Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Протеолитические ферменты и белки-ингибиторы сериновых протеиназ люпина

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Протеолитические ферменты и белки-ингибиторы сериновых протеиназ люпина"

3Г6 од

' ЛКАДЕ.1ИЯ НАУК БЕЛАРУСИ ¿- ^ Р,(Ю ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ИШТИТУТ ЭНЗПЕРИМШТАЛЫЮИ БОТАНИКИ им. В.Ф.ОТРЕШЧА

На правах рукописи

БУСНЮК Ольга Васильевна

УДК 577. 112+151.042 ;633.364

юогштичЕСккЕ фермбнш и беш-ингибигсш

СЕРИНОШХ ПРОТЕИНАЗ ЛЮПИНА 03.00.04 - биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидате биологических науя

¡'инск - 1993

Работа вылолнена в лаборатории биохимии и биотехнологии растений ордена Трудоврго Красного Знамени Института экспериментальной ботаники им. В.Ф.Купревича АН РБ.

Научные руководители: доктор биологических наук, профессор

A.В.Мироненко ;

кандидат биологических наук

B.И.Домаш

Официальные оппоненты: доктор биологических наук Н.Г.Аверина

кандидат биологических наук Г.А.Василевская

Ведущая организация: Институт биохимии им. А.Н.Баха РАН

Защита диссертации состоится хЬс<г" 1994 г.

в /У'^часов на заседании специализированной совета К 006.04.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени •кандидата биологических наук при ордена Трудового Красного Знамени Институте экспериментальной ботаники им.В.Ф.Купревича АН Беларуси (220072, г.Минск, ул.Ф.Скоршш, 27).

С диссертацией махно ознакомиться в Центральной научной библиотеке юл. Я.Ксишса АН Беларуси.

Автореферат разослан 1993 г.

Ученый секретарь

специализированного совета // Р

кандидат биологических наук и — и.В.Рогульченко

Актуальность теш. В настоящее время не вызывает сомнений определяющая роль процессов протеализа в белковом обмене живых организмов. В растениях протеолитические ферменты, катализирующие его реакции, участвуют как в реутилизации соединений яз вегетативных органов и тканей, так и в биосинтезе новых клеточных структур. Им отводится ключевая роль в распаде западных белков и формировании таких физиолого-биохимнческих свойств растений,как продуктивность, белковость,всхожесть семян (Мосолов, 1971, 1983 ; Левицкий и др., 1982 ; Шутов, 1983). Но конкретные механизмы этих процессов в настояцее время изучены далеко не пата остью. Особенно актуальный представляется вопрос о регуляции активности протволятических ферментов, а также их участии непосредственно в процессах накопления к распада белков в онтогенезе растения.

Одним из способов регуляции активности протеиназ, как предполагается, является наличие белков-ингибиторов (Ваиягзг*-пег et п1., 1976 ; Белозерский и др., 1982).Белковые ингибиторы, способные инантавировать различные ферменты животного кробиологического происхождения, выделены в настоящее врем из многих растений (Мосолов, Валуева, 1993). Исследование этих белков открывает новые перспективы в изучении белок-болковцх взаимодействий, структуры активных центров формантов я механизмов их действия. Однако до сих пор неясна :гх фязиологячео-кая роль в жизнедеятельности самих растений. В то яа вре»гл изучение функционирования бачков-ингибиторов протеиназ необходимо для выяснения конкретных механизмов растительного белкового обмена. Особо вакныы представляется это для высокобелковых бобовых культур, в частности, лапина.

Цоль к задачи работы, Целью настоящей работы явилось изучение протекания в липяно протеоллтаческях процессов п возможного участия в их регуляции белков-ингибиторов протеиназ. Исходя из поставленной цели в ходе работы сосались следующие экспериментальные задачи:

- исследование содержания протеолитических ферментов л ингибиторов протеиназ в листьях и семенах различных видов и сортов люпина и их динамики в ходе онтогенеза ;

- анализ в ходе онтогенеза злектрофоретического спектра бс-лков ингибиторсодерясащей фракции листьев я семян ;

"- выделение специфического протеолитического фермента люшгна ;

- выделение, очистка и характеристика белкового ингибитора серпноБшс протеиназ люпина узколистного ;

- изучение антиферментного действия ввделенного ингибитора.

Научная новизна и практическое значение работы, Впервые

проведено исследование системы протеаза-ингибитор в онтогенезе люпина. Между активностью ферментов и ингибиторов во многих случаях обнаружена обратная зависимость. Из семян люпина выделен _ препарат Я^-бензоил-р^аргинин-п-китроанилидазы (БАПАази) и установлена его принадлежность к свриновым протеи-назам. Из семян люпина узколистного (Ьир1пив апвио'НГоНив впервые выделен и очищен ингибитор трипсина, изучены его некоторые физико-химические свойства, установлено его взаимодействие о протеолктическим ферментом люпина, что доказывает участив белков-ингибиторов трипсина в регуляции эндогенных протеолитических процеосов. 1

Полученный препарат ингибитора монет быть использован в качестве аффективного лиганда в аффинной хроматографии при выделении сериновях протеиназ, а такяе, возможно, в медицине, как и ингибиторы из етшотншс органов и тканей.

На основания исследований электрофоретического спектра пнгибиторсодеркацей фракции семян люпина узколистного нами разработан новый метод по оценка белковости семян лапина.

Атгообания работу. Апробация работы состоялась на заседании лаборатории биохимии и биотехнологии Института экспериментальной ботаники юл. В.й.Купревача, симпозиуме по физиология семян (Душанбе, 1988), П съезде Всесоюзного общества физиологов раотений (Минск, 1990), 1У Всесоюзной конференции молодых ученых по физиологии растительной клетки (Минск,1990).

Публикации. Основные положения диссертации изложены в 5 печатных работах.

Структура и объем диссертационной работа. Работа состоит аз введения, трех глав, заключения, выводов я списка литературы (198 источников, из которых НО - заруб егдшх авторов). Диссертация излоаена на 140 страницах машинописного текста, включает 27 рисунков и 14 таблиц.

ШЬЕКШ И МЕТСЕУ ИССЛЕДОВАНИЙ

Объектами исследований служили семена, проростки и лиотья различных сортов люпина яелтого (Lupinus luteue Ь) и люпина узколистного (b.anguatifoiiuB L. ), последовательно "" отбираемые для проведения анализов на различных стадиях онтогенеза. Семена получали из БелНИИЗа (г.Жодино) и Госкомиссии по сортоиспытанию сельскохозяйственных культур Беларуси. Для проведения анализов в вегетативных органах использовали вторую пару листьев (от соцветия) растений люпина узколистного сортов Омега и Казан и люпина желтого сортов БСХА-382 и Пламенный, выращенных в Центральной Ботаническом саду АН Беларуси в 19871989 гг. •

Для экстракади протеолитических ферментов использовался I/I5 1.1 фосфатный буфер pH 8,0, Ингябиторсодержйцую фракции белков извлекали 0,2 M Wioi.

Активность кислых и нейтральных протеолитических ферментов определяли по методу Анеона (Anson, 1938) в модификации, с использованием в качестве стандартных субстратов казеина (pli 7,0) и гемоглобина (pH 4,5). Активность БАПАазы - по скорости расщепления синтетического олигопептида Яс-бензоил-!)^-аргинин-п-нитроаншида (БАЛА). Ингибиторную активность спрэ-деляли по методу Гофмана, Вайсблая (1975; с использованием БАЛА в качестве субстрата для определения. Общую активность ферментов выражали в условных единицах, соответствутпх образованию I мкМ продукта протеолизз (в случае кислых и нейтральных протеаз - тирозина, БАПАазы-п-нитрошшлина) за Г глин инкубации при 30°С. За одну ингибиторную единицу (НЕ) принимал;: количество ингибитора в экстракте, тормозящего расщепление I мкМ субстрата за I мин инкубация. Удельную активность рассчитывали на содержание белка.

Электрофорез ингибиторсодертацей фракции белков листьев и семян проводили в 12f, и 153-ном пегогакриламидном гель (ПААГ) в аппарате АВГЭ-1 по методу Лэимли (Laererail, 1970). Разделение компоненты характеризовали по относительной электрофюрвти-• ческо": подвижности (ОЗН) и молекулярным массам. Ингибиторы трипсина идентифицировали в тонкослойных пластинках по методу :.!лса, Ха.'з.:овица (Misa, Ну во wit г, IS75) в модификации Явлинского (Зеллнсгнй, 1966). Молекулярную массу белков оп-

о

редаляди электрофорезом в 12^-ном ПААГ в диссоциирующих условиях при добавлении додецилсульфата натрия (ДДС-Ка) в концентрации 0,1;?. Гели сканировали на лазерная денситометре Ц1Лговода-2202 ("ЬКВ" Швеция).

Колоночную хроматографию белков проводили, используя методы гель-фильтрации на акрилексах Р-30 и Р-60, ионоообменной хроматографии на ДЕ-52-целлюлозе и аффинной хроматографии на СИВр-активированной сефарозе с применением в качестве лигаи-да препарата перекристаллизованного трипсина фирмы "Спофа" (ЧССР). На этапах выделения белкилиофилизировали в вакуумной 'камере сублимационной установки "Стоке".

Аминокислотный состав белков определяли после предварительного кислотного гидролиза в 6н НИ на анализаторе аминокислот ыарки ААА-339 (ЧССР). Концентрацию белка определяли спекгрофо-тоыетрически и по методу Лоури (1о*гу et а1., 1951).

Статистическая обработка полученных результатов проведена по методу Рокицкого (Рокицкий, 1973).

ССНОВШЕ РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Протеиназы и ингибиторы семян и вегетативных органов люпина

Разнообразие функций, выполняемых протеолитическими ферментами, предопределяет наличие их множественности в расти*-тельном организме. Исследование протеиназ в такой высокобелковой культуре как люпин позволило выявить у него присутствие как минимум двух белок-гидролизукцих систем с различным оптимумом рН действия среды. В семенах и вегетативных органах люпина нами обнадгжено два основных максимума протеолитической активности, соответствующих кислым (рН 4,5-5,0) и нейтральным (рН 7,0) протеазам. Кроме того, присутствует фермент, расщепляющий синтетический олигопетид НА-бензол-в,ь-аргишйп-штро-аншшд-БАПАаза, Его активность оказалась максимальной при рН 8,5, что позволяет отнести его к щелочным протеазам.

Исследование содержания ингибиторов протеиназ в семенах трех основных видов люпина: 1лц>1пиа 1гЛеиа, ь,апги8-1; ifolJ.ua и Ь.ейЪиа показало наличие в них ингибиторов сериновых протеиназ, в частности, трипсина, и отсутствие ингибиторов химотрип-еина и сульфгидрильных протеаз (табл,I ).

"Таблица I

Активность белков-ингибиторов протаиназ в семенах различных ввдов и сортов люпина

1 Г ИЕ/г або.сух.массы

Вид | Сорт 1 ! ингибиторы трипсина ингибиторы химо-трипсииа.субти-,лизина,папаина

Ьир1пия Академический 3,2340,11 0

1иЪе\1з Кастрнчних 3,70^,16 0

БСХА-382 5,46^0,18 0

Пламенный 3,81^,06

1ир1пия Омега 2,40+0,07 0

апкиссИГо- Казан 2,87^,13 0

11из Таис Немчинский 2,6440,16 2,3653,24 о-0

1ир1пиа Факел 4,36^,12 0

аХЬив Синий парус 3.82±0,08 0

Содержание ингибиторов трипсина в лвпинэ относительно невелико по сравнению с другими видами бобовых растений и варьирует от 2,40 до 5,46 ИЕ/г або.сух.мчссн.

Обнаружено также, что основная часть наЛденнкх ингибиторов сосредоточена в солевой фракция белков, т.о. очи являйтеп легкорастворямыки глобулинами. Исследование алехтрофорэтачоо-кого спектра этих белков в листьях и зрелых силенах позволило констатировать специфичность его для различите видов, указкЕа-вдую на полкмор&гзм ингибиторов трипсина, связанный,по-вкдп-мему, с видевши особенностями растений.

Виявлекиоя намл взавкосвягз ыежду наличием спогафгческях компонентов в олектродоретячеснои спектре шпгабяторсодзрзипвй фракции и общим содержанием белка в семена:? позволила разработать новыГ: способ определения белковости семян люпина уз-кол1:стного.

Динамика активности протеолитическях ферментов н ингибиторов трипсина в семенах и листьях лапина в ходе его онтогенеза

Пр;: исследовании систе:лц протеаза-ЗшгиЗйтор представляло интерес изучение се пр«*д? всего в прорастетцях семенах. Ре-'

^ультаты наших исследований показали, что в процессе прораста-, ния семян люпина происходит увеличение активности всех исследуемых групп ферментов как в зародышах, так и в семядолях, начиная с 3-го дня прорастания, вплоть до 7-го дня, когда активность их превышает исходную приблизительно в 8 раз (рис. I). Следует отметить, что наибольшей активностью в ходе прорастания обладает БАПАаза. Параллельно с увеличением протеолитической . активности происходит существенное снижение содержания белков-ингибиторов трипсина в семядолях и полное исчезновение их в зародышах уже к 5 дню прорастания.

В течение прорастания и начального роста проростков макромолекулы белков и полипептидов гидролизуются на более низкомолекулярные формы, которые либо непосредственно используются, либо подвергаются в последующем модификации. Участие протеоли-тических ферментов в этих процессах в настоящее время не вызывает сомнений. В то же время не установлена природа и время появления протеаз, осуществляющих распад запасных белков. В качестве одного из механизмов включения деятельности протеолитических ферментов предполагается наличие природных белков-ингибиторов, связывающих до определенного момента отдельные протеазы в неактивные фермент-ингибиторные комплексы, Наблюдаемое нами при прорастании увеличение активности, всех изучаемых групп протеолитических ферментов при снижении, вплоть до полного иочезновения активности белков-ингибиторов, может являться косвенным подтверждением предположения о диссоциации при прорастании комплекса "протеаза-ингибитор", приводящей к резкому возрастанию протеолитической активности. По мнению некоторых авторов,белковые ингибиторы в данном комплексе может разрушать НАДФН-зависимая протеинсульфоредуктаза (Оепп1в с* а1., 1976).

В пользу предположения о возможности связывания белками-ингибиторами протеолитических ферментов свидетельствует и происходящий при созревании обратный процесс их накопления, сопровождающийся значительным уменьшением протеолитической активности (табл. 2 ).

Следует отметить, что для семян желтого люпина характерна более высокая активность всех изученных групп ферментов чем для узколистного люпина. Так, если активность нейтральных

1800

100

80й 60

60-

I. /

^ /

\ 40-

20.

;

и1. ..1 , —1_

2

I 3 5

7 ДНИ ЛРОт

'прорастали

Ркс. I» Изменение активнооти ингибиторе® трипсина (I), кий-лык протеаз (2), нейтральных протеаз (3) и БАПАазы (4) в Обменах желтого люпина (сорт БСХА-382) при прорастании: а) в зародышах. б) в семядолях; I - активность БАПАазы,. П - активность ,

киолых и нейтральных протеаз, Ш - активность ингибиторов трипсина (сд/г абс.сух.массн)

Таблица 2

Активность протеолитических ферментов и ингибиторов трипсина (ед./г абс.сух.массы) в процессе' созревания семян люпина

¡Фаза со-|Нейтральные Сорт ,-зревания|протеазы г 1

|Кислна проте-|БАПАаза |Ингибито-{ I | сиш

БСХА- 20 дней 382 после

цветения 90,54+1,43 40 27,43£0,73 Зрелые

семена 14,16+1,19

134,23+2,14 329,9+1,7 О 21,37^3,93 247,2*1,9 3,81*0,04

8,6010,56 147,0±1,4 5,46±Р.24

Омега 20 дней после

цветения 22,43+0,82 т 11,85+1,16

Зрелые

семена 3,14*0,45

33,40+1,12 182,2±5,5 0,25$ ,007 21,37+0,22 126,4+2,6 1,20*0,08

4,7*0,68 27,22*0,6 2,4*0,06

протваз, например, у желтого люпина сорта Пламенный в начальный период развития семян составляет 111,6 ед/г абс.сух. массы, кислых протеаз - 161,8 и БЛЛАазы - 395,2, то у узколистного люпина сорта Омега - соответственно 22,4 ; 33,4 и 182,г ед/г ado.сух. массы. По мере созревания семян, когда происходит накопление максимального количества запасных белков, активность протеолитпческих ферментов падает приблизительно в 8-20 раз у сортов Пламенный, БСХА и в 7-10 раз у сортов Отлета, Казан.

Подученные по изменению активности ингибиторов трипсина результаты подтверждает и анализ электрофоретического спектра икгибиторсодеркащей фракции белков, свидетельствующий о деградация компонентов этой фракции в ходе прорастания и накоплении белков ингибиторов трипсина при созревании семян (рис. 2 ). Идентификацию белков-ингибиторов на электрофореграглмах мы проводили путем параллельного анализа наивной белковой фракции и фракции ° добавлением в Нее трипсина. Белковые зоны на первой электрофореграмме, исчезнувшие на второй электрофоре-грамме (с трипсином), являются ингибиторяыми. Причина исчезновения ингибиторной фракции - уход ингибитора в составе комплекса "трипсин-ингибитор". Результаты этого анализа показали, что для келтых люпинов характерно наличие 2 изоформ ингибитора трипсина - это балки с ОЭП 0,710 и 0,856, для узколистных - одной (с ОЭП 0,610). Анализ этой же фракции по молекулярным массам свидетельствует о накоплении в ходе созревания белков о молекулярной массой до 30 кД.например, для сорта Пламенный оно составляет к фазе полной зрелости семян 95,3$ от общего содержания белков в янгибяторсодеркащей фракции (табл.3 ).

Таблица 3

Изменения компонентного состава белков ингибиторсодержацей фракции семян люпина (сорта БСХА-382, Пламенный) в ходе их

созревания

Молекулярная) масса;- Фаза развития ; ,0-30 кД. % { 30-60 кД, $ 1 60-100 кД, %

БСХА ¡Пламен-¡ный •JbCXA ¡ Пламен-j ¡ i hhü ; БСХА. (Пламен-;ный

20 дней посла цветения 40 дней после цветения Зрелые семена 72,01 54,79 87,5 77,02 90,1 95,3 25,96 30,09 12,15 11,27 9.90 1,11 2,01 0 0 15,1 5,7 1,57

от о т

0,2 Н

0,4 0,6 0.8 Н

1,0 1

¿¡ляа

ЯЕЭ

аз

ÜT, гйТ2

т

■ш:

2Z2J

ш®

2ZZZZ

-ит,

1

3 4 1 2-3 4

Рис,2.,ЭлектрофоретическпЯ спектр нативйой ингибитореодер-?шцей фракции бол ков семян люпина явлтого - сорт Пламенный (а) и упколлотпого - сорт Ошзга (б):

1-2 - фаза зеленых бобов ;

3-4 - фаза зрелых семян (1,3 - без трипсина ; 2,4 - о добавлением трипсина ; ИТ - шгглбяторт трипсина)

Нам псказалссь весьма иатврэсным исследование система про-теаза ингибитор и в онтогенезе листьоз, принимающих активное участив в мобилизации азота сторехидас вогототкених час гай растения на формирование белкового комплекса семян. На рио.З(а) рредставленн результаты исследований, проведенных г. онтогенезе листьев желтых люпинса (сорт Пламенной). Для асах исолздозак-}шх протааз мэкси?.{уму активности (С5-ТО день вегетации - 20 дней после цветения) соответствует значительное сшиенив активности ингибиторов. Аналогичная картина наблюдается и для сортов узколистного люпина (рис. 3, б). Для них характерно лишь более постепенное возрастание активности протеаз. Анализ алектро-, форетического споктра ингкйиторсодогясощей фракции белков устьев подтверждает существенное уменьшение количества ингибитор-

дни вегетации

Рпо.З. Динамика активности протеолитических ферментов и ингибиторов трипсина в листьях а)желтого люшша(сорт БСХА-382),б)узко- • диетного люпина(сорт Омега) в ходе их он-тогенёэа*

1 - нейтральные протеазы СрН 7,0);

2 - кислые протеазы (рН 4,5)}

3 - ингибиторы трипсина;

4 - БАДАаза.

!итя

'ИТг

I 1+Т 2 г*Т 3 З+Г 44+1

бгбшшг

' I '

Рис. 4. Идентификация белков-ингибиторов трипсине на элект-рофореграмме ингибиторсодершцей фракции листьев люпина (сорт БСХА) в ходе их онтогенеза: I трек - фаза розетки ; 2трек -фаза бутонизации; Зтрек - фаза цветения ; 4трек - фаза 20 дней Г после цветения ; +Т - с добавлением трипсина.

них белков в фазе 20-40 дней после цветения (рис. 4 ).

Все вышеизложенные результаты дают достаточно целостное представление о динамике как основных протеолитических ферментов, так и ингибиторов трипсина в онтогенезе люпина, однако они являются лишь косвенным подтверждением возможности участия последних в регуляции эндогенного протеолиза. Поэтому в дальнейшем нами было предпринято выделение как ингибитора трипсина, так и отдельной протеазы в целях выяснения возможности их биохимического взаимодействия. •

Выделение и свойства БАПАазы из семян узколистного люпина

При исследовании протеолитических ферментов люпина нами отмечена высокая активность в нем БАПАазы. Многократное ее повышение при прорастании в зародышах, где практически отсутствуют запасные белки, свидетельствует о том, что БАПАаза играет немаловажную роль в регуляторных процессах не только расщепления, но и модификации структурных белков. По некоторым / данным БАПАаза относится к трипсинподобным протеазам (Н1вЬ1ка*а» 1984). Все это побудило нас к попытке выделения именно этого/ фермента в чистом виде в целях более детального изучения его*14 физико-химических свойств.

Измельченный материал

проэксграгирован-ный материал

- осадок<

раствор раотвор —

раствор • раствор

осадок

-раствор

активные фракции

препарат фермента

раствор

активные фракции

экстракция водой, центрифугирован« е

высаливание фракции белков 0-40 (nh4)so4

высаливание фракции белков 40-80 -"- •

neper

О^ООь^М фосф.буфере,

хроматография рилексе Р-30

на ак-

лиоф1Шизация

перераствореиие в 0,005 М фосф.буфере, pll 6,8

ионообменная хроматография на ДЕг-52 целлюлозе

лиофилизация

препарат БАПАазц, кратность очистки 203

Риа. 5 . Схема выделения ЕЛДАази из семян лапина

14

Для выделения и очистки БАПАазы из семян люпина мы попользовали традиционные методы очистки белков :. ступенчатое фрак- -цитирование, диализ, гель-фильтрацию и ионообменную хроматографию на ДЕ-целлюлозе (схема на рис,' 5 ' ) . В окончательном виде метод выделения состоял в следующем. Походные семена , размалывали, просеивали через сито 0,1-0,2. мм и экстрагировали водой в соотношении 1:5 в течение часа при +4°С. Из полу-, ченного после центрифугирования экстракта высаливали, сульфатом аммония фракции 0-40 и 40-80$. После каждого высаливания суспензию центрифугировали, собирая осадок. Осадок суспендировали в 0,005 M фосфатном буфере pFI 7,8 порциями по 3-4 г и после повторного центрифугирования пропускали через акрилеке Р-30 или Р-60. Собирали БАПА-содермащие фракции белка после • элгоции фосфатным буфером pH 7,8 и лиофилязировали их. Частично очищенный фермент растворяли в фосфатном буфере рП 6,8 и, . пооле центрифугирования, наносили на колонку с Д13-52 целлюлозой. Оптимальные условия связывания ферментного белка с ДЕ-52 целлюлозой подбирали предварительно, проверяя интервал pH от 6,5 до 8,0. Последовательно элюировали белки, связавшиеся о ионообменником, используя ступенчатый градиент НаС1в 0,05 M фосфатном буфере pH 6,8. БАПАаза элюировалась 0,15 M Nacn. (рио. 6 ). Фермент обеосоливали на колонке с биогелем Р-2 и после этого лиофилизировали.

280

0,75 -

0,50-

0,25 -

Рмс,

„

ИаСЦМ

AJUÖHWVrfAJe ----1----

скорость элвдии 40 мд/час

Иоследования физико-химических свойств фермента проводи-лиоь на препарате, очищенном в 180-200 раз. Нами было исследовано влияние рН реакционной смеси на активность очищенной БАПАазн. Полученные данные свидетельствуют о том, что оптимум дейотвия фермента лежит в интервале рН 8,5-0,0, что совпадает с данными, полученными ранее для неочищенного препарата.

Для изучения функциональных групп активного центра БАПАазы были использованы специфические ингибиторы диизопропилфторфос-фат (ДИПФФ). фенилметилсульфонилфторид (<ШСФ) и п-хлормерку-рибензоат ( п-ХМБ). Было установлено, что ДИПФФ и ФШФ - специфические ингибиторы сериновых протеиназ, в концентрациях, достаточных для полного подавления трипсина, вал того в данном случае в качестве контроля, вызывают инакгавапдо БАПАазы со-оответственно на 80 и 86$. В то время как n-ХЖ, специфически блокирующий бК-групггы ферментов, в концентрации 0,35 Ш/мл достаточной для полного подавления активности типичной тиоло-вой протеиназы папаина, оказывает незначительное воздействие на выделенный фермент, что свидетельствует об отсутствии в его активном центре сульфгидрильной группы. На основании этих данных можно сделать вывод о тон, что БАПАаза «шина содержит в активном центре остатки серина и гистидина ж является ферментом трипсинового типа.

• Выделение и биохимическая характеристика ингибитора трипсина из семян узколистного люпина

Вопрос о выделении белков-ингибиторов в чистом виде пред-отавляет большой научный и практический интерес ввиду широких перспектив их использования в биотических исследованиях и фармакологической практике.

При выделении ингибитора трипсина Из семян люпина мн применяли метод аффинной хроматографии вследствие невысокого содержания в нем ингибиторных белков,затруднившего выделение с помощью обычных методов фракционирования.' Экстракцию белков ин-гибиторсодержащей фракции проводили 0,2 f.î НаС1(в соотношении 1:5) 10 часов при постоянном перемешивании. Полученный после центрифугирования экстракт подкисляли 0,5 н ICI. При эта.', полностью сохраняется общая ингибиторная активность, а удельная активность повышается в 2,6 раза (табл. 4 ) за счет уда-

Таблица 4 .

Основные стадии очистки ингибитора трипсина иа семян люпина

Стадии очистки ¡Общая ак-;тивность, | ед. ■ ¡Удельная ;активность ((ед/мг) ¡Выход по } активности, % {Степень |очиотки 1

1.Экстоакция

0,2ШаС1 2960 0,063 100 -

2.Осаждение бал-

ков 0,5н НС1 2520 0,164 86 2,6

З.Аф(11инная хро- 720 6,93 24 НО

матография

4.Диализ 440 8,32 15 '132

45кД

25кД _

12,4кД -Я®'«!®».--.

Иг

Рис; 7.Электрофорез ингибитора трипсина из узколистного люпина:а)электрофорез в 1255 ШГ,содержащем 0,1% ДИЗ-Ней I - маркерные белка,2 - ингибитор трипсина^ б)нативный электрофорез: 1-е добавлением трипсина в концентрации ХЗиг/ылД-Ид - тридсик-ингаба-торный комплекс,2 - ингибитор тряпсянаЦИ^).

детая из экстракта балластных балков. После повторного центрифугирования. из полученной надосадочной жидкости высаливали белки вО%-нш насыщением раствора сульфатом аммония. Белок суспендировали в рабочем буфере и наносили на колонку с трип-снн-сефарозой ,4В; Основную массу белков элюировали рабочим буфером (0,05 М трис-НС1, рП 8,0, содержащий 0,5 М НаС1). Затем элюировали связав пмйсд с ферментом ингибитор. Ингибитор прочно связывался с сорбентом и шифровался с колонки одним пикш 0.2 М К01 в 0,01 М Н31. Ингибитор обессолива-

ли диализом против дистиллированной воды при 0+4°С и лиофили-зировали.

В результате проведенной ■очистки был получен ингибитор с коэффициентом очистки 132 и выходом его около 15?!. Электрофорез ингибитора в 12% ШАГ, содержащем 0,1% ДДС-На, показал наличие в препарате одного белкового компонента (рис. 7 ). Молекулярная масса ингибитора по данным электрофореза равна 18400 Д.

Аминокислотный анализ (табл. 5 ) позволил вывить в его составе большое количество остатков аргинина, глицина, аспара-гнновой, глутаминовой кислот и полное отсутствие триптофана, низкое содержание других ароматических аминокислот. Отсутствие триптофана в составе ингибиторной молекулы подтверждает и спектр флуоресценции. Наши исследования показали, что ингибитор трипсина из узколистного люпина является сравнительно устойчивым по отношению к различным денатурирующим секторам. Кипячение в течение 30 мин не вызывает существенных изменений в активности ингибитора, которые установлены только через I час после начала нагревания. ТХУ эффективно икактквирует ингибитор лишь в достаточно высокой концентрации (20%). Ингибитор активен и при высоких значениях рН (инкубация в 6 М мочевине) в течение 12 час. Б молекуле ингибитора установлено отсутствие дисуль^пДЕШ: связей, поэтс,;у слезет предположить, что его устойчивость к различнил денатурирующим факторам связана с особенностями жесткой конформаши компактной белковой матеку-лы, обеспечиваемой большим количество:.! гидрофобных взаиыоцей-ствкй.

Исследования, проведенные нами при изучении антиферментного спектра выделенного ингибитора, показали, что он обладает способностью тормозить активность трипсина и хжотрипсинэ,

Таблица 5

Аминокислотный состав ингибитора трипсина из зрелых оемян люпина узколистного -

Аминокислота

!

% на белок

Аспарагиновая кислота

Треонин

Серин

Глутэминовая кислота

Пролин

Глицин

Алании

Цистеин

Валин

Метионин

йзолейцин

Лейцин

Тирозин

Фенилаланин

Лизин

Гиотидин

Аргинин

Триптофан

9,57

3.63 4,07

11,40 5 46 9 31 4*33 О

4,65 . 0,20 ; 4,00 6,69 4,37

7.64 5,61 3,29

10.52 О .

«

Рио. 8. Влияние ингибитора трипсина из узколистного люпина на активность *рипсина(1),химотрипсина(2), оубтилизина(3),папаина(4) и ЕАПАазн(5).

однако неактивен по отношению н лапаину и субтшшзину (рис.8 ).

Из приведенных данных следует, что линейный характер сояраняется до 67£ ингибирования трипсина, что свидетельствует О вноской специфичности х нэку выделенного ингибитора. Для снижения активнооти 18 мкг трипсина на 50$ необходимо около 10 мкг ингибитора. Экстраполяция к нулевой ферментативной активнооти происходит при концентрации последнего в 21 ыкг.

Титрование ингибитором химотрипсина свидетельствует о той, что его взаимодействие о этой протелнаэой носит нестехиомет-ричеокий характер. Связывание происходит при соотношении 1:3, Я тО время как для трипсина одна молекула ингибитора связывается о одной молекулой фермента.

Изучение взаимодействия выделенного ингибитора с препаратом БАПАазы показало, что в концентрации, достаточной для полного подавления активности эквивалентного количества трипсина, выделенный ингибитор подавляет активность БАПАазы на 355? (рис, 8 ). Применение его в концентрации 100 мкг инактивирует 50 мкг БАПАазы уже на 45%. Полученный результат свидетельствует об угнетении выделенным ингибитором активности эндогенной протеиназы, хотя и не столь эффективном, как в случае с трипсином.

Таким образом, всесторонний анализ системы протеаза-ингпби-тор и в онтогенезе люшша, и на очищенных препаратах болка-ингибитора трипсина и протеиназы, выделенных из его семян, подтверждает предположение об участии природных белков-ингибиторов в регулягди активности собственних протеолитических ферментов. Но в то же зремя, бесспорно, предложенный способ регуляции на является едбетвенным в многогранном и не изученном до конца вопросе контроля за протеолизом.

швода

1. Исследованы протеолитические ферменты и [шгибиторп про-тепнаэ~ люпина. Показано наличие в семенах и вегетативных органах люпина двух белокгидролизующих систем (с onTra.iyj.ioi.: рН 4,5-5,0 и рН 7,0), соответствующих кислым и нейтральным про-таазам, и специфического фермента огражденного протеолиза -БАПАазы.

2. Установлено, что семена г. с следовали их видов лвппна ха-

растеризуются определенным спектром белков-ингибиторов трипсина, обусловленным их генетическими особенностями. На основании электрофоретического анализа ингибиторсодержащей фракции разработан способ оценки белковости семян люпина,

3. Обнаружена видовая специфичность в активности кислых и нейтральных протеаз в семенах исследованных видов люпина.

4. Установлена обратная зависимость между активноотью протэолитических ферментов и ингибиторов сериновых протеинаа в онтогенезе различных видов люпина. Изменения активности ингибиторов подтверждаются анализом электрофоретического спектра ингибиторсодераащей фракции белков.

5. Из семян люпина узколистного (L.angustifoiiue.) о помощью методов гвль-фяльтрационной и ионообменной хроматографии выделен и очищен протеолитический фермент БАПАаза, установлена принадлежность его к оериновым протеиназаы.

6. Методом аффинной хроматографии из семян люпина узколистного впервые выделен и охарактеризован белковый ингибитор трипсина. Ингибитор имеет молекулярную массу (18,4 кД) а еня-нокислотный состав (отсутствие триптофана, высокое содержание аргинина, глютаминовой кислоты и аспарагиновой кислоты), которые позволяют отнести его к семейству соевого ингибитора Кунитца.

7. При исследовании антиферментного спектра выделенного ингибитора установлено эффективное угнетение пл активности трипсина, кестехиометричаское взаимодействие .с хшлотрппсином и отсутствие влияния на папаин и субтилизин. Показано инак-тишруицее действие ингибитора трипсина на активность БАПАазы, что позволяет сделать вывод о возможности его участия в регу- , ляции активности эндогенных протеолитаческих ферментов.

СПИСОК РАБОТ, ОПХБШОВАНШХ ПО ТН.ГЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Домаш В.И., Свистунова О.В., Котловская Г.Н. Система "протеаза-ингибитор" прорастающих и оозреващих семян люпина. В сб.: Физиология семян. Формирование, прорастание, прикладные аспекты. - Душанбе. - 1990 . - С.178-186.

2. Домаш В.И., Буснюк О.В. Актыунасць пратэал1тычных ферментау I 1кг1б1тарау трыасГну у насенн1 луб1ну у працэсе 1х выспявашш//Весц1 АН БССР, серия б1ялаг1чшх нявук. -

1990, КЗ. - С.17-21.

3. Буснюк О.В., Забрейко С.А. Изменение активности эндогенных протеаз и белков-ингибиторов в онтогенезе люпина//

17 Всесоюзная конференция молодых ученых по физиологии растительной клетки. Тезисы докладов. - M, - 1990. - С.67.

4. Домаш В.И., Буснюк О.В. Природные ингибиторы - один

из способов регуляции активноотп протеолитических ферментов// Второй съезд Всесоюзного общества физиологов растений. Тезисы докладов, П часть. - М. - 1992, - С.67.

5. Домаш В.И., Буснюк О.В., Забрейко С.Л. Изменение активности протеолитических ферментов и ингибиторов трипсина в листьях разных видов люпина в'процессе его роста и развития// Физиология и биохимия культурных растений. - 1993. - Т.25, Jfô. - С.170-175.

6. Домаш В.И., Буснюк О.В., Забрейко С.А., Купцов И.О., Миронова Т.П. Способ отбора высокобелковых форм люпина узколистного. Положительное решение ПИИГПЭ от 28.08.92 на-выдачу патента по заявке 5006109/13-057830.