Влияние низкой температуры на активность протеиназно-ингибиторной системы растений

Фролова, Светлана Анатольевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Влияние низкой температуры на активность протеиназно-ингибиторной системы растений
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Влияние низкой температуры на активность протеиназно-ингибиторной системы растений"

На правах рукописи

ии^4Ь2433

ФРОЛОВА Светлана Анатольевна

ВЛИЯНИЕ НИЗКОЙ ТЕМПЕРАТУРЫ НА АКТИВНОСТЬ ПРОТЕИНАЗНО-ИНГИБИТОРНОЙ СИСТЕМЫ РАСТЕНИЙ

03.00.04-биохимия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Петрозаводск 2008

003452433

Работа выполнена в лаборатории экологической физиологии растений Института биологии Карельского научного центра РАН

Научный руководитель: чл.-корр. РАН, доктор биологических наук,

профессор ТИТОВ Александр Федорович

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

СМИРНОВ Лев Павлович

кандидат биологических наук, доцент СУДАКОВ А Надежда Михайловна

Ведущая организация: Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН

Защита состоится «26» ноября 2008 г. в 12.00 часов на заседании Диссертационного совета ДМ 212.087.02 при Карельском государственном педагогическом университете по адресу: 185035 Республика Карелия, г. Петрозаводск, ул. Пушкинская, 17.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Карельского государственного педагогического университета.

Автореферат разослан « » октября 2008 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета кандидат медицинских наук, доцент

А.И. Малкиель

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Хорошо известно, что в период действия неблагоприятной температуры в клетках и тканях растительного организма происходят многочисленные структурно-функциональные изменения, часть из которых вовлечена в процесс формирования повышенной устойчивости (Туманов, 1979; Дроздов и др., 1984; Титов и др., 2006; Трунова, 2007). Однако имеющиеся по этому вопросу литературные данные касаются главным образом анаболических процессов и, прежде всего, синтеза стрессовых (шоковых) белков (Колесниченко, Войников, 2003; Титов и др., 2006; Guy, 1990; Antikanen, Griffith, 1997; Griffith et al., 1997; Tomashow, 1999, 2001), в то время как роль катаболических процессов почти не изучена. Между тем одна из наиболее важных современных тенденций в выяснении тонких механизмов устойчивости растений к изменениям в окружающей среде, и действию неблагоприятных температур в частности, заключается в установлении характера взаимодействия между процессами синтеза и распада белков (Тарчевский, 2001). В условиях стресса уровень «неправильно синтезированных» или поврежденных белков может достичь критических значений и вызвать гибель клетки (Колесниченко, Войников, 2003). Поэтому важную роль в обмене веществ живого организма и защите его от повреждения играют протеолитические ферменты, участвуя не только в деградации белковых молекул, но и в регуляции различных физиолого-биохимических процессов посредством реакций ограниченного протеолиза (Мосолов, 1993). Основными регуляторами активности протеиназ являются белки-ингибиторы, способные образовывать с ними стабильные комплексы и приводить к обратимому подавлению активности про-теолитических ферментов. В настоящее время установлено, что в процессах защиты растений от действия различного рода неблагоприятных факторов значительная роль принадлежит системе протеиназа-ингибитор (Мосолов, Валуева, 2008; Johnston et al., 2006). Однако роль протеиназно-ингибиторной системы в адаптации растений и формировании повышенной холодоустойчивости почти не изучена.

Цель и задачи исследований. Цель настоящей работы - изучение активности протеиназно-ингибиторной системы растений в условиях действия низких закаливающих и повреждающих температур и определение ее возможной роли в механизмах устойчивости растений.

Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи:

> изучить динамику активности амидаз, цистеиновых протеиназ, а также ингибиторов сериновых протеиназ (ингибиторов трипсина) у растений при действии на них низких температур;

> провести сравнительный анализ активности протеиназ и ингибиторов протеолитических ферментов в начальный период действия на растения низких закаливающих и повреждающих температур;

> изучить динамику активности протеолитических ферментов и ингибиторов протеиназ в последействии низкой закаливающей температуры;

> исследовать влияние экзогенных гормонов (АБК, цитокинина) на активность протеиназно-ингибиторной системы растений при действии низких закаливающих температур;

> исследовать экспрессию генов протеолитических ферментов и их ингибиторов в процессе формирования повышенной холодоустойчивости растений.

Научная новизна работы. Впервые изучена динамика активности амидаз, цистеиновых протеиназ и ингибиторов трипсина в период действия и в последействии низкой закаливающей температуры, а также показана их роль в механизмах формирования повышенной холодоустойчивости растений. Установлены различия в динамике активности протеиназ и ингибиторов трипсина в начальный период действия на растения низких закаливающих и повреждающих температур. Показано влияние экзогенных фитогормонов (АБК, цитокинина) на изменение активности протеиназно-ингибиторной системы и формирование повышенной холодоустойчивости растений. Получены новые данные об экспрессии генов с1рР и 1оп1, а также генов цистеиновых протеиназ (ф) и их ингибиторов в процессе холодового закаливания растений.

Практическая значимость работы. Полученные экспериментальные данные дополняют и расширяют современные представления о роли протеолитических ферментов, ингибиторов протеиназ и их генов в адаптации растений к действию неблагоприятных факторов внешней среды и, в частности, низкой температуры. Данная информация может найти применение в физиолого-био-химических и селекционно-генетических исследованиях, направленных на повышение устойчивости растений и разработку методов ее диагностики. Основные положения работы могут быть использованы при чтении спецкурсов по экологической биохимии, частной энзимологии, а также физиологии устойчивости растений.

Апробация работы. Основные результаты диссертации были представлены и обсуждались на конференции «Структурные особенности биосистем Севера (особи, популяции, сообщества) (Петрозаводск, 2005), Международной научной конференции «Вопросы общей ботаники: традиции и перспективы», посвященной 200-летию Казанской ботанической школы (Казань, 2006), Шко-

ле для студентов и молодых ученых «Физиология растений - фундаментальная основа современной агробиотехнологии» (Ростов на Дону, 2006), Международной конференции, посвященной 60-летию КарНЦ РАН «Северная Европа в XXI веке: природа, культура, экономика» (Петрозаводск, 2006), VI Симпозиуме «Химия протеолитических ферментов» (Москва, 2007), VI Съезде Общества физиологов растений (Сыктывкар, 2007), Молодежной научной конференции «Геосферно-биосферные взаимодействия, биоразнообразие и состояние биосистем в высоких широтах» (Апатиты, 2007), Всероссийской конференции «Фундаментальные и прикладные проблемы ботаники в начале XXI века» (Петрозаводск, 2008).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 15 работ, в том числе 2 статьи в рецензируемых журналах.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 132 страницах, содержит 2 таблицы, 31 рисунок. Работа состоит из следующих разделов: введения, обзора литературы, описания методов исследования, результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы, содержащего 302 наименования, в том числе 224 на иностранном языке.

Благодарности. Автор выражает глубокую и искреннюю признательность своим учителям и наставникам: научному руководителю чл.-корр. РАН, д.б.н. А.Ф. Титову, чл.-корр. РАН, д.б.н. H.H. Немовой, а также сотрудникам лаборатории экологической физиологии растений Института биологии КарНЦ РАН. Самые теплые слова благодарности к.б.н. Е.В. Иевлевой за всестороннюю помощь, ценные советы и рекомендации, а также сотрудникам группы молекулярной биологии Института биологии КарНЦ РАН к.б.н. JI.B. Топчиевой и к.б.н. И.Е. Малышевой за помощь в постановке экспериментов.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Исследования проводили на 7-дневных проростках озимой пшеницы (Triíicum aestivum L.) сорта Московская 39 и огурца (Cucumis sativus L.) сорта Зозуля. Выбранные виды растений характеризуются разным отношением к температурному фактору: пшеница относится к группе холодостойких видов, а огурец - к группе теплолюбивых.

Растения выращивали в рулонах фильтровальной бумаги на питательном растворе Кнопа (pH 6.2-6.4) с добавлением микроэлементов в камере искусственного климата при температуре воздуха 22-25°С, его относительной влажности 60-70%, освещенности около 10 клк и 14-часовом фотопериоде. При

достижении недельного возраста проростки пшеницы подвергали действию температур 5, 10 или 15°С, а проростки огурца - 5 и 10°С (при неизменных прочих условиях).

О холодоустойчивости проростков судили по реакции клеток высечек из листьев на 5-мин промораживание в термоэлектрическом микрохолодильнике (Балагурова и др., 1982). В качестве критерия холодоустойчивости использовали температуру гибели 50% паренхимных клеток (ЛТ50), определяемую по деструкции хлоропластов и коагуляции цитоплазмы.

В ряде опытов использовали фитогормоны: цитокинин в форме 6-безила-минопурина (БАП) и абсцизовую кислоту (АБК), концентрации которых были выбраны на основании предыдущих исследований, проведенных в лаборатории (Титов и др., 1981, 1985, 1986). Растения помещали на растворы БАП и АБК за сутки до начала холодового воздействия.

Амидазную активность определяли с помощью метода Эрлангера с соавт. (Erlanger et al.,1961), используя синтетический субстрат - БАПА (Ыа-бензоил-БЬ-аргинин-Д-нитроанилида гидрохлорид).

Активность цистеиновых протеиназ определяли по модифицированному методу Кунитца (Sgarbieri et al., 1964).

Ингибиторную активность оценивали по подавлению активности ферментов (Morichara et al., 1967).

Уровень экспрессии генов clpP, Ion], а также генов цистеиновых протеиназ (ср) и их ингибиторов анализировали методом ПЦР в режиме реального времени. Амплификацию проводили в приборе iQ5 (Био-Рад).

Биологическая повторность в пределах одного варианта опыта при анализе холодоустойчивости и активности ферментов - 6-кратная (каждый опыт повторяли 3-5 раз), а при анализе экспрессии генов - 2-кратная. Математическую обработку данных проводили с помощью общепринятых методов вариационной статистики (расчет средних арифметических значений и их стандартных ошибок, оценка достоверности различий - на основании критерия Стью-дента), используя программу Microsoft Excel. На рисунках приведены средние значения по 2-5 независимым опытам и средние квадратичные ошибки. В работе обсуждаются величины, достоверные при Р<0.05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

1. Влияние низкой закаливающей температуры на холодоустойчивость и активность протеиназно-ингибиторной системы растений

Проведенные нами опыты, в которых проростки озимой пшеницы морозостойкого сорта Московская 39 подвергали действию различных закаливаю-

щих температур (5,10 и 15°С), показали, что под их влиянием холодоустойчивость пшеницы возрастает с неодинаковой скоростью (табл. 1). Так, при действии температуры 5°С устойчивость проростков начинала увеличиваться уже через 1 ч от начала холодового воздействия, а к концу 3-х сут достигала своего максимального значения, сохраняясь в дальнейшем неизменной. Температуры 10 и 15°С не вызывали изменений холодоустойчивости в первые двое суток закаливания, а через 4 сут она достигала при 10°С примерно 80% от максимального уровня, а при 15°С - около 60%. Таким образом, наибольшая скорость холодового закаливания, как и ожидалось, отмечена при действии на проростки пшеницы температуры 5°С.

Таблица 1

Динамика повышения устойчивости при холодовом закаливании проростков пшеницы

Температура Холодоустойчивость, % от максимального прироста

продолжительность закаливания, сут

1 2 3 4 5 7

5°С 81 97 100 100 100 100

10°С 0 0 70 83 95 100

15°С 0 0 0 60 72 100

Наряду с этим установлено, что в листьях проростков пшеницы, подвергнутых действию низких закаливающих температур (5, 10 и 15°С), происходят определенные изменения активности амидаз, цистеиновых протеиназ и ингибиторов трипсина, зависящие от интенсивности низкотемпературного воздействия.

В целом, изменения активности амидаз и цистеиновых протеиназ имели сходную динамику. В частности, в начальный период холодового воздействия их активность увеличивалась в первые часы - при 5°С, и в первые сутки - при 10°С (рис. 1,2). Последующее действие закаливающей температуры приводило к некоторому снижению активности ферментов. При достижении максимального уровня холодоустойчивости амидазная активность продолжала уменьшаться, достигая значений, характерных для контрольных растений того же возраста (рис. 1), тогда как активность цистеиновых протеиназ сохранялась на уровне в 1.5-2 раза превышающем таковой у растений контрольного варианта (рис. 2).

Под влиянием закаливающей температуры 15°С (для пшеницы она близка к границе между зонами холодового закаливания и фоновой) происходило синхронное снижение амидазной активности как у контрольных, так и у опытных растений (рис. 1). Однако закаленные проростки по сравнению с контрольными того же возраста характеризовались более высокими значениями

амидазной активности (до момента выхода холодоустойчивости на постоянный уровень). Следует отметить, что достоверные различия в уровне активности амидаз у опытных растений по сравнению с контрольными наблюдались через 24 ч закаливания (т.е. за 2 сут до появления статистически достоверного прироста холодоустойчивости в данных условиях). В этих же условиях активность цистеиновых протеиназ лишь незначительно увеличивалась через 72 ч закаливания (рис. 2), а затем плавно снижалась, достигая к концу эксперимента значений на 10-15% превышающих таковые у контрольных проростков пшеницы.

3.5

2,5

0,5

105С

0 1 5 24 48 72 96 16 Экспозиция, ч

§ Ь

н ^ gg

В S-

ю-с

1 5 24 48 72 96 120 168 Экспозиция, ч

Рис. 1. Влияние температуры 5, 10, 15 25°С на амидазную активность проростков пшеницы

Рис. 2. Влияние температуры 5, 10, 15 и 25°С на активность цистеиновых протеиназ проростков пшеницы

Таким образом, в результате проведенных исследований установлено, что повышение активности амидаз и цистеиновых протеиназ происходит в начальный период действия на растения пшеницы низкой закаливающей температуры (независимо от ее интенсивности), и оно предшествует росту холодоустойчивости. Полученные результаты соответствуют представлениям о том, что изменение нормальных условий жизнедеятельности сопровождается, прежде всего, усилением протеолитических процессов (Локшина, 1993; Тарчев-ский, 2001; Lensch et al., 2001; Zakharov et al„ 2004; Johnston et al„ 2006). Вероятно, контролируя концентрацию белков и пептидов, амидазы и цистеиновые протеиназы участвуют в модификации и устранении биополимеров, уже невыполняющих (или выполняющих не в полной мере) необходимые организму функции, а также обеспечивают клетку мономерными субстратами для синтеза стрессовых (шоковых) белков, которые, как показано многими авторами

(Титов, 1989; Кузнецов, 1992; Войников и др., 2004; Титов и др., 2006; Трунова, 2007), участвуют в формировании повышенной устойчивости клеток.

Активность ингибиторов трипсина в течение первых двух суток холодо-вого закаливания увеличивалась одновременно с ростом устойчивости, тогда как последующее действие температуры 5°С приводило к снижению остаточной протеолитической активности (рис. 3).

Под влиянием температуры 10°С увеличение активности ингибиторов трипсина происходило уже в течение первых суток закаливания и предшествовало росту холодоустойчивости. При достижении устойчивости максимума активность ингибиторов снижалась, достигая уровня контрольных (не подвергавшихся закаливанию) растений того же возраста. При действии температуры 15°С остаточная протеолити-ческая активность по отношению к трипсину увеличивалась на 3-й сут закаливания проростков пшеницы, оставаясь в дальнейшем на достигнутом уровне. Отмеченное в процессе повышения устойчивости увеличение активности ингибиторов трипсина определяется их способностью обратимо связывать ферменты и переводить их в неактивное состояние (Мосолов, Валуева, 1993). Таким образом, выступая в качестве регуляторов активности протеиназ, ингибиторы трипсина предотвращают преждевременный распад вновь синтезированных белков, тем самым, поддерживая процесс формирования повышенной устойчивости.

Опыты, в которых проростки огурца подвергались действию низкой закаливающей температуры (10°С), показали, что повышение холодоустойчивости клеток листа происходит не сразу, а по истечении некоторого времени (рис. 4). Указанный лаг-период, т.е. период времени, в течение которого устойчивость растений достоверно не увеличивалась, составил примерно 8 ч. Последующее воздействие температуры 10°С вызывало увеличение устойчивости, которая достигала своего максимального уровня на 4-е сут закаливания.

В процессе повышения холодоустойчивости в листьях огурца активность цистеиновых протеиназ сохранялась на уровне, характерном для 7-дневных

Экспозиция, ч

Рис 3. Влияние температуры 5, 10, 15 и 25°С на активность ингибиторов трипсина проростков пшеницы

1.6

0.8

0,4

3,2

1 2'4

Ï Ь6 В

| 0,8

о.

0,0

й s

0,15

3 0,12 ю

I °'°9 g 0,06 5

fr 0,03 s

0,00

ftl

6. à

s 3

d. fc-

С p

0 8 24 48 72 96 120 144 168

s ®

OC S

0 24 48 96 120 144 168 Экспозиция при Ю°С, ч

-Pue. Влияние температуры 10°C на активность амидаз (А), цистеиновых протеи-наз (Б) и ингибиторов трипсина (В) проростков огурца (1 - закалка, 2 - контроль, 3 -холодоустойчивость)

проростков (рис. 4Б), который, однако, превышал таковой у контрольных растений того же возраста.

Важно, что изменения активности амидаз и ингибиторов трипсина в целом имели сходную динамику: в течение первых суток хо-лодового закаливания их активность резко снижалась в 1.5 раза -для амидаз (рис. 4А) и в 2 раза -для ингибиторов трипсина (рис. 4В). Еще через сутки активность вышеуказанных показателей возвращалась к исходным значениям (до начала холодового закаливания), а к моменту выхода холодоустойчивости на постоянный уровень активность ингибиторов трипсина снижалась, достигая значений, характерных для контрольных растений того же возраста, тогда как активность амидаз к концу эксперимента была несколько выше, чем в контроле.

Необходимо отметить некоторые особенности изменения активности протеолитических ферментов в процессе низкотемпературной адаптации холодостойких (пшеница) и теплолюбивых (огурец) растений. В частности, в начальный период роста холодоустойчивости было отмечено уве-

личение амидазнои активности, в то время как при выходе устойчивости на плато активность указанных ферментов снижалась, достигая в большинстве случаев величин, характерных для контрольных (не подвергавшихся температурному воздействию) растений. Вместе с тем, повышенный уровень активности цистеиновых протеиназ можно было наблюдать на протяжении всего

процесса закаливания, что, вероятнее всего, свидетельствует об их участии в процессах, связанных не только с ростом холодоустойчивости, но и поддержанием ее на повышенном уровне как у холодостойких, так и у теплолюбивых растений.

Таким образом, в процессе формировании повышенной холодоустойчивости как холодостойких (пшеница), так и теплолюбивых (огурец) растений увеличение активности амидаз, цистеиновых протеиназ, и ингибиторов трипсина предшествует по времени росту их холодоустойчивости. Возрастающая активность протеолитических ферментов в начальный период воздействия низкой температуры вызывает распад белков в растениях и, вероятно, протеи-назы, участвуя в модификации белков и пептидов, контролируют концентрацию биополимеров, необходимых для жизнедеятельности растений в новых температурных условиях. Усиление активности ингибиторов протеиназ, регулирующих активность ферментов, в свою очередь, предотвращает преждевременный распад белков, синтезированных de novo, обеспечивая тем самым поддержание повышенного уровня холодоустойчивости.

2. Активность протеиназно-ингибиторной системы растений в начальный период действия закаливающих и повреждающих температур

В начальный период действия на растения не только закаливающих, но и повреждающих температур устойчивость некоторых клеточных функций может увеличиваться, по крайней мере, до тех пор, пока доза температурного воздействия не достигнет определенного порогового уровня, вызывающего появления серьезных структурно-функциональных нарушений (Alexandrov et al., 1990). С другой стороны, достаточно продолжительное действие повреждающих температур на растения вызывает снижение их устойчивости, нарушение многих функций и повреждение различных внутриклеточных структур, что в конечном итоге приводит к гибели клеток, тканей и организма (Титов и др., 2006).

Результаты наших опытов показали, что под влиянием низкой повреждающей температуры (5°С) холодоустойчивость проростков огурца снижалась на протяжении всего периода ее действия. Одновременно с этим происходило увеличение активности цистеиновых протеиназ, отмечаемое уже через 15 мин (рис. 5Б) от начала холодового воздействия. Амидазная активность также увеличивалась (рис. 5А), однако рост ее наблюдался несколько позже - через 3 ч. Активность ингибиторов трипсина уже через 15 мин экспонирования проростков огурца при 5°С увеличивалась в 2.5 раза, а затем на протяжении всего эксперимента постепенно снижалась (рис. 5В).

200

100

9 120 Ш>

250 г

200

£ <

Экспозиция, мин

Рис 5. Динамика активности амидаз (А), шгстеи-новых протеяназ (Б) и ингибиторов трипсина (В) проростков огурца при действии низкой закаливающей (1) и повреждающей (2) температур

Очевидно, что увеличение активности амидаз и цистеино-вых протеиназ свидетельствует о начавшихся уже в первые часы действия низкой повреждающей температуры деструктивных процессах, которые необходимо блокировать и обеспечить восстановление нарушенных или поврежденных структур и функций. Вероятно, именно на это и направлено наблюдаемое в первые минуты повреждения увеличение активности ингибиторов протеиназ. Последующее увеличение активности протеиназ и снижение активности ингибиторов трипсина, уже не справляющихся в данных условиях с нарастающим влиянием протеолиза, сопровождается снижением холодоустойчивости растений, разрушением различных клеточных структур, которое в конечном итоге приводит к гибели клеток, тканей и организма в целом.

В результате сравнительного анализа изменений, возникающих в клетках огурца под влиянием низкой закаливающей (10°С) и повреждающей (5°С) температур, было установлено, что активность амидаз у растений в первые 2 ч охлаждения практически не отличалась, тогда как дальнейшее действии температуры 5°С вызывало значительное (в 2 раза) ее увеличение (рис. 5А). С другой стороны, в начальный период действия закаливающих и

повреждающих температур были выявлены существенные различия в активности цистеиновых протеиназ и ингибиторов трипсина. В частности, уже через 15 мин воздействия повреждающей температуры активность цистеиновых протеиназ значительно превышала таковую в условиях закаливания (рис. 5Б), а активность ингибиторов трипсина была в 2.5 раза выше при действии закаливающей температуры (рис. 5В). Таким образом, амплитуда изменений активности протеолитических ферментов и ингибиторов трипсина при холо-довом повреждении растений гораздо выше, чем в условиях низкотемпературного закаливания.

3. Динамика активности протеиназно-ингибиторной системы растений в последействии низкой закаливающей температуры

Как известно, при благоприятных условиях в последействии низких закаливающих температур происходит снижение устойчивости - раззакалива-ние растений (Титов и др., 2006).

В наших экспериментах при возврате проростков пшеницы закаленных в течение 7 сут при температуре 5°С в исходные условия (25°С) наблюдалось снижение их устойчивости. Так, через 24 ч после прекращения воздействия на растения низкой закаливающей температуры их холодоустойчивость начинала снижаться, достигая исходного уровня на 7-е сут (рис. 6).

6 г 1-10 4 Г- 1-10

Экспозиция при 25°С. ч Экспозиция при 25"С. и

Рис. 6. Динамика активности амидаз (А) и цистеиновых протеиназ (Б) проростков пшеницы после их холодового закаливания (5°С х 7 сут) (/- холодоустойчивость)

Наряду с этим у проростков пшеницы наблюдались определенные изменения активности протеолитических ферментов и ингибиторов протеиназ. Например, амидазная активность уже через 5 ч после возвращения проростков в исходные условия увеличивалась (рис. 6А), в течение последующих суток достигала своего максимума и далее постепенно снижалась. При возврате

закаленных растений пшеницы в обычные условия (25°С) активность цистеи-новых протеиназ в течение первых суток раззакаливания возрастала в 1.5 раза, сохраняясь на данном уровне еще 2 сут и далее продолжала до конца эксперимента снижаться (рис. 6Б).

При раззакаливании растений пшеницы активность ингибиторов трипсина, в отличие от активности амидаз и цистеиновых протеиназ, не изменялась.

Из литературы известно, что при возвращении температуры к обычным (нормальным) значениям наряду со снижением холодоустойчивости в клетках и тканях растений происходят существенные изменения в синтезе белков. В частности, синтез стрессовых белков резко тормозится или полностью прекращается, а синтез обычных белков, характерных для физиологически нормальных температур, восстанавливается (Колесниченко, Войников, 2003; Титов и др., 2006). Наши данные об увеличении активности амидаз и цистеиновых протеиназ в начальный период раззакаливания проростков пшеницы подтверждают предположение об участии протеолитических ферментов в образовании, модификации и/или инактивации ряда белков при возврате температуры к обычным (фоновым) значениям.

Вместе с тем, учитывая, что в последействии низкой закаливающей температуры изменений активности ингибиторов трипсина обнаружено не было, логично думать, что при возвращении растений в условия физиологически нормальной температуры на фоне снижения активности протеолитических ферментов регуляторная функция белков-ингибиторов отходит на второй план. И в этом случае они, скорее всего, играют роль запасных белков.

4. Влияние экзогенных гормонов на активность протеиназно-ингибиторной системы растений при действии низкой закаливающей температуры

Абсаизовая кислота В результате проведенных экспериментов с применением экзогенной АБК установлено, что она способствует увеличению холодоустойчивости клеток листа. Так, предобработка проростков пшеницы АБК перед началом воздействия низкой закаливающей температуры приводила к дополнительному увеличению холодоустойчивости: уже к концу первых суток от начала температурного воздействия она достигала уровня, превосходящего значения, характерные для варианта «закаливание без АБК».

Следует отметить, что через 24 ч после обработки растений раствором АБК активность цистеиновых протеиназ была в 2 раза меньше, чем у контрольных растений, а активность амидаз и ингибиторов трипсина превышала таковые в контроле в 2-3 раза.

2 / Ь г г£ «1 £

{ 1 Пп

О 1 5 24 48 72 96 168

^ 5 0.2

лл

-11 ■10

-8

2 ?

-7

-б | х

-5

11 III 9 ё 8 1 ; 7 Р.

-т ■ 6 | X

5 4

24 48 72 % 168

О I 5 24 48 72 96 168 Экслоэииия при 5°С, ч

Рис. 7. Влияние экзогенной АБК (Ю^М) на активность амидаз (А), цистеиновых протеиназ (Б) и ингибиторов трипсина (В) проростков пшеницы при низкотемпературном закаливании (/ -закаливание+АБК, 2 - закаливание без АБК, 3 -устойчивость)

через 1-8 ч воздействия низкой закаливающей цы содержание эндогенной АБК возрастает,

В процессе холодового закаливания у растений, подвергшихся предварительной обработке АБК, изменения амидазной активности имели сходную динамику, что и у растений закаленных без АБК (рис. 7А). Важно, что уже через 1 ч после начала низкотемпературного воздействия у предобрабо-танных АБК проростков пшеницы активность амидаз снижалась в 1.5 раза и сохранялась на достигнутом уровне в течение последующих суток. В первые часы воздействия низкой закаливающей температуры активность цистеиновых протеиназ у проростков, обработанных АБК, практически не менялась, через 1 сут резко увеличивалась, а к концу эксперимента снижалась (рис. 7Б). Активность ингибиторов трипсина в начальный период закаливания несколько уменьшалась, в течение следующих суток на порядок увеличивалась, а к концу эксперимента снова снижалась, достигая значений, характерных для контрольных растений того же возраста (рис. 7В).

Литературные данные свидетельствуют, что уже температуры в листьях пшени-несколько снижается к концу

первых суток, затем продолжает увеличиваться (в течение 3-4 сут), и далее постепенно возвращается к исходной величине, в то время как устойчивость сохраняется на достигнутом уровне (Таланова и др., 1991). Вероятно, увеличение активности цистеиновых протеиназ и ингибиторов трипсина в более поздние периоды адаптации связано с накоплением в растениях АБК, индуцирующей синтез стрессовых белков.

В наших экспериментах показано, что на начальном этапе действия низкой закаливающей температуры на фоне постепенного роста холодоустойчивости у проростков пшеницы, предобработанных АБК, по сравнению с контрольными растениями того же возраста отмечается повышенное содержание амидаз и пониженное - цистеиновых протеиназ и ингибиторов трипсина. В дальнейшем, при достижении устойчивости максимальных значений активность амидаз постепенно снижается, а активность цистеиновых протеиназ и ингибиторов трипсина повышается. Вероятно, указанные изменения связаны с комплексом событий, связанных с синтезом и распадом белка в метках растений при действии неблагоприятных температур, часть из которых направлена на формирование устойчивости, а другая - на поддержание ее повышенного уровня. Поэтому, вполне логично, что АБК может влиять на холодоустойчивость растений к низкой температуре посредством изменения активности про-теолитических ферментов и главных регуляторов их деятельности - белковых ингибиторов.

Цитокинин. Природные цитокинины и их синтетические аналоги оказывают значительное влияние не только на деление, рост и дифференцировку клеток (Полевой, 1982; Кулаева, Кузнецов, 2002), но и на физиологические реакции растений, связанные с воздействием на них неблагоприятных факторов среды, включая экстремальные температуры (Hare et al., 1997).

В наших опытах показано, что спустя 24 ч после обработки растений озимой пшеницы БАП (2мг/л) в их листьях активность амидаз, цистеиновых протеиназ и ингибиторов трипсина была в 1.2, 2 и 4 раза, соответственно, выше по сравнению с контролем.

При последующем холодовом закаливании (5°С) в присутствии БАП скорость и величина прироста холодоустойчивости проростков пшеницы заметно превышали таковые в контрольном варианте (закаливание без БАП). Кроме того, в первые двое суток холодового закаливания активность амидаз у растений была в 1.5-2 раза меньше, чем у растений закаленных без БАП, а спустя трое суток действия низкой температуры активность изучаемых ферментов увеличивалась и сохранялась на достигнутом уровне до конца эксперимента (рис. 8А).

Уже в первые часы закаливания в листьях пшеницы наблюдались значительные изменения в активности цистеиновых протеиназ. В частности, через

9 I

Я I '

7 | |

6 I

-5 -4

-II

-10 -9

-К , -7 -6 -5

0,00

___А - -

-II -10 -9 -8 -7 -6 -5 -4

1 5 24 46 Экспозиция при 5°С, >

Рис. 8. Влияние БАП (2 мг/л) на активность ами-даз (А), цистеиновых протеиназ (Б) и ингибиторов трипсина (В) проростков пшеницы при низкотемпературном закаливании (1 - закаливание+БАП, 2 - закаливание без БАП, 3-устойчивость)

объяснить стимулирующим влиянием цитокининов на биосинтез белков (в том числе стрессовых) и, соответственно, на ряд физиолого-биохимических процессов прямо или опосредованно участвующих в поддержании структур-

30 мин она снижалась в 2.5 раза, в течение последующих 30 мин увеличивалась в 2 раза, через 48 ч постепенно снижалась, и далее увеличивалась, достигая к 3-м сут закаливания значений, характерных для проростков, закаленных без БАП (рис. 8Б).

Активность ингибиторов трипсина у проростков, закаленных в присутствии БАП, постепенно снижалась в первые 2 сут, еще через 1 сут увеличивалась в 5 раз, оставаясь до конца эксперимента на уровне, превышающим таковой у контрольных растений (рис. 8В).

Интересно отметить, что через 3-е сут холодового закаливания после непродолжительного снижения активность как ингибиторов трипсина, так и протеолити-ческих ферментов увеличивалась, достигая значений, характерных или несколько превышающих таковые у контрольных растений того же возраста.

Из литературы известно, что увеличение устойчивости растений к действию неблагоприятных температур под влиянием БАП можно

но-функциональной целостности клеток в процессе адаптации (Шакирова, 2001; Титов и др., 2006).

В наших экспериментах показано, что действие цитокинина на растения вызывало увеличение активности амидаз, цистеиновых протеиназ и ингибиторов трипсина до начала холодового воздействия, тогда как в процессе закаливания цитокинины ингибировали распад белков (посредством снижения активности протеиназ и увеличения активности ингибиторов протеолитиче-ских ферментов).

Таким образом, цитокинины создают благоприятную обстановку для биосинтеза белков, запуск которого является следствием изменения температуры окружающей среды с физиологически нормальной на закаливающую. В отличие от этого, в начальный период действия на растения низкой закаливающей температуры цитокинины, вызывая снижение активности амидаз и цистеиновых протеиназ и увеличение активности ингибиторов трипсина (по сравнению с контролем), вероятно, оказывают защитный эффект на бело-ксинтезирующий аппарат клеток, который проявляется в предотвращении его деградации в условиях воздействия неблагоприятных факторов.

Полученные результаты позволяют сделать вывод о том, что наиболее существенные изменения в активности протеиназно-ингибиторной системы под влиянием АБК и цитокининов происходят сразу после обработки гормонами проростков пшеницы, т.е. до начала холодового воздействия. Поскольку экзогенные АБК и цитокинины способны в отсутствии стресс-факторов вызывать экспрессию генов шоковых (стрессовых) белков (Robertson et al., 1994; Jackson, 1997; Pareek et al., 1997; Шакирова, 2001), то можно предположить, что обнаруженное в данной работе увеличение активности амидаз направлено на изменение спектра белков, синтезируемых в этот период, и способствующих дальнейшему повышению устойчивости. Ингибиторы трипсина, выступая в данном случае в качестве регуляторов активности протеиназ, предотвращают преждевременный распад вновь синтезированных белков и поддерживают тем самым процесс формирования повышенной устойчивости.

5. Экспрессия генов протеолитических ферментов и ингибиторов протеиназ при холодовом закаливании растений

Адаптация растений к неблагоприятной температуре сопровождается экспрессией большого числа генов (Колесниченко, Войников, 2003). В наших опытах по определению экспрессии генов протеиназ и их ингибиторов уже в начальный период холодового закаливания одновременно с ростом холодоустойчивости в листьях проростков пшеницы происходило достаточно быстрое (через 0.5 ч) увеличение уровня экспрессии гена ср, кодирующего цис-

теиновую протеиназу (рис. 9А). При более продолжительном низкотемпературном воздействии (1-3 сут) содержание мРНК гена ср постепенно снижалось, а через 4 сут (при достижении холодоустойчивости своего максимума) возвращалось к исходному уровню (25°С).

ñ п

0,25 0,5 1 5 24 48 72 S»6 I6X

0.25 0,5 I 5 48 72 46 168

025 OÍ I 5 24 48 72 96 168 Экспозиция при 5°С. ч

ГО

frí

0.25 0.5 I 5 24 48 72 96 16« Эксиошишм при 5°С, ч

Рис. 9. Влияние температуры 5°С на холодоустойчивость (1) и экспрессию генов ср (А), генов ингибиторов цистеиновых протеиназ (В), Ion! (Б) и с!рР (Г) генов проростков пшеницы (уровень экспрессии у растений контрольного варианта (25°С) принят за единицу•)

Аналогичные изменения наблюдались и в экспрессии гена lonl (рис. 9Б), кодирующего Lon протеиназы, которые локализованы, главным образом, в митохондриях и тилакоидах хлоропласгов и участвуют в деградации белков с участием АТФ. Вероятно, наблюдавшееся в наших опытах снижение экспрессии lonl гена до исходного уровня уже на 2-е сут закаливания можно рассматривать как свидетельство начавшихся процессов стабилизации белковых комплексов в клеточных органеллах и адаптации растений к низкой температуре, в целом.

В наших опытах также установлено, что действие низкой закаливающей температуры сопровождается быстрой (через 30 мин) экспрессией clpP гена, которая предшествует росту холодоустойчивости растений (рис. 9Г). Вместе с тем, полученные данные показывают, что экспрессия гена clpP, кодирующего ClpP протеиназу хлоропластов, носит транзитный характер: ее уровень

значительно снижается, когда устойчивость начинает расти, затем на 2 сут закаливания вновь увеличивается и далее достигает своего исходного уровня одновременно с выходом холодоустойчивости на плато. Характер изменений экспрессии данного гена подтверждает его возможное участие в регуляции протеолиза белков хлоропластов не только на самых ранних этапах холодо-вой адаптации, но и при пролонгированном действии низкой температуры.

Таким образом, в наших экспериментах установлено, что в процессе хо-лодового закаливания происходит достаточно быстрое и значительное (в 2-4 раза) увеличение уровня экспрессии генов АТФ-зависимых {lonl и clpP) и цистеиновых протеиназ, которое предшествует росту холодоустойчивости проростков пшеницы. Поэтому можно предположить, что повышение устойчивости в первые минуты и часы охлаждения связано с активацией экспрессии этих генов, которая, вероятнее всего, направлена на увеличение активности протеолитических ферментов, участвующих в деградации и модификации белков, утративших в изменившихся условиях свои функции. В результате протеиназы обеспечивают клетку мономерными субстратами для синтеза de novo белков, необходимых для формирования повышенной холодоустойчивости клеток.

В то же время содержание транскриптов гена, кодирующего ингибитор цистеиновой протеиназы, увеличивалось через 0.5 ч закаливания (рис. 9В), достигая своего максимального значения через 5 ч холодового воздействия, а через 1 сут снижалось и в дальнейшем практически не изменялось. Полученные нами и имеющиеся в литературе данные об усилении экспрессии генов ингибиторов цистеиновых протеиназ приводят к мысли об их возможном участии в регуляции активности протеолитических ферментов и предотвращении распада вновь синтезированных белков на начальных этапах действия на растения низкой закаливающей температуры.

Следует также отметить, что по мере роста холодоустойчивости (через 2 сут охлаждения) изменения в экспрессии генов clpP, lonl, ср и генов, кодирующих фитоцистатины, становятся менее значительными, а при достижении устойчивости своих максимальных значений, уровень экспрессии изучаемых генов возвращается к исходным значениям. Отсюда следует, что наиболее важные изменения в экспрессии генов протеолитических ферментов и их ингибиторов происходят именно в первые часы воздействия холода и, по-видимому, являются частью тех изменений, которые и приводят, в конечном счете, к повышению устойчивости растений.

выводы

1. Холодовое закаливание холодостойких (пшеница) и теплолюбивых (огурец) растений сопровождается увеличением активности амидаз, цис-теиновых протеиназ и ингибиторов трипсина в тканях листа, которое предшествует росту их холодоустойчивости. Важно, что увеличение ами-дазной активности наиболее выражено на начальном этапе (часы) охлаждения и способствует повышению устойчивости, тогда как активность цистеиновых протеиназ увеличивается и в более поздние (сутки) периоды адаптации, участвуя в поддержании холодоустойчивости на повышенном уровне.

2. Действие низкой повреждающей температуры вызывает увеличение активности протеиназ и уменьшение активности ингибиторов трипсина и приводит к снижению холодоустойчивости и последующей гибели растений. В условиях температурного повреждения протеиназы играют первостепенную роль в необратимых (деструктивных) процессах катаболизма, тогда как в начальный период холодового закаливания протеолити-ческие ферменты и их ингибиторы выполняют, главным образом, регуля-торную функцию, тесно связанную с адаптацией растений.

3. В последействии низкой закаливающей температуры увеличение активности амидаз и цистеиновых протеиназ, участвующих в деградации и модификации неактивных белков, предшествует снижению холодоустойчивости растений. Существенных изменений в активности ингибиторов трипсина в процессе раззакаливания не обнаружено.

4. Обработка растений экзогенными фитогормонами оказывает заметное влияние на динамику активности протеиназ и ингибиторов, как до охлаждения, так и в процессе холодового закаливания. При этом изменения активности амидаз, цистеиновых протеиназ и ингибиторов трипсина зависят от типа гормона и способствуют повышению исходного уровня устойчивости, а также скорости ее прироста (при действии АБК) или дополнительному ее увеличению (при действии цитокинина) при холодовом закаливании растений.

5. В процессе холодового закаливания происходит усиление экспрессии генов АТФ-зависимых протеиназ (с!рР и 1оп1), а также генов, кодирующих цистеиновую протеиназу (ср) и ингибитор цистеиновой протеиназы, которое предшествует росту холодоустойчивости проростков пшеницы. При достижении растениями максимальной устойчивости содержание в клетках их листьев транскриптов указанных генов возвращается к исходному уровню.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Венжик Ю.В., Фролова СЛ., Титов А.Ф. Взаимосвязь функциональных и структурных изменений клетки в процессе адаптации растений к низким температурам // Структурно-функциональные особенности биосистем Севера (особи, популяции, сообщества): Материалы конференции. Ч. 1. Петрозаводск, 2005. С. 74-78.

2. Фролова С.А., Венжик Ю.В , Титов А.Ф. Особенности формирования устойчивости при холодовом закаливании разных сортов озимой пшеницы // Вопросы общей ботаники: традиции и перспективы. Материалы международной конференции. Казань, 2006. С. 164-165.

3. Фролова С А, Амидазная активность проростков пшеницы при низкотемпературном закаливании // Физиология растений - фундаментальная основа современной агробиотехнологии. Школа для студентов и молодых ученых. Ростов-на-Дону, 2006. С. 163.

4. Венжик Ю.В., Фролова С.А., Титов А.Ф. Функциональные и структурные изменения клеток листа при низкотемпературном закаливании пшеницы // Материалы международной конференции молодых ботаников. Санкт-Петербург, 2006. С. 139.

5. Венжик Ю.В., Фролова С А., Титов А.Ф. Изменение функциональных и структурных изменений в клетках листа пшеницы при холодовом закаливании // Тезисы докладов XII международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2006», Москва, 2006. С.42-43.

6. Венжик Ю.В., Фролова СЛ., Титов А.Ф. Некоторые физиологические особенности адаптации холодостойких растений к низким температурам // Материалы международной конференции «Северная Европа в XXI веке: природа, культура, экономика». Секция биологические науки. Науки о Земле». Петрозаводск, 2006. С. 62-63.

7. Фролова С.А., Титов А.Ф. Динамика активности амидаз и цистеиновых протеи-наз при холодовом закаливании пшеницы // Тезисы докладов и стендовых сообщений VI Симпозиума «Химия протеолитических ферментов». Москва, 2007. С.118.

8. Фролова С.А., Титов А Ф. Амидазная активность проростков пшеницы при холодовом закаливании // Материалы докладов международной конференции "Современная физиология растений, от молекул до экосистем". Сыктывкар, 2007. С. 410.

9 S Frolova, Yu. Venzhik. Effects of abscisic acid on activity of amidase, cysteine proteases and trypsin's inhibitors of wheat seedlings in cold hardening // Abstracts of 2nd International Symposimum «Plant growth substances: intracellular hormonal signaling and applying m agnculture". Kyiv, Ukraine, 2007. C. 102.

10. Фролова С А., Ю.В Венжик, А.Ф. Титов Влияние абсцизовой кислоты на про-теиназно-ингибиторную систему проростков пшеницы при низкотемпературном закаливании // V-я Международная научная конференция «Регуляция роста, развития и продуктивности растений». Минск, 2007. С. 209.

11. Фролова С.А. Влияние пониженной температуры на активность амидаз и цистеиновых протеиназ проростков пшеницы и огурца // Сборник докладов молодежной научной конференции «Геосферно-биосферный взаимодействия, биоразнообразие и состояние биосистем в высоких широтах». Апатиты, 2007. С. 54-56.

12. Фролова С А., Венжик Ю.В., Титов А.Ф. Влияние низкотемпературного закаливания на протеолитическую активность и содержание фотосинтетических пигментов в

листьях проростков озимой пшеницы // Труды Карельского научного центра РАН «Экология. Экспериментальная генетика и физиология». Петрозаводск, 2007. Вып. 11. С 127-130.

13 .Фролова СЛ., Титов А.Ф. Активность протеолитических ферментов и ингибиторов трипсина в листьях пшеницы в начальный период действия и в последействии низкой закаливающей температуры // Известия РАН. Сер. биол. 2008. Т. 35, № 5. С. 549-552.

14. Венжик Ю.В., Фролова С.А., Котеева Н.К., Мирославов Е.А., Титов А.Ф. Структурно-функциональные особенности растений ТгШсит а&чНтт Ь. (Роасеае) на начальном этапе холодовой адаптации // Ботанический журнал. 2008. Т. 93, № 9. С. 3949.

15. Венжик Ю.В., Котеева Н.К, Фролова СЛ., Мирославов Е.А., Титов А.Ф. Структурно-функциональные изменения клеток листа ТгШсит аезптт Ь. (Роасеае) на начальном этапе холодовой адаптации // Материалы всероссийской конференции «Фундаментальные и прикладные проблемы ботаники в начале XXI века». Петрозаводск, 2008. С. 24-26.

Сдано в печать 22.10.2008 г. Формат 60x841/16. Гарнитура Times. Печать офсетная. Уч.-изд. л. 1,5. Усл. печ. л. 1,4. Тираж 100 экз. Изд. № 122. Заказ № 751.

Карельский научный центр РАН Редакционно-издательский отдел 185000, Петрозаводск, пр. А. Невского, 50

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Фролова, Светлана Анатольевна

СОДЕРЖАНИЕ.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Протеолитические ферменты растений и их биологические функции.

1.1.1. Классификация, строение и локализация протеиназ.

1.1.2. Биологические функции протеиназ.

1.2. Ингибиторы протеиназ как полифункциональные белки растений.

1.2.1. Классификация ингибиторов протеиназ и механизм их действия.

1.2.2. Локализация и функции ингибиторов протеиназ.

1.3. Роль внутриклеточных протеолитических ферментов и их ингибиторов в адаптации растений к действию неблагоприятных факторов среды.

1.3.1. Участие протеолитических ферментов в защите растений от действия неблагоприятных факторов среды.

1.3.2. Ингибиторы протеиназ как составная часть защиты растений.

1.3.3. Влияние неблагоприятных факторов внешней среды на экспрессию генов протеолитических ферментов и ингибиторов протеиназ.

ГЛАВА 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. Влияние низкой закаливающей температуры на холодоустойчивость и активность протеиназно-ингибиторной системы растений.

3.1.1. Закономерности изменения холодоустойчивости проростков озимой пшеницы при длительном действии низких закаливающих температур.

3.1.2. Динамика активности протеиназно-ингибиторной системы пшеницы в условиях низкотемпературного закаливания.

3.1.3. Влияние низкой закаливающей температуры на активность протеиназно-ингибиторной системы огурца.

3.2. Активность протеиназно-ингибиторной системы растений в начальный период действия закаливающих и повреждающих температур.

3.2.1. Динамика активности амидаз, цистеиновых протеиназ и ингибиторов трипсина в начальный период действия на проростки пшеницы низкой закаливающей температуры.

3.2.2. Действие повреждающей температуры на холодоустойчивость, активность протеиназ и ингибиторов трипсина проростков огурца.

3.3. Динамика активности протеиназно-ингибиторной системы растений в последействии низкой закаливающей температуры.

3.4. Влияние экзогенных гормонов на активность протеиназно-ингибиторной системы растений при действии низкой закаливающей температуры.

3.4.1. Влияние АБК на активность протеиназно-ингибиторной системы при холодовом закаливании растений.

3.4.2. Влияние цитокинина на активность протеиназно-ингибиторной системы при холодовом закаливании растений.

3.5. Экспрессия генов протеолитических ферментов и ингибиторов протеиназ при холодовом закаливании растений.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Влияние низкой температуры на активность протеиназно-ингибиторной системы растений"

Актуальность темы. Хорошо известно, что в период действия неблагоприятной температуры в клетках и тканях растительного организма происходят многочисленные структурно-функциональные изменения, часть из которых вовлечена в процесс формирования повышенной устойчивости (Туманов, 1979; Дроздов и др., 1984, 2003; Балагурова и др., 1987; Дунаева и др., 1993; Карасев и др., 1995; Климов, 2001, 2003; Титов и др., 2006; Трунова, 2007). Однако имеющиеся по этому вопросу литературные данные касаются главным образом анаболических процессов и, прежде всего, синтеза стрессовых (шоковых) белков (Бочарова и др., 1987; Карасев и др., 1995; Колесни-ченко, Войников, 2003; Титов и др., 2006; Guy, 1990; Antikanen, Griffith, 1997; Griffith et al., 1997; Tomashow, 1999, 2001), в то время как роль катаболиче-ских процессов почти не изучена. Между тем одна из наиболее важных современных тенденций в выяснении тонких механизмов устойчивости растений к изменениям в окружающей среде, и действию неблагоприятных температур в частности, заключается в установлении характера взаимодействия между процессами синтеза и распада белков (Тарчевский, 2001). В условиях стресса уровень «неправильно синтезированных» или поврежденных белков может достичь критических значений и вызвать гибель клетки (Колесничен-ко, Войников, 2003). Поэтому важную роль в обмене веществ живого организма и защите его от повреждения играют протеолитические ферменты, участвуя не только в деградации белковых молекул, но и в регуляции различных физиолого-биохимических процессов посредством реакций ограниченного протеолиза (Мосолов, 1993). Основными регуляторами активности протеиназ являются белки-ингибиторы, способные образовывать с ними стабильные комплексы и приводить к обратимому подавлению активности про-теолитических ферментов. В настоящее время установлено, что в процессах защиты растений от действия различного рода неблагоприятных факторов значительная роль принадлежит системе протеиназа-ингибитор (Мосолов,

Валуева, 2008; Johnston, 2006). Однако функции протеиназно-ингибиторной системы в адаптации растений и формировании повышенной холодоустойчивости исследованы недостаточно.

Цель и задачи исследования. Цель настоящей работы — изучение активности протеиназно-ингибиторной системы растений в условиях действия низких закаливающих и повреждающих температур и определение ее возможной роли в механизмах устойчивости растений.

Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи:

• изучить динамику активности амидаз, цистеиновых протеиназ, а также ингибиторов сериновых протеиназ (ингибиторов трипсина) у растений при действии на них низких закаливающих температур;

• провести сравнительный анализ активности протеиназ и ингибиторов протеолитических ферментов в начальный период действия на растения низких закаливающих и повреждающих температур;

• изучить динамику активности протеолитических ферментов и ингибиторов протеиназ в последействии низкой закаливающей температуры;

• исследовать влияние экзогенных гормонов (АБК, цитокинин) на активность протеиназно-ингибиторной системы растений при действии низких закаливающих температур;

• исследовать экспрессию генов протеолитических ферментов и их ингибиторов в процессе формирования повышенной холодоустойчивости растений.

Научная новизна работы: Впервые изучена динамика активности амидаз, цистеиновых протеиназ и ингибиторов трипсина в период действия и в последействии низкой закаливающей температуры, а также показана их роль в механизмах формирования повышенной холодоустойчивости растений. Установлены различия в динамике активности протеиназ и ингибиторов трипсина в начальный период действия на растения низких закаливающих и повреждающих температур. Показано влияние экзогенных фитогормонов (АБК, цитокинина) на изменение активности протеиназно-ингибиторной системы и формирование повышенной холодоустойчивости растений. Получены новые данные об экспрессии генов clpP и lonl, а также генов цистеиновых протеиназ и их ингибиторов в процессе холодового закаливания растений.

Практическая значимость работы: Полученные экспериментальные данные дополняют и расширяют современные представления о роли протео-литических ферментов, ингибиторов протеиназ и их генов в адаптации растений к действию неблагоприятных факторов внешней среды и, в частности, низкой температуры. Данная информация может найти применение в физио-лого-биохимических и селекционно-генетических исследованиях, направленных на повышение устойчивости растений и разработку методов ее диагностики. Основные положения работы могут быть использованы при чтении спецкурсов по экологической биохимии, частной энзимологии, а также физиологии устойчивости растений.

Благодарности. Автор выражает глубокую и искреннюю признательность своим учителям и наставникам: научному руководителю чл.-корр. РАН, д.б.н. А. Ф. Титову, чл.-корр. РАН, д.б.н. Н. Н. Немовой, а также сотрудникам лаборатории экологической физиологии растений Института биологии КарНЦ РАН. Самые теплые слова благодарности к.б.н. Е.В. Иевлевой за всестороннюю помощь, ценные советы и рекомендации, а также сотрудникам группы молекулярной биологии Института биологии КарНЦ РАН к.б.н. JI.B. Топчиевой и к.б.н. И.Е. Малышевой за помощь в постановке экспериментов.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Фролова, Светлана Анатольевна

выводы

1. Холодовое закаливание холодостойких (пшеница) и теплолюбивых (огурец) растений сопровождается увеличением активности амидаз, цистеиновых протеиназ и ингибиторов трипсина в тканях листа, которое предшествует росту их холодоустойчивости. Важно, что увеличение амидазной активности наиболее выражено на начальном этапе (часы) охлаждения и способствует повышению устойчивости, тогда как активность цистеиновых протеиназ увеличивается и в более поздние (сутки) периоды адаптации, участвуя в поддержании холодоустойчивости на повышенном уровне.

2. Действие низкой повреждающей температуры вызывает увеличение активности протеиназ и уменьшение активности ингибиторов трипсина и приводит к снижению холодоустойчивости и последующей гибели растений. В условиях температурного повреждения протеиназы играют первостепенную роль в необратимых (деструктивных) процессах катаболизма, тогда как в начальный период холодового закаливания проте-олитические ферменты и их ингибиторы выполняют, главным образом, регуляторную функцию, тесно связанную с адаптацией растений.

101

АБК) или дополнительному ее увеличению (при действии цитокинина) при холодовом закаливании растений.

5. В процессе холодового закаливания происходит усиление экспрессии генов АТФ-зависимых протеиназ (clpP и lonl), а также генов, кодирующих цистеиновую протеиназу {ср) и ингибитор цистеиновой протеиназы, которое предшествует росту холодоустойчивости проростков пшеницы. При достижении растениями максимальной устойчивости содержание в клетках их листьев транскриптов указанных генов возвращается к исходному уровню.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

На протяжении многих лет исследованию механизмов адаптации растений к действию неблагоприятных факторов внешней среды и низкой температуры, в частности, уделяется достаточно пристальное внимание. Поэтому, изучение процессов распада белков в процессе формирования повышенной холодоустойчивости представляет собой весьма важный аспект этого вопроса.

Полученные в ходе наших исследований данные позволили выявить общие закономерности изменения активности ряда показателей протеиназно-ингибиторной системы в процессе холодового закаливания растений. В частности, оказалось, что охлаждение проростков пшеницы (независимо от интенсивности низкотемпературного воздействия) и огурца вызывает увеличение активности амидаз, цистеиновых протеиназ и ингибиторов трипсина, которое предшествовует росту их холодоустойчивости. Очевидно, что увеличение протеолитической активности в начальный период закаливания свидетельствует об интенсивно происходящих в этот момент процессах деградации, направленных на модификацию и устранение поврежденных белков, а также белков уже невыполняющих в новых условиях свои функции. В результате, происходящие под действием низкой температуры реакции ограниченного протеолиза обеспечивают клетку мономерными субстратами для синтеза белков холодового шока. Важно отметить, что увеличение амидазной активности было наиболее выражено в начальный период (часы) закаливания и, скорее всего, связано с комплексом изменений, направленных на рост холодоустойчивости растений. Цистеиновые протеиназы, активность которых повышалась не только в первые часы охлаждения, но и при более продолжительном действии низкой температуры, вероятно, принимают участие (прямо или опосредованно) как в увеличении устойчивости, так и в поддержании ее на повышенном уровне. Увеличение активности ингибиторов трипсина, выступающих в данном случае в качестве регуляторов деятельности протеолитических ферментов, предотвращает преждевременный распад внось синтезированных белков и обеспечивает, тем самым, повышение холодоустойчивости растений.

Интересно, что в последействии низкой закаливающей температуры изменения активности амидаз и цистеиновых протеиназ, в целом, имели сходную динамику с таковой в процессе холодовой адаптации. Так, увеличение активности вышеуказанных ферментов предшествовало снижению холодоустойчивости растений в ходе их раззакаливания. Очевидно, что в подобных условиях усиление протеолитической активности направлено на прекращение синтеза стрессовых белков и восстановление синтеза белков, характерных для физиологически нормальных температур. Кроме того, установлено, что в процессе раззакаливания растений активность ингибиторов трипсина практически не менялась, что лишь подтверждает многообразие функций ингибиторов протеиназ и свидетельствует о выполнении ими в подобных условиях роли запасных белков.

Зафиксированное нами значительное увеличение активности цистеиновых протеиназ и амидаз при действии на растения огурца низкой повреждающей температуры свидетельствует о начинающихся уже в течение первого часа деструктивных процессах. Наблюдаемое в это же время повышение активности ингибиторов протеиназ, вероятно, представляет собой попытку восстановления нарушенных и поврежденных структур и функций. Однако последующее увеличение активности протеолитических ферментов и снижение активности ингибиторов трипсина, не справляющихся с нарастающим влиянием протеолиза, сопровождалось снижением холодоустойчивости растений, разрушением клеточных структур и последующей гибелью организма. Можно предположить, что в процессе температурного повреждения протеиназы играют первостепенную роль в необратимых (деструктивных) процессах деградации белка, тогда как в процессе холодового закаливания протео-литические ферменты и их ингибиторы выполняют, главным образом, регу-ляторную функцию, тесно связанную с адаптацией растений.

В нашей работе показано, что в реакции растений на действие экзогенных фитогормонов (АБК и цитокинина) наблюдались существенные различия в изменении активности амидаз, цистеиновых протеиназ и ингибиторов трипсина, которые, вероятнее всего, обусловлены разнообразием физиологических функций протеолитических ферментов и их ингибиторов и разной степенью участия в адаптации растений к неблагоприятным факторам абиотической природы. В частности, обработка проростков пшеницы АБК до начала холодового воздействия вызывала увеличение активности амидаз и ингибиторов трипсина и снижение активности цистеиновых протеиназ. В начальный период адаптации на фоне достаточно быстрого роста холодоустойчивости проростков, предобработанных АБК, по сравнению с контрольными растениями того же возраста (закалка без АБК) отмечалось повышенное содержание амидаз и пониженное — цистеиновых протеиназ и ингибиторов трипсина. В дальнейшем, при достижении максимальной устойчивости активность амидаз постепенно снижалась, а активность цистеиновых протеиназ и ингибиторов трипсина, наоборот, увеличивалась. Необходимо подчеркнуть, что в присутствии АБК повышенный уровень активности амидаз наблюдается в начальный период (часы) действия охлаждения, тогда как активность цистеиновых протеиназ увеличивается и в более поздние (сутки) периоды адаптации растений. Очевидно, указанные изменения связаны с комплексом событий, происходящих на уровне синтеза и распада белков в клетках растений при действии неблагоприятных температур, часть из которых направлена на формирование устойчивости, а другая - на поддержание ее повышенного уровня. Поэтому, вполне логично, что АБК может влиять на холодоустойчивость растений к низкой температуре посредством изменения активности протеолитических ферментов и главных регуляторов их деятельности — белковых ингибиторов.

Наряду с этим, нами установлено, что действие цитокинина (БАП) на растения вызывает увеличение активности амидаз, цистеиновых протеиназ и ингибиторов трипсина до начала холодового воздействия, тогда как в процессе холодового закаливания БАП ингибирует распад белков посредством снижения активности протеиназ и увеличения активности ингибиторов протеолитических ферментов. Следовательно, цитокинин, предотвращая деградацию белоксинтезирующего аппарата клеток, создает благоприятную обстановку для биосинтеза стрессовых белков, запуск которых является следствием изменения температуры окружающей среды с физиологически нормальной на закаливающую.

Нами также было установлено, что росту холодоустойчивости и изменениям в активности протеиназно-ингибиторной системы предшествует увеличение экспрессии генов протеолитических ферментов и их ингибиторов. В частности, в начальный период (первые минуты-часы) охлаждения пшеницы происходит значительное усиление экспрессии генов clpP, lonl и генов цистеиновых протеиназ, вследствие чего увеличивается активность соответствующих ферментов, которые участвуют непосредственно в деградации и модификации поврежденных белков, а также белков, утративших свои функции. Усиление экспрессии генов ингибиторов цистеиновых протеиназ, наблюдаемое в начальный период закаливания, вероятно, направлено на регуляцию активности протеолитических ферментов и предотвращение распада вновь синтезированных белков. Важно, что по мере роста холодоустойчивости (через 1-2 сут охлаждения) изменения экспрессии генов clpP, lonl, ср и генов, кодирующих фитоцистатины, становятся менее значительными, а при достижении устойчивости своих максимальных значений, уровень экспрессии изучаемых генов возвращается к исходным значениям. Отсюда следует, что наиболее важные изменения в экспрессии генов протеолитических ферментов и их ингибиторов происходят в первые часы воздействия низкой температуры на растения и они способствуют повышению их холодоустойчивости.

Таким образом, на основании полученных нами данных и анализа литературы, можно заключить, что происходящие под действием низких температур изменения активности эндогенных протеолитических ферментов и ингибиторов протеиназ, а также экспрессии их генов являются частью тех изменений, которые в итоге обеспечивают адаптацию растений и повышение их холодоустойчивости.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Фролова, Светлана Анатольевна, Петрозаводск

1. Абрамова Е.Б., Шарова Н.П., Карпов B.JI. Протеасома: разрушать, чтобы выжить // Мол. биология. 2002, № 2. С. 761-776.

2. Акимова Т.В. Роль температурного фактора в формировании холодоустойчивости Cucumis sativus L.: Автореф. дис. . канд. биол. наук. Л. ВНИИР. 1980. 24с.

3. Акимова Т.В., Балагурова Н.И., Титов А.Ф., Мешкова Е.А. Повышение теплоустойчивости листьев при локальном прогреве проростков // Физиология растений. 2001. Т. 48, № 4. С. 584-588.

4. Акимова Т.В., Титов А.Ф., Топчиева Л.В. Сравнительное изучение реакции растений на действие высоких закаливающих и повреждающих температур // Физиология растений. 1994. Т. 41, № 3. С. 381-385.

5. Александрова И.Ф., Веселов А.П., Зайцева И.В., Хесина О.В. Влияние гипертермии на активность кислых протеиназ в семенах пшеницы при прорастании // Вестн. Нижегор. ун-та, сер. биол. 2001. С. 105-108.

6. Александрова И.Ф., Николаева Т.И., Веселова А.А. Влияние гипертермии на соотношение протеиназ различных типов в прорастающих зерновках пшеницы // Вестн. Нижегор. ун-та, сер. биол. 2001. С. 172-175.

7. Антонов В.К. Химия протеолиза. М.: Наука, 1983. 367с.

8. Балагурова Н.И., Акимова Т.В., Титов А.Ф. Влияние локального охлаждения проростков огурца и пшеницы на различные виды устойчивости листа и корня // Физиология растений. 2001. Т. 48, № 1. С. 113-118.

9. Блехман Г.И., Шеламова Н.А. Синтез и распад макромолекул в условиях стресса // Успехи совр. биол. 1992. Т. 112, № 2. С. 281-297.

10. Бочарова М.А., Клячко Н.Л., Трунова Т.И., Кулаева О.Н. Влияние отрицательных температур на белоксинтезирующий аппарат закаленной к морозу озимой пшеницы // Физиология растений. 1987. Т. 34, № 3. С. 513-517.

11. Н.Валуев И.Л., Сытов Г.А., Валуев Л.И. Ингибиторы протеолитических ферментов в терапии сахарного диабета // Вопр. мед. химии 2001. Т. 47, № 1. С. 132-139.

12. Валуева Т.А., Мосолов В.В. Роль ингибиторов протеолитических ферментов в защите растений от патогенных микроорганизмов // Биохимия. 2004. Т. 69. С. 1600-1606.

13. Валуева Т.А., Мосолов В.В. Роль ингибиторов протеолитических ферментов в защите растений // Успехи биологической химии. 2002. Т. 42. С. 193216.

14. Валуева Т.А., Мосолов В.В., Григорьева Л.И. Ингибиторы протеиназ из растений как полифункциональные белки // Прикладная биохимия и микробиология. 2001. Т. 37, № 6. С. 643-650.

15. Валуева Т.И., Мосолов В.В. Белки-ингибиторы протеиназ в семенах. 1. Классификация, распространение, структура и свойства // Физиология растений. 1999. Т. 46, № 3. С. 362-378.

16. Валуева Т.И., Мосолов В.В. Белки-ингибиторы протеиназ в семенах. 2. Физиологические функции // Физиология растений. 1999. Т. 46, № 3. С. 379-387.

17. Ванюшин Б.Ф. Апоптоз у растений // Успехи биол. химии. 2001. Т. 41. С. 3-38.

18. Веселов Д.С., Сабиржанова И.Б., Ахиярова Г.Р. и др. Роль гормонов в быстром ответе растений пшеницы на осмотический и холодовой шок // Физиология растений. 2002. Т. 49, № 6. С. 572-576.

19. Войников В.К., Боровский Г.Б., Колесниченко А.В., Рихванов Е.Г. Стрессовые белки растений. Иркутск: Ин-т географии СО РАН, 2004. 129с.

20. Домаш В.И. Протеиназно-ингибиторная система высших растений: свойства и биологические функции: Автореф. дис. . д-ра биол. наук. М., Ин-т биохимии, 1995. 37с.

21. Домаш В.И., Шарпио Т.П., Забрейко С.А. Растительные ингибиторы про-теолиза и перспективы их использования в медицине // Изв. нац. АН Беларуси. Сер. мед. наук. 2008. №. 1. С. 58-63.

22. Дроздов С.Н., Курец В.К. Некоторые аспекты экологической физиологии растений. Петрозаводск: Изд-во ПетрГУ, 2003. 172с.

23. Дроздов С.Н., Курец В.К., Титов В.К. Терморезистентность активно веге-тирующих растений. Л.: Наука, 1984. 168с.

24. Дроздов С.Н., Сычева З.Ф., Будыкина Н.П., Курец В.К. Эколого-физиологические аспекты устойчивости растений к заморозкам. Л.: Наука, 1977. 228с.

25. Дроздов С.Н., Сычева З.Ф., Попов Э.Г., Таланов А.В., Холопцева Е.С., Курец В.К. Роль дыхания в формировании терморезистентности растений // Физиология и биохимия культурных растений. 2005. Т. 37, № 1. С.

26. Дунаева М.В., Бочарова М.А., Клячко Н.Л. Влияние холодового стресса и закаливания на полисомы проростков озимых злаков // Физиология растений. 1993. Т. 40, № 4. С. 599-604.

27. Жученко А. А. Адаптивная система селекции растений (эколого-генетические основы). Т.1. Москва: Изд-во РУДЫ, 2001. 780с.

28. Зверева Г.Н., Трунова Т.И. Зависимость морозостойкости озимой пшеницы от синтеза белка во время закаливания // Физиология растений. 1985. Т. 32, № 5. с. 976-982.

29. Карасев Г.С., Астахова Н.В., Райхман Л.А., Трунова Т.И. Действие никой положительной температуры на содержание белков и ультраструктуру клеток огурца и томата // Физиология растений. 1995. Т. 42, № 6. С. 855861.

30. Кирпиченок Л.Н. Белковый ингибитор цистеиновых протеиназ как активатор протеолиза // Изв. нац. АН Беларуси. Сер. мед. Наук. 2008. №. 1. С. 52-57.

31. Климов С.В. Пути адаптации растений к низким температурам // Успехи соврем. Биол. 2001. Т. 121, № 1. С. 3-22.

32. Климов С.В. Холодовое закаливание растений — результат повышенного отношения фотосинтез/дыхание при низких температурах // Изв. РАН. 2003. № 1.С. 57-62.

33. Колесниченко А.В., Войников В.К. Белки низкотемпературного стресса у растений. Иркутск: Арт-пресс. 2003. 196с.

34. Колесниченко А.В., Побежимова Т.П., Войников В.К. Характеристика белков низкотемпературного стресса растений // Физиология растений. 2000. Т. 47, № 4. С. 624-630.

35. Кретович В.Л. Биохимия растений. М.: Высшая школа. 1968. 664с.

36. Критенко С.П., Титов А.Ф. Влияние абсцизовой кислоты и цитокинина на синтез белка при холодовой и тепловой адаптации растений // Физиология растений. 1990. Т. 37, № 1. С. 126-132.

37. Кузнецов В. В. Индуцибельные системы и их роль в адаптации растений у стрессорным факторам: Автореф. дис. . д-ра биол. наук. Кишинев, ИФР Респ. Молдова, 1992. 74с.

38. Кулаева О.Н. Белки теплового шока и устойчивость растений к стрессу // Соросов, образов, ж-л. 1997. № 2. С. 5-13.

39. Кулаева О.Н., Кузнецов В.В. Новейшие достижения и перспективы в области изучения цитокининов // Физиология растений. 2002. Т. 49, № 4. С. 626-640.

40. Локшина Л.А. Регуляторная роль протеолитических ферментов // Мол. биол. 1979. Т. 13. С. 1205-1229.

41. Локшина Л.А., Соловьева Н.И., Орехович В.Н. Роль лизосомальных протеиназ в деструкции ткани // Вопр. мед. Химию 1987. Т. 33, № 5. С. 38^-3.

42. Лось Д.А. Молекулярные механизмы холодоустойчивости растений // Вестн. РАН. 2005. Т. 75, № 4. С. 338-345.

43. Мосолов В.В. Белковые ингибиторы как регуляторы процессов протеоли-за. 36-е Баховские чтения. М., 1983. 40с.

44. Мосолов В.В. Механизмы контроля протеолиза // Успехи биол. химии. 1988. Т. 28. С. 125-144.

45. Мосолов В.В. Природные ингибиторы протеолитических ферментов // Успехи совр. биохим. 1982. Т. 22. С. 100-118.

46. Мосолов В.В. Протеолитические ферменты. М.: Наука, 1971. 414с.

47. Мосолов В.В., Валуева Т.А. Ингибиторы протеиназ в биотехнологии растений (обзор) //Прикл. биохим. и микробиол. 2008. Т. 44, № 3. С. 261-269.

48. Мосолов В.В., Валуева Т.А. Ингибиторы протеиназ и их функции у растений // Прикладная биохимия и микробиология. 2005. Т. 41, № 3. С. 261282.

49. Мосолов В.В., Валуева Т.А. Растительные белковые ингибиторы протеолитических ферментов. М.: Ин-т биохимии РАН, 1993. 207с.

50. Мосолов В.В., Валуева Т.А. Участие протеолитических ферментов во взаимодействии растений с фитопатогенными микроорганизмами // Биохимия. 2006. Т. 71. Вып. 8. С. 1034-1042.

51. Мосолов В.В., Григорьева Л.И., Валуева Т.А. Ингибиторы протеиназ из растений как полифункциональные белки (обзор) // Прикл. биохим. и микробиол. 2001 Т. 37, № 6. С. 643-650.

52. Немова Н.Н. Внутриклеточные протеолитические ферменты рыб. Петрозаводск: Карельский научный центр РАН, 1996. 104с.

53. Немова Н.Н., Бондарева Л.А. Протеолитические ферменты: учебное пособие. Петрозаводск: Карельский научный центр РАН, 2005. 92с.

54. Полевой В.В. Фитогормоны. Л.: Изд-во ЛГУ, 1982. 248с.

55. Силаева A.M. Структура хлоропластов и факторы среды. Киев: Наук. Думка. 1978. 204с.

56. Старостенко Н.В., Кузнецов Вл. В. Синтез белков теплового шока в ин-тактных растущих проростках Cucumis sativus L. при гипертермии // Докл. Акад. Наук. 1993. Т. 328, № 3. С. 414^116.

57. Таланова В.В., Акимова Т.В., Титов А.Ф. Динамика содержания АБК в листьях и корнях проростков огурца и их теплоустойчивости под влиянием общего и локального прогрева // Физиология растений. 2003. Т. 50, № 1.С. 100-104.

58. Таланова В.В., Титов А.Ф., Боева Н.П. Изменение уровня эндогенной абс-цизовой кислоты в листьях растений под влиянием холодовой и тепловой закалки // Физиология растений. 1991. Т. 38, № 5. С. 991-997.

59. Таланова В.В., Топчиева Л.В., Титов А.Ф. Влияние абсцизовой кислоты на устойчивость проростков огурца к комбинированному действию высокой температуры и хлоридного засоления // Известия РАН. Серия биологическая. 2006. № 6. С. 757-761.

60. Тарчевский И.А. Катаболизм и стресс у растений. 52 Тимирязевские чтения. М.: Наука. 1993. 80с.

61. Тарчевский И.А. Метаболизм растений при стрессе. Казань: Фэн, 2001. 448с.

62. Тарчевский И.А. Процессы деградации у растений // Соросов, образов, ж-л. 1996. № 6. С. 13-19.

63. Тарчевский И.А. Регуляторная роль деградации биополимеров и липидов // Физиология растений. 1992. Т. 39, № 6. С. 1215-12232.

64. Титов А.Ф. Устойчивость активно вегетирующих растений к низким и высоким температурам: закономерности варьирования и механизмы: Авто-реф. дис. . д-ра биол. наук. М. ИФР, 1989. 42с.

65. Титов А.Ф., Акимова Т.В., Крупнова И.В. Особенности начального периода холодовой и тепловой адаптации растений (феноменологический аспект) // Физиология растений. 1989. Т. 36, № 4. С. 717-723.

66. Титов А.Ф., Акимова Т.В., Таланова В.В., Топчиева JI.B. Устойчивость растений в начальный период действия неблагоприятных температур. М.: Наука. 2006. 143с.

67. Титов А.Ф., Дроздов С.Н., Критенко С.П., Таланова В.В., Шерудило Е.Г. Влияние цитокининов на холодо- и теплоустойчивость активно вегетирующих растений // Физиология и биохимия культ. Растений. 1986. Т. 18, № 1. С. 64-69.

68. Титов А.Ф., Дроздов С.Н., Таланова В.В., Критенко С.П. Влияние абсци-зовой кислоты на устойчивость активно вегетирующих растений к низким и высоким температурам // Физиология растений. 1985. Т. 32, № 3. С. 565573.

69. Титов А.Ф., Таланова В.В., Акимова Т.В. Динамика холодо- и теплоустойчивости растений при действии различных стресс-факторов на их корневую систему // Физиология растений. 2003. Т. 50, № 1. С. 94-99.

70. Трунова Т. И. Растение и низкотемпературный стресс. Тимирязевские чтения. М.: Наука. 2007. Т. 64. 54с.

71. Туманов И.И. Физиология закаливания и морозостойкости растений. М.: Наука. 1979. 350с.

72. Чиркова Т.Ф. Физиологические основы устойчивости растений. СПб: Изд-во СПб. ун-та, 2002. 244с.

73. Шакирова Ф.М. Неспецифическая устойчивость растений к стрессовым факторам и ее регуляция. Уфа.: Гилем, 2001. 159с.

74. Шишова Т.К., Руденская Ю.А., Лихолат Т.В., Мосолов В.В. Восстановление жизнеспособности зерна пшеницы, подвергнутого стрессовому воздействию под влиянием ризосферных микроорганизмов // Докл. РАН. 1997. Т. 356, № 1.С. 1-3.

75. Abe M., Abe K., Kuroda M., Arai S. Corn kernel cysteine proteinase inhibitor as a novel cystatin superfamily member of plant origin // Eur. J. Biochem. 1992. Vol. 209, № 3. P. 933-937.

76. Adamska I., Lindahl M., Roobol-Boza M., Andersson B. Degradation of the light-stress protein is mediated by an ATP-dependent, serine-type protease under low-light conditions // Eur. J. Biochem. 1995. Vol. 231. P. 591-599.

77. Alexandrov V. Ya., Zavadskaya I.E., Antropova T.A. Effect of heat shock on cellular function duffering in termoresistance // J. Therm. Biol. 1990. Vol. 15, №2. P. 141-148.

78. Ambe K.S., Sohonu K. Trypsin inhibitor from rye seeds // Acta Biochim. Polo-nica. 1956. Vol. 12. P. 302-305.

79. An G., Mitra A., Choi H.K., Costa M.A., An K., Thornburg R.W., Ryan C.A. Functional analysis of the 3" control region of the potato wound-inducible proteinase inhibitor II gene // The Plant Cell. 1989. Vol. 1, № 1. P. 115-122.

80. Anastassiou R., Argyroudi-Akoyunglou J.H. Thylakoid-bound proteolytic activity against LHC II apoprotein in bean // Photosynth. Res. 1995. Vol. 43. P. 241-250.

81. Andersson В., Aro E.-M. Proteolytic activities and proteases of plant chloro-plasts // Physiol. Plant. 1997. Vol. 100, № 4. P. 780-793.

82. Antikanen M., Griffith M. Antifreeze protein accumulation in freezing-tolerant cereal // Plant Physiol. 1997. Vol. 99, № 2. P. 423-432.

83. Aroca R., Vernieri P., Irigoyen J.J. et al. Involvement of abscisic acid in leaf and root of maize (Zea mays L.) in avoiding chilling-induced water stress // Plant Sci. 2003. Vol. 165. P. 671-679.

84. Barrett A.J., Rawlings N.D. Evolutionary lines of cysteine peptidases // Biol. Chem. 2001. Vol. 382. P. 727-735.

85. Barrett A.J., Rawlings N.D., Woessner J.F. The Handbook of Proteolytic Enzymes. 2003. 2nd ed. Academic Press.

86. Beers E.P., Woffenden B.J., Zhao C. Plant proteolitic enzymes: possible roles during programmed cell death // Plant Mol. Biol. 2000. Vol. 44, № 3. P. 399415.

87. Birkenmeiner G.F., Ryan C.A. Wound signaling in tomato plants: evidence that ABA is not a primary signal for defense gene activation // Plant Physiol. 1998. Vol. 117, №2. P. 687-693.

88. Bode W., Engh R., Musil D., Laber В., Stubbs M., Huber R., Turk V. Mechanism of interaction of cysteine proteinases and their protein inhibitors as compared to the serine proteinase-inhibitor interaction // Biol. Chem. 1990. Vol. 371, № l.P. 111-118.

89. Bode W., Huber R. Natural protein proteinase inhibitors and their interaction with proteinases // Eur. J. Biochem. 1992. Vol. 204. P. 433-451.

90. Boisen S., Djurtof R. Trypsin inhibitor from wheat endosperm: purification and characterization// Cereal Chem. 1981. Vol. 5. P. 460-463.

91. B6lter В., Nada A., Fulgosi H., Soil J. A chloroplastic inner envelope membrane protease is essential for plant development // FEBS Lett. 2006. Vol. 580, № 3. P. 789-794.

92. Bolter C. Methyl Jasmonate Induces Papain Inhibitor(s) in Tomato Leaves // Plant Physiol. 1993. Vol. 103, № 4. p. 1347-1353.

93. Bota D.A., Remmen H.V., Davies К.J.A. Modulation of Lon protease activity and aconitase turnover during again and oxidative stress // FEBS Lett. 2002. Vol. 532, № 1-2. P. 103-106.

94. Bryant J., Green T.R., Gurusaddaiah Т., Ryan C.A. Proteinase inhibitor II from potatoes: isolation and characterization of its promoter components // Bio-chem. 1976. Vol. 15. P. 3418-3424.

95. Bushnell T.P., Bushell D., Jagendorf A.T. A purified zinc protease of pea chloroplasts, EP1, degrades the large subunit of ribulose-l,5-bisphophate carboxylase/oxygenase // Plant Physiol. 1993. Vol. 103, № 2. P. 585-591.

96. Callis J. Regulation of protein degradation // The Plant Cell. 1995. Vol. 7. P. 847-857.

97. Casaretto J.A., Zuniga G.E., Corcuera L.J. Abscisic acid and jasmonic acid affect proteinase inhibitor activities in barley leaves // J. Plant Physiol. 2004. Vol. 161, №4. P. 389-396.

98. Ceci L.R., Spoto N., de Virgilio M., Gallerani R. The gene coding for the mustard trypsin inhibitor-2 is discontinuous and wound-inducible // FEBS Lett. 1995. Vol. 364, № 2. P. 179-181.

99. Cervantes E., Rodriguez A., Nicolas G. Ethylene regulates the expression of cysteine protease gene during germination of chickpea (Cicer arietinum L.) // Plant Mol. Biol. 1994. Vol. 25. P. 207-215.

100. Chen H.-H., Li P.-H. Characteristics of cold acclimation and deacclimation in tuber-bearing Solanum species // Plant Physiol. 1980. Vol. 65, № 6. P. 1146— 1148.

101. Chen J., Burke J., Velten J., Xin Z. FtsHl 1 is essential to thermotolerance in Arabidopsis // Plant Anim. Gen. Conf. 2006. P. 405.

102. Chen J., Burke J., Velten J., Xin Z. FtsHll protease plays a critical role in Arabidopsis thermotolerance // Keystone Symposia. 2006.

103. Chen J., Xin Z., Burke J. FtsHll proteases play a critical role in high temperature stress tolerance in plants // Plant Biol. Bot. Joint Cong. 2007.

104. Ciechanover A. The ubiquitin-proteasome proteolitic pathway // Cell. 1994. Vol. 79, № 1. P. 13-21.

105. Ciechanover A., Schwartz A. The ubiquitin-mediated proteolytic pathway: mechanisms of recognition of the proteolytic substrate and involvement in the degradation of native cellular proteins // FASEB J. 1994. Vol. 8. P. 182-191.

106. Clarke A.K. ATP-dependent Clp proteases in photosynthetic organisms a cut above the rest // Ann. Bot. 1999. Vol. 83, № 6. P. 593-599.

107. Clarke A.K., Eriksson M.-J. The cyanobacterium Synechococcus sp. PCC 7942 possesses a close homologue to the chloroplast ClpP protein of higher plants // Plant Mol. Biol. 1996. Vol. 31, № 4. P. 721-730.

108. Clarke A.K., Gustafsson P., Lindholm J.A. Identification and expression of the chloroplast clpP gene from the conifer Pinus contorta // Plant Mol. Biol. 1994. Vol. 26, № 3. P. 851-862.

109. Coffen W.C., Wolpert T.J. Purification and characterization of serine proteases that exhibit caspase-like activity and are assotiated with programmed cell death in Avena sativa I/ Plant Cell. 2004. Vol. 16, № 4. P. 857-873.

110. Condra J.H., Schlelf W.A., Blahy O.M. In vivo emergence of HIV-1 variants resistant to multiple protease inhibitors //Nature. 1995. Vol. 374. P. 569-571.

111. Dahl S.W., Rasmussen S.K., Petersen L.C., Hejgaard J. Inhibition of coagulation factors by recombinant barley serpin BSZx // FEBS Lett. 1996. Vol. 394, №2. P. 165-168.

112. De Leo F., Ceci L.R., Jouanin L., Gallerani R. Analysis of mustard trypsin inhibitor-2 gene expression in response to developmental or inviromental induction // Planta. 2001. Vol. 212, № 5-6. P. 710-717.

113. De Leo F., Volpicella M., Licciuli S., Liuni S., Gallerani R., Ceci L.R. Plant Pis: a database for plant protease inhibitors and their genes // Nucl. Acid Res. 2002. Vol. 30, № 1. P. 347-348.

114. Delorme V.C.R., McCabe P.E., Kim D.J., Leaver C.J. A Matrix Metallopro-teinase Gene Is Expressed at the Boundary of Senescence and Programmed Cell Death in Cucumber // Plant Physiol. 2000. Vol. 123. P. 917-927.

115. DeMartino G.N., Slaughter C.A. The proteasome, a novel protease regulated by multiple mechanisms // J. Biol. Chem. 1999. Vol. 274, № 32. P. 2212322126.

116. Dombrowski J.E. Salt stress activation of wound-related genes in tomato plants // Plant Physiol. 2003. Vol. 132, № 4. P. 2098-2107.

117. Domingues F., Cejudo F.J. Patterns of starchy endosperm acidification and protease gene expression in wheat grains following germination // Plant Physiol. 1999. Vol. 119, № 1. P. 81-87.

118. Duan X., Li X., Xue Q., Abo-Ei-Saad M., Xu D., Wu R. Transgenic rice plants harboring an introduced potato proteinase inhibitor II gene are insect resistant // Nat. Biotech. 1996. Vol. 14, № 4. P. 494-498.

119. English-Loeb G., Stout M.J., Duffey S.S. Drought stress in tomatoes: changes in plant chemistry and potential nonlinear for insect herbivores. OIKOS 79. 1997. P. 456-468.

120. Erlanger D.F., Kokowsky N., Cohen W. Proteinases activity in biological substrats // Arch. Biochem. Biophys. 1961. Vol. 95, № 2. P. 271-278.

121. Ferri K.F., Kroemer G. Organelle-specific initiation of cell death pathways // Nat. Cell Biol. 2001. Vol. 3, № 11. P. 255-263.

122. Folwer S., Thomashow M.F. Arabidopsis transcriptome profiling indicates that multiple regulatory pathway are activated during cold acclimation in addition to the CBF cold response pathway // Plant Cell. 2002. Vol. 14, № 8. P. 1675-1690.

123. Forsberg J., Strom J., Kieselbach Т., Larsson H., Alexciev K., Engstrom A., Hans-Erik A. Protease activities in the chloroplast capable of cleaving an LHCII N-terminal peptide // Physiol. Plant. 2005. Vol. 123, № 1. P. 21-29.

124. Fucuda H. Signals that control plant vascular cell differentiation // Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2004. Vol. 5. P. 379-391.

125. Garcia-Olmedo F., Molina A., Alamillo J.M., Rodriguez-Palenzuela P. Plant defense peptides // Biopolymers. 1998. Vol. 47, № 6. P. 479-491.

126. Garcia-Olmedo S.F., Sanchez-Monge G., Gomez R.L., Royo J., Carbonero P. Plant proteinaceous inhibitors of proteinases and a-amylases // Oxf. Surv. Plant Mol. Cell Biol. 1987. Vol. 4. P. 275-334.

127. Goff S.A., Goldberg A.L An increased content of protease La, the Ion gene product, increases protein degradation and block growth in Escherihia coli // J. Biol. Chem. 1987. Vol. 262. P. 4508-4515.

128. Gottesman S. Proteases and their targets in Esherichia coli // Annu. Rev. Genet. 1996. Vol. 30. P. 465-506.

129. Greenberg J.T. Programmed cell death: a way of life for plants.// Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1996. Vol. 93, № 22. P. 12094-12097.

130. Griffith M., Antikainen M., Hon W.C., Pihakaskimaunsbach K., Yu X.M., Chun J.U., Yang D.S. Antifreeze proteins in winter rye // Physiol. Plant. 1997. Vol. 100. P. 327-332.

131. Gruis D., Schulze J., Jung R. Storage protein accumulation in the absence of the vacuolar processing enzyme family of cysteine proteases // The Plant Cell. 2003. Vol. 16. P. 170-290.

132. Guidici A.M., Regente M.C., De La Canal L. A potent antifungal protein from Helianthus annuus flowersis a trypsin inhibitor // Plant Physiol. Biochem. 2000. V. 38, № 11. P. 881-888.

133. Gusta L.V., Fowler D.B. Dehardening and rehardening of spring-collected winter wheat and winter rye // Canad. J. Plant Sci. 1976. Vol. 56, № 4. P. 775779.

134. Guy C., Niemi K.J., Brambl R. Altered gene expression during cold acclimation of spinach // Proc. Nat. Acad. Sci. 1985. Vol. 82, № 5. P. 3673-3677.

135. Guy C.L. Cold acclimation and freezing stress tolerance: role of protein metabolism // Annu. Rev. Plant Physiol, and Mol. Biol. 1990. Vol. 41. P. 187-223.

136. Halperin Т., Zheng В., Itzhaki H., Clarke A.K., Adam Z. Plant mitochondria contain proteolytic and regulatory subunits of the ATP-dependent Clp protease //Plant Mol. Biol. 2001. Vol. 45, № 4. P. 461-468.

137. Hammerton R. W., Ho T.-H. D. Hormonal regulation of the development of protease and carboxipeptidase activities in barley aleurone layers // Plant Phy-sol. 1986. Vol. 80, № 3. P. 692-697.

138. Hammond J.B.W., Preiss J. ATP-dependent proteolytic activity from spinach leaves // Plant Physiol. 1983. Vol. 73, № 4. P. 902-905.

139. Hara-Nishimura I., Shimada Т., Hiraiwa N., Nishimura M. Plant specific insertions in the soybean aspartic proteinases, soy АР 1 and soy AP2, perform different functions of vacuolar targeting // J. Plant Physiol. 1995. Vol. 145. P. 632-640.

140. Hare P.D., Cress W.A., Van Staden J. The involvement of cytokinins in plant responses to environmental stress // Plant Growth Regulat. 1997. Vol. 23, № l.P. 79-103.

141. Hatsugai N., Kuroyanagi M., Yamada K., Meshi Т., Tsuda S., Kondo M., Nishimura M., Hara-Nishmura I. A Plant Vacuolar Protease, VPE, Mediates Virus-Induced Hypersensitive Cell Death // Science. 2004. Vol. 305. P. 855858.

142. Heath M.C. Hypersensitive response-related death // Plant Mol. Biol. 2000. Vol. 44, №3. P. 321-334.

143. Heing В., Ugrinovicc K., Sustar-Vozlic J., Kidric M. Different classes of proteases are involved in the response to drought of Phaseolus vulgaris L. culti-vars differing in sensitivity // J. Plant Physiol. 2004. Vol. 161, № 5. P. 519-530.

144. Hejgaard J. Inhibitory serpins from rye grain with glutamine as PI and P2 residues in the reactive centre // FEBS Lett. 2001. Vol. 488, № 3. P. 149-153.

145. Hejgaard J., Rasmusen S.K., Brandt A., Svendsen I. Sequence Homology between barley endosperm protein Z and protease inhibitors of the alpha-antitrypsin family // FEBS Lett. 1985. Vol. 180, № 1. P. 89-94.

146. Hendrick J.P., Hartl F.U. Molecular chaperone functions of heat-shock proteins // Annu. Rev. Biochem. 1993. Vol. 62. P. 349-384.

147. Hobday S.M., Thurmaen D.A., Barber D.J. Proteolytic and trypsin inhibitory activities in extracts of germination Pisum sativum seeds I I Phytochem. 1973. Vol. 12. P. 1041-1046.

148. Hoeberichts F.A., ten Have A., Woltering E.J. A tomato metacaspase gene is upregulated during programmed cell death in Botrytis cinerea-infected leaves // Planta. 2003. Vol. 217, № 3. P. 517-522.

149. Hou W.-C., Lin Y.-H. Dehydroascorbate reductase and monodehydroascor-bate reductase activities of trypsin inhibitors, the major sweet potato (Ipomoea batatas L. Lam) root storage protein// Plant Sci. 1997. Vol. 128, № 2. P. 151158.

150. Inagaki N., Yamamoto Y., Mori H., Saton K. Carboxyl-ternimal processing protease for the D1 precursor protein: cloning and seguencing of the spinach cDNA // Plant Mol. Biol. 1996. Vol. 30, № 1. P. 39-50.

151. Itzhaki H., Navel L., Lindahl M., Cook M., Adam Z. Identification and characterization of DegP, a serine protease associated with the luminal side of the thylakoid membrane //J. of Biol. Chem. 1998. Vol. 273, № 12. P. 7094-7098.

152. Janowiak F., Maas В., Dorffling K. Importance of abscisic acid for tolerance of maize seedlings // J. Plant Physiol. 2002. Vol. 159, № 6. P. 635-643.

153. Johnston M.K., Jacob N.P., Brodl M.R. Heat shock-induced changes in lipid and protein metabolism in the endoplasmic reticulum of barley aleurone layers // Plant and Cell Physiol. 2006. Vol. 48, № 1. P. 31-41.

154. Jones A.M. Programmed cell death in development and defense // Plant Physiol. 2001. Vol. 125, № 1. P. 94-97.

155. Jones J.T., Mullet J.E. A salt- and dehydration-inducible pea gene, Cypl5a, encode a cell-wall protein with sequence similarity to cysteine proteases // Plant Mol. Biol. 1995. Vol. 28. P. 1055-1063.

156. Jones M.L., Chaffin S.C., Eason J.E., Clark D.G. Ethylene-sensitivy regulates proteolytic activity and cysteine protease gene expression in petunia corollas // J. Exp. Bot. 2005. Vol. 56, № 420. P. 2733-2744.

157. Joshi B.N., Sainani M.N., Bastawade K.B., Gupta V.S., Ranjekar P.K. Cysteine Protease Inhibitor from Pearl Millet: A New Class of Antifungal Protein//Biochem. Biophys. Res. Commun. 1998. Vol. 246, № 2. P. 382-387.

158. Kapri-Pardes E., Naveh L., Adam Z. The thylakoid protease Degl is involved in the repair of photosystem II from photoinhibition in Arabidopsis // The Plant Cell. 2007. Vol. 19, № 3. P. 1039-1047.

159. Kennedy A.R. The Bowman-Birk inhibitor from soybeans as an anticarcino-genic agent//Am. Soc. Clin. Nutrition. 1998. Vol. 68. P. 14065-14125.

160. Kiyosue Т., Yamaguchi-Shinozaki K., Shinozaki K. Characterization of cDNA for a dehydration-inducible gene that encode a CLP A, B-like protein in Arabidopsis thaliana L. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1993. Vol. 196. P. 1214-1220.

161. Koiwa H., Bressan R.A., Hasegava P.M. Regulation of protease inhibitors and plant defense // Trends in Plant Science. 1997 Vol. 2. P. 379-384.

162. Koiwa K., Shade R.E., Zhu-Salzman K., Subramanian L., Murdock L.L., Nielsen S.S., Bressan R.A., Hasegava P.M. Phage display selection can differentiate activity of soybean cystatins // Plant J. 1998. Vol. 14. P. 371-379.

163. Koizumi M. Yamaguchi-Shinozaki К., Tsuji H., Shinozaki К. Structure and expression of two genes that encode distinct drought-inducible cysteine proteinases in Arabidopsis thaliana // Gene. 1993. Vol. 129. P. 175-182.

164. Kolodzieczak M., Kolaczkowska A., Szczesny В., Urantowka A., Knorpp C., Kieleczawa J., Janska H. A higher plant mitochondrial homologue of the yeast m-AAA protease // J.Biol.Chem. 2002. Vol. 277, № 46. P. 43792-43798.

165. Kondo H., Abe K., Arai S. Immunoassay of oryzacystatin occurring in rice seeds during maturation and germination // Agric. Biol. Chem. 1989. Vol. 53. P. 2949-2954.

166. Kreps A.J., Wu Y., Chang H.-S. Transcriptome changes for Arabidopsis in response to salt, osmotic, and cold stress // Plant Physiol. 2002. Vol. 130, № 4. P. 2129-2141.

167. Kusaka K., Tada Y., Shigemi Т., Sakamoto M., Nakayashiki H., Tosa Y., Mayama S. Coordinate involvement of cysteine protease and nuclease in the executive phase of plant apoptosis // FEBS Letters. 2004. Vol. 578, № 3. P. 363-367.

168. Lam E. Controlled cell death, plant survival and development// Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2004. Vol. 5. P. 305-314.

169. Lam E. Vacuolar proteases livening up programmed cell death// Trends Cell. Biol. 2005. Vol. 15. P. 124-127.

170. Laskowski M., Jr., Kato I. Protein inhibitors of proteinases // Annu. Rev. Biochem. 1980. Vol. 49. P. 593-626.

171. Lawrence P.K., Koundal K.R. Plant protease inhibitors in control of the phytophagous insects // Electronic J. of Biotech. 2002. Vol. 5, № 1. P. 1-17.

172. Ledoight G., Giffaut В., Debiton E., Mustel A., Evray G., Maurizis J.C., Madelmont J.C. Analysis of secreted protease inhibitors after water stress in potato tubers // Int. J. Biol. Macromol. 2006. Vol. 38. P. 268-271.

173. Lench M., Herrman R.G., Sokolenko A. Identification and characterization of SppA, a novel-light inducible chloroplast protease complex assotiated with thylakoid membranes // J. Biol. Chem. 2001. Vol. 276, № 36. P. 33645-33651.

174. Levitt J. Responses of plant to environmental stresses. Vol. 1. Chilling, freezing and high temperatures stresses. N.Y. etc.: Acad. Press, 1980, 497p.

175. Liang C., Brookhart G., Feng G.H., Reeck G.R., Kramer K.J. Inhibition of digestive proteinase of stored grain coleoptera by oryzacystatin, a cysteine proteinase inhibitor from rice seed// FEBS Lett. 1991. Vol. 278, №2. P. 139-142.

176. Lindahl M., Spetea C., Hundal Т., Oppenheim A.B., Adam Z., Andersson B. The thylakoid FtsH protease plays a role in the light-induced turnover of the Photosystem IID1 protein // Plant Cell. 2000. Vol. 12, № 3. P. 419-431.

177. Lindahl M., Yang D.-H., Andersson B. Regulatory proteolysis of the major light-harvesting chlorophyll a/b protein of Photosystem II by a light-induced membrane-associated enzymic system // Eur. J. Biochem. 1995. Vol. 231. P. 591-599.

178. Lindorff-Larsen K., Winter J.R. Surprisinfly high stability of barley lipid transfer protein, LTP1, towards denaturant, heat and proteases // FEBS Letters. 2001. Vol. 488, № 3. P. 145-148.

179. Linthorst H.J.M., Van der Does C., Brederode F.T., Bol J.F. Circadian expression and induction by wounding of tobacco genes for cysteine proteinases // Plant Mol. Biol. 1993. Vol. 21. P. 685-694.

180. Lipinska В., Zylicz M., Georgopoulous C. The HtrA (DegP) protein, essential for Escherichia coli survival at high temperatures, is an essential endopepti-dase // J. Bacteriol. 1990. Vol. 172. P. 1791-1797.

181. Lipke H., Fraenkel G.S., Liener I.E. Effects of soybean inhibitors on growth of Tribolium confusum // J. Scien. Food and Agricult. 1954. Vol. 2. P. 410— 415.

182. Lippman S. M., Matrisian L.M. Protease Inhibitors in Oral Carcinogenesis and Chemoprevention // Clin. Cancer Res. 2000. Vol. 6. P. 4599-4603.

183. Liu Y., Dammann C., Bhattacharyya M.K. The matrix metalloproteinase gene GmMMP2 is activated in response to pathogenic infection in soybean // Plant Physiol. 2001. Vol. 127, № 4. P. 1788-1797.

184. Liy X.-Q., Jagendorf A.T. ATP-dependent proteolysis in pea chloroplasts // FEBS Lett. 1984. Vol. 166, № 2. P. 248-252.

185. Majeran W., Wollman F.-A., Vallon O. Evidence for a role of ClpP in the degradation of the chloroplast cytochrome b6f complex // Plant Cell. 2000. Vol. 12. P. 137-149.

186. Malone M., Alarcon J.J. Only xylem-borne factors can account for systemic wound signaling in the tomato plant // Planta. 1995. Vol. 196, № 4. P. 740-746.

187. Martinez D.E., Bartoli C.G., Grbic V., Guiament J.J. Vacuolar cysteine proteases of wheat (Triticum aestivum L.) are common to leaf senescence induced by different factors // J. Exp. Bot. 2007. Vol. 58, № 5. P. 1099-1107.

188. Martinez M., Rubio-Somoza I., Carbonero P., Diaz I. A cathepsin B-like cysteine protease gene from Hordeum vulgare (gene CatB) induced by GA in aleurone cells is under circadian control in leaves // J. Exp. Bot. 2003. Vol. 54, №384. P. 951-959.

189. Maurizi M.R. Protease and protein degradation in E. coli // Experienta. 1992. Vol. 48. P. 178-201.

190. Maurizi M.R., Clark W.P., Kim S.-H., Gottesman S. ClpP represents a unique family of the serine proteases // J. Biol. Chem. 1990. Vol. 265, № 21. P. 12546-12552.

191. Meige M., Mascherpa J., Royer-Spiere A., Grang A., Meige J. Analyse des proteiques isoles de Lablab Pupureus L. Sweet: localization intracellulaire des globulines proteases te inhibiteurs de la tiypsinre // Planta. 1976. Vol. 131. P. 191-186.

192. Melville J.C., Ryan C.A. Chymotrypsine inhibitor I from potato: large scale preparation and the characterization of its subunit component // J. Biol. Chem. 1973. Vol. 247. P. 3415-3453.

193. Mikola J., Suolinna E.M. Purification and properties of an inhibitor of microbial alkaline proteinase from barley // Arch. Biochem. Biophys. 1971. Vol. 144. P. 566-578.

194. Moore Т., Keegsta K. Characterization of с DNA clone encoding a chloro-plast-targeted Clp homologue // Plant Mol. Biol. 1993. Vol. 21, № 3. P. 525537.

195. Morel J.-B., Dangl J.L. The hypersensitive response and the induction of cell death in plants // Cell Death Differ. 1997. Vol. 4. P. 671-683.

196. Morichara К., Oka Т., Tsuzuki H. Proteases activity // Biochim. Biophys. Acta. 1967. Vol. 139, № 2. P. 382-397.

197. Mundi J., Rogers J.C. Selective expression of a probable amylase/protease inhibitor in barley aleurone cells: Comparison to the barley amylase/subtilisin inhibitor//Planta. 1986. Vol. 169, № 1. P. 51-63.

198. Muntz K., Belozersky M.A., Dunaevsky Y.E., Schlereth A., Tiedemann J. Stored proteinases and the initiation of storage protein mobilization in seedsduring germination and seedling growth // J. Exp. Bot. Vol. 2001. Vol. 52. P. 1741-1752.

199. Nair J.S., Ramaswamy N.K. Chloroplast proteases // Biol. Plant. 2004. Vol. 48, №3. P. 321-326.

200. Neurath H. Proteolytic enzymes, past and future // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1999. Vol. 96. P. 10962-10963.

201. Neven L.G., Haskell D.W., Guy C.L. et al. Assoriation of 70-kilodalton heat-shock cognate protein with acclimation to cold // Ibid. 1992. Vol. 99. P. 1362-1369.

202. Nover L., Neumann D., Scharf K.-D. Heat shock and other stress response systems of plants. В.: Springer, 1989. 155p.

203. Oelmuller R., Hermann R.G., Pakrasi H.B. Molecular studies pf CtpA, the carboxyl-terminal processing protease for the D1 protein of the Photosystem II reaction center in higher plants // J. Biol. Chem. 1996. Vol. 271, № 36. P. 21848-21852.

204. Ohad I., Keren N., Zer H., Gong H., Мог T.S., Gal A., Tal S., Domovich Y. Lidht-induced degradation of the photosystem II reaction centre D1 protein in vivo: an integrative approach. In Photoinhibition from molecule to field. 1994. P. 161-177.

205. Okamoto Т., Toyooka, Minamikawa T. Identification of membrane-assotiaed cysteine protease with possible dual role in the endoplasmic reticulum and protein storage vacuole // J. Biol. Chem. 2001. Vol. 276, № 1. P. 742-751.

206. Orlowski R.Z. The role of the ubiquitin-proteasome pathway in apoptosis // Cell Death Differ. 1999. Vol. 6. P. 303-313.

207. Ostersetzer O., Kato Y., Adam Z, Sakamoto W. Multiple intracellular locations of Lon protease in Arabidopsis: evidence for localization of AtLon4 to chloroplasts // Plant and Cell Physiol. 2007. Vol. 48, № 6. P. 881-885.

208. Pallen M.J., Wren B.W. The HtrA family of serine proteases // Mol. Microbiol. 1997. Vol. 26, № 2. P. 209-211.

209. Pannetier C., Giband M., Couzi P., Letan V., Mazier M., Hau B. Introduction of new traits into cotton through genetic engineering: insect resistance as example //Euphytica. 1997. Vol. 96. P. 163-166.

210. Parida A.K., Das A.B., Mittra В., Mohanty P. Salt-stress induced alterations in protein profile and protease activity in the mangrove Bruguiera parviflora II Z. Naturforsch. 2004. Vol. 59. P. 408^414.

211. Pena L.B., Tomaro M.L., Gallego S.M. Effect of different metals on protease activity in sunflower cotyledons // Electronic J. of Biotech. 2006. Vol. 9, №. 3.P.25 8-262.

212. Pernas M., Sanches-Monge R., Salcedo G. Biotic and abiotic stress induce cystatine expression in chestnut // FEBS Letters. 2000. Vol. 467, № 2-3. P. 206-210.

213. Pladys D., Vance C.P. Proteolysis during development and senescence of effective and plant gene-controlled ineffective alfalfa nodules // Plant Physiol. 1993. Vol. 103, № 2. P. 379-384.

214. Poerio E., Carrano L., Garsillo A., Buonocke V. A trypsin inhibitor from the water-soluble protein fraction of wheat // Phytochem. 1989. Vol. 28, № 3. P. 1307-1311.

215. Puente X.S., Lopez-Otin C.A. Genomic Analysis of Rat Proteases and Protease Inhibitors // Genome Biol. 2004. Vol. 14. P. 609-622.

216. Reviron M.P., Vartanian N., Sallantin M., Huet J.C., Pernollet J.C., De Vi-enne D. Characterization of a novel protein induced by progressive or rapid drought and salinity in Brassica napus leaves // Plant Physiol. 1992. Vol. 100, №4. P. 1486-1493.

217. Richardson M. Theproteinase inhibitors of plants and microorganisms // Phytochem. 1977. Vol. 46, № 2. 3. 159-169.

218. Rivett A.J. Proteasomes: multicatalitytic proteinase complexes // Biochem. 1993. Vol. 29, № l.P. 1-10.

219. Rodrigo I., Vera P., Conejero V. Degradation of Tobacco Pathogenesis-Related Proteins 1 Evidence for Conserved Mechanisms of Degradation of Pathogenesis-Related Proteins in Plants // Eur. J. Biochem. 1989. Vol. 184, № 3. P. 663-669.

220. Rodrigo I., Vera P., van Loon L.C., Conejero V. Degradation of tobacco pathogenesis-related proteins in plants // Plant Physiol. 1991. Vol. 95, № 3. P. 616-622.

221. Rojo E., Martin R., Carter C., Zouhar J., Pan S., Plotnikova J., Jin H., Panaque M., Sanches-Serrano J.J., Baker В., Ausubel F.M., Raikhel N.V. // Curr. Biol. 2004. Vol. 14. P. 1897-1906.

222. Rosenkrands I., Heigaard J., Rasmussen S.K., Bjorn S.E. Serpins from wheat grain //FEBS Lett. 1994. Vol. 343, № 1. P. 75-80.

223. Roy D.N., Singh M. Psophocarpin Bl, a storage protein of Psophocarpus tet-ragonolobus, has chymotrypsin inhibitory activity // Phytochemistry. 1988. Vol. 27. P. 31-34.

224. Ryan C., Walker-Simmons M. Plant proteinases // Biochem. Plant. 1981. P. 321-349.

225. Ryan C.A. Protease inhibitors in plants: genes for improving defenses against insects and pathogens 11 Ann. Rev. Phytopath. 1990. Vol. 28. P. 425449.

226. Ryan C.A. The systemin signaling pathway: differential activation of plant defensive genes // Biochim. Biophys. Acta. 2000. Vol. 1477, № 1-2. P. 112121.

227. Ryan C.A. Proteolytic Enzymes and Their Inhibitors in Plants // Annu. Rev.Plant. Physiol. 1973. Vol. 24. P. 173-196.

228. Salmia M.A. Inhibitors of endogenous proteinases in scots pine seeds: fractionation and activity changes during germination // Physiol. Plant. 1980. Vol. 48. P. 266-270.

229. Sanmartin M., Jaroszewski L., Raikhel N.V., Rojo E. Caspases. Regulating death since the origin of life // Plant Physiol. 2005. Vol. 137, №3. P. 841-847.

230. Schaffer M.A., Fisher R.L. Transcriptional activation by heat and cold of a thiol protease gene in tomato // Plant Physiol. 1990. Vol. 93, № 4. P. 14861491.

231. Schuler Т.Н., Poppy G.M., Kerry B.R., Denholm I. Insect-resistant transgenic plants // Trends Biotechnol. 1998. Vol. 16. P. 168-175.

232. Segarra C.I., Casalongue C.A., Pinedo M.L., Ronchi V.P., Conde R.C. A germin-like protein of wheat leaf inhibits serine proteases // J. Exp. Bot. 2003. Vol. 54, № 386. P. 1335-1341.

233. Seggarra C.h, Casalongue C.A., Pinedo M.L., Cordo C.A., Conde R.D. Changes in wheat leaf extracellular proteolytic activity after infection with Sep-toria tritici // J. Phytopathol. 2002. Vol. 150, № 3. P. 105-111.

234. Sgarbieri V.C., Gupte S.M., Kramer D.E., Whitaker J.R. Ficus enzymes. I. Separation of the proteolytic enzymes of Ficus carica and Ficus glabrata lattices //J, Biol. Chem. 1964. Vol. 238. P. 2170.

235. Shankin J., DeWitt N.D., Flangan J.M. The stroma of higher plant plastids contain ClpP and ClpC, functional homologs of Escherichia coli ClpP and

236. ClpA: an archetypal two-component ATP-dependent protease // The Plant Cell. 1995. Vol. 7, № 10. P. 1713-1722.

237. Sinvany-Villalobo G., Davydov O., Ben-Ari G., Zaltsman A., Raskind A., Adam Z. Expression in multigene families. Analysis of chloroplast and mitochondrial proteases //Plant Physiol. 2004. Vol. 135, № 3. P. 1336-1345.

238. Solomon M., Belenhi В., Delledonne M., Menachem E., Levine A. The involvement of cysteine proteases and protease inhibitor genes in the regulation of programmed cell death // Plant Cell. 1999. Vol. 11, № 3. P. 431-443.

239. Sonezaki S., Okita K., Oba Т., Ishii Y., Kondo A., Kato Y. Protein substrates and heat shock reduce the DNA-binding ability of Escherichia coli Lon protease//Appl. Microbiol. Biotechnol. 1995. Vol. 44. P. 484-488.

240. Stankovic В., Davies E. Both action potential and variation potentials induce proteinase inhibitor gene expression in tomato // FEBS Lett. 1996. Vol. 390, № 3. P. 275-279.

241. Storey R.D. Plant endopeptidases. In Plant Proteolytic Enzymes. 1986. Vol. 29. P. 119-135.

242. Su W., Lin C., Wu J., Li K., He G., Qian X., Wei C., Yang J. Molecular cloning and expression of a cDNA encoding Lon protease prom rice (Oriza sa-tiva) // Biotechnol. Lett. 2006. Vol. 28. P. 923-927.

243. Subbaiah C.C., Kollipara K.P., Sachs M.M. A Ca2+-dependent cysteinepro-tease is assotiated with anoxia-induced root tip death in maize // J.Exp. Bot. 2000. Vol. 51, № 345. P. 721-730.

244. Svensson В., Asano K., Jonassen I., Poulsen F.M., Mundi J., Svedsen I. A 10 kD barley seed protein homologous with an alpha-amylase inhibitor from Indian finger millet // Carlsberg Res. Commun. 1986. Vol. 51, № 7. P. 493500.

245. Talanova V.V., Titov A.F., Endogenous abscisic acid content in cucumber leaves under the influence of unfavourable temperatures and salinity // J. Exp. Bot. 1994. Vol. 45. P. 1031-1033.

246. Thomashow M.F. Role of cold-responsive genes in plant freezing tolerance //Ibid. 1998. Vol. 118, № l.P.1-7.

247. Tian M., Bendetti В., Kamoun S. A Second Kazal-Like Protease Inhibitor from Phytophthora infestans Inhibits and Interacts with the Apoplastic Patho-genesis-Related Protease P69B of Tomato // Plant Physiol. 2005. Vol. 138, № 3.P. 1785-1793.

248. Tian M., Huitema E., da Cunha L., Torto-Alalibo Т., Kamoun S. A kazal-like extracellular serine protease inhibitor from Phytophtora infestans targets the tomato pathogenesis-related protease P69B // J. Biol. Chem. 2004. Vol. 279, № 25. P. 26370-26377.

249. Tian R.-H., Zhang G.-Y., Yan C.-H., Dai Y.-R. Involvment of poly (ADP-ribose) polymerase and activation of caspase-3-like protease in heat shock-induced apoptosis in tobacco suspension cells // FEBS Letters. 2000. Vol. 474, № l.P. 11-15.

250. Tomashow M. Plant cold acclimation: freezing tolerance genes and regulatory mechanisms // Annu. Rev. Plant Physiol. 1999. Vol. 50. P. 571-599.

251. Tomashow M. So what's new in the field of plant cold acclimation? // Plant Physiol. 2001. Vol. 125, № 1. P. 89-93.

252. Turk V., Bode W. The cystatins: protein inhibitors of cysteine proteinases // FEBS Lett. 1991. Vol. 285, № i2. P. 213-219.

253. Urwin P., Atkinson H.J., Waller D.A., McPherson M.J. Endineered oryza-cystatin I expressed in hairy root confers resistance to Globodera pallida // Plant J. 1995. Vol. 8, № l.P. 121-131.

254. Urwin P.E., Atkinson H.J., McPherson M.J., Involvment of the Nonterminal region of oryzacystatine-I in cysteine proteinase inhibition // Protein Eng. 1995. Vol. 8. P. 1303-1307.

255. Urwin P.E., Liley C.J., McPherson M.J., Atkinson H.J. Resistance to both and rootnot nematodes conferred by transgenic Arabidopsis expressing a modified plant cystatin // Plant J. 1997. Vol. 12, № 2. P. 455-461.

256. Vera P., Cohejero V. Pathogenesis-related protein of tomato: P-69as an alkaline endoproteinase // Plant Physiol. 1988. Vol. 87, № 1. P. 58-63.

257. Vera P., Yago J.H., Cohejero V. Immunogold localization of the citrus exo-cortis viroid-induced pathogenesis-related proteinase P69 in tomato leaves // Plant Physiol. 1989. Vol. 91, № 1. P. 119-123.

258. Vierling E. The role of heat shock protein in plants // Annu. Rev. Plant Phy-sol. and Plant Mol. Biol. 1991. Vol. 42. P. 579-620.

259. Wagstaff C., Leverentz M.K., Griffiths G., Thomas В., Chanasut U., Stead A.D., Rogers H.J. Cysteine protease gene expression and proteolytic activity during senescence of Alstromeria petals // J. Exp. Bot. 2002. Vol. 53. P. 233— 240.

260. Wasternack C., Parthier B. Jasmonate-signalled plant gene expression // Trends in Plant Scien. 1997. Vol. 2. P. 302-307.

261. Watanabe N., Lam E. Recent advance in the study of caspase-like proteases and Bax inhibitor-1 in plants: their possible roles as regulator of programmed cell death // Mol. Plant Pathol. 2004. Vol. 5, № 1. P. 65-70.

262. Welham Т., O'Neill M., Johnson S., Wang T.L., Domoney C. Expression patterns of genes encoding seed trypsin inhibitors in Pisum sativum// Plant Sci. 1998. Vol. 131, № l.P. 13-24.

263. Wildon D.C., Thain J.F., Minchin P.E.H., Gubb I.R., Reilly A.J., Skipper Y.D., Doherty H.M., O'Donnel, Bowles D.J. Electrical signaling and systemic proteinase inhibitor induction in the wounded plants // Nature. 1992. Vol. 360. P. 62-65.

264. Wisniewski К., Zagdanska В., Genotype-dependent proteolytic response of spring wheat to water deficiency // J. of Exp. Botany. 2001. Vol. 52, № 360. P. 1455-1463.

265. Woltering E.J., Bent A., Hoeberichts F.A. Do plant caspases exist? // Plant Physiol. 2002. Vol. 130, № 4. P. 1764-1769.

266. Xu F., Chye M. Expression of cysteine proteinase during developmental events associated with programmed cell death in brinjal // Plant J. 1999. Vol. 118. P. 321-327.

267. Yamada K., Shimada Т., Kondo M., Nishima M., Hara-Nishima I. Multiple functional proteins are produced by cleaving Asn-Gln bonds of a single precursor by vacuolar processing enzyme // J. Biol. Chem. 1999. Vol. 274, № 4. P. 2563-2570.

268. Yamada K., Shimada Т., Nishimura M., Hara-Nishimura I. A VPE family supporting various vacuolar functions in plants // Physiol. Plant. 2005. Vol. 123. P. 369-375.

269. Yamada-Inagawa Т., Okuno Т., Karata K., Yamakana K., Ogura T. Conserved pore residue in the AAA protease FtsH are important for proteolysis and coupling to ATP hydrolysis // J. Biol. Chem. 2003. Vol. 278, № 50. P.50182-50187.

270. Yamamoto Y., Akasaka T. Photosynthesis: from Light to Biosphere // In Photosynthesis: from light to biosphere, ed. P. Mathis IV. 1995. P. 267-270.

271. Yao N., Tada Y., Park P., Nakayashiki H., Tosa Y., Mayama S. Novel evidence for apoptotic cell response and differential signals in chromatin condensation and DNA cleavage in victorin-related oats // Plant J. 2001. Vol. 28, № 1. P. 13-26.

272. Yeh K.W., Lin M.L., Tuan S.J., Chen Y.M., Lin C.Y., Kao S.S. Sweet potato (Ipomea batatas) trypsin inhibitors expressed in transgenic tobacco plants confer resistance against Spodoptera litura // Plant Cell Report. 1997. Vol. 16. P. 696-699.

273. Zaltsman A., Ori N., Adam Z. Two types of FtsH protease subunits are required for chloroplast biogenesis and photosystem II repair in Arabidopsis II The Plant Cell. 2005. Vol. 17, № 10. P. 2782-2790.

274. Zheng В., Halperin Т., Hruskova-Heidingsfeldova O., Adam Z., Clarke A.K. Characterization of chloroplast Clp proteins in Arabidopsis: localization, tissue specificity and stress responses // Physiol. Plant. 2002. Vol. 114. P. 92-101.

275. Zhivotovsky B. From the nematode and mammals back to the pine tree: on the diversity and evolution of programmed cell death // Cell Death Differ. 2002. Vol. 9. P. 867-869.

Информация о работе

Фролова, Светлана Анатольевна
кандидата биологических наук
Петрозаводск, 2008
ВАК 03.00.04

Диссертация

Влияние низкой температуры на активность протеиназно-ингибиторной системы растений - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы