Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Морфологические изменения тимуса и иммунобиохимические показатели крови после применения полиоксидония

ВАК РФ 03.03.04, Клеточная биология, цитология, гистология

Автореферат диссертации по теме "Морфологические изменения тимуса и иммунобиохимические показатели крови после применения полиоксидония"

005020484

На правах рукописи'

(о

МУХАММАД ЗАХИД

МОРФОЛОГИЧЕСКИЕ ИЗМЕНЕНИЯ ТИМУСА И ИММУНОБИОХИМИЧЕСКИЕ ПОКАЗАТЕЛИ КРОВИ ПОСЛЕ ПРИМЕНЕНИЯ ПОЛИОКСИДОНИЯ

03.03.04 - клеточная биология, цитология, гистология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

2 9 (/¡АР 2012

Чебоксары 2012

005020484

Работа выполнена на кафедре функциональной и лабораторной диагностики, и кафедре нормальной и топографической анатомии с оперативной хирургией ФГБОУ ВПО «Чувашский государственный университет им. И.Н. Ульянова»

Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор

Стручко Глеб Юрьевич

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Усенко Виктор Иванович

ФГБОУ ВПО «Казанская государственная академия ветеринарной медицины им. Н.Э. Баумана»

доктор медицинских наук, профессор Самойлова Алла Владимировна АУ «Институт усовершенствования врачей» Минздравсоцразвития ЧР

Ведущая организация: ГБОУ ВПО «Самарский государ-

ственный медицинский университет» Минздравсоцразвития РФ

Защита диссертации состоится «13» апреля 2012 г. в « часов на заседании объединенного совета ДМ 212.300.03 в ФГБОУ ВПО «Чувашский государственный педагогический университет имени И.Я. Яковлева» (428000, г. Чебоксары, ул. К.Маркса, 38, ФГБОУ ВПО «ЧГПУ им. ИЛ. Яковлева»), тел.: (8352) 62-02-83, http://www.chgpu.edu.ru

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ФГБОУ ВПО «ЧГПУ им. И.Я. Яковлева»

Автореферат разослан «12» марта 2012 г.

Ученый секретарь /7

диссертационного совета '/

д-рбиол.наук,профессор . С^^ В.В.Алексеев

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Изучение механизмов функционирования иммунной системы является актуальной медицинской проблемой, которая может помочь не только в лечении, но и в предотвращении развития различных заболеваний. Недостаточная изученность многих аспектов деятельности иммунной системы связана, с одной стороны, с чрезвычайно большим количеством типов клеток, участвующих в иммунных реакциях, а с другой - отсутствием доступных способов их идентификации в каждой конкретной ситуации (И.М. Кветной и др., 2011; Д.А. Ильин, 2011).

Иммунный гомеостаз является необходимой составной частью жизнедеятельности организма. Обменные процессы в организме находятся под надзором иммунной системы, которая, в свою очередь, подчиняется нейро-гуморальной регуляции при участии эндокринной системы (И.М. Кветной, В.О. Полякова, 2011). В задачи иммунной системы входит не только распознавание антигенного материала, борьба с ним, но и надзор за собственными клетками с целью предотвращения приобретения ими новых свойств.

Иммунная система является уникальным защитным механизмом, обеспечивающим гомеостаз, и при контакте с любым антигеном она не только реагирует в виде специфического иммунного ответа, но и способна вовлекать в этот процесс через гуморальные факторы нервную и эндокринную системы (В.А. Труфакин, 2002; Л.И. Дроздова и др., 2007; С.Н. Луговская и др., 2009). Ведущая роль в таких взаимодействиях принадлежит тимусу, в котором присутствуют многочисленные клеточные типы, обеспечивающие процессы иммуногенеза. Морфологические перестройки в тимусе, возникающие в ответ на стресс, на различные анти гены, носят адаптивный характер и сопровождаются изменением цитоархитектоники, и микроокружения клеток, что, по-видимому, и является причиной развития иммунодефицитов в этих условиях (Т.С. Гусейнов и др., 2005; E.H. Сибилаева, 2008; А.Н. Нурмухамбетов и др., 2011).

Проблеме взаимодействия структур тимуса посредством цитокинов и биогенных аминов в последнее десятилетие уделяется особое внимание (O.A. Ставинская и др., 2007, О.В. Сорокин, 2007; С.С. Коновалов и др., 2008, C.B. Диндяев и др., 2009). В связи с этим сформировалась новая дисциплина - ней-роиммуноэндокринология, объектом изучения которой являются механизмы, лежащие в основе взаимодействия главных регулирующих систем - нервной, иммунной и эндокринной. Посредниками взаимодействия этих систем являются внутрииммунные регуляторные факторы - гормоны тимуса, биогенные амины (И.М. Кветной, A.A. Яриллин и др., 2005; E.H. Сибилева,2008; Ястребова С.А. и др., 2010), иммунорегуляторные факторы: интерлейкины (ИЛ-1, ИЛ-6), фактор некроза опухолей, лимфоцит-активирующий фактор и др. (Д.А. Ильин, 2011; A. Daryadel, 2006; Е. Joseph, 2006; Lippuner Nadine, 2007).

Как известно, применение препаратов с иммунотропными свойствами обязывает к тщательному контролю их действия на морфофункциональное состояние органов. Поэтому изучение этого вопроса является весьма актуальным и в теоретическом, и в прикладном аспектах. В настоящее время одним из

наиболее изучаемых иммуномодуляторов является «Полиоксидоний», который обладает сложным и многогранным действием на иммунную и эндокринную системы, усиливая и клеточный, и гуморальный иммунитет (Р.М. Хаитов и др., 2006; Т.И. Лапина и др., 2010; М.Т. Исамухамедова, 2010; М.И. Варфоламеева, Б.В. Пинегин, 2011). Однако для признания полиоксидония как универсального препарата с широким спектром действия не хватает данных о его влиянии на органы иммунитета на клеточном и тканевом уровнях.

Таким образом, всестороннее исследование взаимодействия морфофунк-ционального состояния тимуса и структур периферической крови на фоне применения иммуномодулятора «Полиоксидоний» является важной и перспективной задачей современной иммуноморфологии, имеющей как фундаментальное, так и прикладное значение.

Цель работы - оценить функциональное состояние тимуса и иммунобио-химических показателей крови через три недели применения полиоксидония.

Задачи исследования:

1. Исследовать уровень биогенных аминов в люминесцирующих гранулярных клетках и их микроокружении, популяцию тучных клеток и провести морфометрию коркового и мозгового вещества тимуса через 3 недели введения полиоксидония.

2. С помощью иммуногистохимического анализа изучить клеточный состав тимуса и природу клеток у интактных животных и после трехнедельного применения полиоксидония.

3. Изучить иммунологические, гематологические и биохимические показатели крови через 3 недели введения полиоксидония.

4. Определить содержание биогенных аминов в структурах периферической крови в те же сроки после введения полиоксидония.

5. Выявить корреляционные связи между структурами тимуса и крови для комплексной оценки функционирования иммунной системы.

Научная новизна. Впервые описано, что использование полиоксидония приводит к снижению уровня гистамина во всех структурах тимуса, особенно в лимфоцитах коркового и мозгового вещества, содержание серотонина и катехо-ламинов в люминесцирующих гранулярных клетках увеличивается, в тимоци-тах - практически не изменяется. При этом соотношение (серото-нин+гистамин)/катехоламины во всех структурах достоверно снижается, особенно в тимоцитах коркового и мозгового вещества.

Впервые выявлено, что большая часть клеток внутренней кортикальной, субкапсулярной зон тимуса (50-60%) дают положительную реакцию на белок S-100 и экспрессируют CD 23, что позволяет их отнести к дендритным клеткам. Среди клеточных структур этих зон 20-25% - апудоциты (экспрессируют си-наптофизин и дают положительную реакцию на хромогранин А), до 20% - макрофаги (СБ68-позитивные и содержат фермент лизоцим).

Установлено, что применение полиоксидония в течение трех недель приводит к увеличению количества CD3+-лимфоцитов в паренхиме тимуса на 1525%, CD5+- и СБ451Ю+-лимфоцитов - на 10-15%, CD12+- и СБЗО-клеток - в 1,5-1,8 раз. Впервые выявлено, что в периферической крови у интактных жи-

вотных в лейкоцитах, лимфоцитах, эритроцитах и плазме преобладающим биогенным амином является гистамин. После использования полиоксидония регистрируется уменьшение уровня гистамина и повышение содержания серотони-на во всех изучаемых структурах.

Приоритетными следует считать данные о том, что применение полиоксидония способствует увеличению ^М и ^А, активации системы комплемента и фагоцитоза, повышению уровня ЦИК на фоне роста количества лейкоцитов с абсолютным лимфоцитозом.

Впервые представлены результаты корреляционного анализа между структурами тимуса и периферической крови у интактных животных и после применения полиоксидония. Установлено, что чем выше нагрузка на иммунитет, тем больше его компонентов подключаются для реализации функций. Наличие сильных корреляционных связей при использовании полиоксидония свидетельствует об устойчивом состоянии иммунной системы.

Теоретическое и практическое значение. В связи с широким применением полиоксидония в клинике в качестве иммуномодулятора результаты работы имеют важное значение для практикующих врачей, т.к. являются морфологическим обоснованием иммуностимулирующего действия препарата. Интерес представляют данные о корреляционных взаимоотношениях показателей периферической крови и морфофункционального состояния тимуса.

Кроме того, полученные данные о клеточном перераспределении в тимусе, изменении уровня биогенных аминов в тимусе и крови, а также результаты иммунобиохимических исследований крови представляют интерес для гистологии и иммунологии. Результаты работы используются в материалах лекций, при проведении практических занятий, а также при написании учебных пособий по гистологии и клинической лабораторной диагностике.

Реализация результатов исследований. Полученные научные результаты и положения диссертационного исследования используются в учебном процессе ФГБОУ ВПО «ЧГУ им. И.Н. Ульянова», АУ «Институт усовершенствования врачей» Минздравсоцразвития ЧР.

Результаты работы рекомендуются к использованию при написании учебных пособий по клеточной биологии, гистологии, цитологии и иммунологии для студентов высших учебных заведений медико-биологических и педагогических специальностей.

Научные положения, выносимые на защиту:

1. Применение полиоксидония приводит к достоверному увеличению в тимусе количества дендритных клеток, макрофагов, апудоцитов и тучных клеток, отмечается перераспределение биогенных аминов в сторону увеличения доли катехоламинов и серотонина в структурах тимуса.

2. После использования полиоксидония в периферической крови отмечается увеличение количества лейкоцитов с абсолютным лимфоцитозом, увеличение ^М и .^А, активация системы комплемента и фагоцитоза, повышение количества ЦИК, уменьшение уровня гистамина и повышение содержания серотонина во всех изучаемых структурах.

Апробация работы. Основные результаты диссертации доложены на международных медицинских конгрессах (Сочи, 2005; Кишинев, 2008); Региональной конференции «Современные технологии в медицине» (Чебоксары, 2005), Всероссийской конференции с международным участием «Морфология в теории и практике» (Чебоксары, 2008), региональной конференции «Клиническая и экспериментальная медицина» (Чебоксары, 2010), XVI Всероссийской научно-практической конференции «Молодые ученые в медицине» (Казань, 2011) и «Цитоморфометрия в медицине и биологии: фундаментальные и прикладные аспекты» (Москва, 2011).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 9 статей, из них 4 - в рецензируемых научных журналах и изданиях, определенных ВАК РФ.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 147 страницах машинописного текста, состоит из списка сокращений, введения, обзора литературы, описания материала и методик, четырех разделов собственных исследований, обсуждения результатов собственных исследований, выводов, списка литературы. Работа иллюстрирована 6 таблицами, 60 рисунками. Список литературы включает 263 источника, в том числе 98 зарубежных.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Работу выполняли в 2007-2011 гг в научной лаборатории кафедры нормальной и топографической анатомии ФГБОУ ВПО «ЧГУ им. И.Н. Ульянова» и клинико-диагностической лаборатории диагностического центра Республиканской клинической больницы Минздравсоцразвития 4P. Исследование является частью комплексной темы «Гистохимия биогенных аминов в морфофунк-циональном состоянии органов и тканей в норме и эксперименте» (№ госрегистрации 01201051855 от 19.02.2010 г).

2.1. Материалы исследований. Объектом исследования явились тимус и кровь 130 белых нелинейных крыс-самцов одного возраста и одной массы (180220 г), содержавшихся в обычных условиях при естественном освещении и сбалансированном рационе питания. Все действия, предусматривавшие контакты с экспериментальными животными, осуществлялись в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных».

Животные были разделены на 3 группы: первая - интактные крысы (п=25); вторая - контрольная группа животных с внутримышечным введением физиологического раствора по 0,5 мл 2 раза в неделю в течение 3 недель (п=35); третья - животные с внутримышечным введением полиоксидония из расчета 0,1 мг/кг 2 раза в неделю в течение 3 недель (доза адекватна лечебной для человека, исходя из соотношения средней массы крысы и человека) (п=70).

2.2. Методы исследований.

1. Иммуногистохимические методы исследования с использованием мо-ноклональных антител фирмы Santa Cruze, разделенных на группы по функциональной значимости: 1) маркеры зрелых Т-лимфоцитов - CD3, CD5, CD45RO; 2) маркеры В-лимфоцитов и NK-клеток- CD 12, CD30; 3) маркеры макрофагов-

CD68, лизоцим; 4) маркеры дендритных клеток - CD23, белок S-100; 5) маркеры нейроэндокринных клеток - хромогранин А, синаптофизин.

2. Люминесцентно-гистохимический метод Фалька-Хилларпа - для избирательного выявления катехоламин- и серотонинсодержащих структур тимуса и крови.

3. Люминесцентно-гистохимический метод Кросса, Эвена, Роста - для идентификации гистаминсодержащих структур тимуса и крови.

4. Метод цитоспектрофлюориметрии - для количественной оценки уровня катехоламинов (КА), серотонина (СТ) и гистамина (ГСТ) в структурах тимуса и крови. Для этого на люминесцентный микроскоп была установлена насадка ФМЭЛ-1А при выходном напряжении 900 В.

5. Метод непрямой иммунофлюоресценции с использованием монокло-нальных антител - для установления локализации белка S-100 в структурах тимуса.

6. Окраска полихромным толуидиновым синим по Унна - для качественной и количественной характеристики тучных клеток.

7. Окраска гематоксилином-эозином - в качестве общегистологической окраски с последующей морфометрией долек тимуса. Измерение диаметра коркового и толщины мозгового вещества производились с помощью светового микроскопа и винтового окулярного микрометра МОВ-1-15х, установленного на микроскоп при увеличении объектива 8х и окуляра 15х.

8. Метод радиальной иммнодиффузии - для количественного определения иммуноглобулинов класса G, М и А,

9. Определение активности системы комплемента по 50% гемолизу.

10. Определение уровня циркулирующих иммунных комплексов в сыворотке крови.

11. Определение фагоцитарной активности нейтрофилов с латексом.

12. Метод автоматического подсчета показателей крови (количество эритроцитов, лейкоцитов, тромбоцитов, уровень гемоглобина и гематокрита) проводился с помощью гематологического анализатора "Sysmex" (Япония).

13. Окраска мазков крови по Романовскому-Гимза - для подсчета лейко-формулы крови.

14. Метод автоматического определения биохимических показателей крови (мочевина, креатинин, мочевая кислота, холестерин, кальций, общий белок, щелочная фосфатаза) проводился на биохимическом анализаторе «Dimension AR» фирмы Du Pont (США).

15. Корреляционный анализ Пирсона - для изучения меры взаимной зависимости двух величин между структурами тимуса и крови.

16. Статистический анализ полученных цифровых данных проводился с помощью программы Microsoft Office Excel с оценкой достоверности различия средних величин по t-критерию Стьюдента. Вычислялись: ш - среднеарифметическая величина, □ - стандартная ошибка среднего значения, р - достоверность различия показателей подопытных групп по сравнению с контрольной группой: * -р<0,05; ** - р<0,01; *** -р<0,001.

3. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

3.1. Морфологическое исследование структур тимуса у интактных животных и после применения полиоксидоиия

С помощью люминесцентной микроскопии у интактных крыс выявляются четко очерченные дольки тимуса с заметным корковым и мозговым веществом. Во внутренней кортикальной зоне располагается ряд люминесцирующих гранулярных клеток с беловато-желтыми включениями, ограничивающие мозговое вещество в виде ободка в 1-2 ряда - премедуллярные клетки (рисунок 1). По периферии дольки в субкапсулярной зоне выявляются более мелкие клетки с зеленовато-желтыми гранулами в цитоплазме - субкапсулярные клетки. Мик-рофлуориметрически в этих клетках выявляются катехоламины, серотонин и гистамин. Между премедуллярными и субкапсулярными клетками тимусной дольки располагаются лимфоциты коркового вещества, которые также содержат определенную концентрацию биогенных аминов и обладают слабой люминесценцией. Кнутри от премедуллярного ряда клеток локализовано мозговое вещество тимуса.

Применение полиоксидония приводит к изменению цитоархитектоники тимуса: дольки увеличиваются в размерах как за счет диаметра коркового, так и за счет площади мозгового вещества. Премедуллярные клетки окружают мозговое вещество плотным кольцом в 4-5 ряда. Клетки крупные, яркие, желтовато-белой люминесценции. Количество премедуллярных клеток увеличивается до 18-20 в поле зрения, что на 50-60% превышает норму. В 15-20% случаев наблюдается «вклинение» кортико-медуллярного ряда клеток в субкапсуляр-ный (рисунок 2).

Рисунок 1. Тимус. Интактные животные. Рисунок 2. Тимус. Полиоксидоний, 3 недели.

Люминесцирующие гранулярные клетки Крупные люминесцирующие клетки

внутренней кортикальной и субкапсулярной зон. внутренней кортикальной зоны Метод Фалька. ЛЮМАМ-4. Об. 8, гомаль 1,7. вокруг темного мозгового вещества.

Метод Фалька. ЛЮМАМ-4. Об. 8, гомаль 1,7

У интактных животных преобладающим биогенным амином во всех исследованных структурах является гистамин, особенно в тимоцитах коркового и мозгового вещества, где его уровень в 3-4 раза выше содержания катехолами-нов и серотонина в этих же структурах.

В премедуллярных клетках после применения полиоксидония содержание серотонина и катехоламинов увеличивается на 67%, уровень гистамина практически не изменяется. Это приводит к снижению соотношения (СТ+ГСТ)/КА до 5,04 против 6,31 у интактных животных. В то же время в лимфоцитах микроокружения этих клеток - тимоцитах коркового вещества, содержание серотонина и катехоламинов увеличивается незначительно, а уровень гистамина падает почти в 2 раза (рисунок 3), что проявляется резким снижением соотношения (СТ+ГСТ)/КА до 3,92. У интактных животных этот индекс составляет 5,7 (рисунок 4). В тимоцитах мозгового вещества наблюдаются аналогичные изменения, однако соотношение (СТ+ГСТ)/КА уменьшается менее значительно.

Норма

6п 5'7

3,92 \

Рисунок 4. Соотношение (серотонин+гистамин)/катехоламины в тимоцитах коркового вещества

В клетках субкапсулярного ряда уровень серотонина возрастает почти на 20%. Это придает им беловатую люминесценцию, что и отмечалось нами при визуализации. Содержание катехоламинов снижается на 15%, а гистамина - в 1,6 раза. Такое перераспределение биогенных аминов в макрофагах субкапсу-лярной зоны, вероятнее всего, является ответной реакцией на значительные изменения в клетках премедуллярного ряда и тимоцитах коркового вещества. Поэтому соотношение (СТ+ГСТ)/КА в субкапсулярных клетках практически не изменяется: 5,95 против 6,45 у интактных крыс.

Количество тучных клеток при люминесцентной микроскопии заметно увеличивается, причем в основном за счет молодых недегранулированных форм. При цитоспектрофлуориметрии уровень серотонина в них повышается на 37%, катехоламинов - на 11%, а уровень гистамина снижается на 22%. Соотношение (СТ+ГСТ)/КА отличается от нормы незначительно: 6,12 и 6,62 соответственно. В то же время, в лимфоцитах микроокружения тучных клеток на фоне незначительного увеличения серотонина (на 21%) уровень гистамина снижается более существенно (на 41%), что приводит к наглядному уменьшению соотношения (СТ+ГСТ)/КА: 4,85 против 5,83 у интактных животных.

Норма ФР ПО

Рисунок 3. Интенсивность свечения биогенных аминов (у.е.) в тимоцитах коркового вещества у интактных животных, после введения физиологического раствора (ФР) и полиоксидония (ПО)

Толщина коркового и диаметр мозгового вещества, а также масса тимуса крыс в норме, _после введения физиологического раствора и полиоксидония_

Вид воздействия Толщина коркового вещества (мкм) Диаметр мозгового вещества (мкм) Площадь мозгового вещества (мм2) Масса тимуса (мг/100 г массы)

Норма 303,4+6,12 346,55±14,3 94,21±1,7 144,2±14,6

Физиологический раствор 292,93+8,12 333,97+11,7 87,35+2,1* 138,6±13,1

Полиоксидоний 373,25+9,63** 432,72+16,6** 146,66±3,4** 151,4+6,7

Следует отметить, что в контрольной группе с введением физиологического раствора уровень биогенных аминов тоже несколько меняется, но эти изменения менее выражены. Соотношение (СТ+ГСТ)/КА в тимоцитах коркового, мозгового и микроокружениях тучных клеток, а также в субкапсулярных клетках становится выше нормы.

Исследование морфологии тучных клеток с помощью окраски полихром-ным толуидиновым синим показало, что в норме преобладают дегранулирован-ные Т-2 и Т-3 формы клеток (79,2%) с (3,- и р2-метахромазией (рисунок 5). После введения полиоксидония отмечается увеличение количества тучных клеток (рисунок 6). В 33,2% случаев - это недегранулированные Т-0 и Т-1 формы клеток с рг метахромазией. Соответственно дегранулированные Т-2 и Т-3 формы занимают 62,6%, что на 16,6% меньше, чем у интактных крыс.

Рисунок 5. Тимус. Интактные животные. Т-2 формы тучных клеток с Р,- и Р2-

метахромазией. Ок. толуидиновым синим по Унна. Об. 10, ок. 10, гомаль 3,0.

Рисунок 6. Тимус. Полиоксидоний, 3 недели. Увеличение количества тучных клеток в септах дольки. Ок. толуидиновым синим по Унна. Об. 20, ок. 10, гомаль 3,0.

Окраска срезов тимуса гемотоксилином-эозином и проведение морфо-метрии долек выявили следующее: толщина коркового вещества после применения полиоксидония увеличивается на 19%, а площадь мозгового вещества возрастает на 36%. При этом масса тимуса практически не отличается от нормы и контрольной группы (таблица 1).

Таблица 1

* - Р<0,01, ** - Р<0,001

3.2. Иммуногистохимическое исследование структур тимуса у интактных животных и после применения полиоксидония.

Для изучения маркеров зрелых Т-лимфоцитов и Т-клеток памяти нами использовались моноклональные антитела к CD3, CD5 и CD45RO. Известно, что антигены CD3 и CD5 экспрессируются на поздних тимоцитах и зрелых Т-клетках. Однако, если СОЗ+-клетки - это строго специфичные Т-лимфоциты, то СБ5-позитивными могут быть и В-лимфоциты внутридольковых периваску-лярных пространств. Выявлено, что у интактных и контрольной групп животных количество СБЗ+-клеток составляет 25-35% общей доли лимфоцитов. Они располагаются, в основном, в мозговом веществе тимуса и во внутридольковых периваскулярных пространствах. После применения полиоксидония число СПЗ+-клеток возрастает до 50%. Это связано не только с увеличением количества самих зрелых Т-лимфоцитов, но и с увеличением диаметра и площади мозгового вещества тимусной дольки на 20 и 36% соответственно.

Количество С05+-лимфоцитов незначительно превышает число CD3 -клеток за счет В-лимфоцитов внутридольковых периваскулярных пространств и составляет около 35-40% у интактных и 45-55% - у экспериментальных животных.

С помощью моноклональных антител к CD45RO нами определялись гибнущие тимоциты и Т-клетки памяти. Установлено, что у интактных животных до 20-25% лимфоцитов внутренней кортикальной зоны дают положительную реакцию на CD45RO (рисунок 7). После применения полиоксидония количество CD45RO+-лимфоцитов возрастает до 35-40% (рисунок 8).

Рисунок 7. Тимус. Иитактные животные. Рисунок 8. Тимус. Полиоксидоний, 3 недели. СО45Я0+-клетки. Ув. 1200х Значительное увеличение С045ЯО+-клеток. Ув. 1200х

Для выявления В-лимфоцитов и натуральных киллеров использовались моноклональные антитела к антигенам СБ 12 и СВЗО. С012+ клетки у интактных животных выявлялись в небольшом количестве во внутридольковых периваскулярных пространствах (2-3%) и единичные - во внутренней кортикальной зоне. После трехнедельного использования полиоксидония количество СП 12 -клеток возрастает почти в 2 раза во внутренних периваскулярных пространствах и обнаруживаются во внутренней кортикальной зоне, окружая мозговое вещество в 1-2 разорванных ряда.

Антиген СИЗО относится к семейству факторов некроза опухолей и экс-прессируется активированными В-, Т- и ЫК-клетками. В лимфоидной ткани тимуса интактных крыс СЭ30+-клетки визуализируются в небольшом количестве в междольковых септах. В условиях иммуномодуляции СВЗСГ-клетки обнаруживаются также и в кортико-медуллярной зоне. Следует отметить, что СЮЗО отвечает не только за активацию, дифференцировку Т- и В-лимфоцитов, но и за индукцию апоптоза. Нехарактерное появление СБ30+-клеток в виде неправильного кольца вокруг мозгового вещества прямо коррелирует с обнаружением в этой зоне С045ІЮ'-клеток.

Для изучения гистотопографии макрофагов тимуса нами использовались моноклональные антитела к СБ68 и фермент лизоцим. С068-позитивные клетки у интактных животных всегда выявляются в небольшом количестве во всех зонах тимусной дольки и под капсулой рядом с жировой тканью (рисунок 9). Аналогичная картина наблюдается и при обработке парафиновых срезов на лизоцим (рисунок 10). После применения полиоксидония наблюдается увеличение количества макрофагов в 1,5-2,2 раза и группирование их вокруг мозгового вещества.

Рисунок 10. Тимус. Интактные животные. Макрофаги субкапсулярной зоны. Иммуногистохимическая реакция на лизоцим Ув. 400х

Одним из ключевых структурных элементов тимуса, помимо лимфоцитов и эпителиальных клеток, являются дендритные клетки. Для их выявления нами применялись антитела к антигену С023 и белку Б-100 (иммунопероксидазный и люминесцентно-гистохимический методы). У интактных животных дендритные клетки обнаруживаются, наряду с макрофагами и нейроэндокринными клетками, в основном во внутренней кортикальной зоне. Единичные клетки выявляются под капсулой, по ходу соединительной ткани, в мозговом веществе.

Примененный нами люминесцентно-гистохимический метод на белок 8100 показал, что положительной реакцией на этот белок обладает лишь часть люминесцирующих гранулярных клеток внутренней кортикальной и субкапсулярной зон долек тимуса. Это подтверждается и при иммуногистохимической окраске на этот белок. Дендритные клетки выстраиваются в 1-2 ряда вокруг мозгового вещества и во внутридольковых периваскулярных пространствах.

Рисунок 9. Тимус. Интактные животные. Макрофаги субкапсулярной зоны. Иммуногистохимическая реакция на СБ68. Ув. 400х

Гистологическая картина тимуса существенно меняется после введения полиоксидония. Отмечается значительное увеличение С023+-клеток как в корковом, так и в мозговом веществе (рисунок 11). Дендритные клетки экспресси-руют большое количество белка 8-100, что делает их яркими при люминесцентной микроскопии. Их количество и размеры заметно увеличиваются, особенно во внутренней кортикальной зоне и мозговом веществе дольки тимуса.

Рисунок 11. Тимус. Полиоксидоний, 3 недели. Увеличение количества дендритных клеток и их размеров в кортико-медуллярной зоне. Иммуногистохимическая реакция на С023. Ув. 1200*

Среди общеизвестных структур тимуса выявляются клетки, которые по своим морфологическим и физиологическим характеристикам невозможно отнести ни к макрофагам, ни к дендритным клеткам. Они диффузно располагаются во всех зонах тимуса, особенно много их выявляется во внутреннем кортикальном слое. Для того, чтобы получить информацию о данном типе клеток, нами использовались моноклональные антитела к хромогранину А и сипапто-физину - маркерам клеток нейроэндокринной системы.

Клетки АПУД-серии выявляются у интактных животных диффузно во всех зонах тимусной дольки. При люминесцентно-гистохимическом исследовании - это крупные, яркие с беловато-желтым свечением клетки и заметными гранулами в цитоплазме. Обработка парафиновых срезов на синаптофизин подтверждает наличие таких клеток во всех зонах, особенно в кортико-медуллярной. Использование иммуномодулятора приводит к увеличению количества клеток АПУД-серии и к повышению экспрессии в них синаптофизина.

3.3. Морфологическое исследование крови у интактных животных и после применения полиоксидония

После обработки мазков крови по Фальку-Хилларпу на выявление серо-тонин- и катехоламинсодержащих структур, а также по методу Кросса для визуализации гистаминсодержащих структур были исследованы следующие ее компоненты, плазма крови, эритроциты, лейкоциты и лимфоциты. С помощью цитоспектрофлуориметрии определялось содержание серотонина, катехолами-нов и гистамина в этих структурах. У интактных животных преобладающим биогенным амином во всех изучаемых структурах, как и в тимусе, является ги-стамин (рисунок 12). Самый высокий уровень гистамина зарегистрирован в лейкоцитах, который в 1,5 раза выше, чем в плазме и в 2,7 раза - чем в эритроцитах. Кроме того, его содержание в лейкоцитах в 1,75 раз выше уровня серотонина и в 4 раза - катехоламинов. В плазме крови - соответственно в 3,5 и 2,8 раза. В эритроцитах содержание гистамина достоверно не отличается от уровня серотонина и в 1,5 раза выше содержания катехоламинов. Уровень катехоламинов распределен во всех структурах приблизительно одинаково. Содержание серотонина в лейкоцитах почти в 2 раза выше, чем в эритроцитах и в 3 раза -чем в плазме крови. Следует отметить, что только в плазме катехоламины преобладают над серотонином.

Рисунок 12.Распределение гистамина в структурах крови у интактных животных

Рисунок 13. Интенсивность свечения биогенных аминов (у.е.) в лейкоцитах у интактных животных, после введения физиологического раствора (ФР) и полиоксидония (ПО)

В серотонин В [истамин О

При трехнедельном применении полиоксидония преобладающим биогенным амином во всех структурах также остается гистамин, однако, его значения не столь значимые по отношению к другим биогенным аминам. Так, его уровень в лейкоцитах лишь в 1,4, в плазме - в 1,2, а в эритроцитах - в 1,15 раза выше содержания серотонина и катехоламинов. В лейкоцитах отмечается уменьшение уровня гистамина и серотонина на 36 и 21% соответственно и увеличение содержания катехоламинов на 42% (рисунок 13). Это приводит к значительному уменьшению соотношения (СТ+ГСТ)/КА с 6,36 у интактных животных до 2,54 - у экспериментальных. Аналогичные изменения происходят и в лимфоцитах крови, однако уровень серотонина в них уменьшается более значительно. В плазме регистрируется рост значения серотонина и катехоламинов в

1,7 и 1,4 раза соответственно и снижение содержания гистамина на 36,6%. В результате такого перераспределения биогенных аминов соотношение (СТ+ГСТ)/КА становится равным 2,23 против 3,60 у интактных животных. В эритроцитах колебания биогенных аминов менее значимые. Отмечается лишь достоверное увеличение уровня катехоламинов на 26%, что приводит к незначительному уменьшению соотношения (СТ+ГСТ)/КА с 2,91 до 2,44.

В общем анализе крови достоверных изменений со стороны красной крови и тромбоцитов не выявлено. Количество лейкоцитов после применения по-лиоксидония составляет 8,87x109/л, что в 1,5 раза выше значений у интактных животных. В лейкоформуле отмечается достоверное снижение числа эозинофи-лов, лимфоцитоз и легкий моноцитоз (рисунок 14). Абсолютное значение лимфоцитов составляет 6750/мл, в то время как у интактной и контрольной группы животных эти цифры составляют не более 3900/мл.

В иммунограмме отмечается достоверное увеличение всех классов иммуноглобулинов. Уровень возрастает на 9%, ^М - на 40%, 1§А - в 2,5 раза (рисунок 15). Активность системы комплемента увеличивается на 17,6%, а уровень ЦИК - в 1,8 раза. Кроме того, отмечается активация базального фагоцитоза: фагоцитарный индекс возрастает почти на 20%.

В биохимическом анализе крови следует отметить снижение концентрации мочевины в 1,6 раза, увеличение уровня креатинина на 27%, мочевой кислоты - на 23%, холестерина - на 22%, щелочной фосфатазы - на 33%.

1 і і

и . і ь к-

я

Рисунок 14. Лейкоформула крови у интактных животных, после введения физиологического раствора (ФР) и полиоксидония (ПО)

і И эозинофипы И п/я нейтрофилы □ с/я нейтрофилы Щ лимфоциты И моноциты |

Рисунок 15. Уровень иммуноглобулинов (г/л) крови у интактных животных, после введения физиологического раствора (ФР) и полиоксидония(ПО)

І ^СВ^МЕидА I

3.4. Корреляционный анализ взаимоотношений структур тимуса и крови

Для анализа линейных корреляционных взаимоотношений мы взяли лишь отдельные пары, которые, по нашему мнению, представляют больший интерес.

Первая труппа корреляционных пар - это взаимосвязь между биогенными аминами лимфоцитов крови с тимоцитами, плазмой и иммуноглобулинами крови (таблица 2).

Таблица 2

Корреляционные взаимоотношения биогенных аминов лимфоцитов крови с тимоцитами, плазмой и иммуноглобулинами

Корреляционная пара Биогенный амин Интактные крысы После введения физраствора После введения полиоксидония

Корковые тимоциты -лимфоциты крови СТ ... 0,28 0,64

гст 0,86 0,64 0,89

КА 0,38 0,41 0,76

Мозговые тимоциты -лимфоциты крови СТ — ... 0,38

гст 0,7 0,52 0,86

КА 0,38 ... ...

Плазма - лимфоциты крови СТ -0,38 — -0,46

ГСТ -0,44 -0,4 0,75

КА -0,62 -0,59 0,92

.^А - лимфоциты крови СТ -0,48 -0,36 —

гст -0,42 -0,56 0,86

КА -0,37 -0,48 ...

.1§М - лимфоциты крови СТ -0,43 -0,62 —

ГСТ -0,54 -0,5 0,72

КА -0,51 -0,46 0,28

- лимфоциты крови СТ -0,4 -0,36 —

ГСТ -0,51 -0,62 0,62

КА -0,29 — —

В 18 исследуемых парах у иитактных животных количество сильных корреляционных связей всего 1 (5,6%), слабых - 2 (11,2%), умеренных - 15 (83,2%). Следует отметить, что в парах между показателями крови корреляционные связи всегда отрицательные, а между лимфоцитами крови и тимуса -всегда положительные.

После введения полиоксидония можно отметить три важные особенности: 1) увеличивается количество пар с сильными корреляционными связями до 6 (33,3%) и с отсутствием достоверных корреляционных связей - также 6 (33,3%); 2) между лимфоцитами крови и иммуноглобулинами наблюдается положительная корреляционная взаимосвязь, что не характерно для интактных животных; 3) ведущим биогенным амином во всех парах с умеренной и сильной корреляционной связью является гистамин.

Вторая группа корреляционных пар - компоненты иммунной системы периферической крови. У интактных животных среди 13 изучаемых корреляционных пар значимая корреляция определялась в 9 парах (69,2%). Сильная корреляционная зависимость выявлялась лишь в 2-х парах: между лимфоцитами и нейтрофилами, а также между и ^А.

После введения полиоксидония количество значимых взаимосвязей сокращается до 8 (61,5%), но при этом 3 из них (37,5%) - с сильной взаимозависимостью. Обращает на себя внимание несколько особенностей: 1) увеличение процента корреляционных пар с сильной взаимозависимостью (с 22,2% у интактных животных до 37,5% у экспериментальных); 2) постоянно сохраняется обратная корреляция содержания лимфоцитов и нейтрофилов, несмотря на различный состав корреляционных взаимосвязей.

4. ВЫВОДЫ

1. Применение полиоксидония вызывает изменение морфофункциональ-ного состояния тимуса: во всех изучаемых клетках уровень гистамина снижается, особенно в лимфоцитах коркового и мозгового вещества, содержание серо-тонина и катехоламинов в люминесцирующих гранулярных клетках увеличивается в 1,2-1,7 раз, а в тимоцитах практически не изменяется. Отмечается увеличение тучных клеток с Рг и Рг-метахромазией почти в 2 раза, на долю Т-2 и Т-3 форм приходится 63% всех клеток. Выявляется увеличение площади тимусной дольки в 1,43 раза, толщины коркового вещества на 19%, площади мозгового вещества на 36%, корково-мозгового индекса в 1,5 раза при неизмененной массе органа.

2. Большая часть клеток внутренней кортикальной, субкапсулярной зон (50-60%), а также среди тимоцитов мозгового вещества у интактных животных дают положительную реакцию на белок Б-100 и экспрессируют антиген СБ23, что позволяет отнести их к дендритным клеткам. До 20% клеток этих зон являются СБ68-позитивными и содержат фермент лизоцим, проявляя тем самым свойства истинных макрофагов. 20-25% люминесцирующих гранулярных клеток экспрессируют синаптофизин и дают положительную реакцию на хро-могранин А, т.е. относятся к клеткам АПУД-системы.

Применение полиоксидония приводит к увеличению количества клеток во всех зонах тимуса, особенно во внутренней кортикальной зоне в основном за счет дендритных клеток и макрофагов. Количество СОЗ+-лимфоцитов в паренхиме тимуса возрастает на 15-25%, СБ5+- и СБ451Ю+-лимфоцитов - на 510%, С012+- и СБЗО-клеток - в 1,2-1,5 раз.

3. Введение полиоксидония приводит к увеличению количества лейкоцитов в 1,5 раза с абсолютным лимфоцитозом до 1650/мл. В иммунограмме отмечается достоверное увеличение 1{>М на 40%, ^А - в 2,5 раза, активация системы комплемента на 18% и фагоцитоза на 20%, повышение уровня ЦИК в 1,8 раза.

4. В периферической крови у интактных животных в лейкоцитах, лимфоцитах, эритроцитах и плазме преобладающим биогенным амином является ги-стамин. После применения полиоксидония регистрируется уменьшение уровня гистамина и повышение содержания серотонина в 1,3-1,5 раз во всех изучаемых структурах, что приводит к значительному снижению соотношения (серото-нин+гистамин)/катехоламины, особенно в лимфоцитах крови.

5. Проведение корреляционного анализа для комплексной оценки функционирования иммунной системы выявило, что у интактных животных между лимфоцитами крови и тимуса всегда отмечается положительная взаимосвязь, которая наиболее выражена между гистамином корковых тимоцитов и лимфоцитов крови. Применение полиоксидония способствует усилению корреляционных взаимоотношений между лимфоцитами крови, тимоцитами, плазмой и иммуноглобулинами.

Структурные элементы иммунной системы не функционируют все одновременно: чем выше нагрузка на иммунитет (введение иммуномодулятора), тем

больше ее компонентов подключаются для реализации функций. Наличие сильных корреляционных связей при использовании полиоксидония свидетельствует об устойчивом состоянии иммунной системы.

5. СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Москвичев, Е.В. Изменения показателей крови после аутолиенотранс-плантации и введения мексидола / Е.В. Москвичев, Е.Б. Шумилова, Л.М. Меркулова, 3. Мухаммад // Морфология. - 2008. - Т.133. - №2. - С.91-92.*

2. Мухаммад, 3. Полиоксидоний как корректор постспленэктомического иммунодефицитного состояния / 3. Мухаммад // Науч. труды II съезда физиологов СНГ. - Кишинев, 2008. - С. 159-160.

3. Стручко, Г.Ю. Инволюция тимуса как последствие экспериментального канцерогенеза / Г.Ю. Стручко, Л.М. Меркулова, Е.В. Москвичев, 3. Мухаммад // Клиническая анатомия и экспериментальная хирургия. - 2010. - Вып. 10. -С.84-87.

4. Мухаммад, 3. Т-зависимые иммунорегуляторные эффекты полиоксидония и иммунофана (обзор литературы) / 3. Мухаммад, Г.Ю. Стручко, Л.М. Меркулова, М.Н. Михайлова // Вестник Чувашского университета. - 2010. -№3. - С.140-145.*

5. Мухаммад, 3. Применение корреляционного анализа в оценке иммуномо-дулирующих свойств полиоксидония / 3. Мухаммад // Клиническая и экспериментальная медицина: сб. науч. трудов. - Чебоксары: Изд-во Чуваш, ун-та, 2010.-С. 133-135.

6. Мухаммад, 3. Иммуногистохимическое исследование структур тимуса после применения полиоксидония / 3. Мухаммад, Г.Ю. Стручко // Клиническая и экспериментальная медицина: сб. науч. трудов. - Чебоксары: Изд-во Чуваш, ун-та, 2010.-С. 140-143.

7. Стручко, Г.Ю. Морфологическая и иммуногистохимическая характеристика тимуса и опухолей ЖКТ на фоне иммунной недостаточности / Г.Ю. Стручко, Л.М. Меркулова, Е.В. Москвичев, 3. Мухаммад // Вестник Чувашского университета. - 2011. - №3. - С.450-455.*

8. Мухаммад, 3. Изучение иммуномодулирующих свойств полиоксидония на тканевом уровне / 3. Мухаммад // Культурологические проблемы дошкольного образования в поликультурном регионе: сб. науч. статей. - Чебоксары: Изд-во ЧГПУ, 2011. - С. 48-51.

9. Мухаммад, 3. Морфофункциональное состояние тимуса при введении иммуномодулятора «Полиоксидоний» / 3. Мухаммад, Г.Ю. Стручко // Вестник Чувашского государственного педагогического университета им. И.Я. Яковлева. - 2011. - №4(72). - 4.1. - С.88-93.*

*- публикации в ведущих рецензируемых научных журналах и изданиях, определенных ВАК РФ

Подписано к печати 10.03.2012 г. Бумага писчая. Печать оперативная. Усл. печ. л. 1,0. Тираж 100 экз. Заказ № К-156.

Отпечатано в типографии ООО «Издательство «Перфекгум». 428019, г.Чебоксары, пр. И.Яковлева, д.15, оф.82 Тел. (8352) 28-79-83, факс (8352)28-79-84 E-mail: mail@perfecturabooks.ru www.perfectumbooks.ru

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Мухаммад Захид, Чебоксары

61 12-3/1230

МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Чувашский государственный университет имени И.Н. Ульянова»

На правах рукописи

МУХАММАД ЗАХИД

МОРФОЛОГИЧЕСКИЕ ИЗМЕНЕНИЯ ТИМУСА И ИММУНОБИОХИМИЧЕСКИЕ ПОКАЗАТЕЛИ КРОВИ ПОСЛЕ ПРИМЕНЕНИЯ ПОЛИОКСИДОНИЯ

03.03.04 - клеточная биология, цитология, гистология

Диссертация

на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель:

доктор медицинских наук профессор Г.Ю. Стручко

Чебоксары 2012

ОГЛАВЛЕНИЕ

Стр.

ВВЕДЕНИЕ........................................................................................4-9

Глава 1. Обзор литературы..........................................................................10-40

1.1. Современные представления об анатомии, эмбриогенезе, гистологии и гистохимии тимуса......................................................10-17

1.2. Функциональное значение тимуса..................................................................17-24

1.3. Роль биогенных аминов в формировании иммунного ответа 24-35

1.4. Современные представления о реакции организма на введение полиоксидония...........................................................................35 -40

Глава 2. Материал и методы исследований..................................................................41-47

Глава 3. Результаты собственных исследований......................................................48-102

3.1. Морфологическое исследование тимуса у интактных животных и после применения полиоксидония............................................................48-67

3.2. Иммуногистохимическое исследование структур тимуса

у интактных животных и после применения полиоксидония.......................68-86

3.3. Морфологические исследование крови у интактных животных и после применения полиоксидония............................................................87-97

3.4. Корреляционный анализ взаимоотношений структур

тимуса и крови........................................................................98-101

Глава 4. Обсуждение результатов собственных исследований..................102-116

Глава 5. Выводы..................................................................................117-118

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.................................................................................................119-147

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

Б А - биогенные амины; ДК - дендритные клетки; ГСТ - гистамин; КА - катехоламины;

ЛГК - люминесцирующие гранулярные клетки;

ПО - полиоксидоний;

СТ - серотонин;

ТК - тучные клетки;

ФР - физиологический раствор;

CD - claster of differentiation;

NK - натуральные киллеры;

ИНФ - интерферон;

ФНО - фактор некроза опухоли.

ВВЕДЕНИЕ

Изучение механизмов функционирования иммунной системы является актуальной медицинской проблемой, которая может помочь не только в лечении, но и в предотвращении развития различных заболеваний. Недостаточная изученность многих аспектов деятельности иммунной системы связана, с одной стороны, с чрезвычайно большим количеством типов клеток, участвующих в иммунных реакциях, а с другой - отсутствием доступных способов их идентификации в каждой конкретной ситуации (И.М. Кветной и др., 2011; Д.А. Ильин, 2011).

Иммунный гомеостаз является необходимой составной частью жизнедеятельности организма. Обменные процессы в организме находятся под надзором иммунной системы, которая, в свою очередь, подчиняется нейро -гуморальной регуляции при участии эндокринной системы (И.М. Кветной, В.О. Полякова, 2011). В задачи иммунной системы входит не только распознавание антигенного материала, борьба с ним, но и надзор за собственными клетками с целью предотвращения приобретения ими новых свойств.

Каждая клетка организма выполняет определенные функции в пределах органа или системы. Однако, при определенных условиях, она может эти функции утратить и приобрести новые, несвойственные для себя, характеристики. Как правило, это происходит вследствие генетической мутации, которая в свою очередь может быть обратимой или нет. Обратимые изменения генома, чаще всего, распознаются клетками иммунной системы еще до того, как клетка приобрела несвойственные для себя функции. Обратимая мутация в геноме клетки подвергается репарации, через удаление измененного фрагмента ДНК, с последующей репликацией. Если это невозможно - запускается многоступенчатый механизм запрограммированной гибели через апоптоз. В случае если и этот механизм оказывается неэффективным, измененная клетка подвергается лизису и фагоцитозу. Иммунокомпетентные клетки присутствуют в этой схеме на каждом этапе. Они отвечают за распознавание мутантов инициацию «лечения» или апоптоза и в конечном итоге - за их элимина-

цию. Звенья иммунной системы работают в совокупности через сложные механизмы межклеточных взаимодействий, и выпадение одного из звеньев может приводить к дисфункции всей иммунной системы (Грабовой А.Н., 2011).

Актуальность темы.

Иммунная система является уникальным защитным механизмом, обеспечивающим гомеостаз, и при контакте с любым антигеном она не только реагирует в виде специфического иммунного ответа, но и способна вовлекать в этот процесс через гуморальные факторы нервную и эндокринную системы (В.А. Труфакин, 2002; Л.И. Дроздова и др., 2007; С.Н. Луговская и др., 2009). Ведущая роль в таких взаимодействиях принадлежит тимусу, в котором присутствуют многочисленные клеточные типы, обеспечивающие процессы иммуногенеза. Морфологические перестройки в тимусе, возникающие в ответ на стресс, на различные антигены, носят адаптивный характер и сопровождаются изменением цитоархитектоники и микроокружения клеток, что, по-видимому, и является причиной развития иммунодефицитов в этих условиях (Т.С. Гусейнов и др., 2005; E.H. Сибилаева, 2008; А.Н. Нурмухамбетов и др., 2011).

Проблеме взаимодействия структур тимуса посредством цитокинов и биогенных аминов в последнее десятилетие уделяется особое внимание (O.A. Ставинская и др., 2007, О.В. Сорокин, 2007; С.С. Коновалов и др., 2008, C.B. Диндяев и др., 2009). В связи с этим сформировалась новая дисциплина -нейроиммуноэндокринология, объектом изучения которой являются механизмы, лежащие в основе взаимодействия главных регулирующих систем -нервной, иммунной и эндокринной. Посредниками взаимодействия этих систем являются внутрииммунные регуляторные факторы - гормоны тимуса, биогенные амины (И.М. Кветной, A.A. Яриллин и др., 2005; E.H. Сибиле-ва,2008; Ястребова С.А. и др., 2010), иммунорегуляторные факторы: интер-лейкины (ИЛ-1, ИЛ-6), фактор некроза опухолей, лимфоцит-активирующий фактор и др. (Д.А. Ильин, 2011; A. Daryadel, 2006; L.Nadine, 2007).

Как известно, применение препаратов с иммунотропными свойствами ведет к тщательному контролю их действия на морфофункциональное состояние органов. Поэтому изучение этого вопроса является весьма актуальным и в теоретическом, и в прикладном аспектах. В настоящее время одним из наиболее изучаемых иммуномодуляторов является «Полиоксидоний», который обладает сложным и многогранным действием на иммунную и эндокринную системы, усиливая и клеточный, и гуморальный иммунитет (P.M. Хаитов и др., 2006; Т.Н. Лапина и др., 2010; М.Т. Исамухамедова, 2010; М.И. Варфоламеева, Б.В. Пинегин, 2011). Однако для признания полиоксидония как универсального препарата с широким спектром действия не хватает данных о его влиянии на органы иммунитета на клеточном и тканевом уровнях.

Таким образом, всестороннее исследование взаимодействия морфо-функционального состояния тимуса и структур периферической крови на фоне применения иммуномодулятора «Полиоксидоний» является важной и перспективной задачей современной иммуноморфологии, имеющей как фундаментальное, так и прикладное значение.

Цель исследования.

Оценить функциональное состояние тимуса и иммунобиохимических

показателей крови через три недели применения полиоксидония.

В соответствии с целью работы поставлены следующие задачи:

1. Исследовать уровень биогенных аминов в люминесцирующих гранулярных клетках и их микроокружении, популяцию тучных клеток и провести морфометрию коркового и мозгового вещества тимуса через 3 недели

введения полиоксидония.

2. С помощью иммуногистохимического анализа изучить клеточный

состав тимуса и природу клеток у интактных животных и после трехнедельного применения полиоксидония.

3. Изучить иммунологические, гематологические и биохимические показатели крови через 3 недели введения полиоксидония.

4. Определить содержание биогенных аминов в структурах периферической крови в те же сроки после введения полиоксидония.

5. Выявить корреляционные связи между структурами тимуса и крови для комплексной оценки функционирования иммунной системы. Научная новизна работы.

1. Впервые описано, что использование полиоксидония приводит к снижению уровня гистамина во всех структурах тимуса, особенно в лимфоцитах коркового и мозгового вещества, содержание серотонина и катехола-минов в люминесцирующих гранулярных клетках увеличивается, в тимоци-тах - практически не изменяется. При этом соотношение (серото-нин+гистамин)/катехоламины во всех структурах достоверно снижается, особенно в тимоцитах коркового и мозгового вещества.

2. Впервые выявлено, что большая часть клеток внутренней кортикальной, субкапсулярной зон тимуса (50-60%) дают положительную реакцию на белок 8-100 и экспрессируют СО 23, что позволяет их отнести к дендритным клеткам. Среди клеточных структур этих зон 20-25% - апудоциты (экспрессируют синаптофизин и дают положительную реакцию на хромогранин А), до 20% - макрофаги (С068-позитивные и содержат фермент лизоцим).

3. Установлено, что применение полиоксидония в течение трех недель приводит к увеличению количества СБЗ+-лимфоцитов в паренхиме тимуса на 15-25%, СБ5+- и СБ45ЯО+-лимфоцитов - на 5-10%, С012+- и СБЗО-клеток -в 1,2-1,5 раз.

4. Впервые выявлено, что в периферической крови у интактных животных в лейкоцитах, лимфоцитах, эритроцитах и плазме преобладающим биогенным амином является гистамин. После использования полиоксидония регистрируется уменьшение уровня гистамина и повышение содержания серотонина во всех изучаемых структурах.

5. Приоритетными следует считать данные о том, что применение полиоксидония способствует увеличению ^М и активации системы ком-

племента и фагоцитоза, повышению уровня ЦИК на фоне роста количества лейкоцитов с абсолютным лимфоцитозом.

6. Впервые представлены результаты корреляционного анализа между структурами тимуса и периферической крови у интактных животных и после применения полиоксидония. Установлено, что чем выше нагрузка на иммунитет, тем больше его компонентов подключаются для реализации функций. Наличие сильных корреляционных связей при использовании полиоксидония свидетельствует об устойчивом состоянии иммунной системы. Практическая значимость работы.

В связи с широким применением полиоксидония в клинике в качестве иммуномодулятора результаты работы имеют важное значение для практикующих врачей, т.к. являются морфологическим обоснованием иммуностимулирующего действия препарата. Интерес представляют данные о корреляционных взаимоотношениях показателей периферической крови и морфо-функционального состояния тимуса.

Кроме того, полученные данные о клеточном перераспределении в тимусе, изменении уровня биогенных аминов в тимусе и крови, а также результаты иммунобиохимических исследований крови представляют интерес для гистологии и иммунологии. Результаты работы используются в материалах лекций, при проведении практических занятий на кафедре гистологи, эмбриологии и цитологии, иммунологии и аллергологии, функциональной и лабораторной диагностики медицинского факультета Чувашского государственного университета им. И.Н. Ульянова. Итоги работы отражены в опубликованных статьях, тезисах и сообщениях. Основные положения, выносимые на защиту.

1. Применение полиоксидония приводит к достоверному увеличению в тимусе количества дендритных клеток, макрофагов, апудоцитов и тучных клеток, отмечается перераспределение биогенных аминов в сторону увеличения доли катехоламинов и серотонина в структурах тимуса.

2. После использования полиоксидония в периферической крови отмечается увеличение количества лейкоцитов с абсолютным лимфоцитозом, увеличение JgM и JgA, активация системы комплемента и фагоцитоза, повышение количества ЦИК, уменьшение уровня гистамина и повышение содержания серотонина во всех изучаемых структурах.

Апробация работы.

Основные результаты диссертации доложены на международных медицинских конгрессах (Сочи, 2005; Кишинев, 2008); Региональной конференции «Современные технологии в медицине» (Чебоксары, 2005), Всероссийской конференции с международным участием «Морфология в теории и практике» (Чебоксары, 2008), региональной конференции «Клиническая и экспериментальная медицина» (Чебоксары, 2010), XVI Всероссийской научно-практической конференции «Молодые ученые в медицине» (Казань, 2011) и «Цитоморфометрия в медицине и биологии: фундаментальные и прикладные аспекты» (Москва, 2011). Публикации.

По теме диссертации опубликовано 9 статей, из них 4 - в рецензируемых научных журналах и изданиях, определенных ВАК РФ.

Структура и объем диссертации.

Диссертация изложена на 147 страницах машинописного текста (собственно текста - 118 страниц), состоит из введения (7 с), обзора литературы (31с), описания материала и методик (7 с), четырех разделов собственных исследований (55 с), обсуждения результатов собственных исследований (15 с), выводов (2 с), списка литературы (28 с). Работа иллюстрирована 6 таблицами, 60 рисунками. Список литературы включает 263 источника, в том числе

98 зарубежных.

ГЛАВА 1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Современные представления об анатомии, эмбриогенезе, гистологии и гистохимии тимуса

Тимус является органом, в котором происходят тесные клеточные взаимодействия между нервной, иммунной и эндокринной системами, что является необходимым для протекания физиологических процессов как в самой железе, так и в организме в целом.

Тимус - парное образование, которое закладывается на 5-й неделе внутриутробного развития и формируется в виде двух многослойных эпителиальных тяжей из Ш-ей и IV-ой пары жаберных карманов (З.С. Хлыстова, 1987; В. Von Gaudecker, 1986).

В тимусе раньше определяется эндокринная функция, а позднее - лим-фопоэтическая. Объединение этих функций в тимусе наступает в сроки 7,5 8,0 недель эмбриогенеза (З.С. Хлыстова и др., 2000). К моменту рождения тимус имеет следующую характеристику: масса в среднем 15-20г (0,5% веса тела), крупные дольки паренхимы, дифференцированные на более широкую кору и относительно узкое мозговое вещество, содержащее тимические тельца, а также узкие междольковые септы и внутридольковые периваскулярные пространства, расширяющиеся в области кортико-медуллярной границы. Железа достигает максимальной относительной массы к периоду полового созревания, после чего начинается ее инволюция (В.М. Петренко, 1998; З.С. Хлыстова, 2000; В.А. Агеева и др., 2000; Михайлова М.Н., 2004; Диндяев C.B., 2008; Липин А.Н., 2009; В. von Gaudecker, 1986; G. Janossy et al., 1986).

Продолжительность жизни человека и широта возрастной патологии зависит от состояния иммунной системы. К 60 годам количество как незрелых, так и зрелых клеток тимуса значительно снижается. Причиной по мнению

И.М. Кветного с соавт. (2011) является дегенерация эпителиальных клеток тимуса и снижение секреции биологически активных веществ - ИЛ-7 и ти-мического сывороточного фактора, регулирующих дифференцировку Т- и В-лимфоцитов (И.М. Кветной, В.Х. Хавинсон и др. 2011). Кроме того, этой группой ученых установлено, что у лиц старше 60 лет в тимоцитах присутствуют белок пролиферации Ю67 и проапоптотический белок Р53 и с возрастом апоптоз клеток преобладает над их пролиферацией (И.М. Кветной, В.О. Полякова и др., 2011). Так же установлено, что у пожилых людей происходит снижение количества дендритных клеток в тимусе (А.П. Парахонский и др., 2011) и цитотоксических Т-лимфоцитов (И.М. Кветной, 2011).

Морфологически в вилочковой железе выделяют 4 зоны: субкапсуляр-ную, внутреннюю кортикальную, медуллярную и внутридольковые перива-скулярные пространства (Ю.А. Гриневич, В.Ф. Чеботарев, 1989; G. Janossy et al., 1986; Н. Kristin, 1989).

Субкапсулярная зона представлена сетью эпителиальных клеток, занимающих около 1/4 ширины коры вилочковой железы. В ячейках эпителиальной сети расположены лимфоидные клетки, представленные в основном пре-Т-лимфоцитами, лимфобластами, и немногочисленные макрофаги (Ар-шинова С.С., 2002). Сосудистая сеть состоит из капилляров с толстой базаль-ной мембраной и узким перикапиллярным пространством с единичными зрелыми Т-лимфоцитами, B-лимфоцитами, макрофагами и тучными клетками (Липин А.Н., 2009). Среди субкапсулярных клеток при электронной микроскопии выделяют два типа клеток: 1) вытянутые, формирующие непрерывный слой на базальной мембране, с овальными ядрами и крупным ядрышком. В цитоплазме этих клеток хорошо развита гранулярная эндоплазматическая сеть, встречаются пучки тонофиламентов, пиноцитозные пузырьки, электронно-плотные гранулы диаметром 15-20 нм. 2) звездчатые клетки с овальными ядрами, с 1-2 ядрышками и малоконд