Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Состояние протеолиза в процессах пролиферации клеток тимуса и опухолей

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Состояние протеолиза в процессах пролиферации клеток тимуса и опухолей"

ШНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ СИБИРСКИЙ ЫВДЦИНСКИЯ УНИВЕРСИТЕТ

На правах рукописи

ИОПШЮВА Ольга Евгеньевна

уда 577.156.1:576.3/4

СОСТОЯНИЕ НРОТЕОЛИЗА В ПРОЦЕССАХ" ПРОЖЕРЛЦИИ КЛЕТОК ИМУСА И ОПУХОЛЕЙ

03.00.04 - Биохимия

Автореферат Диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Томск - 1992

У-

/

/

Рабата выполнена на кафедре биохимии медико-биологпчьс-кого факульета Сибирского медицинского университета

Научный руководитель: кандидат биологических нау.: Г.Л.Суханова

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор г1'.С.Федорова доктор медицинских наук, профессор Н.Н.Маянская

Ведущее -учреадение: Институт биологической и кедицннсйой химии РЛН г.Москва.

Защита состоится " " ¿¿/¿-У/..)'__1992 года с______ч.

на заседании специализированного Совета Д.004.28.01 Сибирского медицинского университета (634050, г.Томск, Московский тракт, 2).

С диссертацией ыэ)ШО ознакомиться в научной библиотеке Сибирского медицинского университета (г.Томск, Ир.Ленина,107).

Автореферат разослан "" года

Ученый секретарь специализированного Совета, доктор медицинских наук,

профессор ' Э.И.Белоборсдова

'? ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

' i • Л:»'АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. Изучение механизмов контроля пролиферации иммунокомпетентных и опухолевых клеток является одной из проблем современной биохимии. Особое значение в этом плана имеет исследование ограниченного протеолиза с участием протео-литических ферментов, их активаторов и ингибиторов, продуктов, протеолиза. Протеолитические ферменты выполняют самые разнообразные функции в организме. Катализируя процессы распада белка в клетке, протеиназы участвуют в необратимых катаболических реакциях. В результате ограниченного протеолиза образуются нейропептиды, ангиотензины, брадикйнин, факторы роста, гормоны тимуса, представляющие собой биологически активные вещества -регуляторы метаболических и физиологических функций [В.В.Мосолов, 197I; О.А.Гомазков, 1988; В.Н.Орехович, Л.А.Локшина,1984].

Протеолитические ферменты, как известно, способны стимулировать синтез ДНК и ускорять вступление клеток в митоз [H.H. Маянская,1977; Л.Г.Прокопенко, 1987; a.L.e>*tooa} 1974] . В меньшей степени исследована роль плазменного протеолиза, взаимосвязь плазменного и тканевого протеолиза в регуляции процессов метаболизма.и деления клеток. Между тем, изучение этих процес-' сов является актуальным для направленного воздействия на мито-генез лимфоцитов и трансформацию опухолевых клеток.

Установлено, что в регуляции митотической активности клеток тимуса - центрального органа иммунитета, принимает участив брадикинин, известный вазооктивнай пептид, образующийся в результате активации кининоаой системы плазмы крови. Являясь биологически активным веществом, брадикинин увеличивает синтез ДНК в тимоцитах, iслетках костного мозга, фибробластах [j.F.

(j.R.MacMaftuSjD.J.GLt£an, 1970; Г.Л.Суханова, Т.К.

Клишзнтьева, Г.А.Докшина, 1977; F. ГАахссаи, 198б] - Изуче-1ше участия брадикинина как продукта плазменного протеолиза в регуляции активности лимфоцитов и клеток опухоли необходимо для понимания взаимосвязи процессов тканевого и плазменного протеолиза с пролиферацией нормальных и неопластически трансформированных клеток,

Протеолитические системы плазмы крови, как известно, действуют по каскадному принципу с чередованием неактивных, активирующих и тормозящих активность компонентов, что позволяет в случае необходимости существенно ускорять физиологические процессы в организме, а также тонко регулировать их на каждом этапе [ Л.А.Локшна,1977; A.M.Чернух, О.А.Гомазков, 1076 ] . Контроль каскадных протеолитических систем осуществляется благодаря мощной системе ингибиторов, которые полностью или частично литят ферменты каталитической активности. Ингибиторы протеолиза способны модифицировать лротиферативцую _активность клеток: Á.¡ -Протеиназный ингибитор, -макроглобулин подавляют ответ лимфоцитов крови на ФГА я Ион А [Ф.С.-Барвнова, 1980; S.H.bxHi, 1983; V. James , I960] , «соитрикал снижает прививаемость я метастазяройание опухолевых клеток [о.Б. Мишин, 1982 3 . Исследование антипролиферативного вффек-та ингибиторов лротеинаэ имеет теоретическое и практическое значение.

1ЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ. Цель работы оаклвчается в изучении внутриклеточного и плазменного протеолиза в условиях активации лимфоцитов и при опухолевом росте.

Были поставлены следующие задачи; I. Исследовать (активность протеолитических ферментов лимфоцитов периферической крови человека, клеток тимуса и опу-

холей мышей. Установить дозовуа зависимость пролифератив-ного эффекта брадикинина, связь с активностью катепсина Д и эластазы этих клеток.

2. Изучить состояние протеолиза тканей и шазмы крови итакт-ных мышей: активность катепсина Д, эластазы тииуса и печени, -протеиназного ингибитора, ¿х -иакроглобулиьа, трипсина и эластазы плазш кроки.

3. Провести анализ состояния протеолиза при опухолевой росте в сингенных и аллогенных условиях.

4. Выявить взаимосвязь тканевого и плазменного протеолиза, значение ингибиторов при опухолевом'росте в условиях модификации брадикишноы и контрикалом. ■

НАУЧНОЕ ЗНАЧЕНИЕ И НОВИЗНА РАВ01Ы. Проведана комплексная оценка тканевых,плазменных протеиназ и ингибиторов а регуляции процессов пролиферации лимфоцитов крови, клеток тимуса и опухолей.

Выявлен разный характер пролиферативного ответа клеток в зависимости от активности протеолитических ферментов. Впервые представлены доказательства взаимосвязи брадикинина, испольэуе-шэго я качестве стимулятора пролиферации, с. катепсином Д, эдас-тазой тимуса, лимфоцитов крови, клеток трансплантируемых опухолей.

Установлена взаимосвязь активности протеиназ и их ингибиторов в пролиферативных процессах. Впервые обнаружены новые свойства брадикинина ингибировать активность трипсина, усиливать активность -макроглобулина плазмы крови. Представлены различия в регуляции состояния протеолиза сингенных и аллергенных опухолей при участии брадикинина и контрикала.

ПРАШЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ. Работа содержит данные фуццамонтального характера о состоянии протеолиза лимфоцитов крови, тимуса и опухолевых клеток, что представляет новый раздел биохимии, раскрызащий проблему регуляции размножения клеток. Характеристика состояния протеолиза мышей линии BAIB/с и беспородных мышей, приведенная в работе, необходима для направленного подбора опытных животных при планировании медико-биологического эксперимента. Перспективный является использование брадикинина в качестве митогена для постановш реакции бласттрансформации лимфоцитов. Способность брадикинина стимулировать пролиферацию клеток тимуса, и ингибировать протеиназц плазмы крови, увеличивая активность -макроглобулина, позволяет рекомендовать его в качестве иммуномодулятора и ингибитора протеолиза.

АПРОБАЦИЯ. Основные положения диссертационной работы доложены на всесоюзных конференциях "Фундаментальные науки - медицине и здравоохранению" (Иркутск,1989), "Биохимия опухолевой клетки" (Минск,1990), на конференции молодых ученых (Томск, 1989), конференции Томского отделения Российского биохимического общества (1991), а также на научных конференциях ЦНШ1 и медико-биологического факультета Томского медицинского института (1988-1992), '

ПУБЛИКАЦИЯ. По материалам диссертации опубликовано 7 научных работ.

Объем работы. Диссертация изложена на 175 страницах машинописного текста, включает 3 схемы, 21 рисунок, 25 таблиц. Библиографический указатель содержит 231 литературный источник, из них 112 - отечественных.

ПОЛОЖЕНИЯ, ШНОСИШЕ НА ЗАЩЙ1У

1. Увеличение активности катепсина Д и эластазы является критерием стимуляции клеток тимуса и рассматривается как биохимический показатель интенсивности роста опухолей в ал-логенных и сингенных условиях.

2. Брвдикинин-продукт плазменного протеолиза - увеличивает ми-тотическув активность лимфоцитов крови, клеток тимуса, что сопровождается угнетением активности протеиназ плазмы крови. Действие контрикала, в отличие от брадикинина, заключается

в более выраженном ингибировании плазменного протеолиза.

3. Более высокий исходный уровень протеолиза мышей линии ВА1В/с способствует развитию масгоцитомы Р-815. В процессе опухолевого роста происходит увеличение активности трипсина, эластазы плазмы крови, угнетение активности протеин^ тимуса, что сопровождается повышением отношения А1 Щ/Х^ЫГ.

4. Стимуляция брадикинином пролиферации клеток тимуса и инги-бирование контрикалом плазменного протеолиза представляют реакции, направленные на торможешш опухолевого роста.

СОДЕРЖАНИЕ РАБ01Ы МАТЕРИАЛЫ И МйТОДН. В работе использовали 760 мышей линии-ВА1В/с и беспородных мышей, самцов, весом 18-20 г. Все животные были разделены на 4 группы (табл.1).

У животных извлекали тимус, печень, собирали плазму крови. Суспензию клеток тимуса получали продавливанием через капроновый фильтр и отмыванием в 0,25 М растворе сахарозы, приготовленном на О.ОЬ М трис-НСг буфере (рН=»7,4). На этом же растворе готовили 10$ гомогенат печени. Плазму крови получали центрифугированием крови с добавлением 3,8% раствора цитрата натрия в тече-

Таблица I.

Характеристика экспериментальных групп животных

группа Характеристика

Мыши беспородные и линии BAIB/с используемые в качестве контроля.

Мыши, которым внутривенно вводили брадикинин (Реа-нал, Венгрия) в дозах I ыкг/кг и I ыг/кг массы тела или контрикал (VЕВ,Германия) в дозе 750 Е/кг. Состояние протеолиза изучали через 2,4,6 часов и 1,3,7 суток после введения препаратов.

Мыаш-опухоленосители. В качестве аллогенной опухоли использовал и карциному Эрлиха, трансплантируемую беспородным ыьшам. Мытам линии BAIB/с перевивали сингенную по комплексу Н^ -гистосовместимос-тн мастоцитому P-8I5. Опухоли Р-Щ5 и Эрлиха перевивали вцутрибршинно в количестве'2'10 и 7'10 клеток. Опухоли росли в асцитной форме, отличаясь по скорости роста. Время исследования опухоли Эрлиха составило 1,2,5,8 сутки, а опухоли P-8I5 -3,5,7,8,10,14 сутки после перевивки опухоли.

Ыыши-рпухоленоснтели при введении брадикинина (I мкг/кр й I мг/кр) и контрикала (750 Е/кг). Беспородным мышаы брадикинин вводили через I сутки посла перевивки опухоли Эрлиха. Мышам линии ВА1В/с брадикинин вводили через 3,7 суток после трансплантаций мастоцитомы P-8I5, контрикал - через 7 суток. Показатели протеолиза определяли через 2,4,6 часов и 1,3,7 сутки после введения препаратов.

ние 15 мин при ЗООО об/мин.

Ыитотическув активность клеток тимуса изучали ыетафазным ыетодом с предварительным введением мышам 0,2 ыл 0,0^ раство-■ ра колхицина за-2 часа до докапитации. Для характеристики роста

I

г

з

4

опухоли подсчитывали количество клеток карциномы Эрлиха и мастоцитомы P-8I5, соответственно, на Q и 14 сутки пйсла перевивки, пользуясь камерой Горяева.

Лимфоциты венозной крови доноров отделяли в присутствии 1% раствора желатины при 37°С, культивировали в течение 3 суток. Пролиферативцую активность лимфоцитов крови оценивали по включению %-тимидина в реакции бласттрансфорыации. Микропланшеты, содержащие 2'10** лимфоцитов, 10 мкг/кг ФГА или брадики-нина в концентрации 30"^ - 2 "10"® М инкубировали в термостате с 5% содержанием COg при температуре 37°С. За 24 часа Д0 окончания опыта в каждую лунку вносили I ыкСи %-тимидина. Клетки осаждали на фильтрах "Владипор" с диаметром лор 0,45 мкм с помощью специального устройства, промывали 5S6 раствором ТХУ,

раствором этанола высушивали и помещали в виалы о 5 мл сцинтилляциокной жидкости следущего состава: 5 г 2,5-динитро-фенилоксазола и 0,1 г I,4-ди-5-фекил-2-оксазояил-бенэола »a I литр толуола. Радиоактивность измеряли в иыл/ыин на счетчике Matfc -III.

В условиях La vdio также была изучена доэовая зависимость эффектов брадикинина на активность трипсина плазмы крови и ка-тепсина Д опухоли P-8I5 при добавлении его в среду инкубации в

g к

концентрациях 10 -10 ° М.

Активность кателсина Д (К5.Э.4.23.5) определяли спектрофо-тометрически по гидролизу гемоглобина и выражали в ныоль тир/ш на I мг белка, активность эластазы СКФ.3.4.23.11) - ао образованию продукта гидролиза бутил-океикарбонил-Lвланин- ß -нитро-анилида (БАНЭ), выражали в мкыоль БА11Э/мин на I мг белка. Для определения активности трипсина (КФ.3.4.21.4). использовали Ы -бензоил- L аргинин- _Я -нитроанилид (БАПНА), активность фермен-

та выражали в мЕ/мл. Активность ¿¿-протеииазного ингибитора и /•г-макроглобулина определяли унифицированным спектрофотометри-ческим методом по торможению гидролиза N -бензоил-1_ аргинин -этилового эфира (БАЭЭ) и выражали в условных ингибиторных едини -цах (ИЕ/мл). Количество белка определяли микробиуретовым методом.

Полученные данные обработаны статистически с применением пакета прикладных программ ( ВллйР ,19Ь5 г.) для сравнительного, двухфакторного дисперсионного анализа, а также дискрими-нантного анализа, частой и множественной корреляции,.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОЕСЗОДЕНИЁ

Для изучения пролиферативной активности и состояния про-теолиза лимфоцитов крови были проведены опыты по определению

о

интенсивности включения Н-тиыидина в ДНК и активность катеп-сина Д под влиянием известного митогена ФГА, а также установлена дозовая зависимость эффекта брадикинина (табл.2).

Таблица 2

л /

Включение Н-тимидина (имп/мин) и активность катепсина Д (нмоль тир/мин на I мг белка) лимфоцитов крови, культиви-' руемых с ФГА и брадикинином.

Показатель кон— ^ч^ центра-^«, ция митогенй^. Включение ^Н-тими-дина Активность катепсина Д

I сутки 3 суток I сутки 3 суток

Контроль ¡»ГА 10 мкг/мл Брадикинин Ю"5 Ы Брадикинин 10~9 Ы 253,4+26,7 332,£¡52,0 р>0,05 1014,3+101,6 р<0,05 266,3+32,2 р>0,05 399,0+67,4 1104,7+45,7 р< 0,05 973,2+107,4 р<0,05 2204,9+597,9 р<0,05 0,60+0,04 0,73+0,05 р<0,05 о,за+о,съ р<0,05 0,60+0,03 р > 0,05 ' 0,60+0,04 0,50+0,03 р<0Т05 0,56+0,05 р > 0705 .0,45+0,05 р< 0,05 '

Использована данные 10-12 опытов.

ФГА не влияет на вюшчение ^Н-тимидина через I сутки и стимулирует синтез ДНК через 3 суток культивирования клеток. Брадикинин увеличивает включение тимидина через I сутки (Ю~5М). Доза 10"% оказалась наиболее эффективной через 3 суток после добавления брадикинина о культуру лимфоцитов. Индекс стимуляции лимфоцитов"в этом случае составил 5,5 .

Активность катепсина Д повышается под влиянием ЙГА через I сутки, а через 3 суток, при его максимальном митогенном действии, активность фермента понижается на 17$. Аналогичная зависимость наблюдается для брадикинина. Стимуляция брадикини-ном включения Н-тимидина сопровождается угнетением активности

с

катепсина Д лимфоцитов. Брадикинин в концентрациях 10 М и-10"% снижает активность катепсина Д на 50$ и 25$, соответственно.

Таким образом, брадикинин, также как ЙГА, способен стимулировать пролиферативную активность лимфоцитов крови, что сопровождается угнетением активности катепсина Д.

При внутривенном введении брадикинина мьягам в дозе I ыг/кг наблюдается увеличение митотической активности клеток тимуса. Митотический индекс возрастает через 2 часа с 1,04+0,08 до 1,80+0,15 (р^0,05) и сохраняется на повышенном уровне через 7 суток (2,39+0,20).

Клетки тимуса имеют высокую активность катепсина Д, отличаясь более, чем в 20 раз от лимфоцитов крови. Общая активность катепсина Д тимуса равняется 15,9+0,6 нмоль тир/мин на I мг белка, свободная - 5,5+0,3 нмоль тир/-мин на I мг белка. Эффект брадикинина на активность катепсина Д тимуса зависит от дозы препарата, что было подтверждено методом двухфакторного дисперсионного анализа. В дозе I мкг/кг брадикинин угнетает, а в дозе

I мг/кг - увеличивает активность катепсина Д. Повышение свободной активности катепсина Д тимуса под влиянием брадикинина происходит с максимумом через б часов, общей - через I сутки, соответственно, в 2,2 й 1,7 раза. Активность эластазы тимуса мышей после введения брадикинина также повышается, но в меньшей степени, чем активность катепсина Д. Экскреция лизосомальных протеиназ, как известно, является необходимым этапом активации макрофагов, цитотоксических лимфоцитов [в.А.Ляшенко, В.А.Дро-иенников, И.М.Ыолотковская, 1988] , и, возможно, что увеличение общей активности катепсина Д под влиянием брадикинина свидетельствует об активации яммунокомпетентных клеток.

Таким образом, стимуляция пролиферации клеток тимуса под влиянием брадикинина сопровождается увеличением активности катепсина Д.

Способность брадикинина стимулировать пролиферативную активность и активность катепсина Д тимуса.имеет отношение к регуляции опухолевого роста. В связи с этим было исследовано влия-1 ние : брадикинина на пролиферативную активность опухолевых клеток (табл.3). - .

Таблица 3

Количество клеток (млн/мл) опухолей Эрлиха и Р-815 щ и введении брадикинина

. ( Карцинома Эрлиха Мастоцитома Р-815

1 сутки 3 суток 7 суток

Контроль 1 62,7+8,5 53,8+10,7 53,8+10,7

Ерадикинин 1 ыкг/кг 108,2+14,9 75,0+24,5 58,511,9

0,05 Р<;0,05 * Р> 0,05

Ерадикинин I мг/кг .16,2+2,9 46,0+5,7* 79,9+12,9

Р<0,05 Р<0,05 Р«£ 0,05

Представлены данные 6-8 опытов.

Брадикинин в дозах I мкг/кг и-1 мг/кг вводили через I сутки после перевивки опухоли Эрлика и через.3,7 суток после трансплантации мастоцитомы Р-815, количество клеток подсчитывали соответственно через 8 и 14 суток. Установлено, что брадикинин в дозе I мкг/кг увеличивает количество клеток карциномы Эрлиха и мастоцитомы Р-815 на 70% и 39$, соответственно, и не изменяет их количества через 7 суток после перевивки опухоли Р-815. После введения брадикинина в дозе I мг/кг на ранних стадиях развития опухоли (I и 3 сутки) наблюдается торможение роста карциномы Эрлиха на 74$ и мастоцитомы Р-815 на 135?. Однако введение брадикинина в этой дозе на стадии сформировавшейся опухоли стимулирует рост мастоцитомы Р-815.

Таким образом, брадикинин способен индуцировать и тормозить процессы канцерогенеза в зависимости от применяемой дозы и стадии развития опухоли.

Известно, что противоопухолевым эффектом могут обладать как вещества с антилролиферативной активностью (антибиотики, кейлоны), так и стимуляторы пролиферации иммунокомпетентных клеток [Ю.Л.Романов, С.А.Кетлинский, 1984; Е.Д.Гольдберг, В,В. Новицкий, 1906; Ю.Б.Гриневич,1988] . Однако активация иммуно- . компетентных клеток может и усиливать рост опухолей [с.А.Станкевич, В.И.0греба,1990; и.т. Рхе1т.198з] . Известно, что рост опухоли сопровождается иммунодепрессией [Р.В.Петров,1982, В.С.Калинин, 1980] , и, вероятно, в поздние стадии развития опухоли на этом фоне проявляется эффект брадикинина как стимулятора пролиферации опухолевых клеток.

Результата изучения активности катепсина Д клеток опухолей Эрлиха и Р-815 представлены в табл.4. В связи с разной скоростьо роста опухолей для карциномы Эрлиха взяты более рашие сроки

после перевивки, чем для мастоцитоми Р-815.

Таблица 4

Активность катепсина Д (нмоль тир/мин на I мг белка) опухолевых клеток.

Карцинома Эрлиха Мастоцитома Р-815

5 сутки * 5,5+0,3 8 сутки 6,7*1,3 рг.0,05 8 сутки 9,8+1,8 14 сутки 18,4+4,9 рс0,05

В процессе" развития опухолей активность катепсина Д повышается, о чем свидетельствуют более высокие значения активности катепсина Д опухолей Эрлиха и Р-815 в поздние сроки. Известно, что увеличение активности дротеиназ опухолевых клеток способствует деградации окружающей нормальной ткани, обеспечивает инвазию и метастазирование, Опухоли, имеющие повышенную активность протеолитических ферментов, характеризуются выраженной метаста-зирующей способностью [к.Н.Вереыеенко, О.П.Голобородько, А.И. Кизим,1988 ] .

Под влиянием брадикинина в дозе I ыг/кг, введенного через 3 суток после перевивки опухоли Р-815 мышам линии БА1В/с, что соответствует ранним этапам опухолевого процесса, происходит понижение активности катепсина Д на 60% (р^0,05). При введении брадикинина через 7 суток после перевивки опухоли Р-815, т.е. на стадии сформировавшейся опухоли, наблюдается снижение активности катепсина Д ыастоцитомы на 50%. Угнетение активности катепсина Д происходит под влиянием обеих доз пептида.

Выявлена дозовак зависимость ингибирующего действия брадикинина на катепсин Д в условиях 1а мИго. При добавлении брадикинина в концентрациях 10~5-10~7 11 в среду инкубации актив-

ность катепсина Д мастоцитомы понижается. Угнетение активности фермента на 50% ( 3 наблюдается при концентрации брадикинина.

Активность катепсина Д карциномы Эрлиха также снижаетсг при введении брадикинина в дозе I ыкг/кг. Брадикинин в дозе I мг/кг увеличивает активность фермента на 49$ (р«^0,05).

Как известно, активация лизосомальных протеиназ и выход их из клеток вызывает увеличение активности протеиназ плазмы крови. Катепсин Д гранулоцитов обладает кининогеназной активностью [0.Г.0гл0блина,1980] , кодяагеназа 1У типа опухолевых клеток активирует компоненты комплемента, фибринолиз, кининовую систему [к.Н.Веремеенко, О.П.Голобородько, А.И.Кизим,198в] . Для характеристики системы протеолиза было проведено комплексное исследование внутриклеточного и плазменного протеолиза. В табл.5 представлены данные изучения активности катепсина Д, эластазы тимуса, печени, трипсина, ингибиторов плазмы крови мышей линии ВА1В/с и беспородных.

У мышей линии ВА1В/с обнаружена более высокая активность катепсина Д, эластазы тимуса, печени, эластазы плазмы крови по сравнению с беспородными животными. Активность трипсина и ингибиторов плазмы крови была одинаковой в обеих исследуемых группах.

Влияние брадикинина на состояние протеолиза плазмы крови мышеи обеих групп заключается в снижении на 7055 активности трипсина. Пониженная активность трипсина плазмы крови сохраняется в течение 4 часов после введения брадикинина. Однако через I сутки наблюдается активация трипсина в 1,9 раза у мышей линии ВА1В/с и в 1,2 раза у беспородных мьглей. Активность эластазы плазмы крози мышей линии ВА1В/с под влиянием брадикинина

Таблица 5

Показатели протеолиза тимуса, печени, плазмы крови мышей линии ВА13/с и беспородных.

Показатель Единицы BAIB/c Беспородные

НатеиС :■■■ Ч • ицл'са:

Своб^у ся нмоль тир 5,5+0,3 5,2+0,6

Общая мин I мг 15,9+0,6 10, £¿0,8

Катепсин Д печени:

Свободная 3,6+0,3 3,6+0,6

Общая 10,£¿0,8 8,£¿0,4

Эластаза: тимуса мкмоль БАНЭ 14,341,5 I2,3i0,9

печени мин I мг 23,0±1,3 23,9+2,7

плазмы 111,3+6,9 60,8+4,2

Трипсин «Е/мл 2,5+0,3 2,6+0,3

Протеиназшй ИЕ/мл 22,8+5,5 23,9+5,6

ингибитор

Иакроглобулин гЕ/мл 2,7+0,4 3,2+0,4

такжо снижается на 40$ через 6 ча£ов, а чероз 3 суток - возрастает на 700. У беспородных мьшей эластаза плазмы крови оказалась менее чувствительной к брадикинину.

Исследование непосредственного ос|фекта брадикинина на трипсин плаэш крови в условиях ¿л vitro, позволяет выявить

дозовую зависимость. Добавление брадикинина в концентрациях —7 ^

10 -10 И в среду инкубации снижает активность трипсина. В

этих опытах дозой, ингибирупцей активность трипсина на 50$,

р

также как для катепсина Д ыастоцитоыы Р-815, лвлйс-ея 10"' м \

брадикинина.

Активность протоиназ зависит от активности -протеинаэ-ного ингибитора и -макроглобулина плазмы крови. Эти ингиби-

торы обладают различной функциональной сп—.обностьо: <¿2. -макроглобулин ограничивает активность протеиназ, подавляя протео-литическую и сохраняя эстераэную, з то время как <Ki -протеи-назный ингибитор полностью угнетает активность протеолитичег4-irrx ферментов [ К.Н.Веремеенко, Семенюта О .С., А.И.Кизим, 1983; Т.С.Котова, О.И.Басис,193б] .

Под влиянием брадикинина активность -протеиназиого-ингибитора плазмы крови мышей линии BAIB/g существенна не изменяется, а.у беспородных.мьэей отмечено его увеличение в 2,3 раза через I сутки. Активность ¡L2-макроглобулина понижается через 2 часа после введения брадикинина ка 29? у беспородных мышей и на 74% у мышей линии BAIB/c, а затем возрастает. Вероятно, снижение активности Л г -макроглобулина в ран- ' ние сроки после введения брадиюшина, а также увеличение в отдаленные сроки связаны с изменениями активности трипсина и эластазы плазмы крови. Коэффициент корреляции между активностью протеиназ и -макроглобулином составляет +0,7 +0,9 . Кроме того, между показателями активности / v -протеиназного ингибитора и Яг -макроглобулина обнаружена обратная зависимое' =0,7), что является подтверждением рецйпрокного характера изменений активности ингибиторов/

С помощью метода дискриминантного анализа получена функция классификации (2 ), позволяющая выявить особенности реакции на брадикинин мышей обеих групп.

2 =245,3 Тр(2ч)+15,З.ЦЦ тим(2ч)+7,0 Эл тим(6ч)+4,0 Эл тим (1сут)+0,7 Эл пл(1суг)+1,7 Эл пл(Зсут)+1,8 Эл пл(7сут). Из уравнения функции классификации следует, что более существенный в!слад в ответную реакцию на введение брадикинина дает активность трипсина плазмы крови,'затем катепсина Д, эластазы

тимуса. Меньшее значение имеет активность эластазы плазмы крови. Реакция на брадикинин мышей линии ВА1В/с характеризуется более высоким коэффициентом 2. , по сравнению с беспородными животными. Уравнение может использоваться для целенаправленного подбора животных при планировании медико-биологического эксперимента.

На следующем этапе исследовали состояние протеолиза тимуса и плазмы крови в условиях развития опухоли в организме. Показано, что под влиянием опуэ. ли у мышей-опухоленосителей существенно изменяется активность йротеиназ тимуса, печени и плазмы крови. Через 14 суток после перевивки мастоцитомы Р-815 в клетках тимуса отмечено снижение активности эластазы и катепсина Д на 72% и 32%, соответственно. В печени мышей - ' опухоленосителей, напротив, наблюдается увеличение активности катепсина Д, и, особенно, эластазы, .что, возможно, обусловлено активацией лизосои гепатоцитов в результате системного влияния опухоли на организм. У беспородных мышей под влиянием опухоли Эрлиха отмечены незначительные изменения активности протеолитических ферментов тимуса и печени.

В процессе роста опухолей наблюдается активация протеиназ плазмы крови мышей. На 6-14 сутки роста мастоцитомы Р-815 активность трипсина плазмы крови увеличивается в 1,9 раза, активность эластазы существенно не изменяется. У беспородных мышей с карциномой Эрлиха увеличение активности трипсина и эластазы плазмы крови бйяо менее выраженным, чем у мышей линии ВШ/с.

Большое значение при активации протеолиза тлеет состояние ингибиторного эвена плазмы крови. У мышей с опухолями Р-815 и

Эрлиха происходит увеличение активности протеиназного ингибитора. Более виражинное увеличение наблюдается у мышей линии ВА1В/с под влиянием мастоцитош Р-815: на 14 сутки роста опухоли активность Л.1 -протеиназного ингибитора превышает в Z раза уровень контроля. Активность ¿г -макроглобулина в процессе роста опухоли снижается и на 14 сутки роста мастоцитоми Р-815 она составила 67% от первоначапьного уровня. Рецилрок-ное изменение активности -протеиназного ингибитора и Лг -макроглобулина под влиянием опухоли приводит к увеличению соотношения ДЙ/^МГ. 11а стадии сформировавшейся опухоли Р-815 коэффициент <¿1 МГ у мышей линии ВА1В/с был равен'3. Влияние опухоли Эрлиха на активность ингибиторов плазыы крови беспородных мышей было менее выраженным и коэффициент составил 1,3.

Следовательно, рост опухолей сопровождается угнетением активности катепсина Д и эластазы тимуса, стимуляцией протеи- * наз печени и плазмы крови, активацией катепсина Д опухолевых клеток, увеличением соотношения Щ/^-г МГ. Более значительные изменения протеолиза обнаружены под влиянием мастоцитомы Р-8Г5. К факторам усиливающим действие этой опухоли на организм следует отнести условия сингенности и высокий исходный уровень внутриклеточного и плазменного протеолиза мышей линии ВА1В/с.

Брадикинин способен модифицировать состояние протеолиза тимуоа, плазмы крови мышей-опухоленосителей. При введении бра-дикшшна мышам линии ВА1В/с через 3 и 7 суток после перевивки мастоцитоми Р-815 наблюдается увеличение активности катепсина Д на 40$ и 50$, соответственно. Активность трипсина плазмы крови мышей линии ВАХВ/с с мастоцитомой Р-815 под влиянием

брадикинина снижается на 70%, 66%, 24%, соответственно через 2,4,6 часов. В отличие от интактных животных, у мышей-опухоленосителей проявляется более выраженный ингибирутощий аффект брадикинина на активность трипсина плазмы крови. Кроме того, ещё одной особенностью реакции мышей-опухоленосителей на бра-дикинин является угнетение активности -протеиназного ингибитора плазмы крови, в отличие от интактных мышей. Изменение характера влияния брадикинина на активность трипсина и ¿-1 -протеиназного ингибитора плазмг крови, вероятно, связано с дисбалансом протеиназ и ингибиторов мышей-опухоленосителей. На фоне значительного повышения активности трипсина и <¿-1 -протеиназного ингибитора у мышей-опухоленосителей реакция на брадикинин выявляется раньше, чем у интактных животных.

Активность ¿2,-макроглобулина под влиянием брадикинина увеличивается в 1,5 раза, у беспородных мышей-опухоленосителей, а у кышей линии ВА1В/с с мастоцитоиой Р-815 этот показатель Возрастает в 2,2 раза.

Кроме непосредственного ингибируяцего действия на активность протеиназ Лг -макроглобулин способен стимулировать пролиферацию клеток тимуса, костного мозга, селезенки [л.И.Симонова, В.Н.Шантырь,1979] .'Учитывая, что Лг -макроглобулин обладает цитотоксичсским действием на опухолевые клетки [р.Н. Коо,1933] , увеличение его активности у мылей-опухоленосите-лей при введении брадикинина является, несомненно, благоприятны* признаком.

Таким образом, под влиянием опухолей и брадикинина происходят разнонаправленные изменения состояния протеолиза тимуса и плазмы крови.

В связи с тем, что было обнаружено свойство брадикинина ингибировать активность протеиназ шшзмы крови и его способность увеличивать активность ингибиторов, мы провели сравнительный анализ действия брадикинина и контрикала, известного ингибитора протеолитических ферментов. Показано, что эти препараты обладают аналогичным действием в ранние сроки. Через 2 часа после введения контрикала активность трипсина снижается на 80$, а эластазы - на 30$., Эффект сохраняется в течение 6 часов, а затем активность трипсина восстанавливается до исходного уровня. В отличие от брадикинина, контрикал в 2,3 раза увеличивает активность «¿1 -протеиназного ингибитора с максимумом через 6 часов после введения. Активность 4.% -макроглобулина под влиянием контрикала также возрастает, но в меньшей степени, чем активность -протеиназного ингибитора.

Кроме того, контрикал практически не изменяет активность катепсина Д тимуса и понижает активность эластазы тимуса через I сутки после введения.

Таким образом, общим звеном эффектов брадикинина и контрикала на протеолиз является снижение активности трипсина и эластазы плазмы крови в ранние сроки. Брадикинин, в отличив от контрикала, повышает активность катепсина Д, эластазы тимуса, трипсина плазмы крови, начиная с б часов и до 7 суток. Имеются различия во взаимодействии брадикинина и контрикала о ингиииторами плазмы крови.

Ингибиторы протеолиза могут выполнять определенную роль в ограничении роста опухоли. В наших опытах контрикал, введенный через 7 суток после перевивки ыастоцитомы Р-815, уменьшает количество клеток опухоли на 40$. Действие контрикала сопро-

вождается угнетением активности катепсина Д опухолевых клеток на 36% (р^ 0,05). При совместном введении с брадикинином, конт-рикал еще больше снижает количество клеток (на 4£$) и активность катепсина Д опухоли (на 44%). ■

Важным фактором противоопухолевого действия контрикала является модификация протеолиза плазмы крови опухолевых мышей. Показано, что при введении контрикала на стадии сформировавшейся опухоли происходит снижение активности трипсина и элас-тозы плазмы крови в течение Зсуток. В ответ на введение контрикала наблюдается снижение активности <¿1 -протеиназного ингибитора и увеличение -макроглобул'ина плазмы крови'мышей-опухоленосителей.

При сравнении эффектов брадик.инина и контрикала, а также результатов их совместного введения, отмочено, что брадикинин в большей степени влияет на активность катепсина Д и эластазы тимуса, увеличивая их активность. Противоопухолевое действие контрикала сопровождается более выраженным угнетением активности эластазы и трипсина плазмы крови.

Вероятно, что при введении брадикиннна на ранних стадиях опухолевого процесса, когда иммунодепрессия ещё не выражена, торможение роста опухолей Эрлиха и Р-815 является результатом ингибирования катепсина Д опухоли, трипсина плазмы крови, а ■*акже активации катепсина-Д и олост,ааы тимуса и последующих цитотоксических реакций Т-лимфоцитов. Угнетение активности катепсина Д клеток мастоцитомы Р-815 и дктивоция ферментов тимуса мышей линии БА1В/с на стадии сформировавшейся опухоли * являются, по-видимому, реакциями,■направленными на стимуляцию . противоопухолевого ответа. Однако угнетение контрикалом плаз-

менных протеиназ в этот период имеют более существенное зна-чешш.

На основании полученных данных можно заключить, что процессы канцерогенеза характеризуются определенным соотношением активности протеиназ тшуеа, опухолевых клеток, активностью плазменных протеиназ и ингибиторов. Снижение активности прсте-иназ опухоли и плазмы крови, увеличение активности катепсина Д тимуса, Х-2. -макроглобулина плазмы крови ограничивает опухолевый рост. Длительное снижение активности трипсина плазмы крови под влиянием брадикинина и контрикала, при совместном введении ещё более усиливает этот процесс.

Новые свойства брадикинина, заключающиеся в стимуляции пролиферации клетои тимуса, иш*ибировании плазменного протео-лиза, усилении активности -макроглобулина могут найти широкое применение в клинике при лечении имцунодефицитньос состояний. Не исключена возможность применения брадикинина и контрикала в комплексном лечении онкологических больных. Перспективным в этом плане является сочетание митозостимулируицего эффекта брадикинина на клетки тимуса и выраженного ингибирупцего дей< пия контрикала на активность плазменного протеолиза.

ВЫВОДЫ

I. Ятфэциты крови, клетки тимуса, опухолей Эрлиха и Р-815 существенно отличаются по активности внутриклеточных протеиназ. Активация лимфоцитов крови под влиянием $ГА и брадикинина приводит к снижению активности катепсина Д; а клетках тимуса и опухолей наблвдается увеличение активности катепсина Д и эластазы.

-242. Увеличение активности катепсина Д, зластаоы тимуса под влиянием брадикинина сопровождается снижением количества клеток опухолей Эрлиха и Р-815 на ранних стадиях канцерогенеза. На Стадии сформировавшейся опухоли брадикинин увеличивает число клеток мастоцитомы Р-815.

3. При введении брадикинина и контрикала, используемых в качестве стимулятора пролиферации и ингибитора протеолиза, происходит увеличение активности катепсина Д и эластазы тимуса, а также снижение активности трипсина и эластазы плазш крови.

4. Уровень внутриклеточного и плазменного протеолиза мышей линии ВА1В/с выше, чем у беспородных мышей. В ответ на введение брадикинина у мышей линии ВА1В/с наблюдаются более выраженные

. изменения активности трипсина плазмы крови, катепсина Д и эластазы тимуса. Отличия протеолиза мышей линии ВА1В/с и бес-.породных мышей и значимость этих показателей в ответ на введение брадикинина подтверждены методом дискриминантного анализа.

5. В процессе роста опухолей Эрлиха и Р-815 наблюдается увеличение активности трипсина и эластазы плазмы крови и снижение активности катепсина Д, эластазы тимуса, что сопровождается

~ увеличением отношения ¿ЦШДзЦГ. Более значительные изменения показателей протеолиза наблюдаются у мышей линии ВА1В/с под влиянием мастоцитомы Р-815, по '.сравнению с карциномой Эрлиха, трансплантируемой беспощадным мышам.

6. Обнаружены новые свойства брадикинина стимулировать активность катепсина Д'и эластазы тимуса, увеличивать активность Лг-и&к-роглобулина, Для контрикала более характерно ингибирование активности трипсина, эластазы плазмы крови и усиление актив. -нооти Л^-протеиназного ингибитора.

ШгеЧЕНЬ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ I. Влияние брадикинина на состояние протеолиза клеток тимуса и плазмы крови при опухолевом росте //В кн."Иммунологическая, недостаточность. Клинические и лабораторные методы выявления. .. Иммунокоррекция".-Томск.-1988.-С.55 (в соавторстве о Г.А.Сухановой, Г.В.Потаповой). Я. Роль брадикинина в регуляции протеолитических процессов при опухолевом росте //В кн."Фундаментальные науки-медицине и здравоохранению". -Иркутск.-1989.-С.Ш-П2 (в соавторстве с Г.А'.Су-хановой, Г.В.Потаповой). 3.Особенности протеолитических процессов мышей линии ВА1В/с и беспородных мышей при введении брадикинина //В кн."йундаыентальныэ науки-медицине".-Томск.-1989.-С.135-136 (в соавторстве с Г.А.Сухановой).

4. Протеолитические процессы плазмы крови и тканей мышей при вве- ' дении брадикинина на разных стадиях развития опухоли //В кн. "Фундаментальные науки-медицине".-Томск.-1990.-С.120-121

(в соавторстве с Г.А.Сухановой).

5. Мембранные и протеолитические ферменты иммунококпетентннх и опухолевых клеток //В кн."Биохимия^опухолевой клетки".-Минск.-I990.-C.98 (в соавторстве с Г.А.Сухановой).

6. Влияние брадикинина на активность трипсина и его ингибиторов при опухолевом росте //В кн. "!4едяко-биологические аспекты нейро-гумораяъной регуляции.-Томск.-1990.-Вып.1.-С.92-94

(в соавторстве с Т.й.Крижановской, Г.А.Сухановой).

7. Дозовая зависимость влияния брадикинина на состояние протеолиза //В кн."Актуальные вопросы клинической и теоретической медицины".-Томск.-1990.-С.16.

Заказ 210 Тирая 100 Ротапринт ТИАСУРа