Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Морфологическая и иммуногистохимическая характеристика тимуса при экспериментальном канцерогенезе потомства самок с вторичным иммунодефицитом

ВАК РФ 03.03.04, Клеточная биология, цитология, гистология

Автореферат диссертации по теме "Морфологическая и иммуногистохимическая характеристика тимуса при экспериментальном канцерогенезе потомства самок с вторичным иммунодефицитом"

На правах рукописи

ДРАНДРОВА ЕЛЕНА ГЕННАДЬЕВНА

МОРФОЛОГИЧЕСКАЯ И ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ТИМУСА ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОМ КАНЦЕРОГЕНЕЗЕ ПОТОМСТВА САМОК С ВТОРИЧНЫМ ИММУНОДЕФИЦИТОМ

03.03.04 - клеточная биология, цитология, гистология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

2 8 ОКТ 2015

Москва-2015

005563906

005563906

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном

образовательном учреждении высшего профессионального образования

«Чувашский государственный университет имени И.Н. Ульянова» Министерства образования и науки Российской Федерации

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор Стручко Глеб Юрьевич

Официальные оппоненты:

Диндяев Сергей Валерьевич, доктор медицинских наук, доцент Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Ивановская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации, кафедра гистологии, эмбриологии, цитологии, профессор

Яглов Валентин Васильевич, доктор медицинских наук, профессор Федеральное государственное бюджетное научное учреждение «Научно-исследовательский институт морфологии человека» Федерального агентства научных организаций России, лаборатория развития эндокринной системы, главный научный сотрудник

Ведущая организация:

Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Пермский государственный медицинский университет имени академика Е.А. Вагнера» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Защита диссертации состоится «¿?/» /2 201-5~г. в « ^ '/часов ^Яшнуг» на заседании диссертационного совета Д. 208.040.01 при ГБОУ ВПО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова Минздрава России по адресу: 119991, г. Москва, ул. Трубецкая, д.8, стр. 1

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Первого МГМУ им. И.М. Сеченова Минздрава России по адресу: 119034, г. Москва, Зубовский бульвар, дом 37/1 и на сайте организации: www.mma.ru

Автореферат разослан «/^ » _201

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук, профессор

Салтыков Борис Борисович

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы. Онкологическая заболеваемость в России и мире продолжает неуклонно расти. В индустриально развитых странах злокачественные новообразования выявляются ежегодно у сотен тысяч человек. Смертность от онкозаболеваний составляет 7,5 млн человек в год, т.е. на долю онкопатологии приходится около 13% смертей в мире (С.А. Шинкарев и др., 2013). В России этот показатель составляет 15,4% (A.B. Самойлова, 2015).

Исследования последних лет доказали несомненную роль патологий иммунной системы в развитии раковых опухолей. Так, известно, что среди пациентов с первичными иммунодефицитами стандартизованный показатель заболеваемости раком выше в 1,6 раза по сравнению с общей популяцией (С.М. Vajdic et al., 2010). Появившаяся в XX веке и стремительно развивающаяся наука онкоиммунология постоянно обнаруживает новые факты о процессах взаимодействия иммунных клеток с раковыми (O.J. Finn, 2012).

В структуре смертности от злокачественных новообразований более 30% занимают лица моложе 60 лет. Также увеличивается число детей с впервые выявленной онкопатологией (А.Д. Каприн и др., 2013). Новообразования стоят на третьем месте в списке причин детской смертности в России после смерти от внешних причин и вследствие врожденных аномалий развития (Л.П. Суханова, М.С. Скляр, 2007). Наиболее часто злокачественные новообразования встречаются у детей до 4 лет, что свидетельствует о роли в развитии данной патологии факторов, действовавших пренатально.

Состояние здоровья матери во время беременности несомненно влияет на развитие иммунной системы плода. В современной литературе мы встретили данные о негативном влиянии на формирование иммунитета потомства патологии гепатобилиарной системы матери (Т.И. Бирюкова, 2009; Е.Ю. Шаврина, 2012), экзогеннотоксических воздействий (И.В. Тарасюк, 1996; П.В. Пугач, 2012), патологии беременности (Т.А. Романова, C.B. Обухова, 2013).

Известно, что активация иммунной системы материнского организма в ранние сроки беременности приводит к снижению противоопухолевого иммунного ответа у потомства (С.С. Обернихин, 2013; Н.В. Яглова, 2013). Однако нам не встретились данные об иммунном статусе и

морфофункциональных особенностях органов иммунной системы у потомства самок с иммунодефицитом. Существуют работы по изучению иммунных органов при канцерогенезе на фоне нормального функционирования иммунной системы (О.Ю. Кострова, 2013), а также при исходном вторичном иммунодефиците (Е.В. Москвичев, 2013). Несмотря на это, в доступной нам литературе мы не обнаружили данных об изменениях состояния иммунных органов при канцерогенезе в условиях врожденного иммунодефицита.

Таким образом, изучение морфологических и иммуногистохимических особенностей тимуса потомства самок с вторичным иммунодефицитом, а также изменений, происходящих в тимусе при введении канцерогена на фоне врожденного иммунодефицита, является актуальным и представляет научный интерес для широкого круга специалистов. Все вышесказанное свидетельствует о целесообразности настоящего исследования.

Цель исследования - оценить морфофункциональное состояние тимуса потомства крыс с вторичным иммунодефицитом через 3 и 6 месяцев после рождения без постнатального воздействия, а также при постнатальном введении 1,2-диметилгидразина. Задачи исследования:

1. Провести морфометрию коркового и мозгового вещества долек тимуса у потомства интактных и спленэктомированных самок через 3 и 6 месяцев после рождения, а также при постнатальном введении 1,2-диметилгидразина в общей дозе 80 мг/кг в этих экспериментальных группах.

2. Изучить содержание биогенных аминов в люминесцирующих структурах тимуса через 3 и 6 месяцев после рождения в указанных экспериментальных моделях.

3. Выявить экспрессию маркеров апоптоза (Ьс1-2) и клеточной пролиферации (Кл67) в структурах тимуса потомства крыс в эти же сроки в указанных экспериментальных моделях.

4. Установить особенности распределения зрелых Т-лимфоцитов (СБЗ) и ретикулоэпителиальных клеток (Рап-с^окегаНп) в корковом и мозговом веществе тимуса в эти же сроки в экспериментальных моделях.

5. Определить особенности локализации и количественного распределения

клеток микроокружения долек тимуса - дендритных (Б-100), тучных, нейроэндокринных (БупарЮрЬузш) и мононуклеарных фагоцитов (С068) в эти же сроки в указанных экспериментальных моделях.

Научная новизна работы. Впервые показано, что беременность в состоянии иммунодефицита влечёт за собой структурные изменения тимуса потомства. В возрасте 3-х месяцев толщина коркового вещества и площадь мозгового вещества уменьшается по сравнению с возрастной нормой. В возрасте 6-ти месяцев морфометрические показатели, напротив, увеличиваются.

Установлено, что постнаталыюе введение канцерогена потомству спленэктомированных самок сопровождается более значимыми инволютивными изменениями в тимусе, чем введение той же дозы канцерогена интактным крысам. В возрасте 3-х месяцев изменения соответствуют И-1П фазам инволюции, в возрасте 6-ти месяцев наблюдается IV фаза.

Впервые продемонстрировано, что введение 1,2-диметилгидразина потомству спленэктомированных крыс приводит к усилению интенсивности люминесценции биоаминсодержащих структур тимуса и увеличению отношения (серотонин+гистамин)/катехоламины. В тимусе 6-месячных крыс регистрируется особенно значимое увеличение данного отношения.

В нашей работе установлено, что беременность на фоне иммунодефицита приводит к изменению локализации и количественного распределения клеточных популяций в структурах тимуса. В возрасте 3-х месяцев наблюдается увеличение численности всех исследуемых групп клеток, причем наиболее значимо возрастает число СОЗ+-клеток (более чем в 2 раза). В тимусе 6-месячных крыс отмечается усиление экспрессии маркера клеточной пролиферации Кл67. Локализация и численность клеток микроокружения не

отличается от возрастной нормы.

Впервые показано, что постнатальное введение канцерогена потомству самок с вторичным иммунодефицитом приводит к разнонаправленным изменениям морфологии клеток тимуса. В возрасте 3-х месяцев количество Кл67+-клеток увеличивается. В возрасте 6-ти месяцев отмечается резкое уменьшение численности пролиферирующих клеток, количество СОЗ+-клеток

достоверно возрастает. Численность макрофагов и эпителиальных клеток ниже, а дендритных клеток и клеток АРШЭ-серии выше возрастной нормы на обоих сроках исследования.

Научно-теоретическая значимость. Материалы диссертационного исследования дополняют сведения о влиянии экстрагенитальной патологии у беременных на иммунный статус потомства. Впервые описаны изменения морфофункционального состояния тимуса потомства в возрастной динамике в зависимости от состояния иммунной системы матери. Проанализирована взаимосвязь между иммунным статусом матери во время беременности и характером инволютивных изменений в тимусе потомства при химически индуцированном постнатальном канцерогенезе. Полученные данные представляют интерес для гистологов, онкологов и иммунологов.

Практическая значимость. Работа носит экспериментально-теоретический характер, а также интересна для практических врачей -онкологов и иммунологов. Результаты работы будут использованы в практике врачей женских консультаций и детских поликлиник для выявления пациентов, составляющих группу риска по патологиям иммунной системы.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Беременность в состоянии вторичного иммунодефицита приводит к морфофункциональным изменениям тимуса потомства: в возрасте 3-х месяцев на фоне уменьшения толщины коркового и площади мозгового вещества отмечается достоверное увеличение численности СБЗ+-лимфоцитов, дендритных клеток, макрофагов, ретикулоэпителиоцитов и клеток АРШ-серии. В возрасте 6-ти месяцев значения морфометрических показателей выше, чем в группе интактных крыс того же возраста. Численность Кл67+-клеток увеличена. Количество и локализация клеток микроокружения соответствует возрастной норме.

2. Постнатальное введение 1,2-диметилгидразина потомству самок с вторичным иммунодефицитом сопровождается более выраженными инволютивными изменениями в тимусе, чем введение той же дозы канцерогена интактным крысам. Инволюция характеризуется потерей дольчатой структуры тимуса, отсутствием сетевой организации корковых ретикулоэпителиоцитов,

инверсией распределения зрелых лимфоцитов, уменьшением численности пролиферирующих клеток, макрофагов и Ьс1-2+-клеток и увеличением количества дендритных клеток и клеток АРШ-серии.

Внедрение результатов исследования

Данные, полученные в ходе исследования, используются в учебном процессе при чтении лекций и проведении практических занятий на кафедре общей и клинической морфологии и судебной медицины ФГБОУ ВПО «ЧТУ им. И.Н. Ульянова», кафедре терапии и семейной медицины АУ ЧР «Институт усовершенствования врачей», в практике БУ «Республиканский клинический онкологический диспансер». Результаты исследования в форме статей и тезисов опубликованы в отечественных и зарубежных научных изданиях.

Соответствие диссертации паспорту научной специальности

Научные положения соответствуют формуле специальности 03.03.04 -«Клеточная биология, цитология, гистология». Результаты проведенного исследования соответствуют области исследования специальности, конкретно -пунктам 1,5 и 6.

Апробация работы. Основные результаты работы были представлены на IV Всероссийской научно-практической конференции «Цитоморфометрия в медицине и биологии: фундаментальные и прикладные аспекты» (Москва, 2011); V Всероссийской научно-практической конференции «Цитоморфометрия в медицине и биологии: фундаментальные и прикладные аспекты» (Москва, 2012); V Международной студенческой электронной научной конференции «Студенческий научный форм 2013»; V Международном молодежном медицинском конгрессе «Санкт-Петербургские научные чтения -2013» (Санкт-Петербург, 2013); IV съезде физиологов СНГ (Сочи, 2014); конференции, посвященной 250-летию кафедры анатомии человека Первого МГМУ им. И.М. Сеченова «Анатомия человека: вчера, сегодня, завтра» (Москва, 2014). Материалы докладывались на XII Всемирном конгрессе «Здоровье и образование в XXI веке» (Москва, 2011); Итоговой Всероссийской студенческой научной конференции с международным участием «Медицинская весна» (Москва, 2013); научно-практической конференции молодых ученых с международным участием «Актуальные вопросы

экспериментальной и клинической медицины» (Чебоксары, 2014).

Апробация диссертационной работы прошла на совместном заседании кафедры общей и клинической морфологии и судебной медицины, кафедры нормальной и топографической анатомии с оперативной хирургией, кафедры инструментальной диагностики с курсом фтизиатрии и кафедры медицинской биологии с курсом микробиологии и вирусологии ФГБОУ ВПО «ЧТУ им. И.Н. Ульянова» (протокол №1 от 22.05.2015г.).

Личный вклад автора. Диссертация является личным трудом автора Драндровой Елены Геннадьевны. Ею проделана большая работа по проведению экспериментов, сбору литературных источников, анализу полученных данных, написанию статей и тезисов по материалам диссертационной работы. Все экспериментальные данные получены лично автором. Статистическая обработка научных данных и подготовка иллюстративного материала выполнена самостоятельно автором. Все использованные в диссертации литературные источники проанализированы лично.

Публикации. По теме диссертации опубликованы 25 научных работ (тезисы — 16, статьи - 9). 3 работы опубликованы в ведущих рецензируемых российских научных журналах из перечня ВАК, рекомендованных для публикаций основных результатов диссертаций на соискание учёных степеней.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения и шести глав: обзора литературы, материалов и методов, результатов собственных исследований, обсуждения результатов и заключения, выводов, списка литературы. Работа изложена на 157 страницах машинописного текста (собственно текста - 123 страницы), содержит 7 таблиц и проиллюстрирована 75 рисунками, включая микрофотографии. Список литературы содержит 313 источников, в том числе 155 зарубежных.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Эксперименты выполнены на 150 белых нелинейных крысах-самцах. Животные были получены посредством спаривания 4-хмесячных крыс-самок с самцами массой 150-200 г. Спаривание спленэктомированных самок с самцами

проводилось спустя месяц после операции - спленэктомии. Кормление, уход и выведение из эксперимента крыс проводились согласно правилам обращения с лабораторными животными (H.H. Каркищенко, C.B. Грачев, 2010). Проведение исследования единогласно одобрено на заседании Этического комитета медицинского факультета ФГБОУ ВПО «ЧТУ им. И.Н. Ульянова» (протокол №4/2 от 09.04.2015г.). Эксперименты проводились круглогодично с сентября 2010 года по декабрь 2014 года.

В качестве модели вторичного иммунодефицита выбрана спленэктомия. Спленэкгомия выполнялась под местной анестезией с соблюдением всех правил асептики и антисептики через разрез по белой линии живота. В качестве канцерогена использован 1,2-диметилгидразин дигидрохлорид, производства компании Acros organics (Бельгия).

Животные были разделены на четыре группы: 1 - потомство здоровых самок (п=30); 2 - потомство здоровых самок с постнатальным введением канцерогена (1,2-диметилгидразин дигидрохлорид) из расчета 20 мг/кг 1 раз в неделю в течение 4 недель (п=40); 3 - потомство спленэктомированных самок (п=40); 4 - потомство спленэктомированных самок с постнатальным введением канцерогена (1,2-диметилгидразин дигидрохлорид) из расчета 20 мг/кг 1 раз в неделю в течение 4 недель (п=40). Выведение животных из эксперимента проводилось через 3 и 6 месяцев после рождения путем декапитации. При патоморфологическом исследовании учитывались частота развития новообразований, их морфологические особенности, локализация. Объектом исследования служил тимус. Для проведения люминесцентно-гистохимических методов исследования изготавливали криостатные срезы органа толщиной 10 мкм. Парафиновые срезы толщиной 4 мкм окрашивали общегистологическими и иммуногистохимическими методами.

В работе использовались следующие методы:

1. Люминесцентно-гистохимический метод Фалъка-Хилларпа (В Falk., N Hillarp., 1962) в модификации Е.М. Крохиной (Е.М. Крохина, П.Н. Александров, 1969) - для обнаружения серотонина и катехоламинов в структурах тимуса.

2. Люминесцентно-гистохимический метод Кросса, Эвена, Роста (S.A.

Cross et. al., 1971) - для выявления гистаминсодержащих структур тимуса.

3. Метод цитоспектрофлуориметрии (С. Юденфренд, 1965; В.Н. Карнаухов, 1978; В.Л. Калмыков, 1982) - для количественного определения уровней биогенных аминов в структурах тимуса. Измерения производили с помощью насадки ФМЭЛ-1А, которая устанавливалась на люминесцентный микроскоп ЛЮМАМ-4. Выходное напряжение при всех измерениях составляло 600 В.

4. Для характеристики суммарно-направленного действия серотонина, гистамина и катехоламинов определялось отношение (СТ+ГСТ)/КА, которое свидетельствует о функциональном состоянии клеток тимуса (Г.Ю. Стручко, 2003).

5. Метод окраски полихромным толуидиновым синим по Унна — для качественной и количественной оценки популяции тучных клеток тимуса. Тучные клетки подсчитывали в десяти полях зрения микроскопа (объектив 40 и окуляр 15). По степени дегрануляции выделяли 4 типа клеток: ТО — тучные клетки с плотно заполненными неразличимыми гранулами и ядром; Т1 — клетки с отдельно различимыми гранулами и неполностью замаскированным ядром; Т2 — клетки с хорошо различимыми гранулами как внутри, так и вокруг клетки, и отчетливым ядром; ТЗ — опустошенные тучные клетки с единичными гранулами внутри и рассеянными гранулами вокруг клетки (Д.П. Линднер и др., 1980; Г.Ю. Стручко и др., 1995).

6. Для оценки функциональной активности тучноклеточной популяции подсчитывали индекс дегрануляции по формуле ИД

((А *0)+(Б*1)+(В *2)+(Г*3))/п (Д.П. Линднер и др., 1980), где А - число недегранулирующих клеток (ТО); Б - слабодегранулирующие тучные клетки, (Т1); В - клетки с умеренной степенью дегрануляции, (Т2); Г - клетки с сильной степенью дегрануляции, (ТЗ); п - общее число тучных клеток.

7. Иммуногистохимические методы с использованием моноклональных (МКАТ) и поликлональных антител (ПКАТ) к антигенам крысы фирмы Santa Cruze (США) (DJ. Dabbs, 2002):

а) ПКАТ к CD3 (маркер зрелых Т-лимфоцитов);

б) МКАТ к белку Ki67 (маркер пролиферирующих клеток);

в) МКАТ к CD68 (маркер макрофагов);

г) ПКАТ к белку S-100 (маркер клеток нейроэктодермального происхождения и дендритных клеток);

д) ПКАТ к белку bcl-2 (маркер долгоживущих клеток, ингибитор апоптоза);

е) ПКАТ к Synaptophysin (маркер клеток нейроэндокринного происхождения);

ж) МКАТ к Pan-cytokeratin (маркер эпителиальных клеток).

Для выявления иммуногистохимических реакций в работе применялась система визуализации Leica ChromoPlex™ 1 Dual Detection for BOND. В качестве внутреннего контроля реакции служила неиммунизированная кроличья сыворотка. Результаты реакций оценивали с применением микроскопа

микромед з том.

За положительную иммуногистохимическую реакцию на антитела к кластерам дифференцировки (CD) и Synaptophysin принимали коричневую окраску мембраны клетки. Положительной реакцией на Pan-cytokeratin, белки S-100 и bcl-2 считали коричневую окраску цитоплазмы. Экспрессию белка Ki67 оценивали по коричневому окрашиванию ядра. Для оценки результата производили подсчет позитивно окрашенных клеток в десяти полях зрения при увеличении 400х, выражая результаты в процентах и единицах в поле зрения.

8. Метод окраски гематоксилином и эозином - для оценки общегистологической картины и проведения морфометрических измерений коркового и мозгового вещества тимуса.

9. Морфометрический метод выполняли с помощью автоматизированного морфометрического комплекса, включавшего микроскоп МИКРОМЕД 3 ЛЮМ, цифровую фотокамеру и персональный компьютер с набором прикладных программ. Использовалась программа «Микро-Анализ» (Санкт-Петербург, 2010) для измерения толщины коркового и площади мозгового вещества тимуса, а также количественных характеристик иммуногистохимических реакций.

10. Статистическая обработка полученных цифровых данных проведена с помощью пакета программ Microsoft office (Word и Excel) на компьютере, а также программы G-stat. В работе приводятся следующие показатели: M — средняя арифметическая величина; m — средняя ошибка средней

арифметической величины. Статистическую достоверность оценивали по I-критерию Стьюдента. (В.В. Власов, 2001; О.Ю. Реброва, 2002).

результаты собственных исследований

Тимус 3-месячных крыс характеризуется наибольшей морфофункциональной активностью. В возрасте 6-ти месяцев в вилочковой железе наблюдаются начальные проявления возрастной инволюции. Происходит уменьшение размеров тимической дольки главным образом за счет уменьшения толщины коркового вещества, частично стираются границы между дольками. При проведении иммуногистохимических реакций выявлено, что численность пролиферирующих клеток, дающих положительную реакцию на Кл67, снижена (рис. 1), а количество СБЗ+- клеток (зрелых лимфоцитов), напротив, увеличено. Резко возрастает количество Ьс1-2+-, С068+- и 8-100+-клеток. Доля ретикулоэпителиальных и тучных клеток изменяется незначительно.

Рисунок 1 - Тимус. Иммуногистохимическая реакция к К67. МИКРОМЕД 3 ЛЮМ. Ув. 400х. а - потомство интактной крысы, 3 месяца; значительная доля пролиферирующих клеток располагается в корковом веществе; б - потомство интактной крысы, 6 месяцев; уменьшение количества Кл67+-клеток. 1 - мозговое вещество дольки; 2 - корковое вещество дольки.

Люминесцентно-гистохимические методы исследования позволили вьивить увеличение численности люминесцирующих гранулярных клеток (ЛТК), а также тенденцию к их дегрануляции, дисбаланс уровня биогенных

аминов с небольшим увеличением соотношения (СТ+ГСТ)/КА. Увеличение соотношения (СТ+ГСТ)/КА свидетельствует об угнетении функциональной активности иммунной системы, которое сопровождает явления возрастной инволюции тимуса (Г.Ю. Стручко и др., 2012).

Введение канцерогена потомству интактных крыс приводит на ранних сроках, в возрасте 3-х месяцев, к активизации работы тимуса. Результаты люминесцентно-гистохимических и морфометрических исследований лишь незначительно отличаются от контрольной группы. Площадь мозгового вещества изменяется недостоверно, толщина коркового вещества увеличивается в 1,5 раза. Также растет и относительная масса тимуса. Согласно результатам иммуногистохимических реакций, в корковом веществе значительно увеличивается численность пролиферирующих клеток. Количество зрелых лимфоцитов возрастает в меньшей мере, что позволяет предположить об усилении процессов эмиграции Т-клеток из тимуса. Наблюдается более чем двухкратное увеличение количества клеток APUD-серии.

В возрасте 6-ти месяцев, спустя 120 суток после окончания введения канцерогена, на фоне канцерогенеза в толстой кишке, в тимусе наблюдается развитие процессов акцидентальной инволюции. Основными её проявлениями выступают снижение абсолютной массы тимуса на 28% относительно возрастной нормы, расширение междольковых промежутков, рост индекса дегрануляции тучных клеток. Количество Ki67+ и СОЗ+-клеток увеличено. Снижена численность макрофагов и Ъс1-2+-клеток в 1,5 и 1,9 раза соответственно. Количество синаптофизин-положительных клеток увеличивается более чем в 5 раз.

Синаптофизин - трансмембранный гликопротеид, экспрессируется клетками нейроэндокринного происхождения (Т.В. Сайнога, A.A. Славинский, 2011, А.Г. Беловешкин и др., 2013). В тимусе синаптофизин экспрессируется клетками медуллярной зоны, которые относят к клеткам APUD-серии (Е.В. Москвичев и др., 2012; M. Bai, 2008).

Нейроэндокринные клетки являются облигатной клеточной популяцией тимуса. По одним данным, они обеспечивают взаимодействие между клетками микроокружения и Т-клетками, проходящими дифференцировку. Вещества,

выделяемые нейроэндокринными клетками, участвуют в регуляции таких иммунных процессов как клеточная пролиферация, дифференцировка, миграция, секреция, апоптоз и выработка цитокинов (А.Г. Беловешкин и др., 2013; U. Moll et al., 1988). Увеличение экспрессии синаптофизина в тимусе говорит об усилении нейроэндокринных влияний.

У потомства спленэктомированных крыс в возрасте 3-х месяцев наблюдается снижение всех морфометрических показателей относительно возрастной нормы. Толщина коркового вещества и площадь мозгового вещества дольки снижены на 17% и 70% соответственно. Резкое увеличение соотношения (СТ+ГСТ)/КА свидетельствует об угнетении иммунных процессов в тимусе (рис. 2). Увеличение численности зрелых лимфоцитов более чем в 2 раза (рис. 3), а также макрофагов, дендритных клеток и клеток APUD-серии говорит о напряженности иммунного ответа.

Потомство интактных крыс

□ Потомство интактных крыс с послнатальным вве деьием кандеро гене

п Потомство

сп ленэк-го м»4э о в ан^ы х самок

■ Потомство сп ленэкто мцо о в ан(-ы х самок с постната/ы-ым введением кандеро гена

Рисунок 2 - Отношение (серотонин+гистамин)/катехоламины в биоаминсодержащих структурах тимуса у крыс всех исследуемых групп в возрасте 3 месяцев

Доказано, что пренатальный стресс сильно влияет на гомеостаз развивающегося организма (А.П. Парахонский, 2009; V.G. Moisiadis, S.G. Matthews, 2014). Выделяемые при активации гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой системы глюкокортикоиды, проникая через плаценту, угнетающе действуют на формирование эндокринной, иммунной и нервной систем плода (A.B. Шайтарова и др., 2011; N. Shanks, S.L. Lightman, 2001; J.

14

ЛПСКМЗ ЛПССКЗ ТКВ ТМВ ТК Mit. тк

Dotsch, 2014). Аналогичным образом влияют глюкокортикоиды и в неонатальном периоде.

Рисунок 3 - Тимус. Иммуногистохимическая реакция к CD3. МИКРОМЕД 3 ЛЮМ. Ув. 400х. а - потомство интактной крысы, 3 месяца; зрелые Т-клетки большей частью расположены в мозговом веществе; б - потомство спленэктомированной самки, 3 месяца; увеличение численности СОЗ+-клеток. 1 - мозговое вещество дольки; 2 - корковое вещество дольки.

Мы полагаем, что предшествующая беременности спленэктомия столь же отрицательно сказывается на закладке органов и систем плода. В основе этого влияния лежит стойкое увеличение уровня кортизола в крови, выявляемое даже в отдаленные сроки после операции (Г.Ю. Стручко, 2003). Еще одним немаловажным фактом является недостаточность как гуморального, так и клеточного звеньев иммунитета матери (В.В. Масляков и др., 2012).

Известно, что во внутриутробном и неонатальном периодах плод, а впоследствии - новорожденный приобретает пассивный иммунитет от матери. Через плаценту к плоду поступают антитела, продуцируемые В-лимфоцитами матери (Е. Jauniaux, В. Gulbis, 2000). После рождения факторы иммунитета продолжают поступать в организм новорожденного вместе с материнским молоком (G. Chineo, 2005). Недостаточность пассивной иммунизации плода и новорожденного в период незрелости его собственной иммунной системы также, по нашему мнению, является причиной запуска в тимусе патологических процессов.

В возрасте 6-ти месяцев у потомства спленэктомироваяных самок отмечается увеличение относительной массы тимуса на 56% по сравнению с возрастной нормой. Площадь мозгового вещества и толщина коркового вещества долек также увеличиваются. На фоне усиления экспрессии bcl-2 растет процент пролиферирующих клеток (в 2,8 раза в корковом веществе). Количество, размеры и интенсивность люминесценции J11К также увеличиваются.

Белок bcl-2 является важнейшим супрессором апоптоза. Экспрессируется он главным образом на мембране митохондрий и, в меньшей степени, на ядерной и клеточной мембранах (A.M. Камышный и др., 2007). Увеличение количества bcl-2+ клеток наблюдается при высокой интенсивности клеточного деления (Е.В. Москвичев, 2013; J.C. Reed et al., 1987).

Высокий уровень клеточной пролиферации и усиление экспрессии антиапоптотического белка bcl-2 указывает на преобладание пролиферативных процессов над клеточной гибелью. На наш взгляд, данные изменения в тимусе являются последствием влияния повышенного уровня глюкокортикоидов во внутриутробном и неотанальном периодах. Так, доказано, что введение дексаметазона крысам в течение первой недели жизни приводит к длительному нарушению процессов Т-клеточной дифференцировки в тимусе и является фактором риска для развития аутоиммунных заболеваний (J.M. Bakker et al., 2001).

При введении канцерогена потомству спленэктомированных самок

изменения в тимусе более значительные, чем при аналогичном воздействии на потомство интактных крыс. В возрасте 3-х месяцев теряется дольчатость вилочковой железы. Междольковые промежутки в одних участках железы стираются, в других, напротив, чрезмерно расширяются (рис. 4). Уменьшается площадь мозгового и толщина коркового вещества.

В ЛГК значительно изменяется содержание биогенных аминов. Уровень серотонина и катехоламинов заметно снижается, а уровень гистамина, напротив, достоверно повышается во всех группах клеток. Данные изменения приводят к увеличению соотношения (СТ+ГСТ)/КА. Увеличивается количество выявляемых тучных клеток с преобладанием дегранулирующих форм (рис. 5).

Процент Ю67+ клеток растет незначительно (на 13%). С068+-клеток определяется достоверно меньше, чем в тимусе интактных крыс того же возраста.

Рисунок 4 - Тимус. Потомство спленэктомированной крысы с введением канцерогена, 3 месяца. Окраска

гематоксилином и эозином. МИКРОМЕД 3 ЛЮМ. Ув. 100х. Границы между дольками визуализируются плохо. Железа теряет дольчатую структуру. 1 -мозговое вещество дольки; 2 -корковое вещество дольки; 3 -междольковые перегородки.

Рисунок 5 - Тимус. Потомство спленэктомированной крысы с введением канцерогена, 3 месяца. Окраска полихромным толуидиновым синим по Унна. МИКРОМЕД 3 ЛЮМ. Ув. 400х. Увеличение количества тучных клеток с умеренной и сильной степенью дегрануляции. 1 -междольковые перегородки; 2 — корковое вещество дольки. Стрелками указаны

дегранулирующие тучные

клетки.

Белок CD68 используется в качестве маркера макрофагов и опухолевых клеток макрофагального происхождения (Н. Strobl et al., 1995; Е. Kunisch et al., 2004). Известно, что главной функцией макрофагов тимуса является элиминация погибших в процессе дифференцировки Т-лимфоцитов (С.А. Кащенко и др., 2010; Wood G.W., 1985). Кроме этого, они участвуют в процессах созревания Т-клеток (R. Navarro et al., 1991). Уменьшение

количества макрофагов и незначительный рост Ki67+ клеток свидетельствует о том, что на фоне раннего наступления возрастной инволюции тимус потомства спленэктомированных самок не столь активно реагирует на опухолевый рост, как тимус потомства интактных крыс.

Известно, что одним из побочных эффектов длительной терапии глюкокортикостероидами является атрофия коры надпочечников. Механизм её развития заключается в блокаде оси гипотапамус-гипофиз-кора надпочечников посредством торможения секреции адренокортикотропного гормона гипофиза (В.В. Городецкий и др., 2002). Описано также развитие острой надпочечниковой недостаточности у новорожденных и атрофии коры надпочечников у плодов, чьи матери страдали гиперкортицизмом (A.B. Миронов, 2008; I.T. Lanman, 1961; K.Kreines, W. De Vaux, 1971).

Тимус и кора надпочечников являются антагонистами в отношении развития ответной реакции на стресс. Известно, что после удаления вилочковой железы усиливается морфофункциональная активность надпочечников (J. Comsa, 1973). Последствием адреналэктомии является увеличение массы тимуса (3. Кемилева, 1984, Н.М. Киселева, 2011). Мы предполагаем, что увеличение массы тимуса, рост морфометрических показателей, усиление пролиферативных процессов в тимусе потомства спленэктомированных крыс является следствием дисфункции коры надпочечников под влиянием повышенного уровня кортизола в организме матери в период беременности. Параллельное исследование надпочечников данной группы крыс выявило, что удаление селезенки у самок приводит к развитию гипотрофии надпочечников у потомства. Наблюдается снижение массы надпочечников, уменьшение площади коркового вещества, уменьшение количества макрофагов, достоверное увеличение количества дендритных и нейроэндокринных клеток (О.Ю. Кострова и др., 2014). Полученные данные подтверждают нашу гипотезу.

В возрасте 6 месяцев при введении канцерогена потомству спленэктомированных самок дольчатая структура в тимусе определяется лишь в центральной части органа. Наблюдается инверсия в количестве зрелых лимфоцитов: рост популяции в корковом веществе и уменьшение их количества в мозговом. Макрофагов, Ki67+- и bcl-2+- клеток достоверно

меньше, а клеток APUD-серии и S-100+- клеток больше соответственно в 6 и 1,5 раза, чем в тимусе потомства спленэктомированных самок без воздействия. Процентное содержание ретикулоэпителиальных клеток уменьшается в основном за счет кортикальных ретикулоэпителиоцитов. Корковые эпителиоретикулярные клетки теряют сетевую организацию, что свидетельствует об утрате способности к тимопоэзу (Е.В. Москвичев, 2013, K.G. Flores et al., 1999) (рис. 6).

Т. . ' ^ ТУ* Z*- Рисунок 6 - Тимус. Потомство

ШнШЛ'?'^ l ~ спленэктомированной крысы с

введением канцерогена. 6

Белки S-100 экспрессируются главным образом в нервной ткани. В тимусе антитела к белкам S-100 используются для обнаружения клеток нейроэктодермального происхождения - дендритных клеток (Н. Chen et al., 2014). В тимусе эти клетки участвуют в процессах как позитивной, так и негативной селекции, т.е. обеспечивают центральную иммунологическую толерантность (A.J. Moore, M.K. Anderson, 2013). Увеличение количества дендритных клеток, вероятно, связано, с усилением антигенной стимуляции вследствие опухолевого роста. Однако отсутствие сетевой организации корковых ретикулоэпителиоцитов и недостаточное поступление костномозговых предшественников делает тимопоэз невозможным, вследствие чего дендритные клетки не могут выполнить свою функцию.

Таким образом, исходя из полученных нами экспериментальных данных, мы можем заключить, что спленэктомия у самок серьезно сказывается на

месяцев. Иммуногистохимическая реакция к панцитокератину.

МИКРОМЕД 3 ЛЮМ. Ув. 100*. Отсутствие сетевой структуры корковых ретикулоэпителиоцитов. 1 - мозговое вещество дольки; 2 -корковое вещество дольки.

морфофункционалыюм состоянии тимуса у потомства. Мы считаем, что это влияние опосредовано гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой системой. Также установлено, что введение 1,2-диметилгидразина приводит к развитию акцидентальной инволюции тимуса. У потомства спленэктомированных самок в возрасте 3-х месяцев изменения в тимусе выражены меньше, чем у потомства интактных крыс. В возрасте 6-ти месяцев, напротив, наблюдаются более выраженные признаки акцидентальной инволюции на фоне явлений возрастной инволюции. Вероятно, это связано с восстановлением функциональной активности надпочечников на данном сроке. Важная роль в процессах акцидентальной инволюции тимуса принадлежит клеткам микроокружения: клеткам АРХШ-серии, тучным, дендритным клеткам, ретикулоэпителиоцитам, макрофагам. Также, по нашему мнению, в запуске и дальнейшем развитии инволютивных изменений в тимусе принимают участие и биогенные амины.

ВЫВОДЫ

1. Морфометрические показатели долек тимуса у потомства спленэктомированных самок, а также при постнатальном введении 1,2-диметилгидразина в общей дозе 80 мг/кг потомству интактных и спленэктомированных крыс свидетельствует о развитии акцидентальной инволюции органа. Это проявляется в достоверном снижении толщины коркового и площади мозгового вещества во всех экспериментальных группах с максимальным уменьшением цифровых значений (на 36 и 15% соответственно) через 6 месяцев у потомства спленэктомированных самок с постнатальным введением канцерогена

2. Уровень биогенных аминов достоверно изменяется во всех люминесцирующих клетках тимуса всех экспериментальных групп. В ЛТК кортико-медуллярной зоны значительно повышается содержание гистамина в группах после введения канцерогена (в 1,5-2,2 раза), что сопровождается заметным ростом соотношения (СТ+ГСТ)/КА. В ЛТК субкапсулярной зоны на фоне разнонаправленных изменений уровня биогенных аминов, напротив, отмечается снижение соотношения (СТ+ГСТ)/КА в группах с введением канцерогена. В лимфоцитах коркового и мозгового вещества на фоне достоверных изменений содержания биогенных аминов отмечается повышение

соотношения (СТ+ГСТ)/КА в 1,3-3,4 раза. Наиболее значительные изменения наблюдаются через 6 месяцев у потомства спленэктомированных самок на фоне введения канцерогена.

3. Наибольшие изменения в экспрессии маркеров пролиферации (Ю67) и апоптоза (Ьс1-2) выявляются в тимусе через 6 месяцев во всех экспериментальных группах. В корковом и мозговом веществе тимуса потомства спленэктомированных крыс выявляемость Кл67 возрастает в 2,8 и 1,7 раза. У потомства интактных крыс с постнатальным введением канцерогена в корковом веществе - повышается на 28%, а в мозговом снижается на 30%. У потомства спленэктомированных самок с постнатальным введением канцерогена - снижается лишь в мозговом веществе на 36%. Экспрессия Ьс1-2 в этих группах уменьшается на 38,48 и 32% соответственно.

4. Во всех экспериментальных группах регистрируется достоверное увеличение СОЗ+-лимфоцитов с одновременным снижением численности ретикулоэпителиальных клеток в корковом веществе тимуса. Наиболее выраженные изменения отмечаются через 6 месяцев в группах с постнатальным введением канцерогена. В мозговом веществе на этом сроке на фоне незначительного роста количества СЭЗ+-лимфоцитов выявляется дезорганизация и снижение плотности эпителиальных клеток.

5. Постнатальное введение канцерогена, особенно у потомства спленэктомированных самок, приводит к достоверному увеличению численности клеток нетимопоэтического микроокружения долек на всех сроках исследования. Преимущественная локализация синаптофизин+-клеток АРШ)-серии и тучных клеток - внутренняя кортикальная зона, Б-100+дендритных клеток и С068+ мононуклеарных фагоцитов - субкапсулярная зона и внутридольковые периваскулярные пространства тимусной дольки.

6. Сравнительный многофакторный анализ морфофункциональных изменений в тимусе в указанных экспериментальных моделях показал, что наиболее выраженная атрофия железы с дисбалансом биогенных аминов, дезорганизацией эпителиальных клеток, структур нетимопоэтического микроокружения коркового и мозгового вещества отмечается у потомства спленэктомированных крыс с постнатальным введением канцерогена.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Иммуногистохимическое исследование тимуса потомства крыс с иммунодефицитной беременностью / О. Ю. Кострова, Е. Г. Драндрова, К. В. Бессонова, Г. Ю. Стручко // Бюллетень Северного государственного медицинского университета. - 2011. -№1.-С. 197-198.

2. Морфофункциональное состояние тимуса у потомства крыс с иммунодефицитом / Г. Ю. Стручко, Л. М. Меркулова, Е. Г. Драндрова и др. // Мат. IV Всероссийской научно-практической конференции «Цитоморфометрия в медицине и биологии: фундаментальные и прикладные аспекты». - Москва, 19-20 мая 2011. - С. 91-93.

3. Исследование особенностей развития злокачественной опухоли при различном иммуноэндокринном статусе / Г. Ю. Стручко, Л. М. Меркулова, Е. В. Москвичев, О. Ю. Кострова, М. Н. Михайлова, Е. Г. Драндрова и др. // Материалы научно-практической конференции «Вопросы клинической медицины». - Чебоксары, 2011. - С. 174-177.

4. Драндрова, Е. Г. Участие люминесцирующих гранулярных клеток тимуса в процессах его инволюции при развитии экспериментальной опухоли толстой кишки / Е. Г. Драндрова, К. В. Бессонова, М. Н. Михайлова // Юность Большой Волги: сборник статей лауреатов ХШ Межрегиональной конференции-фестиваля научного творчества учащейся молодежи «Юность Большой Волги». - Чебоксары. 2011. - С. 320-322.

5. Люминесцирующие гранулярные клетки тимуса при развитии экспериментальной опухоли толстой кишки / Е. Г. Драндрова, Г. Ю. Стручко, О. Ю. Кострова и др. // Сборник научных статей XII международного конгресса «Здоровье и образование в XXI веке». -Москва, 2011. - С. 66-68.

6. Исследование морфологии тимуса через 5 месяцев после окончания курса введения канцерогена на фоне вторичного иммунодефицита / Е.В. Москвичев, Г.Ю. Стручко, Л.М. Меркулова, М.Н. Михайлова, Е.Г. Драндрова и др. // Злокачественные опухоли. - 2012. -Том2,№2.-С. 35-36.

7. Биоаминный фон тимуса у потомства крыс с иммунодефицитной беременностью / О. Ю. Кострова, Г. Ю. Стручко, Л. М. Меркулова, М. Н. Михайлова, Е. Г. Драндрова и др. // Сборник материалов и тезисов к 90-летию со дня рождения Д.С. Гордон «Морфология в теории и практике». - Чебоксары. 2012. - С. 218-220.

8. Иммуногистохимический фенотип тимуса у потомства крыс с иммунодефицитом / Г. Ю. Стручко, Л. М. Меркулова, Е. Г. Драндрова и др. // Мат. V Всероссийской научно-практической конференции «Цитоморфометрия в медицине и биологии: фундаментальные и прикладные аспекты». - Москва, 18 мая 2012. - С. 128-130.

9. Влияние иммунодефицитной беременности на морфофункциональное состояние тимуса потомства / Е. Г. Драндрова, К. В. Бессонова, Г. Ю. Стручко, М. Н. Михайлова // Россия. Наука. Университет: сб. тр. Всерос. 46-й науч. студ. конф. - Чебоксары: Изд-во Чуваш. Ун-та, 2012. - С. 453.

10. Воспроизводство потомства у крыс при развитии беременности на фоне иммунодефицита / Г. Ю. Стручко, Л. М. Меркулова, О. Ю. Кострова, М. Н. Михайлова, Е. Г. Драндрова и др. И Мат. XI конгресса Международной ассоциации морфологов. Морфология. -2012.-Т. 141, №3. - С. 153.

11. Драндрова, Е. Г. Влияние иммунодефицитной беременности на противоопухолевый иммунитет потомства / Е. Г. Драндрова, Г. Ю. Стручко, М. Н. Михайлова // Успехи современного естествознания. - 2013. - №9. - С. 84-86.

12. Клеточный состав тимуса и его биоаминное состояние у крыс на фоне канцерогенеза, осложненном вторичным иммунодефицитом / Г. Ю. Стручко, Л. М. Меркулова, Е. В. Москвичев, Е. Г. Драндрова и др. И Мат. IX Международной научно-практической конференции «Образованието и науката на XXI век - 2013». Лекарство. Ветеринарна наука. - София, 2013. - Том 11. - С. 43-47.

13. Драндрова, Е. Г. Изменение морфофункционального состояния тимуса потомства крыс с иммунодефицитом в условиях воздействия канцерогена / Е. Г. Драндрова // Юность Большой Волги: сборник статей лауреатов XV Межрегиональной конференции-фестиваля научного творчества учащейся молодежи «Юность Большой Волги». — Чебоксары. 2013. — С. 61-67.

14. Драндрова, Е. Г. Изменение клеточного состава паренхимы тимуса потомства крыс с иммунодефицитной беременностью / Е. Г. Драндрова // Сборник тезисов Итоговой Всероссийской студенческой научной конференции с международным участием «Медицинская весна». - М.: Изд-во Первого московского государственного университета им. ИМ. Сеченова. 2013. - С. 36-37.

15. Изменения тучноклеточной популяции тимуса потомства крыс с иммунодефицитом на фоне канцерогенеза / Е. Г. Драндрова, Г. Ю. Стручко, М. Н. Михайлова и др. // Сборник тезисов V Международного молодежного медицинского конгресса «Санкт-Петербургские научные чтения - 2013». - Санкт-Петербург. 2013. - С. 145-146.

16. Драндрова, Е. Г. Особенности последствий иммунодефицитной беременности / Е. Г. Драндрова // Природа. Наука. Победа: сб. тр. Всерос. 47-й науч. студ. конф. - Чебоксары: Изд-во Чуваш. Ун-та, 2013. - С. 466^(68.

17. Драндрова, Е. Г. Изменение клеточного состава паренхимы тимуса потомства крыс с иммунодефицитной беременностью с последующим введением канцерогена / Е. Г. Драндрова, Г. Ю. Стручко, М. Н. Михайлова // Природа. Наука. Победа: сб. тр. Всерос. 47-й науч. студ. конф. -Чебоксары: Изд-во Чуваш. Ун-та, 2013. - С. 468-469.

18. Морфофункциональные изменения селезенки и тимуса крысят, родившихся от спленэктомированных крыс-самок / Г. Ю. Стручко, Л. М. Меркулова, О. Ю. Кострова, М. Н. Михайлова, Е. Г. Драндрова и др. // Успехи современного естествознания. - 2014. - №9. - С. 70-72.

19. Цитоморфология тимуса потомства крыс с иммунодефицитной беременностью при

введении канцерогена / Е. Г. Драндрова, Г. Ю. Стручко, М. Н. Михайлова, О. Ю. Кострова // Мат. конф., посвященной 250-летию кафедры анатомии человека Первого МГМУ им. И.М. Сеченова «Анатомия человека: вчера, сегодня, завтра». - Москва. 2014. - С. 44.

20. Морфофункциональное состояние тимуса при экспериментальном канцерогенезе потомства самок крыс с вторичным иммунодефицитом / Г. Ю. Стручко, JI. М. Меркулова, Е. Г. Драндрова и др. // Медицинский журнал Западного Казахстана. - 2014. - №1(41). - С. 32-33.

21. Реакция клеток лимфоидного микроокружения тимуса и селезенки на развитие опухоли толстой кишки у потомства крыс с иммунодефицитом / М. Н. Михайлова, JI. М. Меркулова, Г. Ю. Стручко, О. Ю. Кострова, Е. Г. Драндрова и др. // Сборник научных трудов IV съезда физиологов СНГ. - Сочи. 2014. - С. 148.

22. Драндрова, Е. Г. Иммуногистохимические исследования тимуса потомства крыс с вторичным иммунодефицитом / Е. Г. Драндрова // Актуальные вопросы экспериментальной и клинической медицины: сб. материалов науч.-практ. конф. молодых ученых с междунар. участием. - Чебоксары: Изд-во Чуваш. Ун-та, 2014. - С. 11-13.

23. Иммуногистохимические исследования клеточного состава тимуса при канцерогенезе в условиях врожденного иммунодефицита / Е. Г. Драндрова, Г. Ю. Стручко, JI. М. Меркулова и др. // Современные проблемы науки н образования. - 2015. - № 3; URL: http://yyww.science-education.ru/123-19825.

24. Драндрова, Е. Г. Иммунофенотипирование клеток микроокружения тимуса у потомства самок с вторичным иммунодефицитом / Е. Г. Драндрова // Фундаментальные исследования. - 2015. - №1 (часть 8). - С. 1571-1575.

25. Морфологическая картина и иммуногистохимический фенотип тимуса при вторичной иммунной недостаточности / Г. Ю. Стручко, JI. М. Меркулова, Е. В. Москвичев, О. Ю. Кострова, М. Н. Михайлова, Е. Г. Драндрова // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2015. - Т. 159, №6. - С. 784-788.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

гст гистамин СКЗ субкапсулярная зона

КА катехоловые амины CT серотонин

КМЗ кортико-медуллярная зона тк тучные клетки

лгк люминесцирующие гранулярные ткв тимоциты коркового вещества

клетки ТМВ тимоциты мозгового вещества

МКАТ моноклональные антитела CD cluster of differentiation (кластер

М/ОТК микроокружение тучных клеток дифференцировки)

ПКАТ полшслональные антитела

Подписано в печать 19.10.2015г. Формат 60*84/16. Бумага офсетная. Гарнитура Times New Roman. Усл. п.л. 1,0. Заказ № 207. Тираж -100 шт.

Отпечатано в типографии ООО «Хорошая типография». 113099, г. Москва, ул. Валовая, д. 14, стр. 8. E-mail:2202758@mail.ru