Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Протеиназно-ингибиторная система высших растений: свойства и биологические функции

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Протеиназно-ингибиторная система высших растений: свойства и биологические функции"

д кПт> 1 \ г.и»

Ма правах рукописи

ДОМЛШ Валентина Иосифовна

прошауйгю-гяггквягопид сгстЕМА шип« растений: своГст и шшюпмескке сункцгз!

03,00.04- Биологическая химия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Москва- 1997

Работа выполнена в лаборатории биохимии и биотехнологии растений Института экспериментальной ботаники им. В.Ф.Купревича АН Беларуси

Научный консультант - доктор биологических наук,

профессор Мосолов В.В.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

профессор Евстигнеева З.Г.; доктор биологических наук, профессор Белозерский М.А.; доктор биологических наук Калер В.Л.

Ведущая организация: Московский государственный университет пшцевык производств.

Зашита диссертации состоится 10 апреля 1997 года в 10 часов на заседании Специализированного Совета ( Д 002.96.01) по присуждению ученой степени доктора биологических наук в Институте биохимии им.А.н.Баха ран (117071, г.Москва.Ленинский проспект, 33, корпус 2)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологической литературы РАН (117071,г.Москва.Ленинский проспект,33.корпус 1)

Автореферат разослан " ty" xM^iç 1097 г.

Ученый секретарь Специализированного Совета, доктор биологических наук

Валуева

0БИ1АЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАВСЯЫ

Актуальность теми диссертации. Протеолиз является одним из важнейших биохимических процессов в ¡слетках как животных,так и растений. Протеолитические ферменты участвуют в образовании гормонов .ферментов и других жизненно необходимых активных белков и пептидов (Мосолов,1971,1983; Локшна,1979,1994). Прогеааы участвуют в деградации ~елков при прорастании и их процессинге при созревании, в транспорте веществ из вегетативных органов. Они играют первостепенную роль в формировании таких физиолого-биохими-ческих свойств растений как продуктивность,белковость,всхожесть оемян,валютные реакции и др. Но, к сожалению, многие стороны этих процессов остаются не изученными. В частности, неизвестна роль отдельных эндопептидаз при катаболизме и биосинтезе белков. Мало данных относительно протеаз, участвующих в глубоком гидролизе белков и в транспорте аминокислот в репродуктивные органы. Недостаточно сведений о протеазах, функционирующих в стареющих листьях. Из важности функций, выполняемых протеаз ами вытекает и важность вопроса о механизмах регуляции их активности.

Понять механизм действия и регуляцию клеточного протеолиза невозможно без исследования биохимических свойств протеолитичес-ких ферментов и их роли в хизнедеяте.г" кости растительного организма. Предполагается, что один из способов регуляции активности протеаз в клетках животных,растений и микроорганизмов реализуется через белки - ингибиторы,способные обратимо образовывать с ферментами неактивные комплексы ( Мосолов,Валуева,1993; Richardson, 1977). Вопрос регуляции протеолиза - один из актуальнейших в современной энзимологии ( Антонов,1991).

Известно,что в животном организме существует система фермент* ингибитор, контролирующая работу ферментов. Нарушение деятельности этой системы приводит к тяжелым"заболеваниям (Веремеен-ко.1971; Сыновец,Левицкий,1985). В высших же растениях протеинав-но-ингибигорная система не изучена. Не ясна роль этой системы в метаболизме белков и в адаптации растений к неблагоприятным факторам внешней среды.Неизвестна роль ■ отдельных компонентов этой системы, в частности, белковых ингибиторов, в регуляции эндоген-

них протеаз в связи с биосинтезам и распадом запасных белков и другими биологически важными процессами,происходящими у растений. Не решена роль протеиназно-ингибиторной системы в способности растений мобилизовать свои защитные силы при действии фитопато-генной инфекции. Не выявлена видовая и сортовая специфичность по уровню активности протеаз и белковых ингибиторов. Это в значительной степени относится к такой высокобелковой и широко распространенной культуре как люпин и другим с.х. растениям.

В связи с проблемой пищевого и кормового Ое.иса остро стоит вопрос о белках-ингибиторах как антипитательном факторе.

Выделение протеиназ и белков-ингибиторов в чистом виде, исследование их физшсо-химических свойств будет способствовать раскрытию биологических функций указанной системы.

Исследование электрофоретического спектра отдельных компонентов системы протеинаэа-ингибитор раскрывает возможности использования и/, в качестве маркеров в селекции, при выяснении вопросов, связанных с эволюцией и генетикой растений (Кокарс-в М., 1992).

Изучение биохимических свойств и роли протеиназно-ингибиторной системы, несомненно, представляет научный и практический интерес и дает возможность разработать подходы к регулированию процессов прорастания,созревания семян, отделения белка в запас и улучшения его качественного состава. Исследование этих и некоторых других проблем обобщено в предлагаемой диссертации.

Цель и задачи исследования. Целью работы было дать целостное представление о биохимических свойствах и биологических функциях протеиназно-ингибиторной системы у высших растений и использовать результаты исследования для решения вопросов биохимии,фитоишуии-тета и селекции с.х. культур.

Для достижения поставленной цели требовалось решить следующие вадачи:

- изучить уровни активности протеолитических ферментов, белковых иигибиторов и особенности электрофоретического спектра ин-гибиторсодержащей фракции белков генетически различных форм растений и возможности использования их в качестве белковых маркеров в селекции с.х.растений;

изучить реакцию протеиназно-ингибиторной системы растений на воздействие неблагоприятных факторов внешней среды;

- исследовать роль протеиназно-ингибиторной системы ь процессах катаболизма,биосинтеза запасных белков растений и транспорта азотистых соединений из вегетативных органов в репродуктивные;

- выделить белки-ингибиторы протеиназ в высокоочшценном состоянии из семян и листьев разных видов люпина,исследовать их физико-химические свойства, ввдоспецифичность и локализацию в субклеточных структурах;

- выделить эндогенные протеиназы и их белковые ингибиторы из семян и листьев ряда бобовых растений,исследовать их свойства и субстратную специфичность;

- исследовать роль белковых ингибиторов в качестве защитного фактора растений ог фитопатогенной инфекции;

- белки-ингибиторы протеиназ как показатель качества белка;

Научная новизна. Изучен уровень активности отдельных компонентов протеиназ но-ингибиторной системы семян и вегетативных органов разных видов растений. Впервые выявлены различные классы npoiполитических ферментов и белков-ингибиторов в семенах и листьях различных видов люпина. Впервые исследовано совместное действие протеиназ и их белковых ингибиторов у высших растений in vivo. Изучена динамика распада и накопления запасных белков семян люпина и характер проявления действия годичных классов протеаз и белковых ингибиторов в этих процессах.Показано существование ингибиторов в связанной с протеазами формэ в зрелых семенах и высвобождение их из этого состояния при прорастании семян. Показана роль цистеиновых протеиназ в деградации ингибиторов трипсина при прорастании семян люпина.. Установлена роль белков-ингибиторов в механизмах регуляции активности протеолигическнх ферментов при прорастании и созревании семян. ■

Впервые установлена возможность регуляции протеиназно-ингибиторной системы на начальных этапах прорастания семян с помощью фитогормонов, в частности брассиностероидов.

Впервые показана роль протеиназно-ингибиторной системы в передвижении азотистых соединений из вегетативных органов в репродуктивные и видоспецифичносгь взаимосвязи содержания белка в семенах люпина с уровнем активности как протеолитических ферментов,так и белковых ингибиторов в листьях. Впервые обнаружено присутствие в листьях люпина металлопротеиназы, максимальная актив-

ность' которой отмечена у стареющих листьев,что дает возможность предполагать ее участие в утилизации белковых соединений листьев в этот период.

Из семян и листьев люпина выделена эндогенная протеиназа БА-ПАаза, один из компонентов протеиназно-ингибиторной системы, показана принадлежность ее к классу сериновых протеиназ и способность расщеплять некоторые полипептиды к /5- конглотина, большую и налу» субъедикицы рибулозо-1,5-дифосфаткарбоксилазы/оксиге-назы.

Впервые выделены,очищены ингибиторы трипсина из семян и листьев различных видов люпина и дана физико-химическая характеристика. На основании анализа аминокислотного состава белков и их биохимических свойств, ингибиторы из семян люпина желтого,белого и узколистного отнесены к семейству ингибитора Кунитца из сои,а из многолетнего - к семейству ингибиторов Баумана-Еирк. Высокая эффективность лгибитора из люпина многолетнего по отношению к трипсину открывает возможности для его практического использования .

Впервые обнаружены белки-ингибиторы эндогенных прогеиказ в семенах и листьях бобовых культур ( люпин,кормовые бобы). Полученные данные показывают, что регуляция активности протеолитичес-ких ферментов осуществляется с помощью белковых ингибиторов, а одновременно функционирующие протеиназы и ингибиторы разных органов растений представляют единую протеинаэно - ингибиторну» систему.

Впервые выявлена локализация различных классов протеиназ и белков-ингибиторов в субклеточных структурах ( хлоропласта, митохондрии, ядра и др.) ряда бобовых растений.

Впервые установлена способность ингибиторов протеиназ снижать концентрацию Х-вирусов в листьях картофеля, подавлять активность протеиназ,рост и развитие фитопатогенных грибов Fusarium sambucinum и Fusarium oxysporum, что позволяет считать их, наряду с фитоаллексинами,фенолами и др., одним из факторов устойчивости растений к фитопатогенной инфекции. Это имеет ванное значение при создании сортов и форм растений, устойчивых к фитопатогенкым микроорганизмам. Впервые в растениях люпина,кормовых бобов к картофеля обнаружены эндогенные ингибиторы фитопатогенной инфекции.

Показана отрицательная линейная корреляционная связь между

уровнем активности ингибиторов трипсина и переваримостью белка in vitro, что говорит об их влиянии на качество белка с.х. культур.

Полученные в результате выполнения работы сведения расширяют представление о биохимических свойствах,механизмах действия и Функциях протеинаэ и белковых ингибиторов, что вносит существенный вклад в развитие нового направления в биохимии, связанного с изучением регуляции метаболизма белков растений. Результатами исследований обоснова j и новое направление в функциональной биохимии растений: протеиназно - ингибиторная система как средство временной и пространственной регуляции метаболизма белков в растительном организме.

Практическая значимость получению: рсзуг-ьтагсз.

Результаты анализа действия протекназно-ингибиторной системы, ее активности и электрофоретического спектра позволили установить четкую видовую и сортовую специфичность, что дает возможность использовать ее для анализа генофонда и в селекции с.х. культур. Предложен способ отбора высокобелковых форм люпина узколистного, защищенный патентом.

Разработан способ получения ингибитора трипсина из семян люпина многолетнего, загущенный авторскш свидетельством. Ингибитор трипсина ь.^жет быть использован в биохимических исследованиях при изучении механизма действия серниовых протеинаэ, в аффинной хроматографии в качестве лигаида при очистке ферментов, в медицинской практике для лечения ряда заболеваний.

Установленная способность ингибиторов протеинаэ угнетать активность протеаз,рост и развитие фигопатогенной инфекции дала возможность разработать способ оценки устойчивости картофеля к сухой фузариозной гнили и способ получения средства для защиты растений, защищенные авторскими свидетельствами.

На основании результатов исследований по действию неблагоприятных факторов внешней среды на изменение активности протен-назно-ингибиторной системы предложено использовать показатель активности отдельных компонентов этой системы в качестве теста на техногенные воздействия.

Результаты исследований позволили тагосе впервые использовать показатель активности ингибиторов трипсина в качестве теста при разработке режимов термовструдерной обработки зерна в комбикормовой промышленности. Этот показатель включен в ТУ " Компоненты

зерновые вструдированные" к используются в АКО " ЭКОМОД".

Материалы исследований находят также применение ь селекционных учреждениях и при чтении лекций по биохимии и физиологии растений в БГУ.

Экономическая значимость полученных результатов.

Препараты протеиназ, белков-ингибиторов трипсина и суммарного белка семян люпина могут быть использованы в качесгве коммерческих продуктов.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту. . - видовая и сортовая специфичность протеиназно-ингибиторной системы ряда высших растений;

- основные компоненты системы обеспечивают временную и пространственную организацию деградации и биосинтеза белков в ходе роста и развития растений;

- сопряженность между накоплением белка в семенах и листьях разных видов долина и активностью элементов протеиназно-ингибиторной системы;

- разработка способов получения препаратов протеиназ и белковых ингибиторов из семян и листьев люпина для изучения их физико-химических свойств и специфичности;

- внутриклеточная компартментация протеиназ и белков-ингибиторов некоторых бобовых растений;

- схема этапов действия протеиназно-ингибиторной системы высших растений;

- белки как специфические ингибиторы эндогенных протеиназ;

- протеиназно-ингибиторная система как фактор фитсиммунктета;

- ингибиторы трипсина как антипитательный фактор "и термовструдирование как способ повышения качества иелка семян сельскохозяйственных растений.

Апробация результатов диссертации.

Основные результаты работы были представлены и обсуждены на У1 конференции биохимиков Прибалтийских республик,Беларуси и Ленинграда (Рига, 1681 г.)j на 111 Республиканской конференции физиологов и биохимиков Молдавии (Кишинев,1981); на Республиканской конференции " Научно- методические аспекты создания высокопродуктивных сортов с.х. культур" (Жодйно.1982); на У111 Объединенном симпозиуме биохимических обществ СССР и ГДР ( Рига,1985); на Республиканском совещаний "Ингибиторы протеаз как факторы защиты

растений от болезней и вредителей" ( Одесса, 1987); на Всесоюзном совещании " Физиология и биохимия прорастания семян" (Душанбе, 1988); на 1 и 11 съездах физиологов растений (Минск,1990, Санкт-Петербург,1993); на ХУ Менделеевском съезде по общей и прикладной химии ( Минск, 1993); на 1 съезде фотобиологов и биофизиков (Минск,1994); на Республиканской научной конференции "Современные проблемы генетики и селекции" (Минск,1995),на Международном совещании "Экологический статус загрязненных радионуклидами территорий" (Минск,1995), на 11 съезде Белорусского общества физиологов растений (Шнек, 1995), на 8-й Международной конференции по люпину (Нью-Йорк,1996).

Опубликовалиость результатов.

Материалы диссертации опубликованы в 66 научных работах (2 монографиях,31 научной статье, 29 тезисах, трех авторских свидетельствах и одном патенте).

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 390 страницах машинописного текста,состоит из введения,8 глав и приложения. Работа иллюстрирована 84 таблицами и 91 рисунком,; в списке цитируемой литературы 490 наименований.

Принятие сокращения. ПААГ- полиакриламидный гель.ОЭП- относительная электрофоретическая подвк ность, РДФК/0 - рибулозо-1,5-дифосфаткарбоксилаза/оксигеназа, кД- килодальтон,БАЛА - N,¿--бензокл- DL-аргинин-п-нитроанилид, БАЭЭ - бензоил-БЬ-аргинин этиловый'эфир, ЯМСФ - фенилметилсульфонилфторид, ПХМБ - п-хлормер-курибенаоат.КГ - круговой дихроизм,НЕ - ингибиторная единица, НЖ -надосадочная жидкость.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ Иатеркалы н метода исследования

Основным объектом-исследования были различные виды люпина: многолетнего (Luplnus polyphyllus L.), желтого (L.luteus L.), белого (L. albus L.), узколистного (L.angustlfollus L.). В работе использовали кормовые бобы (Vicia faba L.), лоцерну (Medicado sativa L.), верно злаковых культур, клубни и листья картофеля и др.

Активность нейтральных,кислых протеаз и БАПАазы определяли

по гидролизу IX казеина, IX гемоглобина и 2,3 мМ БАЛА (Домаш и др.1993), активность металлопротеиназы - с использованием азокола в качестве субстрата С Chrispeels et al.,1979), активность цисте-иновых протеиназ - с использованием 1% казеина и в присутствии L-цистеина (50 мМ) и ЭДТА (20 мМ), Активность РДФК/0 определяли по методу Магомедова (1978).

Активность ингибиторов трипсина определяли по методу Гофмана и Вайсблая (1975) с использованием в качестве субстрата п-нитроа-нилид бенэоил- DL-аргинина, хкмотрипсика и субтилизина - по изменению гидролиза ферментами денатурированного нагреванием казеина. Экстракцию ингибиторов протеиназ проводили 0,2 М NaCl.

Электрофорез белков в ПААГ проводили в нативных условиях и с О,IX SDS и jJ- меркалтоэтанолом по методу Лэммли ( Laeim\li,1970).В основу метода идентификации ингибиторов трипсина взят метод Миса и Хаймоввда (1973). Для идентификации в треки ПААГ с ингибиторсо-держащей фракций белка добавляли трипсин (30-40 мкг). Параллельно вели электрофорез белкового раствора без трипсина. Зоны белка в треках с трипсином, которые уменьшались иди исчезали,вследствие образования комплекса "трипсин-ингибитор", обладающего меньшей по сравнению с контрольной ( без трипсина) злектрофоретической подвижностью, считались ингибиторными.

Легумино - и вицилиноподобные белки выделяли по разработанному нами методу ( Мироненко и др. 1973).

Гель - хроматографию белков проводили на акрилексах Р-4, Р-30.Р-60 и сефадексах S-75 и G-100. Ионообменную хроматографию -на КМ-сефадексе А-25, DEAE-Toyopearl 650 KW. Аффинную хроматографию проводили при использовании в качестве лиганда трипсина, кова-лентно связанного с сефарозой 4В, в основном, " batch''-методом. Изофокусирование белков проводили по методу Ригли (1974).

Аминокислотный состав белков определяли на аминоанавизаторе Т-339 (Чехословакия). Триптофан определяли в отдельной навеске после щелочного гидролиза ( Inglis et al.1976 ), полуцисткн -после окисления надмуравьиной кислотой ( Moore,1963).

Переваримость белка In vitro определяли по методу Левицкого (1985).

В основу выделения алейроновых зерен положен метод Соболева (1985) .Выделение остальных кяеточннх органелл проводили по методам, описанным в " Технике биохимических исследований субклеточных

структур биополимеров растительной клетки", под ред. Решетникова В.Н.(1986).

Определение содержания бедка проводили по Кьельдалю, Лоури в ыодифтсацки Хартрк (1972), Брэдфорду (1976) и Бзйли (1965).

Статистическую обработку данных проводили по Рокицкому (1979) и с использованием пакетов статистических программ Stadia и Statgraf.

СИСТЕЗЛА ПРОТЕО^гЭЛ У РУДА СЕЛЬС/СОХСвЯЙСТЗЕКШ.« РАСТЕНИЙ

При исследовании функциональной роли протеаз и их белковых ингибиторов важно иметь представление об изменчивости уровня активности этих компонентов у различных растений. Это касается в первую очередь люпина, наиболее распространенной в Беларуси и Нечерноземной зоне России высокобелковой культуры, сведения о которой отсутствуют.

Результаты исследований показали существенно различный уровень активности протеаз и белковых ингибиторов у исследуемых видов растений.Так,семена люпина желтого имеют уровень активности нейтральных протеаз 12-12,9; кислых - 7,5-8,9; БАПАазы - 116,5134,6 ед/i абс.сух. массы. У люпина узколистного активность этих ферментов лежит в пределах соответственно 9,4-11,6; 7,3-7,7; 58,8-69,8. Семена люпина белого имеют активность нейтральных протеаз 7,8-10; кислых протеаз 5,8-7,2 и БАПАазы - 53,5-97,7. Для семян люпина многолетнего уровень активности ферментов равен соответственно 10,8, 7,0 и 68 ед/г абс.сух. массы. Активность про-теиназ находится во взаимосвязи с накоплением белка в семенах. Так, содержание белка в семенах люпина желтого достигает 47%, узколистного и белого - 30-35Х. Видовые различия отмечены и для семян люцерны. Ввдоспецифичность характерна и для белков-ингибиторов трипсина (табл.). Наиболее богаты ингибиторами семена сои. Между содержанием ингибиторов трипсина, белка и масла у этой культуры существует слабая линейная корреляционная связь ( г = 0,23 и 0,15 соответственно). Это дает возможность проводить отбор на снижение содержания ингибиторов при сохранении высокого содержания этих показателей. Такая же закономерность наблюдается для других зернобобовых культур (люпин,горох,кормовые бобы). В связи с отсутствием' априорных сведений относительно ингибиторов протеи-

- И -

Таблица

Варьирование уровня активности белков-ингибктоооз протеиназ (трипсина) у различных видов растений (ИЕ/г азе.сух.массы)

Вид растений Количество проанализи- Варьирование уро-

рованных образцов вня fiJíT явности

Amaranthus,семена 6 3.0 - 14,0

-"—"- .листья 6 2,5 - 4,3

Avena sativa 4 0,9 - 1,3

Glycine max 150 230,0 - 620,0

Hordeum vulgare 14 7,6 - 22,0 '

Lupinus albus 10 4,3 - 6,0

Lupiñus angusti-folíus 15 2,5 - 4,3

Lupiñus luteus 24 2,5 - 6,2

Lupinus polyphyllus 15 Medlcago sativa,семена 8 листья 8 10.Ü - 2,3 - 25,0 5,ü

9,5 - 10, i

Pisum sativum 21 1.6.1 - 40,"

Secale cereale ■ 13 8,9 - 14,7

Solanum tuberoc jm 26 35,0 - 1G3.„ j,

Trlticale 10 5.7 - 10,:

Tríticum vulgare 4 О _

Vicia faba Ту 1 Л,о - 17,", !

Zea mays & О, j

наз у люпина, проведен более подробный акали? содорлльил у этой культуры. Зародыши, как оказалось, имеют активность янп-Лито-ров в 2,5 раза выше, чем семядоли. Листья люгика, .) порг-:ч- се на грамм або. сух. массы, имеют довольно высокую г.нгибкгориук . -.тив-ность (до 15 ие). Основное количество ингибитс-рсь т; ипсим» ■ ^держится в глобулиновой фракции белка. Кнптбито;-ы н-дходя гсг к ^ем*-нах люпина, в связанном с протеазами состоянии С го г/О*- .

Для исследованных гадов растений харе;, го;-ну ••• ¿к- г

электрофоретическом спектре янгибиторсодерлак >й фр'лгтч.и С> пкпв. Ингибиторы трипсина локализованы, в основном, в оОласг.1 0,30,6. Установлена не только.видовая, но и сортовая спе1бф-ж.-*;ть в профиле спектра этих белков. Так, выявлены осойсгшгастк с;.ектра сортообразцов люпина узколистного, различающихся по содержании белка в семенах,еакяачаощнеся в том, что более высокобелковые сортообраацы имеют ярко выраженную зону при ОЭЛ 0,40,а менее бел-, ковистые - при 0,36. На этом основании разработан способ отбора высокобелковых форм люпина узколистного (Патент 1&77751).что подтверждает возможность использования ингибиторов трипсина в качестве маркерных белков в селекции.

- iE -

Дейстаио рззлнччмя $эч:м>;ч>в на дзбкл&ность протенназно-инги-бгггсрной системы растения

Условия окружающей среды, особенно неблагоприятные, действуют на растительный организм,реакция которого может быть очень разнообразной. К сожалению, действие условий внешней среды на характер изменения протеиназно-ингкбиторной системы остается неизученным. Исследования лзменения активности ингибиторов трипсина в семенах Ю сортов желтого кормового люпина, выращенного на 11 госсортоучастках Беларуси,Украины и России в 1981-82 гг. показали, что варьирование уровня активности почти у половины сортов в границах одних и тех же участков не превышало 15Х от максимального. Коэффициент вариации уровня активности по сортам в зависимости от места выращивания составлял 8-10%. Установлена слабая корреляционная связь активности ингибиторов трипсина с алкалоид-ностью и содержанием белка в семенах люпина, что может быть использовано в селекции.

Неблагоприятные погодные условия ( 32°С и влажность 40%) вызывали снижение активности ингибиторов трипсина и БАПАазы в семенах люпина соответственно на 35 и 57Z. Высокие интенсивности света (25 клх,лс) и влажность воздуха (87Х), снижали активность нейтральных, кислых протеаз,БАПАазьг и ингибиторов трипсина на 15-307. по отношению к контролю ( освещенность 7,5 клюке и влажность 60%) в листьях люпина, выращенного на ионитных субстратах в камерах искусственного климата в автоматически контролируемых условиях.

Обработка посевов ячменя и ржи в начале кущения и в фазе выхода в трубку препаратами, пестицидов, гербицидов и инсектицидов (метафос,тилг,симазин, амбуш.валатои и др.) вызывала снижение активности ингибиторов трипсина в семенах на 10-15%.Угнетение активности ( на 16X0 наблюдалось и при действии повышенных доз минеральных удобрений.

Различные уровни радиоактивного загрязнения,образовавшегося в результате аварии на-Чернобыльской АЭС, в 137 и 259 х 104 Бк/м2 снижали активность ингибиторов трипсина на 40 и 70Z соответственно, по отношению к контролю (11,1 х 104 Бк/м2). Существенных изменений в активности протеолитических ферментов не наблюдалось . Снижение активности ингибиторов прогеиназ приводит к измене-

нию комплекса протеиназа-ингибитор в сторону активации гидролаэ, что в конечном итоге, вызывает ускорение прорастания семян люпина. Полученные данные объясняют действие радиации на прорастание семян (Гр0д8инский,1989).

На основании результатов исследований можно заключить, что протеиназно-ингибиторная система является,возможно, тем лабильным элементом структуры, изменением которой растительный организм на ранних этапах реагирует на неблагоприятные внешние воздействия. Это дает возможность использовать отдельные компоненты этой системы в качестве теста на техногенные воздействия.

Протеиказно-ннгибнторная система и белковый обмен в онтогенеза растений люпина

Динамика активности Эндогенных протеинаэ и белковых ингибиторов в прорг .ащих семенах лкпина.Сведения о роли протеиказ-но-ингибиторной системы в прорастающих семенах будут способствовать углублению представления об этом процессе с целью осознанного управления.

Для выяснения роли протеинаэ и белковых ингибиторов при прорастании семян использовали сорта желтого кормового люпина Пламенный, БСХА и увкодистного - Оыега и Казан. Результаты исследований показали изменение активности нейтральных протеаз (максимум активности при рН 6,5-7,0), кислых-(при рН 4,5-5,0), БАЭЭ - эсте-раэы-(рН 7,0-7,5) и щелочной протеиназы БАПАазы (рН 8,0-8,5). Так, в семядолях и эародышах-исследованных сортов желтого кормового люпина наблюдается повышение активности всех изучаемых ферментов до максимальной величины на третий день прорастания в пересчете на абс.сух. массу семадоли/вародыша. Удельная же активность ферментов максимальна к седьмому дно прорастания. В семядолях и эародышах люпина обнаружена трипсиноподобная протеика-аа,гидролизующая сложный эфир БАЭЭ. Активность фермента максимальна в первые сутки прорастания. Следует отметить более высокую активность ферментов в зародышевой оси по сравнению с семядолями.

Ингибиторы протеинаэ, как показали исследования, находятся на БО-бОХ в связанном с протеазами состоянии. При прорастании семян активность ингибиторов трипсина, в противоположность ферментам, снижается как в семядолях, так и эародышах ( гипокотилях и кор-

них). В зародшвх семян она полностью исчезает к пятому дню прорастания. В семядолях снижение ингибиторной активности Оолее медленное (рис.1). Уменьшение активности ингибиторов трипсина подтверждается и электрофорезом в полиакриламидном геле ингибиторсо-держащей фракции белков семядолей и зародышей. Уменьшение содержания ингибиторов заметно и при гель-фильтрации на сефадексе Б-100. Снижение активности ингибиторов при прорастании люпина,как показали наши исследования, обусловлено расщеплением их цистеино-выми протеиназами, что доказывается прямым действием фермента, выделенного и хроматографически гомогенного, из прорастающих семян на препарат ингибитора трипсина. Инкубация ингибиторного бел-:а в течение часа при 37°С приводит к полной его инактивации. Это доказано и методом электрофореза в ПЛАТ, где заметно уменьшение ингибиторной зоны.Снижение активности ингибиторов в процессе прорастания семян ведет к повышению уровня активности протеиназ благодаря распаду протеиназно-ингибиторного комплекса. Функционирование системы обеспечивает образование аминокислот и олигопепти-дов,обеспечивающих рост проростка. Опыты позволили также установить, что фитогормоны (эпибрассинолид) в концентрации 10~9 М оказывают анаболическое действие на протеиназно - ингибиторную систему в течение первых двух суток прорастания семян люпина желтого, что говорит о том, что эта система рэходится под контролем биологически активных веществ.

Роль протеиназно^ингибиторного комплекса в прорастании семян подтверждена прямым действием препарата ингибитора трипсина на прорастание семян люпйка. Повышенные дозы коммерческого препарата ингибитора из сои затормаживали прорастание семян благодаря связыванию протеаз в неактивный комплекс.Низкие же (10~7 М) доэы ингибитора трипсина, наоборот,значительно'повышали энергию прорастания семян,вызывали усиленное корнеобразование при дальнейшем росте проростков.Возможно,это обусловлено-их действием на аукси-новый обмен растении люпина.

Кзыенеккэ протеингзно-гспгкбзггориоЛ скстеыц в оатогеиезе растений лкпина. Протеазы играют важную роль в реутилизации азотистых соединений из вегетативных органов. Но, к сожалению,имеется незначительное число сведений, касающихся,в основном, лишь протеаз листьев злаковых культур (Павлов,1980; Левицкий,1982;Кондратьев, 1983; Вовчук,1988). Тем не менее, данные о протеазно - ингиби-

ЕА,КЕ/

Рис.1. Изменение активности нейтральных (1),кислых протеаз (2), БАПАазы (3),БАЭЭ-эстеразы (4) и белков-ингибиторов трипсина (5) в семядолях (А) и зародышах (Б) семян желтого кормового люпина сорта БСХА-382 в процессе прорастания

торной системе,участвующей в транспорте небелковых соединений ив вегетативных органов, и особенно о регуляции активности протеаз, дао? возможность более полно раскрыть механизм формирования белкового комплекса семян за счет азотсодержащих соединений листьев.Торможение процессов оттога этих соединений из вегетативных органов позволяет поддерживать па определенном уровне содержание в mix белка, что может способствовать повышению кормовой ценности зеленой массы.

Листья исследованных видов люпина,различаются по белковости,содержат ферменты, расщепляющие казеин при оптимуме рН 6,5; гемоглобин при оптимуме рН 4,0-4,5 и БАЛА - при оптимуме pli в,0-8,5. В процессе вегетации происходит изменение активности различных классов протеаз. До фазы бутонизации активность ферментов находится приблизительно на одном и том же уровне. В листьях желтого люпина (сорта БСХА - 382 и Пламенный) максимум активности протеаз обнаруживается на 20-й день после цветения, у сортов же узколистного (Омега и Казан) и многолетнего - на 15-18-й, у белого j^jroraa (Синий парус) - на 30-й день после цветения,что связано с различной продолжительностью их вегетации. Максимум активности исследованных видов ферментов связан с интенсивностью реутилизации небелковых азотистых соединений в этот период, идущих на построение белковых молекул. Отток по.-чпептидов и аминокислот из листьев в формирующиеся семена подтверждается и снижением содержания белка у них. Причем, сорта люпина желтого, обладающие более высокой активностью ферментов в листьях, имеют и более высокое содержание Сел^а (до 47%) в семенах, чем, например, сорта узколистного люпина (около 38Х).

В листьях люпина удалось впервые обнаружить активность ме-таллопротеиназы, фермента, расщепляющего субстрат азокол. Активность его максимальна в стареющих листьях ( Э0-40 дней после цветения) . Оптимум действия этого фермента лежит в области рН 8,5-9,0. Возможно, металлопротеиназа. участвует в распаде белков в листьях на поздних этапах вегетации.

Использование синтетических ингибиторов и активаторов проте-иназ (<1МСФ, ГОСМБ, ЭДТА, 1,10-фенангролина, пепстатина и др.) в концентрации lxlO-3 M показало, что основными протеазами, функционирующими в вегетирующих листьях люпина являются сериновые и цистеиновые. Активность протеазы стареющих листьев ингибировалась

фенантролинои,что подтверждает ее принадлежность к классу метал-лопротеиназ.

При изучении вопроса о регуляции активности различных классов протеиназ в листьях люпина, особое внимание было направлено на исследование роли ингибиторов протеиназ в этом процессе. Как оказалось, максимальная активность белков-ингибиторов протеиназ (трипсина) у всех видов люпина наблюдается в фазе цветения. Это подтверждено и электрофорезом нативной ингибиторсодержацей фракции белков в ПААГ. Выявлены изофорыы ингибиторов с ОЭП 0,13; 0,26 и 0,33 в фазе цветения люпина желтого. В листьях узколистного люпина ингибиторные зоны находятся при ОЭП 0,48; 0,53 и 0,60, у бе-лого-при 0,54 и 0,62; У многолетнего-при 0,20; 0,50 и 0,61.

В фазе плодообразования люпина наблюдалось также уменьшение доли высокомолекулярных (60 - 100 кД) белков в среднем на 20-25%.

Наблюдаемое уменьшение содержания ингибиторов в листьях ло-пина в период ..дчала формирования семян, когда отмечается максимальная активность протеаз, связано, по-видимому,с их регулятор-ной функцией. Это подтверждается ингибированием активности БАПА-азы (на 40%), нейтральных (на 12%) и кислых (на 227.) протеаз под действием ингибиторов трипсина из люпина.

Динамика активности протоолигкческшс ферментов и белков-ик-гкйнгоров лрэхеодаз при согреаашш семян липкна. Созревание семян люпина также сопряжено с изменением активности протеиназко-инги-биторной сйстемы. Начальный этап созревания характеризуется высокой активность», кислых, нейтральных и щелочных протеаз. Активность же белковых ингибиторов незначительна. Они начинают синтезироваться, когда содержание сухого вещества составляет около 20% и начинается синтез вицидиноподобных белков. Период интенсивного накопления вицилгаго-и легумикоподобных белков семян характеризуется спадом активности протеодитических ферментов, и в зрелых семенах она минимальна. Активность же ингибиторов протеиназ максимальна. Установлена видовая специфичность в уровне активности системы протеиназа-ингибитор. Так, активность всех исследуемых протеиназ в начальный период согревания у сортов люпина желтого в 5 рае выше, чем у люпина узколистного. У сортов желтого кормового люпина наблюдается и более высокий уровень запасного белка,чем у сортов узколистного люпина. С созреванием семян увеличивается доля (до 87%) нивкомолекулярных белков (до 30 кД), что подтверждает

- Т8 -

факт накопления ингибиторов протеиназ.Изоформы ингибиторов сосредоточены для люпина желтого при ОЭП 0,71 и 0,85, а для люпина узколистного - при 0,50 и 0,75.

Переход ингибиторов в связанное с ферментами состояние можно рассматривать как один из механизмов регуляции их активности.Благодаря комплексу протеиназа-ингибитор предупреждается распад запасных белков.

Тагам образом, аьслизируя и обобщая полученные результаты,основные этапы действия протеиназно-ингибиторной системы в растениях люпина можно представить в виде следующей схемы (рис.2.).

Семена прораставшие

ЦПРИ СПРИ АПРИ чАи ¿АИ >И --— АПР

ЦПР СПР

Ак,П

Ак

Лист

ЦПР СПР АПР

у-и >-и

ЦПРИ ОТРИ А1Г Ак,П -Б

Семена покоящ. запасной белок

ЦПРИ СПРИ АПРИ -

транспорт

транспорт

Лист, фаза цветения

ЦПРИ СПРИ АПРИ Ак,П -Б

Формирующиеся семена

ЦПР СПР АПР >И у-И У"И ЦПРИ СПРИ АПРИ Ак.П -Б

Ак 4 П

Лист стареющий фаза плодообразов.

ЦПРИ СПРИ

ЦПР —

'И МПРИ И >И СПР АПР МПР >- Ак,П

Ак

П

Рис.2. Схема основных этапов действия протеинавно-ингибитор-ной системы в онтогенезе люпина. ЦПР - цистеиновая про-теиназа; СПР - сериновая протеиназа; АПР - аспартильная протеиназа; МПР - металлопротеиназа; И - ингибиторы протеиназ; ПРИ - прогеиназно-ингибиторный комплекс; Б -белок; Ак - аминокислоты; П - пептиды

Прорастание семян сопряжено с разрушением комплекса протеиназа- ингибитор вследствие расщепления ингибиторов цистеиковыми протеинааами. Образованные пептиды и аминокислоты при гидролизе белка идут на построение белка листьев, в этом процессе активное участие принимают цистеиновые.сериновые и аспартилъные протеина-аы. Активация' протеинаэ наблюдается при снижении ингкбиторной активности в листьях в фазе плодообразования. В этот период обнаружено появление и металдопротеиназы. Высокая активность протеинаэ обнаруживается на начальных этапах созревания семян,когда активность ингибиторов ыишшальна.На всех стадиях роста и развития люпина наблюдается взаимосвязь действия протеинаэ и белков- ингибиторов, что говорит о важной роли протеиназно-ингибиторной системы в белковом обмене растений.

Итак, протешазы и белки-ингибиторы в семенах и листьях об- • разуют связную систему. Эта" система обеспечивает транспорт и утилизацию аминокислот из семян в листья и корни при прорастании семян и обратный перенос их из стареющих листьев в созревающие семена. Следовательно, протеиназно-ингибиторная система состоит из пространственно разделенных в листьях и семенах элементов, одновременное изменение активности которых в противоположное состояние формирует градиент концентрации азотистых субстратов. Градиент обеспечивает их перенос s направлении, при котором реализуются важнейшие биологические процессы: прорастание семян, утилизация азотистых соединений стареющих листьев для образования запасных белков семян.

свойства кокшгкнгов протблцсно -клгиеэторпой сксгаа лслинл

Бчхеление эндогенной прогехназы из лкпмна.ее снзико-зкчичес-кие свсблиа к субстратная специфичность. Протеолитические ферменты выделены из немногих растений. Особое внимание уделено ферменту, обладающему высокой активностью по отношению к БАЛА и функции которого, к сожаления).окончательно не выяснены. В чистом виде этот фермент выделен ив некоторых злаковых и бобовых растений ( Белозерский, Дунаевский, 1980; Caldwell et al., 1976;. Duran-tl, Cerletti,lS89).

БАПАазу из муки семян люпина желтого сорта Кастрычник в на-

изй работе- экстрагировг-ли 0,05 М фосфатним буфером рН 7,8. Из экстр-зкта высаливали фрасцию 40-80? сульфатом аммония,обессоливали и наносили на колонку с блогелем Р-30. Фракция, активная по отиоиению к Б/ДА, выхолила упким пиксм. Ее обессоливали и ггропус-кали через ГОЕ-Тоуореаг1 650 БАПАаза десорбировалась с колонки 0,15 М №01 в 0,005 М фосфатном буфере,рН 7.4. Активную фракцию оса;',дачи сульфатом аммония и рехромагогра|[)ировали на колонке с Р-30. Нрепа^т, очиденный в 121 раз да*;ал при электрофорезе в ПЛАТ одну четкую зону и два минорных компонента. Молеку-лярнал масса препарата по данным электрофореза в денатурирующих условиях равна 55 ± 2,2 кД. Удельная активность фермента ровна 51,9 сд/иг белка.

Иога-зано, что ингибированне (85£) актиьности фермента наблюдалось под слиянием 1 ш «,105. На активность протеазы не оказывали вллянил ионы 7л, Са, ,Мп и Ре л концентрации 0,5 мМ. Полученные данные говорят о принадлежности БАПАазы из семян люпина к классу сериновнх протеиназ. К этому же классу принадлежит и БАПАаза, вн-делышзя из ржи и гречихи ( Белозерский, Дунаевский,1990 ). Так как БАЛЛ является субстратом трипсина,то ее могло назвать трипси-ноподобной протеиназой. Константа Михаэлиса препарата, равна 2 х10"~"\М. Фермент устойчив в течение 5 суток при 4° С. При 37°С его полная инактивация наступает в течение суток. БАПАаза гидро-лизует амидные и эфирные связи. Она расщепляет протамик и гисто-ны.Обнаружена способность БАПАазы гидролизовать конглютине полипептид с Мм 47 кД,а в ^-конглютине -35 кД при инкубации (1:1) в течение 24 48 часов при 37°С. Возможно, эта протеиназа играет роль в модификации запасных белков, после чего они расщепляются другими протеазами.

БАПАаза, выделенная подобным способсм из листьев люпина желтого ¡мела молекулярную массу около 63 кД. Как и из семян, фермент из листьев является сериновой протеиназой. Константа Михаэлиса равна 1,75 х Ю-4 м. Удельная активность очищенного фермента составила 47,4 ед/мг белка. Исследования позволили впервые установить способность БАПАазы гидролизовать больную и малую субъединицу ( 55 и 15 кД) РДФК/0, основного белка листьев.

Таким образом, на основании проведенных исследований БАПАвы из семян и листьев разных видов люпина можно сделать заключение о сходстве ¡к свойств и, возможно, выполняемых функций.

- 2Г -

Белки - киглбгггорм протекиаз ка разных викоа лкжкна и >сс физике - химические свойства. Относительно ингибиторов протеияаз у люпина в литературе имеются лкиь сведекил об отсутствии и незначительном содержании ингибиторов трипсина з семенах этой культуры ( Бенкек,Степанова,1986; Naoko, Sature,1983).

Наш впервые белковые ингибиторы протеиназ выделены из семян люпина многолетнего,желтого и белого (А.с.138905?; Доыаа, 1931; Домаш и др.1S93). ООщзя схема выделения ингибиторов трипсина из семян люпина многолетнего и желтого представлена на p;:c.ó. При электрофорезе в Г1ААГ препаратов ккгибкгороз и денатуркрулапх условиях обнаружено по одной зоне. Ыалекуллриоя касса mrnc,.i?c¿.-¡ na люпина многолетнего равна 10 £ 1 кЛ; желтого- îfc,6 х i (рис.4); белого 18,6 ± 0,5 кД; узколистного 18,7 х 0,f- kÇ.

Титрование ферментов ингибиторам;; но люпина покы»дяо.ч.\> линейный характер ингибированкя трипсина г^епаратом гч с-;ми: пина многолетнего сохраняется до 80Z (ра<\!>>. У др/r;*;; ъидс:. иина - до 50Х шгибирования.Все виды к-п-кби'» ¡ро» ; •■ срм... .■■:■•-/.нн сказались неактивными по стяододо: к ци-и <ира*/ ч:.:.- »■%>■ теиназам. Константа ингибг-.х-^гш/.я rpr';c.::¡a с.;,;. .лии-гь -и ; tiro равна l,5.10"10 М, для хвлтого.белого к у:- qjuíc. <о: ; • оо--; .•> твенно 2 хЮ"9; 1,0 х 10~s; l;,3.-[(/u ч. нкгиоиюр триюи.гг «ш люпина многолетнего, по-видимому, найбадс--1 ? :<$ек7изеи ct-;••» тений семейства бобовых.

Для аминокислотного состава акгибит-чх/.- льр?<ст<-рж> я.;?, os содержание аспарагиновой, глютамлновой кислот, третий, v. на,аргин1ша. Для люпина многолетнего одзод'яо пег- «еьа«.* c-v'jp-жание полуцистина (около ÍZX, для другs-л «м •» - '*ол> ■ '). Отсутствие триптофана в препаратах * « v. ч- ■ ••« vvo-ресцекции.

Ингибиторы устойчивы и области рН й-11, к дейстсш у - кч«ч-и~ ны, 52 ТХУ, пепсина (1 час, 37°С, рН 2.1). Дая iraniCnvc; я ¡-.ь до-пина многолетнего характерна более высокая термоустойчивое«. ( кипячение в течение 30 минут снижало активность на ЭИ). Устойчивость к денатурационным воздействиям объясняется наличием дисуль-фидных связей, придающих жесткость конформации белковой мс-.жсу-лы,дополнительно,возможно, к большому числу гидрофобных взаимодействий.

Для ингибиторов из всех видов люпина характерно отсутствие в

осадок

осадок

семена

1

V

мука

I

супернатачт

осаждение балластных белков при рН 4,0

экстрами 0,2 М ;.'аС1, центрифугирование 8 тыс.(?,15 мин

центрифугирование, 12 тыс. р ^ 20 улш

-•упернатант |

гысаливание сульфатом аммония до 0,85

Спи. трат

осадок

-осадок I

г~

суп-'-онатант

растворение в 0,05 М ?ркс-НС1 буфере, Г>Н 8,0. цонтрг'.фу.гжа-вание 20 тис. ¿,15 мин

4»$;яш<я хроматограф;«

диализ лисфидизация

— оастзоренке в 0,05 М ацетатном буфере,рН 4,0

ионообменная хроматография на КМ - сефадексе А-25

I

элюа1?

ингибитор ]

диализ против ДКСТИЗ. 13 оды

жофилизадая

Рис. 3. Схема выделения ингибитора трипсина

из семян люпина многолетнего и желтого

кд I 45,

25 —

17.8 12,3 —

кД .67

25

. _12,3

■I

Рис.4. Электрофорез ингибиторов трипсина из семян тапина нкоголзткего (а) и к»лтого (б).1 - белки-маркери-, 2 - шдеденный ингибитор

•ел

С

О £

ь4 о к а ы о о

1С0

80

60

40

20

0 I

0,25

;,50 0,75 1,0 1,25

!ЖГ

Ркс.5. Угнетение активности трипсина (1).химотрилсина (2), паяглна (3) и субтилизина (4) ингибитором из .семян многолетнего

КД - спектре отрицательного экстремума при 222 нм, что свидетельствует о присутствии лгать />- спиралей ( СгеепПе^.Газтач, 1953). Это подтверждается и расчетом упорядоченных структур, которые составляют около 20%.

Кодификацией остатков аминокислот показано наличие аргинина в реактивном центре ингибиторов.

Все ткаы ингибиторов содержат около 37. углеводов (гексоз и пентоз).

Таким образом, на основании исследования физико-химических свойств белковых инги нторов трипсина из семян разных видов люпина могло предположить, что ингибиторы из семян люпина желтого, белого и узколистного относятся к семейству ингибитора Кунитца из сои, а из люпина многолетнего - к семейству ингибитора Баумана- Бирк.

С целью изучения физико-химических свойств и разнообразия выполняемых ингибиторами функций, впервые проведено выделение ингибиторов протекназ лз листьев разных вкдоз люпина.

Ингибиторы из листьев люпина многолетнего и люпина желтого сорта Кастрычник выделяли путем экстракции 0,2 М ХаС1, осачдения балластных белков, хроматографии НН на акрилексе Р-30, трипсин -сефгрозе и КМ-сеФадексе А -25. Основная масса белка элюировалзсь 0,25 М ацетатным буфером, рН 6,9. Достигнута 273-кратная очистка.

Молекулярная масса ингибитора трипсина из листьев люпина многолетнего,определенная методом электрофореза в ПААГ, составляла 12,5 х 0,8 кД,а из листьев люпина желтого - 19 ± 1,2 кД. Ингибитор из листьев люпина многолетнего, как и ингибитор из семян, эффективно подавлял активность трипсина, слабее - химотрипсина и не действотл на активность папакна.субтилизина. Константа инги- ■ бирования для лузпина многолетнего составляет 1х10"10 М, а для "елтого - 1,5хЮ~10 М. Ингибитор из листьев люпина многолетнего был более термоустойчив,чем из листьев люпина желтого. Для ингибиторов трипсина из листьев люпина характерно более высокое, чем в семенах содержание глютаминовой кислоты, серина и б.олее низкое

-.л а ..-е.'.-.

содержание ароматических аминокислот.

Исходя из полученных данных можно. заключит^^тс^^ля, ингибиторов из семян и листьев, люпина характерна.^вд^^ескач,обусловленность их физико-химических свойств. Имеющиеся различия сЕязакы возможно, с физиологическими функвдями,. выполняемыми ими.

Выделение и свойства белков-ингибиторов эндогенных протеиназ бобовых растения

Изучение регуляции протеолиза с помощью ингибиторов весьма актуально,однако его результаты не вышли из дискуссионной стадии. В литературе сравнительно мало сведений относительно существования способов выделения и очистки,а также свойств белковых ингибиторов эндогенных протеиназ ( Белозерский, Дунаевский, 1982; Sha-in, Mayer, 1953; Baumgartner,1976). Дополнительные данные по этому вопросу,несомненно, интересны и способствуют раскрытию биологических функций природных ингибиторов.

Ингибиторы эндогенных протеиназ выделяли из семян и листьев люпина многолетнего, желтого и кормовых бобов путем экстракции 0,005 М фосфатным буфером,pH 7,4. Экстракт нагревали до 60° С (5 мин) и центрифугировали. НЖ концентрировали и наносили на колонку с Р-30. Основная масса балластных белков Еыходила сразу после свободного объема. Белки- ингибиторы эндогенна., протеиназы (БАПА-азы) злюировались с колонки частично вместе с ингибитором трипсина. Активную фракцию концентрировали, диализовали против исходного буфера и пропускали через колонку с DEAE-Toyopearl 650 HW. Белок-ингибитор вымывался с колонки 0,2 М NaCl в исходном буфере. Его концентрировали, обессоливали и использовали для работы (До-маш,Забрейко,1995).

Результаты исследований показали, что молекулярная масса препарата из семян люпина многолетнего, определенная методом гель-фильтрации, равна 25 ± 3 кД, а электрофорезом - около 20 кД. Линейная зависимость между количеством ингибитора и ферментативной активностью БАПАазы сохранялась до 55% подавления активности. Полное ингибирование фермента наступает при добавлении 125 мкг ингибитора. Подобными cboi. -гвами обладали ингибиторы и из семян и листьев люпина желтого. Следует отметить, что выделенные ингибиторы из исследованных нами растений тормозят активность БАПАазы по принципу "перекрестного действия", что говорит о возможной общности механизма регуляции.эндогенных протеиназ у растений.

В процессе прорастания семян содержание ингибиторов эндогенных протеиназ снижается и на четвертые сутки их активность' полностью исчезает как в зародышах, так и семядолях. "

Таким образом, можно заключить, что регуляция протеолнти-ческих ферментоз происходит с участием ингибиторов эндогенных прогеиназ у всех без исключения растений, но осуществляется ингибиторами с различными физико-химическими свойствами, специфичными для каждого вида.

Локализация прогеиназ и белковых ингибиторов в клеточных структурах бобовых растений

До настоящего .ени малочисленны и достаточно противоречивы дачные о локализации протеаз и белковых ингибиторов в растительных клетках. Дальнейшее исследование этого вопр^-а важно для установления их физиологических функций. В своей работе мы использовали люпин, кормовые бобы и' горох.

Результаты показали, что белковые тела люпина содержат ЕАЛА-азу и ингибиторы трипсина. Кроме того, в этих органеллах присутствует кислая фосфатаза и аспартильная протеияаза (Соболев, 1985; Белозерский с сотр.,1993). Белки ядер люпина содержат ингибиторы тркпоика, а корковых бсбов, хроме того, и ингибиторы химогрипси-на, субтнллзкна и цястеиновых протеиназ.Хлоропласт« и митохондрии люпина обнаруживают незначительное содержанке ингибиторов тиоло-вых протеиназ (папаина, фицина). Хлоропласта же кормовых бобов содержат ингибиторы трипсина, цистеиновых протеиназ, а мембраны митохондрий - и ингибиторы субтидиэина. В хлоропластах и ми??-хекдриях кормовых бобов обнаружена нейтральные, кислые протеаьы, БАПАаза и даг.е ыеталлопротеиназа.

В хлоропластах листьев гороха присутствует нейтральная, кислая протеиназа, БАПАаза и металлопротеиказа, удельная активность которых составляет соответственно 9,0; 4,5; 20,9 и 3,2 ед/ мг Сйдка. Кроме того, они содержат ингибиторы трипсина и больше количество ингибиторов тиоловых протеиназ. Мембраны митохондрий также богаты ингибиторами цистеиновых протеиназ и трипсина. Наличие ингибиторов протеиназ (трипсина, химотрипсина и субтилизкна) обнаружено в межклеточной жидкости, полученной из листьев злаковых растений.

Результаты проведений исследований позволяют предположить, что протеиназко-ингибигеркая система играет роль не только в деградации и биосинтезе запасных белков, но и в функционировании

различных клеточных структур.

BEJSOi-lDirjffiHTOFU ПРОШ25АЗ как ФАКТОРЫ ШМУШГГШ.

растений

Предполагается, что одной из функций белковых ингибиторов протеиназ может быть залита растении от поражения вредными насекомыми н микроорганизмами (Richardson,1977; Мосолов, Валуева, 1093). Для доказательства этого предположения проводили детатьные исследования с растениями люпина,ржи,ячменя и картофеля.

Результаты позволили выявить корреляционную связь (г= +0,80) между активностью ингибиторов трипсина в зародьшах семян люпина и устойчивостью растений к фуаариозу. Показана такая же закономерность для клубней и листьев картофеля, что дает возможность использовать ее в качестве теста на устойчивость к болезням. Подтверждением роли протеиназно-ингибиторной системы в устойчивости растений к фктопатогенюй инфекции являются опг~ы с растениями ржи, ячменя и картофеля, показавшие, что в ответ на заражение происходит накопление белков - ингибиторов протеиназ, причем у устойчивых сортов на 20 - SO X больше, чем у неустойчивых. Это, возможно, связано с индуцированным грибом синтезом ингибиторов de novo. Наблюдаются изменения и в активности нейтральных, кислых протеиназ и БАПАазы в сторону их уменьшения,а также в электрофоре-тическом спектре ингибиторсодержащей фракции белков.

Установлено также участие ингибиторов трипсина в механизмах устойчивости растений картофеля к вирусным болезням (Амбросов, Домаш и Др.,1979).

Обработка посевов картофеля к мплексонатами, совместно с микроэлементами Zn,B и Wo способствует снижению концентрации X -вирусов в листьях картофе."ч. Это связано и с повышением активности ингибиторов трипсина на 18-75%, в зависимости от варианта опыта, у менее устойчивого сорта Темп и на 30-90% у более устойчивого сорта Добро.

Обработка клубней картофе -ч ингибиторами трипсина приводила к существенному снижению концентрации вирусов в листьях растений, выросших из них. Полученные результаты даот основание для разработки способов иммунизации растений к вирусным болезням.

Полил-лнтабяторц.спс^фячнио к протеиназ <м кинроорг-чинзиов.

В растениях,наряду с ингибитора/и трипсина и химотрипскна известны ингибиторы, специфичные к сериновим протеиназам микроорганизмов. Но к сожалению, сведения по этому вопросу очень фрагментарны (Richard5on,i977; Мосолов,1955; Кенаров Ал.,1992).

Провес.иные исследования дали возможность обнаружить и впервые выделить из семян и листьев люпина и некоторых других бобовых ингибиторы протеиназ фнтопатегеккой инфекции. Для этого муку семян люпина экстрагирс. али 0,005 М фосфатным буфером,после чего из экстракта ссапдали балластные белки, НК концентрировали и пропускали через акрилекс Р-30. Активную фракции xpcvaroi, афировали на ДЭАЭ - целлюлозе. Молекулярная масса белка, ингибирумщего активность протеиназ грибов рода Fusarium,примерно 26 кД • (определена методом гель-хроматографии).Ингибитор из семян люпина подавлял активность F.oxysporum и F. safibucinum. Линейная зависимость между количеством вн^сснсго в инкубационную среду ингибитора и ферментативной активное гы» сохранялась до 65% подавления активности. Волок незначительно подавлял активность трипсина, не действовал на еубтилиэин и ферменты Aspergillus aliaceus.

Белки,способные лнактивировать микробные протеиназы,выделены из семян и листьев люпина многолетнего, желтого и кормовых бобов. Следует отметить, что белки из семян и листьев кормовых бобов, в противоположность белкам из люпина, подавляли активность субтили-зина и протеиназы Aspergillus aliaceus, но не действовали на активность Fusarium. Полученные нами новые данные показывают существование у г-аждого вида растений ингибиторов, функцией которых является нейтралиаашш протеиназ фигопагогенных микроорганизмов, специфичных для какого вида растений.

Замочено также, что экстракт из клубней картофеля способен ингибировать активность протеиназ фитопатогенного гриба рода Fusarium. Установлено, что различные по устойчивости к F. saTibuci-num сорта картофеля по-разному ингибировали протеазы гриба с молекулярной массой 25-28 и ба-98 кД, относящиеся.к классу серино-вых. Результаты анализа дали возможность разработать способ определения устойчивости картофеля к микромицетам F.sambucinun ( A.c. 1470271).

Подтверждением защитной роли белков-ингибиторов протеинаа

являются и данные по прямому действию их ка рост и развитие F.sanbucînurn. Добавление ингибитора, выделенного кз картофеля в культуральную среду до конечной концентрации 0,05 и 0,1%, способствовало снижению биомассы мицелия гриба на 90%. Препарат в концентрации 0,1% снижал диаметр колоний гриба на чажах Петри на 58% через 72 часа. Активность протеолитическда ферментов в куль-туральной жидкости снижалась на 70%. Ингибитор (0,01 - 0,1%) снижал на 45 - 86% объем пораженной ткани картофеля, вызванной грибом ( A.c. 1584167). .

Ингибитор трипсина из люпина многолетнего угнетал рост и развитие гриба F. oxysporum (Дорожкин.Домаш и др.1985). Он снижал число проросших спор, развитие ростковых трубок и др.

Тагам образом, полученные данные дали возможность экспериментально доказать роль белковых ингибиторов протеиназ в системе фи-тоиммунитега, как одного из факторов устойчивости растений к болезням.

БЕЛКОВЫЕ ИНГИБИТОРЫ ПРОТЕИНАЗ КАК ОДИН ИЗ ПОКАЗАТЕЛЕЙ КАЧЕСТВА БЕЛКА

Питательная и кормовая ценность семян с.х. культур зависит не только от количества и качества белков (аминокислотный состав, переваримость и др.), но и.от присутствия токсических,антипитательных веществ.Предполагается, чтэ одними из таких веществ являются ингибиторы протеиназ ( трипсин,химотрипсин). Скармливание белка, даче высокой биологической ценности,не дает положительных результатов в связи с недостаточной его утилизацией из-за связывания пищеварительного фермента трг. .сина ингибиторами в неактивный комплекс.Об актуальности рассмотрения вопроса об ингибиторах протеиназ, как одном из ан-:шитательных факторов говорит ряд Международных конференций,посвященных этому вопросу (Вена 1973; Нью-Йорк, 1986).

Для проверки предположения о действии ингибиторов трипсина на качество белка исследовали действие этих веществ на переваримость in vitro белка семян с.х. культур. Результаты показали отсутствие корреляционной связи между переваримостью белка в семе-нач люпина желтого и ингибиторами (г=-0,0б): Но для диких видов, более богатых ингибиторами, коэффициент корреляции равен -0,97±

0,02, т.е с увеличением содержания ингибиторов переваримость белка уменьшается. Тесная корреляционная связь отмечена и для белков семян гороха (г= -0,64_¿ 0,12). У диких видов гороха, по данным авторов ( Singh,Jambmathan, 1979), переваримость белка была на 35% шике, чем у культурных видов. Взаимосвязи между указанными показателями для злаковых культур ( ячмень,рожь,тритикале) не отмечено.

Для изучения действия различных доз препаратов ингибиторов трипсина на переваримость белка гороха, в инкубационную смесь вносили от 0,5 до 3,Г мг ингибитора. Оказалось, что с повышением дозы препарата переваримость белка in vitro постепенно снижается и при 2,5 мг в среде составляет 25Х от контроля,пос. ■ чего кривая выходит на плато.

Основные пути снижения уровня ингибиторов трипсина в семенах с. зс. культур. Одним из путей снижения содержания ингибиторов про-теиназ в семенах с.х.культур является селекция. Но этот путь является трудным и длительным. При этом следует иметь ввиду,что снижение содержания ингибиторов может вызвать и снижение устойчивости к болезням. Но, зная уровень ингибиторов у устойчивых сортов бобовых растений можно при прочих равных условиях исключить сорта с более высоким уровнем ингибиторов. Среди бобовых культур особенно остро стоит проблема снижения ингибиторов у сои.Существует ряд технологических способов обработки сои с целью их инактивации. Прогревание муки при 100° С в течение 15,50 и 120 минут снижает активность соответственно на 13,20 и 60%. В последнее время в производстве используются термовсгрудерные установки для обработки зерна (Мельцер и др.,1990). Проведенные совместно с Институтом тепло- и массообмена АНВ опыты по действию различных режимов термовструдкровакия зерна на активность ингибиторов трипсина показали, что она снижается в зависимости от режима на bü-100%. Со снижением активности.ингибиторов наблюдается повышение степени декстринизации крахмала, переваримости белка и др. При этом не замечено отрицательного влияния на содержание белка и его аминокислотный состав. Полученные данные позволили разработать режимы термовструдирования зерна ка основе использования показателя активности ингибиторов трипсина в качестве теста. Этот показатель включен в Технические Условия "Компоненты зерновые термовструдированные" и используются в настоящее время в АО "ЭКО-

- ЗГ-1

МОЛ".

Таким образом, показано,что белки-ингибиторы протеиназ,выполняющие широкий ряд биологических функций, могут снижать и качество белка семян с.х. растений, что ставит проблему поиска компромиса. Исследования позволили также обосновать применение белка семян кормового люпина (из-за незначительного содержания ингибиторов протеиназ) в сыром виде,без тепловой обработки, для пищевых и кормовых целей.

вывода

1. Показан широкий спектр уровня активности белков-ингибиторов протеиназ у растений различных систематических групп. Впервые установлена.видоспецифичность в активности протеаз и белковых ингибиторов для растений рода Шр1пиэ. Установлено наличие в семенах к листьях исследованных видов и сортов люпина протеаз с оптимумом действия при рН 4,5; 7,0; 8,0 и 9,0. Вг-"?вленная видовая и сортовая специфичность в злектрофоретическом спектре ингибиторсо-держащей фракции белков семян ряда высших растений дала возможность разработать способ отбора высокобелковых форм люпина узколистного и показать, что белки-ингибиторы протеиназ могут служить в качестве маркеров в генетике и селекции растений.

2. Установлена роль протеиназно - ингибиторной системы в метаболизме белка различных видов люпина.'Показано, что прорастание семян сопряжено с повышением уровня активности нейтральных,кислых протеаз,БАПАазы.БАЭЭ-эстеразы. Так, активность цистеиновых протеиназ увеличивается к 48 часам прорастания почти в три раза. Повышение же активности БАЭЭ-эстеразы происходит лишь в первые сутки прорастания. Наблюдающееся снижение активности ингибиторов протеиназ в процессе прорастани" семян люпина связано с их деградацией цистеиновой протеиназой. Отмечен более высокий уровень протеиназ и белковых ингибиторов в зародышевой оси семян люпина.

Установлено участие протеинаано-ингибиторной системы в белковом обмене листьев люпина п-ч биосинтезе запасного белка семян. Выявлено участие сериновых.аспартильных и цистеиновых протеаз в транспорте азотистых веществ из вегетативных в репродуктивные органы. Впервые показано наличие в листьях люпина металлопротеина-аы,максимальная активность которой наблюдается в стареющих листь-

пх.

Созревание семян люпина связано с падением активности проте-иназ и повышением уровня активности ингибитороп трипсина,которое обнаруживается при доле сухой массы вещества 2 семенах около 20Х, т.е. в период качала синтеза вицитиноподобных белков. Показано существование ингибиторов в связанном с протеазами состоянии в зрелых соме.-.ах.

3. С г.оксхью хроматографических методов анализа впервые установлено наличие в семенах и листьях исследованных видов бобовых растений белковых ингибиторов эндогенных протеиназ.изучены их физико-химические свойства и сделано заключение о возможном существовании у всех без исключения растений специфичных ингибиторов эндогенных протекназ.

4. Из семян люпина желтого и многолетнего хроматографически-ми методами выделена эндогенная пептидгидролаза БАПАаза, исследованы ее биохимические свойства и установлена принадлежность этого бермэнта к классу сериновых протекназ и ее способность расщеплять субъедимщы и !';-"свглмтина.

5. с установлена локализация протеииаз и белковых ингибиторов в различных клеточных структурах растений, люпина,кормовых бобгз и гороха. В частности, обнаружено наличие в алейроновых зернах, митохондриях,хлоропластах и ядрах указанных растений цкс-теизюзых протепнзз.ЕАПАазы.ыеталлопротеиназы, ингибиторов трипсина, химотрипсина.субтилизина и паяакна.

0. Впервые из семлн и листьев разнда видов люпина выделены в чистом виде ингибиторы трипсина, исследованы физико-химические свойства и показана да видовач спещзфичность. Ингибиторы трипсина из семян и листьев лошша желтого,белого и узколистного принадлежат к семейству 'икг-:битора Кукитца из сои, а из люпина многолет-"»го - к семейстау ингибитора Баумаяа-Бирк. Самая низкач величина константи ингибнрования (Ю-10 М) отмечена у ингибитора люпина многолетнего.

V. Полученные в результате исследований дачные позволили не только подтвердить предположение о защитной функции белковых ингибиторов протекнаэ, но и значительно расширить это" представление. Показана'их способность подавлять активность протеаз рода Ризаг1ит, задерживать рост и развитие фитопатогенкого гриба,а также снижать- концентрацию Х-вируссв на растениях картофеля. При-

сутствке ингибиторов протеиказ в растениях можно считать одним из механизмов устойчивости растений к болезням. Ка основании исследований сделано предположение о наличии у каждого вида растений ингибиторов протеиназ фитопатогенных м>:кроорганизмов, специфичных для него.

8. Показано,что ка воздействие неблагоприятных факторов вкесней среды (пестицидов,гербицидов,повышенных доз минеральных удобрений,радиационного загрязнения и др.) растение отвечает изменением активности отдельных компонентов системы протеолиза. Предлагается использовать этот показатель в качестве теста на техногенные воздействия.

9. Исследование ингибиторов протеиназ как одного из факторов качества белка, в частности отрицательно влияющего на его переваримость , позволило обосновать необходимость компромиса при селекционном снижении содержания уровня ингибиторов в богатых ими семенах растений. Термовструдирование оказалось наиболее эффективным способом снижения содержания ингибиторов трипсина в семенах растений,что легло в основу разработки технологических режимов, которые нашли применение в комбикормовой промышленности.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕШ ДИССЕРТАЦИИ

1. Мкрокекко А.В.,Домад! В.И. .Рогульченко И.В. Белки культурных к дикорастущих кормовых растений.- Минск: Наука и техника, 1990.- 200с.

2. Волынец А.П., Прохсрчик Р.А..Пшеничная Л.А.Майснер А.Д. Минько И.Ф.«Будкевич Т.А., Каурс- И.А..Булко О.П..Заболотный А.И.,Домаа В.И. и др. Физиология плодообразования люцерны. Минск Наука и техника, 1989,- 208

3. A.c. СССР,МНИ А 61 К 35/28,ДСП. Способ получения ингибитора трипсина.- / Домаш В.И., Мироненко A.B. .Чехова А.Н. Опубл. 28.04.1985,- 4 с.

4. A.c. 1470271 СССР.МКИ \ 01Н 1/04. Способ оценки устойчивости картофеля к микромицетам Fusarium sambucinum Fuck./ Дорож-кин H.A.,Домал В.И.,Вельская С.И.,Новикова Л.М.Опубл. 07.04.89, Еюл. N 13.- 4с.

5. A.c. 1584167, ДСП, СССР.МКИ А01 N 65/00. Способ получе-

ния средства для защиты растений./ Дорожкин Н.А.,Домаш в.И..Новикова Л.М.Опубл. 18.06.87.- 4 с.

6. Пат.1877751 CCCF.MKH А 01 Н 1/04. Способ отбора высокобелковых форм люпина узколистного./ Домаа В.И.,Вуснюк 0.В.,3аб-рейко С.А..Купцов Н.С., Миронова Т.П. Заявл.01.07.91: Опубл. 30.08.93, Билл, N12.-4 с.

7. Мир^ленко A.B..Домал В.И..Рогульченко И.В.,Заболотный А.И. .Троицкая Т.М..Мохар Т.А. Физико-химические свойства белков бобовых растений и изменение их в процессе формирования урожая. // Регуляция роста и ¡..¡тание растений.Мн.1972.- С.105-111.

8. Мяроненко A.B.,Троицкая Т.М. .Шурхай С.Ф. .Домаш В.И. Выделение вицилино-и легукиноподобных белков из семян ж<_ лтого люпина. // Прикл.биохимия и микробиол. - 1978. Т.14.В.б. - С.752-758.

3. Мироненко A.B..Домал В.И..Щуцкая О.В. Белки- ингибиторы протеаз у растений картофеля,различных по устойчивости к вирусным болезням. // Вирусные болезни растений и меры борьбы с ними. Ереван, 1978.- С.73-74.

10. Амбросоз А.Л.,Домал В.И. Дуцкая 0.В. .Чехова А.Н. Влияние М-вируса на содержание белков-ингибиторов протеаз у растений картофеля. // Защита растений.!,'л. ,1979,- Т.IV.- С.3-7.

11. Мироненко A.B.,Домаа В.Я..Чехова А.Н..ШарОЕа З.Н. Актив-кость белков-ингибитороз протеаз а семенах различных сортов желтого и белого кормового люпина. // Прикл.биохимия и микробиол. -1979.-Т. 15.- С.760-763.

12. Домал В.I.Актыунасць бялкоу-1нг1б1тарау пратэ1наз жоута-га кармавога луб1ну 1 ix гзрмаустойл1васць. // Восц1 АН БССР, сер.б!ялаг.навук. - 1979.-N 4. - С.49-51.

13. Мироненко A.B., Домаа В.И., Рогудьченко И.В..Чехова

A.Н., " Ходорцова Л.<2. Белковый комплекс разных сортов люпина как показатель их кормовых качеств. // Тезисы докл. IV Всес.био-Xим.съезда,М.-1979,- С.241-242.

14. Дорожкин H.A.,Мироненко A.B..Чекалинская Н»И,,Домаа

B.И., Нитиевская В.И. Активность белков-ингибиторов протеаз в семенах различных по устойчивости к болезням сортов люпина. // Докл.АН БССР.- 1980.- N 7.- С.645-647.

15. Мироненко A.B.,Домаа В.И..Чехова А.Н. .Ходорцова Л.Ф. .Воронов А.Т. Содержание и динамика активности белков-ингибиторов протеиназ люпина. // Физиолого-биохимические основы регулирования

роста и обмена веществ растений. Мн.,1981. - С. 11-19.

16. Домаш В.И. Биохимические показатели качества верна icop-мового люпина.// Научно-методол. основы селекции интенсивных сортов верновых культур,устойчивых к неблагоприятным факторам климата. Иодино, 1981.- С.66-69.

17. Мироненко А.В..Домаш В. И. Природные белки-ингибиторы протеиназ и их роль в жизнедеятельности растений. // Тез. симп.докл. VI конф. биох. Прибалт, респ.БССР и Ленинграда,Рига, 1981.- С.537-639.

18. Шрапенка A.B., Забалотны А. I.,Домаш В. I. .Рагульчанка I.B. Залежнасць ф!з1ка-х1м1чных уласц1васцей бялкоу бабовых рас-л1н ад ix б1ялаг1чных асабл1васцей 1 умоу вырошчвання. // Весц1 АН БССР,сер.б!ял.Н.-1981.- N 2.- С.117-122.

19. Домаш В.И.«Чехова А.Н. Изменение активности белков-ингибиторов протеиназ в растениях кормового люпина в процессе его роста и развития и в зависимости от условий выращивания.// Биохимия нуклеиновых кислот и метаболизм белка. Тез. докл.республ.конф. Мн.,1981. - С.Зб.

20. Заболотный A.M..Мироненко A.B.,Домаш В.И..Шурхай С.Ф., Роман Г.В. Биологическая ценность белка семян люпина и методы ее контроля. // Научно- ыетодол. аспекты создания высокопродукт. сортов с.х.культур. Тезисы докл. республ. конфер. Мн.,1982. - С. 105-106.

21. Домаш В.И..Чехова А.Н. О возможности использования исследований природных белков-ингибиторов протеиназ в селекции. // Там же. - С.104-105.

22. Домаш В.И.,Мироненко A.B..Чехова А.Н. .Полканова Т.П.,Хо-дорцова Л.Ф. Ценные сортооСразцы лю..ина на содержание белка и его качество. // Селекция и семеноводство.- 1983.-N.6.- С.26-27.

23. Мироненко А.В.,До,.зш В.И..Рогульченко И.В. Новое в увеличении производства растительных кормовых белков.Обз.инф. БелНИ-ИНГИ.Мн.,1983. - 48с. '

24. Журавлева Л.А.,Домаш В.И..Рогульченко И.В..Чехова А.Н., Канделинская О.Л. Белки семян люпина. // Изучение,охрана и рацио-нальн.испольа.почв и раст. ресурсов. Тез. докл. Всес.конф. Уфа, 1983. - С.152-153.

25. Домаш В.И..Рогульченко И.В..Мироненко A.B. Белки и белковые ингибиторы протеиназ семян кормового люпина. // Геном

растений. Тез.докл. каучн.конф. Черновцы,1983.- С.65-63.

26. Ломал В.И.,Чехова А.Н. Белки-ингибиторы протеиназ люцерны.// Ботаника.Мн.,1984.-В.26.-С.140-141.

27. Дороккин H.A. .Домаш В.И. .Нитиевская В.И. .Мироненко A.B., Чехова А.Н. Влияние ингибитора протеиназ из семян люпина на Fusarium oxysporum. // ДАН БССР.- 1985. - Т.29.- С.551-553.

28. Мироненко А. В.,Домаш В.И..Чехова А.Н.Белки-ингибиторы протеиназ люпина и их роль в регуляции ферментативной активности.// Тез докл.8-го Объед. симп.биохим. обществ СССР и ГДР. Рига, 1985. - 117.

29. Домао В.I.,М1раненка А.В.,Шарова З.М.,Чэхава A.M. Binxi-м1чная характарыстыка насення жоутага кармавога лубIну. // Весц1 АН БССР,сер.бIЯЛ.Н.- 1987.-N 1.- С.24-27.

30. Домзш В. I. .Шрдненка А.В.,Чэхава A.M. Б1ях1м1чная харак-тарыстшса Склковага комплексу луб1ну коУтага айчыннай i замехнай селекшл.// Весц! АН БССР.,сер.б1ял.навук.- 1987.- N 2,- С.39-42.

31. Домаа В.И..Мироненко А.В.,Чехова А.Н. О динамике и роли белков-ингибиторов протеиназ в растениях. // Молекул, механизмы регул, метаболии.процессов.- Тез. докл.,Мн.,1987.- С.60.

32. Домаш В.И., Чехова А.Н..Когловская Г.Н. .Росенкова B.C. Маст-зпанова М.В. Белковие ингибиторы протеиназ и переваримость белка In vitro зерна тритжзле. Там же. - С.50.

33. Дэмгл В.И. Природные ингибиторы протеиназ и устойчивость растений к болезням. // Физиолого-биохим.основы иммунитета к грибн.болезням.- Тез.докл. Уфа,1988,- С.28.

34. Домаш В.К. .Мироненко A.B..Рогульченко И.З..Иванцов Л.В. Белковый комплекс люпина. // Докл. BACXHM.-1989.-N9.- С. 19-23.

35. Домел В.И. .Королева О.С. .Котловская Г.Н. Содерлсание белка, активность и электрофоретический состав ингибиторсодержащей Фракции семян гороха.//Химия природн.соедин.- 1989.-н 2- С. 243247.

36. Яроиевич М. И..Мироненко A.B..Домаш В.И..Пелагейчик Т.Я. Некоторые биохимические показатели качества белка различных видов амаранта в условиях БССР. // Амарант - Тез. Всес'. раб. сов. Ленинград,1989.- С.23-24.

37. Домап В.И..Котловская Г.Н. Уровень активности ингибиторов трипсина в семенах различных с.х. -куль^^/'Тё^Йгйч^зкая и прикладная карпология: Материалы Всес.конф. - Кййяне<5. г"'Ч11тшнца,

1989.- С.116%

38. Дсмаи В. I. ,Вуснмк В.В. Актыунасць пратэачхтычкых фермен-тау i 1нг1б1тарау трыпс!ну у KaceHHi JiyöiHy у прадэссе ix паспя-вання. // Весц1 АН БССР, сер. б1ял.навук.-1990.- N3.- С.17-21.

39. Домаш В.И. Метод оценки устойчивости картофеля к фузари-озу.// Физиолого-биохимические основы иммунитета. - Тезисы докл. Всес.совещ.- Уфа,1990.- С.187.

40. Домал В.И..Свистунова О.В., Котловская Г.Н. Система "протеаза-ингибитор" прорастающих и созревающих семян люпина. // Физиология семян: формирование,прорастание,прикладные аспекты. Дуаа<бе.- 1990.- С.178-181.

41; Домап В.И. Природные ингибиторы протеиназ растений: физико-химические свойства и биологические функции. // Актуальные проблемы соЕрем. биохимии.-Минск,1991.- С.3-4.

42. Домаш В.И. Белковый ингибитор трипсина из семян люпина белого (Luplnus albus L.).// ДАН ECCP.-1991.-T.XXXY.-N 11.- С. 1039-1041.

43. Домаш В.И. Наличие белков-ингибиторов протеиназ у различных видов растений.// Достижения биотехкологкк-агропромышлен-ному комплексу.// Тезисы докл. Всес. конф. Черновцы,1991.-Т.1. - С.18.

44. Дорохкин H.A. Домаи В.И..Вельская С.К,.Новикова Л.М. Белки-ингибиторы протеиназ и .оценка устойчивости клубней картофеля к Fusarium sambucirum. // Тевиси докл. Всесоюзн.совещ. по защите раст,- Минск, 1991,- С.25.

45. Домаш В.И..Пелагейчик Т.Я..Забрейко С.А. Видовая и сортовая специфичность активности природных ингибиторов протеиназ растений.// Тег.докл. Vi съезд- Белорусского об-ва генетиков и селекц,- Горки.- 1992.- С.35.

46. Домаш В.И. Выделение и физико-химические свойства ингибитора трипсина из семян люпина белого.// Тез.докл. У1 Украинского биох.съезда.-Киев,1992.- С.118.

. 47. Домаш В.И.,Буснхк О.В..Забрейко С.А. Изменение активности иротеолитических ферментов и ингибиторов трипсина в листьях разных видов люпина в процессе его роста и развития. // Физиол. и биохимия, культурн. раст,- 1993.- N 2.- С.170-175.

48. Домаш В.И..Свистунова О.В. Изменение активности протео-литических ферментов и белков-ингибиторов протеиназ при прораста-

- за--

нии я созревании семя;! лопина.// Материалы У1 делегатского съезда Белорусского республ.ботанич. об-ва,- Минск, 1393.- С.415-416.

49. Давыденко O.P., Понятовская В.Н..Миронова Т.П.,Домаа

B. И.Перспективные образцы сои для условий Беларуси. // Селекция и семеноводство.- 1993.- К 2,- С.16-18.

50. Домая В.И, Участие белков-ингибиторов протеиназ в регуляции клето-.ного метаболизма.// Тез. докл. 111 съезда Всероссийского об-ва физиологов растений.- Санкт-Петербург. 1993.- С.96.

51. Заболотный А.И. .Гончарова Н.В..Домаш В.И. Д'евердов В.В. Львов Н.И. Аккумуляц. .г радионуклидов аварийных выпадений ЧАЭС в жизнедеятельности растений. // Тез докл. ХУ Менделеевского съезда по общей и лрикл. химии.- Минск,1993.- С.395-39?.

52. Домал B.;î. .Пелагейчик Т.Я. .Заболотный А.И. Протеиназ-но-кнгибиторная система семян растений и воздействие неблагоприятных факторов внешней среды.// Окружающая среда и здоровье. Тезисы докл.Ыэлд. конф.- Черновцы.- 1993.- - С.236.

53. Дома:: В. И. .Оабрейко С. А. ,3кмачева А.В.,Иевлева Е.В. ,Мо-CO/.OJ Б.В. Вщелгнгге и свойства ингибиторов трипсина из семян люпина желтого и унсголетнего. // Химия природн.соед.- 1993.- N 6.-

C. 879-864.

54. Кладницкая Г.В., Валуева Т.А.,Домаш В.И..Новикова Л.М., Мосолов В.В. Экзопротеазы гриба Fusariun sambucinum Fuck и их взаимодействие с ингибиторами. // Прикл.биохимия и микробиол. - 1994.- H 1.- С.21-28.

55. Домам В.И.Ермолицкая Л.В..Пелагейчик Г.Я. Локализация белкоЕ-ингибиторов протеиназ в субклеточных органеллах растений. -Тез. докл. 1 съезда Белорусского об-ва фотобиологов и биофизиков. Минск, 199'!.- С.27.

56. Заболотный А.И..Домаш В.И..Булко О.П. Влияние уровня загрязненности почв радионуклидами Чернобыльской АЭС на азотный оомен люпина желтого ( Lupinus luteus L.).// Экологический статус загрязненных радионуклидами территорий.-'Тезисы. Мевдун. совет. -Минск, 1995.- С.52.

57. Заболотный А.И..Гончарова Н.В..Домаш В.И..Шевердов В.В. Влияние аккумуляции радионуклидов аварийных выпадений ЧАЭС на фотосинтетические процессы и азотный обмен люпина желтого // Физиология и биохимия культ.раст.- 1995.-. N,3-4.- С.130-134.

58. Самерсов В.Ф.Прищепа И. А..,Дй?мащ ,В.И. Изменение акткЕнос-

ти белков-ингибиторов протеиназ в семенах зерновых культур под влиянием средстз химизации. // Защита растений.-1995.- В.18. - С.127-139.

59. Домад В,И. Природные ингибиторы протеиназ различных генетических форм растений и возможности их практического использования.// Современные проблемы генетики и селекции.- Тез. докл Респ. конф. М.~ 1995. - С.21.

60. Домаш В.И..Забрейко С.А. Белки из семян люпина многолетнего ( Lupinus polyphyllus L.) .ингибирующие активность эндогенных и экзогенных протеиназ. // Докл.АН Беларуси.-1995. Т.39.-С.70-73.

61. Домаш В.И. Белковый ингибитор трипсина из листьев люпина. // Тез.докл.11 съезда Белорусского об-ва физиологов растений. Минск.1995.- С. 95-96.

62. Домащ В.И..Бускюк 0.В..Забрейко С.А. Выделение и свойства протеолитического фермента из семян люпина желтого (Lupinus lute-us L.). Там же. - С. 96-97.

63. Домаш В.И..Янчевская Т.Г..Буснш О.В..^лыланикова А.Л., Вербицкая Н.А. Изменение активности протеаз и белковых ингибиторов в листьях люпина желтого (Lupinus iuteus L.) под действием света и влажности. Там же. - С.97-98.

64. Решетников В.Н..Заболотный А.И..Лаптева O.K..Домаш В.И. Д'евердов В.В. .Гончарова Н.В. .Сень Л.А.,Володин В.Г. Последействия радиоактивного загрязнения почв аварийными выпадениями ЧАХ для сельскохозяйственных растзкгй. '// Intern, confer. "One Decade after Chernobyl. Austria Center. Vienna. April. 1996. P.142-147.

65. Domash Y.I. Proteins - inhibitors of proteinases ( trypsin) from seeds of different lupine species. // 8th Intern. Conference "Lupin". USA. 1996.

66. Домаш В.И. Белковг^ ингибиторы протеиназ у растений и их биологические функции.// В сб. Проблемы экспериментальной ботаники. К 100-летию со дня рождения В.Ф.Купревича. 1997.- С.347-355.