОЦИТАМИ В ПРИСУТСТВИИ БИЕОШЦЕША. ?+ "

Са участвует в сопряжении внешнего стимула с ответной реакцией клетки " и 'является универсальным посредником, регулирующим все формы клеточной активности. Исследование роли ионов -'кальция в -механизме ■ потенцирования клеточной ХЯ блеомшзнном. тгровадаш -С '-ЕСшльзованием-на^еджшна- блокатора АТФ-зависимых Са' -каналов тг кальциевого ионофора 123187. ■

Выло показано, что б отсутствии блеошцпна ингибирование нифедашшом (2х10_^М) -интенсивности лшенол- и лицигенин-зависимой ХЗ - перитоне вльннх- макрофагов, активированных - ША, не превышает ЗОЕ. "Действие 'шфэдипина • на ХЯ • клеток в .присутствии блеомицина'было-гораздо'более-эффективншд, т.к. он практически полностью -устранял активирунщй . эффект антибиотика, снижая "блеомицвновкй" прирост интенсивности ХЯ макрофагов, активированных ФМА, с 140% до 26% (лшинол) и с 95% до 12% (лвдигенин) (рис.5). Известно, что - форболовый зфгр повын-ает сродство

Рне.5 Дейсткне внфедопнна на ""Злеомихщвваый" прирост нптшснвнкгтн ХЛ иеритонеаяьныг . мяхрофягш, .якааяровяаных ФМА.

.Концезграцяя: блсояицяна-10мкг/«л; нифедтгана-2х103 М; ФМА.-50нг/юг; лгоневол! (ЛЮМ)-0,5иМ; люцигсннаа (ЛЦГ)-0,5ыМ

JSOU

лцг

2+

протеинкияазы С к Са ., поэтому, для аютвации клеток достаточно (физиологической концентрации кальция- Вдеомицин,

вероятно, индуцирует дополнительную активацию Са-каналов.

"Еяеомициновнй" прирост интенсивности Л фагоцитов, активированных частицами зимозана, действие которого сопровождается "быстрым" увеличением цитотлазматического -кальция, был более устойчив к. введению нифедашша, т.к. используемая концентрация блокирует только 50% каналов, что недостаточно для -эффективного . ингибирования процесса. Увеличение концентрации блокатора до 1СГ% снизило величину "блеомицинового" прироста интенсивности- ХЛ до 1055. Полученные данные говорят о важности транспорта кальция-для'обеспечения работы антибиотика.

Известно, что антагонисты кальция повышают мутагенность цитостагиков [sceia н, 1993]. Это интерпретируют на базе гипотезы "накопления", согласно которой, антагонисты кальция

ингиоируют выход блеомидана из клетки и увеличивают таким' образом время воздействия антибиотика на клетки опухоли. В связи с этик, использование нифздипина как препарата, повыша-вдего мутагенность и, одновременно, сникающего способность блеомицина потенцировать окислительный метаболизм фагоцитов, является чрезвычайно перспективным для'дальнейшего изучения.

Исследование роли ионов железа в механизме усиления блеомишшом интенсивности Ы1 активированных фагоцитов проводили с использованием различных хелаторов.

Показано, что хелаторы келеза десферриоксамин (десфзрал) и 1,2-диметил-3-гидрокси-4-Ш1ридинон (Ы), а также вещества, обладанхцие одновременно хелатирувдим и антиоксидантным действием- биофлавоноид рутин и его комплексы с медью и железом, эффективно ингибируют, а в концентрации выше 10-6Ы полностью устраняют эффект потенцирования интенсивности XI активированных макрофагов блеомициноы (рис.6).

1дО

Рис. 6 Влияние десфсраля в Ы на ввтев ашиосп лнидщ^^-ашюдиж ХЛ оертговшиаис макрофагов, актавврованвых иишмшшш, в присутствии бвгяитмаа. или без вето.

100%- 6а блсоннцква и врсааратоь.

С- полярная концентрация дссфсрала юга 1,1 ■

г.

ИССЛЕДОВАНИЕ" ВЛИЯНИЯ АНЕИОШЩАНТОВИ ХЕЛАТОРОВ МЕТАЛЛОВ ЕЕЕЕМЕННИГ-ВАЛЕНТНОСТЕЙ НА' РАЗВИТИЕ "БЛЕОМИЩШОВОГО" ФИБРОЗА' ЛЕГКИХ.

Описание модели "блеомицияового" фиброза и схемы введения препаратов -представлено- -на-^зис;-7. • 'Фиброзный процесс- -возникал при однократном интратрахеальном (и/т) введении раствора антибиотика.

Рис.7 Схема хронического эксперимента па шученшо аланпня препаратов -группы ругана я хглаторов железа - десферлля н LI ня блеомицпи-нвдупнрованное воспаленней фиброз легких.

Схема ввелтадщ препарате»

I ил н/т, однократно

I__время (сутки) досяс начала эксперимента_

I I |х(3) | | | i xf 71 i llll ! I 1.1 I M II | I i I II lx(2S) I

t ^.по 1 мл пероряльво, ежедаезно

х- исследование бноматервала через 3,7 н 28 сутох посте начала эксперимента Псрорапъное введенис-растворов проводили с нспользовалнем кишечного зонда

Исследуемые группы

путь введения группа интратрахсальво (н/т) пероральво

! контроль 0,9% NaCl 0,9% NaCl

2 препарат исса-нрепжрат (104 М) нссяг-прспарат (10-* М)

3 блеоняпив блсоиядин (1 иг/шг) 0S% NaCl

4 бпеоижциа + препарат бшооиаяия.|1игДпг)+ ■исссспрспвраrftO-* М) ксаглрспарат (10-< М)

Блеомицин на ранних стадиях после интратрахеального введения провоцировал острое воспаление, характеризующееся развитием отека легких, повышением концентрации общего белка и.количества нб йтрофилов в брйнхо- альвеолярной жидкости (табл.2). Нарастание воспалительного процесса ■сопровождалось увеличением' интенсивности лшпш- к лщкгенин- зависимой ХЛ фагоцитов из БАЛ "ОлеомициноЕых" крыс (гипэрпродукция АФК) на протяжении

Таблица 2 Влияние рутина и Си-ру-пша. на действие и/т введенного бдеомицина в системах ш то.

группа хоицеат-рнди ветка: в ЕАЛ.игУш! соотношение жооя- ЧССГВЕ <нф/вф янтснсивн остьХЛ (вюин-вол),% ивтеноХЛ (лшцвге-нив), % концентрация КОВД.ОХСЯ-пролвяа. мхх/ 100нг тканн легких.

3 сутки 0,9% ЖС1 Блм Бли+рухнн Бли+С«- рутин 0.09±0.02 0,51+0,08 0,6410,1*** 024+0,05** 92±3,75 4,4±1,7 5,51:1,12 539+1,0 И5±10 196+27 100±10** 40+5* ' И0±8 250+15 225±24*** 148+20* . 1,0±0,05 13+0,09 1,0±0,07** 12+0,08*** 190±33 290±38 230±31*** 210+14***

7 сутки о.9У„та Блн БлшЧ-рухкв . Блм+Си- • русин 0,11±0,02 0,96+0,14 №±0,18 0,6±0,Г* 5,04+1,1 0,6+028 1,9*0,98*** 5,13*2,0** 108±9 190±20 1б8±17*** 142±16" . 130±10 290+20 225±23** 120+15* 0,68+0,05 2,5510,19 221±025*е* Ш±02** 250+21 420±25 340±24*« 330±14*

28 сутхи 0.9% ИаС! ' Блк . Бли+руткв Ьш±Си-рутвв ТУ+0,02 . 0,31+0,03. . 032+0,04 ■ 0,3+0,02 «±3,9 6.4ШЗ. 9£6±22 10Д+1£ 101±7 168±7 150±9** 115+7* 100±6 170+14-160±15 90+10* 0,95±0,05 I ¿>±0,69 .-1;6±0,0б*** 1,6±0,04*** 270±12 490±14 ■ ' -360±42** 360±17*

* - р <0,005;" - р<0,05; *** - р<02

всего эксперимента и интенсификацией процесса ПОЛ легких. На 28 сутки регистрировалось резное увеличение содержания оксипролина в ткани легких. .

В предыдущих главах работы было показано, 'что предварительная инкубация с блеомицином .клеток, выделенных из интакхных крас и вктиЕированзнх опсонизированным зиыозаном - приводит к дополнительному увеличению интенсивности клеточной ХЯ ("Олеомициновый" прирост - «-Л. Этот. эйфект сохранялся и для фагоцитов, изолированных из крыс, подвергшихся и/т'воздействию 0,9%-КаС1 (рис.8).

время (сутт) после я/т «ведения вссплретыгратов

РиеЛ Елжшие рутпиа я Сч-рутяня вя усшквае ввтшсввааетн люшнал-девасаквй ХЛ лсйяеодтов бронхо-яшикаларпого ляяава опитяых групп крыс, пря добавления йлеомииш* in vitro.

У еловая эксперимента in vitro: фагоциты БАЛ (0,5x106 шг1) ншеубировнля с блеоыяцяном (1 Онхг/ыж) в течения 5 минут, затек добавляли частицы опазимазаяа (200 ихт/ил).

Лешсощгш БАЛ выдеясиы из опытных групп крыс, получавших блеоиицнн я ясся. препараты по схсис, представленной нарнс.7.

После интратрахеального введения блеошцина фагоциты теряли способность к • развитию добавочного "свечения " при ' повторной инкубации-с антибиотиком в -условиях • In vitro. Одной из причин, может--быть' "истощение■ -радикал-генерирущих систем клеток в результате ■-длительной типерпродукции - 'АФК - -фагоцитами из " "блеомициновых"' -крыс, ~ или ^насыщения—им 'определенных систем, участвущих в -возгшкшвэши - /-эффекта ■ усиления XI.

■-Штратрахеально- -введенный"-'блеомяцин.....не -метаболизируется в

v

легких-и выводится из' бронхо—легочного "пространства вместе с клеткшяи, в которых он 'преимущественно накапливается, что происходит на счет частичжго обновления таеточного состава и восстановления соотношения-мф/нф к концу -эксперимента (табл.2).

Одновременно (28 сутки) восстанавливается и чувствительность фагоцитов к блесшщину.

Биофлавоноид рутин и комплекс рутина с медью, вводимые штратрахеально и перорально, оказали профилактический эффект к снизили интенсивность развития "блеомицинового" фиброза. Cu-рутин, ингибировал индуцируемую иятратрахе&пъно введенным блеомицином гиперпродукцию АФК фагоцитами БАЛ, оказал противовоспалительный эффект, снизил интенсивность перекисного окисления липидое легких и концентрацию оксгшролша, повышенных цосле взедения антибиотика. Одновременно, лечение си-рутином полностью устранило потенцирование UI фагоцитоз, полученных из "блеомициновых" крыс, возникающее при их инкубации с блеоми-цином в условиях in vitro (рис.8). Сохранение толерантности к блеомицину на потяжении всего эксперимента позволяет сделать вывод, что развитие фиброзного процесса на фоне лечения Gu-рутином будет замедляться не только при однократном, но-и при хроническом введении антибиотика, что является чрезвычайно важным моментом для использования блеошцина в клинической онкологии.

Действие рутина отличалось нестабильностью. Мы полагаем, что нецелесообразно вводить- рутин интратрахеальво, т.к. его дейртвие в первый исследуемый срок 'эксперимента (обусловленное преимущественно и/т введением) не снижает, а в отдельных случаях (например, выход белка -в- бронхо-альвеолярное пространство) ухудшает действие блеомицина. Пероральное введение препарата, действие которого ш наблюдаем '.в более поздние сроки эксперимента, является более устойчивым и снигает .многие -показатели "блеомицанового" ■'• воспаления, а такие концентрацию оксипршшна. -Мы полагаем, что необходимо

дальнейшее изучение рутина и оптимизация схема его введения.

Исследование хелатороз железа- десфзрала и ы ограничивалось изучением их влияния на параметры "блеомицинового" воспаления и окислительного метаболизма фагоцитов БМ. Показано, что оба препарата- тюржзлизуют -все -исследованные показатели (табл.2) и являются, тбким образом, агентами, потенциально способными снизить фиброгенность блеомицина.

шводы

I. Влеомицш^ концентрации от 1,0 до 10 мкг/мд увеличивает интенсивность л начальную скорость хемялшинесцентного ответа макрофагов и нейтрофилов, активированных форболоЕым эфаро?л и частицами опсонизированпого зимозана.

2. Усиление блеомицином клеточной хемилшинесценции обусловлено преимущественной генерацией супероксидных радикалов к происходит за счет активации НАДШ-оксидазн п лшпоксигеназы. Блеошцин активирует лигоксигеназу как в покоящихся, так и з активированных макрофагах. Блеомицин не влглет на активность шелопероксидазы,' циклоксигеназы и фосфолшаз.

3. Стимулированная " тЗлеомицином продукция кислородных ■радикалов -фагоцитирущими -клетками является кальций-зависимым

О I.

процессом и ингибируется "блокатором Са -каналов нифедипином в концентрации 2x10"% на-'852.

4. Разработана "система скрининга препаратов, способных предотвратить • развитие '"блеомицинового". фиброза, заключающаяся в изучении их влияния на индуцируемую антибиотиком типерпродукцюо актишых'форм кислорода, воспаление, перекисное окисление липидов и-фиброз легких.

5. Хелаторы ионов келеза десферриоксамин и 1,2-даметил-З-гидрокси-4-1шридиаон, введенные интратрзхэально 'и перорзльно, иягибируот стимулированную блеомицЕшом хемшшшшвсцонцию макрофагов и гипэрпродукцию кислородных , радикалов клетками Оршхо-альвэолярвдго "лавака.

6. БиофлавоЕОид рутин и его комплекс с мэдьв при ингаляционном и пероральном введении подавляет стимулированную блеомицином • гштзрпродукцшэ кислородных радикалов клетками бронхо-альвеолярного лакана, пзрекисное окисление лапздов.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ЖСОЙЕЩЩЩ.

I. Комплекс методов, .заключающийся в изучении свободко-^радикального статуса лейкоцитоз, перекисного окисления лштидов и фиброза легких mosho рекомендовать для отбора средств, ирздотвращашщх развитие блеомицан- индуцированного воспаления-л- фаброза легких s для'подбора схем введения данных препаратов.

2. -Рутин - природное-'нетоксическое соединение, обладающее хелатэдушяшг-Ti"-антирадикальными • свойствами и его комплекс с ■ медью-"-рекомеэдуатся для •дальнейшего изучения в качестве лекарственного препарата для профилактики , ослоннений, сопровоадащих терапию опухолей блесшцином.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ'ПО ШЕ ДйССЕтЩй.

I. -Ибрагимова Т.к., Острахович Е.А., Соодаева С.К., Коркина Л.Г., "Афанасьев И.Б. Протквофтбразное действие препаратов на основе природных флавоноидов. Тезисы, 4' Нац. Конгресс по болезням органов дыхания, 1994, Москва.

Z. КЬт-Ипа Ь., Ibragimova G., Abramova Ii., Kikohal'ohiK ,

Csato J., Aianas' ev I. Protective .action of natural antioxidants against lung injury induced by oobalt ions, asbestos fibers and bleomycin. International congress oh Зтее Rad. in Health, and Diseases., 1995, Istanbul, Turkey.

3. Коркина Л.Г., Ибрагдаова Г.А., -Бегзшин А.В., Лурье Б.Л. Исследование механизма блеомвдкн- индуцированного фиброза легких. Тезисы 2 конгресса по болезням органов дыхания, 1991г., Челябинск.

4. Александров О.В., Лурье Б Л., Гноевш: В.В., Григорьев С.П., Ыанакова Е.В., Коркина 1.Г., Ибрагимова Г.1. Влияние длительной оксиганотералин на хемлжмзнесценк5эс> и антградакальную активность у больнкх хроническим сбструтстившм ОрОНХИТОН. ПУХФЙОЕОЛОГИЯ, 1932, N 3, с.тр.9-13,

5. Eorfcma Ь.С,5 Oeato ¿.A,, Ibragimova G.A., Kimdiev Yu.I., Krasnyuic К.Г., Aianas'ev I.В. Batural ocauriag oral chelators against leaa and „cobalt toxicity.. Central Eurcp-«T.Public-Health., Suppl., 1996, in press.