Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Протеиназно-ингибиторная система высших растений: свойства и биологические функции

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Протеиназно-ингибиторная система высших растений: свойства и биологические функции"

од

ИНСТИТУТ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ БОТАНИКИ им. Е Ф. КУПРЕВИЧА АКАДЕМИИ НАУК БЕЛАРУСИ

УДК 577.151: 633-------

ДОМАШ Валентина Иосифовна

ПРОТбИНА5НО-Ю1ГШ1ТОРНАЯ СИСТЕМА ШСЩХ РАСТЕНИЙ: СВОЙСТВА И БИОЛОГИЧЕСКИЕ ФУНКЦИИ

03. 00. 04- биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени догаора биологических наук

Минск-1995

Работа выполнена в лаборатории биохимии и биотехнологии растений Института экспериментальной ботаники им. В Ф. Купревича АН Беларуси

Научный консультант - доктор биологических наук,

профессор МОСОЛОВ Е Е

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

профессор БЕЛОЗЕРСКИЙ Ы. А.; доктор биологических наук НШШЩРОВ ЕЕ; доктор биологических наук АВЕРИНА Е Г.

Оппонирующая организация- Институт биохимии им. А. Е Баха

АН России

Защита диссертации состоится "«Уг " (З'Сгу) 1995г. в / у' ■ час. на заседании совета по защите диссертаций Д. 01.38.01 в Институте экспериментальной ботаники АН Беларуси (220072, Минск, ул. Ф. Скорины, 27)

С диссертацией можно' ознакомиться в Центральной научной библиотеке им. Я Коласа АН Беларуси

Автореферат разослан (^¿'^ 1995 г.

Ученый секретарь совета

по защите диссертаций, -

кандидат биологических наук и Р<л-и.г и. Е Рогульченко

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность теш диссертации. Протеолиа является одним из важнейших процессов жизнедеятельности как животных, так и растений. Протеолйтические ферменты участвуют в образовании гормонов ,ферментов и других жизненно - необходимых активных белков—и пептидов (Мосолов,1971,1983; Локшина, 1979,1994). Протеазы участвуют в деградации белков при прорастании и их процессинге при созревании, в транспорте веществ из вегетативных органов. Они играют первостепенную роль в формировании таких физиолого-биохими-ческих свойств растений как продуктивность,белковость,всхожесть семян, защитные реакции и др. Но, к сожалению, многие стороны этих процессов остаются не ясными. В частности, неизвестна роль отдельных эядопептидаз при катаболизме и биосинтезе белков. Мало данных относительно протеаа, участвующих в транспорте веществ в репродуктивные органы. Недостаточно сведений о протеазах, функционирующих в стареющих листьях. Из важности функций, выполняемых протеазами,вытекает и вопрос о механизмах регуляции их активности. Понять механизм действия и регуляцию клеточного протеолиза невозможно без исследования биохимических свойств протеолити-ческих ферментов и их роли в жизнедеятельности растительного организма. Предполагается, что одним иа способов регуляции активности протеолитических ферментов является присутствие в животных,растениях и микроорганизмах особых биологически активных веществ,белков-ингибиторов, основным свойством которых является способность к образованию с ферментами неактивных обратимых комплексов (Мэсо-лов,Валуева, 1993, Richardson,1977). Вопрос регуляции протеолиза является одним из актуальнейших в современной энзимологии ( Антонов, 1991).

Известно,что в животном организме существует система фермент-ингибитор, контролирующая работу ферментов. Нарушение деятельности этой системы приводит к тяжелым заболеваниям (Веремеен-ко,1971).

В растительном организме вопрос о протеиназно-ингибиторной системе почти не изучен. Не ясна роль этой системы в метаболизме и в адаптации растений к неблагоприятным факторам внешней среды. Неизвестна роль отдельных компонентов этой системы, в частности белковых ингибиторов,в регуляции эндогенных протеаз в связи

- г -

с биосинтезом и распадом запасных белков и другими биологически важньада-процессами, происходящими у растений. Не решена роль про-теиназно-ингибиторной системы в способности растений мобилизовать свои защитные силы при действии фитопатогенной инфекции. Не выявлена видовая и сортовая специфичность по уровню активности проте-аэ и белковых ингибиторов. Эхо в значительной степени относится • к такой высокобелковой и широко распространенной в Беларуси культуре как люпин и другим с. х. растениям.

В связи с проблемой пищевого и кормового белка стоит и вопрос о белках-ингибиторах как антипитательном факторе.

Выделение протеиназ и белков- ингибиторов в чистом виде и исследование их физико-химических Свойств будет способствовать решению вопроса о биологических функциях указанной системы.

Исследование электрофоретического спектра отдельных компонентов системы протеаза-ингибитор раскрывает возможности использования их в качестве маркеров в селекции, в вопросах, связанных с эволюцией и генетикой растений. (Конарев Ал. ,1992).

Изучение биохимических свойств и роли протеиназно-ингибитор-ной системы, несомненно, представляет научный и практический интерес и дает возможность выявить подходы к регулированию процессов прорастания,созревания семян, отложения белка в запас и улучшения его качественного состава

Свяаь работы с крупньми научмьми программами, темами Проведенные исследования входили в плановые темы Института экспериментальной ботаники им. В. Ф. Купревича АН Беларуси, координируемые Научным советом по проблеме "Продуктивность растений" -"Изучение зависимости физико-химических рвойств функциональных и запасных белков от биологических особенностей растений"-1977-1981 гг. , N госрегистрации 77002309; " Изучение биохимических свойств и механизмов регуляции обмена белков в связи с продуктивностью растений"- 1982-1986 гг, N госрегистрации 01823005152; "Изучение биохимических свойств и метаболизма белков важнейших с. х. растений"- 1987-1990 гг, N госрегистрации 0870024512; "Исследование биохимических свойств и метаболизма белков генетически различных форм растений - 1991-1994 гг, N госрегистрации 1994868. Кроме того, исследования выполнялись по Всесоюзной комплексной программе ОЦ. 032 " Разработать фиэиолого-биохимические способы и приемы, направленные на повышение продуктивности некоторых с. х. растений" - 1981-1985 гг.; по Республи-

канской комплексной научно-технической программе "Люцерна" -1981-1985 гг; по Республиканской научно- технической программе "Энерго- и ресурсосбережение" .тема N 4.06 - 1991-1994 гг.; по Республиканской комплексной программе фундаментальных исследований "Биотехнология",тема N 38- 1993-1995 гг.

------------Цая> и задачи исследования. Целью исследования являлось дать

целостное представление о биохимических свойствах и биологической роли протеинаэно-ингибиторной системы ряда высших растений и выяснить возможности применения ее для решения вопросов биохимии, фитоиммунитета и селекции с. х. культур.

Для достижения поставленной цели требовалось решить следующие задачи:

- изучить разнообразие уровня активности протеолитических ферментов, белковых ингибиторов и особенности электрофоретическо-го спектра ингибиторсодержащей фракции белков генетически различных форм растений и возможности использования их в качестве белковых маркеров в селекции с. х. растений;

- изучить реакцию протеинаэно-ингибиторной системы растений на воздействие неблагоприятных факторов внешней среды;

- исследовать роль протеинаэно-ингибиторной системы в процессах катаболизма,биосинтеза запасных белков растений и транспорта азотистых соединений иа вегетативных органов в репродуктивные;

- выделить белки- ингибиторы протеиназ в высокоочищенном состоянии ив семян и листьев разных видов люпина,исследовать их физико-химические свойства, видоспецифичность и локализацию в субклеточных структурах;

- выделить эндогенные протеиназы и их белковые ингибиторы из семян и листьев ряда бобовых растений,исследовать их свойства и субстратную специфичность;

- исследовать роль белковых ингибиторов в качестве защитного фактора растений от фитопатогенной инфекции;

- белки-ингибиторы протеиназ как показатель качества белка;

Научная новизна. Изучен уровень активности отдельных компонентов протеинаэно-ингибиторной системы семян и вегетативных органов разных видов растений. Впервые выявлены различные классы протеолитических ферментов и белков-ингибиторов в семенах и листьях различных видов люпина. Изучена динамика распада и накопления "аппсрот. белкоч семян люпина и характер проявления действия

различных классов протеаа и белковых ингибиторов в этих процессах. ГЬказано существование ингибиторов в связанной с протеаза-ми форме в зрелых семенах и высвобождение их из связанного состояния при прорастании семян. Показана роль цистеиновых протеиназ в деградации ингибиторов трипсина при прорастании семян. Установлена роль белков-ингибиторов в механизмах регуляции активности про-теолитических ферментов при прорастании и созревании семян.

Показано участие фитогормонов, в частности, брассиностерои-дов в регуляции протеиназно-ингибиторной системы на начальных этапах прорастания семян люпина.

Показана роль системы протеолиза в передвижении аготистых соединений из вегетативных органов в репродуктивные и ее видоспе-цифичность во взаимосвязи содержания белка в семенах люпина с уровнем активности протеолитических ферментов и белковых ингибиторов в листьях. Впервые обнаружено присутствие в листьях люпина металлопротеиназы, максимальная активность которой отмечена в стареющих листьях,что дает возможность предполагать ее участие в утилизации белковых соединений листьев в этот период.

С использованием ряда биохимических методов исследований из семян и листьев люпина выделена эндогенная протеиназа БАПАаза, один из компонентов протеиназно-ингибиторной системы, показана принадлежность ее к классу цистеиновых протеиназ и способность расщеплять некоторые полипептиды - и ^ - конглютина и РДФК/О.

Впервые выделены,очищены и дана физико- химическая характеристика ингибиторов трипсина из семян и листьев различных видов люпина. На основании анализа аминокислотного состава белков и их биохимических свойств,ингибиторы из семян люпина желтого,белого и узколистного отнесены к семейству ингибитора Кунитца из сои, а из многолетнего - к семейству ингибитора Баумана- Бирк. Высокая эффективность по отношений к трипсину ингибитора из люпина многолетнего открывает возможности для его практического использования.

Установлена локализация протеолитических ферментов и белков-ингибиторов в алейроновых зернах, ядрах, хлорочластах и митохондриях ряда бобовых растений.

Выделен специфический ингибитор эндогенных протеиназ из семян и листьев люпина и кормовых бобов,участвующей в регуляции активности ферментов.

Впервые выявлена способность ингибиторов протеиназ снижать

концентрацию Х-вирусов в листьях картофеля, подавлять активность протеинаа.рост и развитие фитопатогенных грибов Fusarium sambucinum и Fusarium oxysporum, что позволяет считать их наряду с фитоаллексинами, фенолами и др. одним из факторов устойчивости растений к фитопатогенной инфекции. Это имеет важное значение при создании сортов и фор!ГрастеНий_ устойчивых-к фитопатогенным мик-___ роорганизмам.

Показана отрицательная корреляционная зависимость между уровнем активности ингибиторов трипсина и переваримостью белка in vitro, что говорит о их влиянии на качество белка с. х. культур.

Полученные в результате выполнения работы сведения расширяют представление о биохимических свойствах, механизмах действия и функциях протеиназно- ингибиторной системы и вносят вклад в развитие нового направления в биохимии, связанного с изучением регуляции метаболизма белков растений.

Практическая аиачимость полученных результатов.

Исследование электрофоретического спектра иигибиторсодержа-щей фракции белков растений показало их видовую и сортовую специфичность, что дает возможность использовать его для анализа генофонда и в селекции с. х. культур. На основании результатов иследо-ваний предложен способ отбора высокобелковых форм люпина узколистного.

Разработан способ получения ингибитора трипсина из семян люпина многолетнего. Ингибитор трипсина может быть использован в биохимических исследованиях при изучении механизма действия сери-новых протеиназ, в аффинной хроматографии в качестве лиганда при очистке ферментов, в медицинской практике для лечения ряда заболеваний.

Установленная способность ингибиторов протеиназ угнетать активность протеаз.рост и развитие фитопатогенной инфекции дала возможность разработать. способ оценки устойчивости картофеля к

сухой фузариоаной гнили и способ получения средства для защиты растений.

На основании результатов исследований по действию неблагоприятных факторов внешней среды на изменение активности протеиназно- ингибиторной системы предложено использовать показатель активности отдельных компонентов этой системы в качестве теста на техногенные воздействия.

Результаты исследований позволили впервые использовать пока-

затель активности ингибиторов трипсина в качестве теста при разработке режимов термовструдерной обработки зерна в комбикормовой промышленности. Этот показатель включен в ТУ " Компоненты зерновые вструдированные" и используются в АКО " ЭКОМОЛ".

Научно обоснована возможность применения белка семян кормового люпина ( второй сои) в сыром виде, без тепловой обработки для пищевых и кормовых целей.

Материалы исследований находят также применение в селекционных учреждениях Беларуси, в ВУЗах при чтении лекций по биохимии и физиологии растений.

Экономическая значимость полученных результатов.

Препараты протеиназ, белков-ингибиторов трипсина и суммарного белка семян люпина могут быть использованы в качестве коммерческого продукта

Основные положения диссертации, выносимь» на защиту.

- видовая и сортовая специфичность протеиназно-ингибиторной системы ряда высших растений;

- основные компоненты системы, участвующие в деградации и биосинтезе белка, росте и развитии растений люпина;

- сопряженность между накоплением белка в семенах и листьях разных видов люпина и активностью протеиназно-ингибиторной системы;

- разработка способов получения препаратов протеиназ и белковых ингибиторов из семян и листьев люпина, их физико-химические свойства и специфичность;

- внутриклеточная локализация протеиназ и белков-ингибиторов некоторых бобовых растений;

- схема основных этапов действия протеиназно-ингибиторной системы растений люпина; .

- белки-ингибиторы- регуляторы эндогенных протеиназ;

- система протеиназа-ингибитор как фактор иммунитета растений;

- ингибиторы трипсина как антипитательный фактор и способы ' повышения качества белка семян с. х. растений.

Литой вклад соискателя.

В основу работы положены исследования, проводимые автором за период 1972-1995 гг. За время работы автор была соруководителем и руководителем ряда научно-исследовательских тем по фундаментальным и научно-техническим программам. Идея темы диссертации, анализ результатов исследований, а также экспериментальная работа

выполнялась под руководством и личном участии автора и других исполнителей тем и договоров о творческом содружестве. Соискатель являлась соруководителем успешно защищенной кандидатской диссертации.

Апробация результатов диссертации.

Основные результаты работы были представлены и^обсуждены на У1 конференции биохимиков Прибалтийских республик, БеларусиЮе-~ нинграда (Рига, 1981 г.); на 111 Республиканской конференции физиологов и биохимиков Молдавии (Кишинев,1981); на Республиканской конференции "Научно- методические аспекты создания высокопродуктивных сортов с. х. культур" (Жодино,1982); на У111 Объединенном симпозиуме биохимических обществ СССР и ГДР (. Рига,1985); на Республиканском совещании "Ингибиторы протеаз как факторы защиты растений от болезней и вредителей" ( Одесса, 1987); на Всесоюзном совещании "Физиология и биохимия прорастания семян" (Душанбе, 1988); на 1 и 11 съездах физиологов растений ( Минск, 1990, Санкт- Петербург 1993); на ХУ Международном Менделеевском съезде по общей и прикладной химии ( Минск, 1993); на 1 съезде Белорусского общества фотобиологов и биофизиков (Минск, 1994); на Республиканской научной конференции "Современные проблемы генетики и селекции" (Минск, 1995), на Международном совещании "Экологический статуо загрязненных радионуклидами территорий" (Минск, 1995).

Опубдиковалность результатов.

Материалы диссертации опубликованы в 60 научных работах (2 монографиях, 29 научных статьях,25 тезисах, трех авторских свидетельствах и одном патенте).

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 359 страницах машинописного текста,состоит из введения, 8 глав и приложения. Работа иллюстрирована 86 таблицами и 82 рисунками; в списке цитируемой литературы 483 наименования.

Принятые сокращения. ПААГ- полиакриламидный гель.ОЭП- относительная электрофоретическая подвижность, РДФК/0 -рибулезо-1,5-дифоефаткарбоксилаза/оксигеназа,кД- килодальтон, БАЛА- М^бен-аоил-DL- аргинин-п-нитроанилид, БАЗЭ- N^ бензоил-DL-аргинин этиловый зфир, ФМСФ- фенилметилсульфонилфторид, ЮТБ- п-хлормеркури-бензоат.КД- круговой дихроизм, ИЕ- ингибиторная единица; НЖ- на-досадочная жидкость.

0С5ЮВН0Е ООДЕРЙШЕ Материалы и метода исследования

Основньм объектом исследования были различные виды люпина: многолетнего (Lupinus polyphyllus L. ) .желтого ( L. luteus L. ), белого ( L. albus L ),узколистного (L. angustifolius L.).B работе испольвоваяи кормовые бобы (Vicia faba L),люцерну ( Kfedicago sativa L.),зерно злаковых культур, клубни и листья картофеля и др.

Активность нейтральных,кислых протеаз и ЕАПАазы определяли по гидролизу 1Z казеина, IX гемоглобина и 2,3 мМ БАЛА (Домаш и др. 1993). Активность металлопротеиназы - с использованием азокола в качестве субстрата ( Chrispeels et al. ,1979). Активность цисте-иновых протеиназ- с использованием IX казеина и 0,005 Ы L-цистеи-на и 0,02 И ЭДТА в качестве добавок. Активность РДФК/О определяли по методу Магомедова (1978).

Активность ингибиторов трипсина определяли по методу Гофмана и Вайсблая (1975).химотрипсина и субтилизина- по изменению гидролиза ферментами денатурированного нагреванием казеина. Экстракцию ингибиторов протеиназ проводили 0,2 M NaCl.

Электрофорез белков в ПААГ проводили в нативных условиях и с О, IX SDS ( Laemmli, 1970). В основу идентификации ингибиторов трипсина взят метод Миса и Хаймовица (1973) в модификации Зелинского (1986) и нашей. Для идентификации, в треки ПААГ с инги-биторсодержащей фракцией белка добавляли трипсин (30-40 мкг). Параллельно вели электрофорез белкового раствора без трипсина Зоны белка в треках с трипсином, которые уменьшались или исчезали,считались ингибиторными.

Гельхроматографию белков проводили на акрилексах Р-4, Р-30.Р-60 и сефадексах G-75 и G-100. Ионообменную хроматографию -на КМ-сефадексе А-25, ДЕАЕ-Toyopearl 650 HV. Аффинную хроматографию проводили при использовании в качестве лиганда трипсина,кова-лентно связанного с сефарозой 4В, в основном, " batch''-методом. Изофокусирование белков*проводили по методу Ригли (1974).

Аминокислотный состав белков определяли на аминоанализаторе Т-339 (Чехословакия). Триптофан определяли в отдельной навеске после щелочного гидролиза ( Inglis-et al. 1976 ), полуцистин -после окисления надмуравьиной кислотой ( Moore,1963).

Переваримость белка in vitro определяли по методу Левицкого

С198Б).

В основу выделения алейроновых зерен положен метод Соболева (1985). Выделение остальных клеточных органелл проводили по методам, описанным в "Технике биохимических исследований субклеточных структур биополимеров растительной клетки", под ред. Решетникова В. Н. (1986). —

Статистическую обработку данных проводили по методу Рокицко-го (1979) с использованием ЭВМ и компьютерной техники.

ШСШМ протеолиза у ряда свлшшхозшлвшшх РАСТЕНИЙ

фи исследовании функциональной роли протеаз и их белковых ингибиторов важным является представление об уровне активности этих компонентов у различных растений. Это касается в первую очередь люпина, наиболее распространенной в Беларуси высокобелковой культуры, сведения о которой отсутствуют.

Результаты исследований показали различный уровень активности протеаз и белковых ингибиторов у исследуемых видов растений. Так, сорта люпина желтого имеют уровень активности нейтральных протеаз 12-12,9; кислых - 7,5-8,9; БАПАазы- 116,5-134,6. У люпина узколистного активность атих ферментов равна соответственно 9,4-11,6; 7,3-7,7 и 58,8-69,8. Семена люпина белого имеют активность нейтральных протеаз 7,8-10,0; кислых протеаз 5,8-7,2 и БАПАазы - 53,5-97,7. Для семян люпина многолетнего уровень активности ферментов равен соответственно 10,8, 7,0 и 68 ед/ г абс. сух. массы. Активность протеиназ находится во взаимосвязи с накоплением белка в семенах. Видовые различия отмечены и для семян люцерна Видоспецифичность характерна и для белков-ингибиторов трипсина "табл.". Наиболее богаты ингибиторами семена сои. Мзжду содержанием ингибиторов трипсина, белка и масла у этой культуры существует слабая корреляционная свяаь ( г- 0,23 и 0,15 соответственно). Это дает возможность проводить отбор на снижение содержания ингибиторов при сохранении высокого содержания атих показателей. Такая же закономерность наблюдается для других зернобобовых культур (люпин,горох,кормовые бобы}. В связи с отсутствием сведений относительно ингибиторов протеиназ у люпина, проведен более подробный анализ их содержания у этой культура Зародыши, как оказалось, имеют активность ингибиторов в 2,5 раза выше, чем семядоли. Листья люпина, в пересчете на грамм

Таблица

Варьирование уровня активности белков-ингибиторов протеиназ ( трипсина) у различных видов растений (ИЕ/г абс. сух. массы)

Вид растений Количество проанализи- Варьирование уро-|

рованных образцов вня активности. 1

Amaranthus,семена 6 3,0 - 14,0 ' 1

-"- .листья 6 . 2,5 - 4,3

Avena sativa 4 • 0,9 - 1.3

Glycine max 160 230,0 - 620,0 I

Hordeum vulgare 14 7,6 - 22,0 J

Lupinus albus 10 4,3 - 6.5 1

Lupinus angusti- * I

folius 16 2.5 - 4.3 I

Lupinus luteus 24 2,5 - 6,2 J

Lupinus polyphyllus 15 Medidago sat iva,семена 8 - - листья 8 10,0 -2,3 - 25,0 1 5,5 1

9,5 - 10,4 I

Pisum sativum 21 16,1 - 40,7 I

Secale cereale 13 8.9 - 14,7 J

Solanum tuberosum 26 36.0 - 153.0 I

Triticale 10 5.7 - 10.1 I

Triticum vulgare 4 1,3 -

Vicia faba 7 11,6 - 17.1 1

Zea mays 6 6.6 - 8.4 1

абс. сух. массы, имеют активность до 10-15 НЕ. Основное содержание ингибиторов трипсина находится в глобулиновой фракции белка в связанном (до 60%) с протеазами состоянии.

Для исследованных видов растений характерен и различный электрофоретический спектр ингибиторсодержащей фракции белков. Ингибиторы трипсина локализованы, в основном, в области ОЭП 0,30,6. Установлена видовая и сортовая специфичность в профиле спектров этих белков. Так,выявлены особенности спектра сортооб-разцов люпина узколистного, различающихся по содержанию белка в семенах, заключающиеся в том, что более высокобелковые формы имеют в спектре ярко выраженную зону при ОЭП 0,40, а менее- при 0,36. На этом основании разработан способ отбора высокобелковых форм люпина уэколистного (Патент 1837751),что указывает на возможность использования ингибиторов трипсина в качестве маркерных белков в селекции.

Действие различных факторов на протеиназно- ингибдаорную систему растений

Окружающая среда, особенно неблагоприятная, оказывает действие на растительный организм, реакция которого может быть очень разнообразной. К сожалению, не известно действие внешней

среды на характер изменения протеиназно-ингибиторной система Исследования изменения активности ингибиторов трипсина в семенах 10 сортов желтого кормового люпина, выращенного на 11 госсортоучастках Беларуси, Украины и России в 1981-82 гг. показали, что варьирование уровня активности от максимального почти у половины сортов в" гранйдах одних и тех же участков не превышало 15%. Коэфг-фициент вариации уровня активности по сортам в зависимости от места выращивания составлял 8-10%. Установлена слабая корреляционная зависимость между активностью ингибиторов трипсина,содержанием алкалоидов и белка в семенах люпина, что может быть использовано в селекции.

Неблагоприятные погодные условия в летнее время ( 32°^ С и влажность 40%) вызывали снижение активности ингибиторов трипсина и НАПАазы в семенах люпина соответственно на 35 и 57%. Высокая интенсивность освещенности (25 квт\м2),а также влажность 87%, снижали активность нейтральных,кислых протеаз.БАПАазы и ингибиторов трипсина на 15-30% по отношению к контролю ( освещенность 7,5 квт\ьГи влажность 60%) в листьях люпина, выращенного на ионитсвя-аывакщих субстратах в камерах искусственного климата в автоматически контролируемых условиях.

Обработка посевов ячменя, ржи и люпина препаратами пестицидов, гербицидов и инсектицидов ( метафос.тилт.симаэин, амбуш.ва-латон и др.) вызывала уменьшение активности ингибиторов трипсина в семенах на 10-15%. Угнетение активности ( на 16% ) наблюдалось и при действии повышенных доз минеральных удобрений.

Дозы радиоактивного загрязнения, вызванные результатами аварии на Чернобыльской АЭС, в 136,9 и 259х 10 Вк/м2снижали активность ингибиторов трипсина на 40 4^70% соответственно, по отношению к контролю ( 11,1 х 10 Бк/м ). Существенных изменений в активности протеолитических ферментов не наблюдалось. Снижение активности ингибиторов протеиназ приводит к изменению комплекса протеаза-ингибитор, что,, в конечном итоге, вызывает ускорение прорастания семян люпина. Полученные данные объясняют действие радиации на прорастание семян (Гродзинский.1989).

На основании результатов исследований можно заключить,что протеиназно-ингибиторная система является,возможно, тем чувствительным местом, изменением которой растительный организм на ранних этапах реагирует на неблагоприятные внешние воздействия. Это дает возможность использовать отдельные компоненты этой системы в

- 12 -

качестве теста на техногенные воздействия.

Протемназно- ингибиторная система и белковый обмен растений лнпина

Динамика активности эндогенньк протеиназ и белотал ингибиторов в процессе прорастания семян лапина. Сведения о протеиназ-' но-ингибиторной системе в прорастающих семенах будут способствовать углублению представления об этом процессе с целью воздействия на его ход.

Для выяснения роли протеиназ и белковых ингибиторов при прорастании семян использовали сорта желтого люпина Пламенный и БСХА и узколистного Омега и Казан. Результаты исследований показали изменение активности нейтральных протеаз с оптимумом активности при pH 6,5-7,0; кислых- 4,5-5,0; БАЭЭ-зстеразы- 7,0-7,5 и щелочной протеазы БАПАазы ( pH 8,0-8,5). В частности, наблюдается резкое увеличение активности изучаемых ферментов при прорастании в пересчете на грамм абсолютно сухой массы, но менее резкие - при пересчете на семядолю (зародыш) "рис.1". Следует отметить более высокую активность ферментов в зародышевой оси по сравнению с семядолями. В противоположность ферментам активность ингибиторов трипсина снижается как в семядолях, так и зародышах ( гипокотилях и корнях) и к . пятому дню прорастания почти полностью исчезает. Снижение активности ингибиторов трипсина подтверждается и электрофорезом в полиакриламмидном геле ингибиторсодержащей фракции белков семядолей и зародышей. Уменьшение содержания ингибиторов заметно и при гельфильтрации на сефадексе G-100. Снижение активности ингибиторов трипсина при прорастании, люпина, как показали исследования, обусловлено расщеплением их цистеиновыми протеина-зами, что доказывается прямым действием фермента, выделенным хро-матографическим методом из прорастающих семян на ингибитор трипсина (препарат). Инкубация ингибиторного белка в течение часа при 37°С приводит к полной его инактивации. Это доказано и методом электрофореза в ПААГ, где заметно уменьшение ингибиторной зоны. .Полученные данные вносят вклад в имеющиеся немногочисленные сведения (Мосолов, 1988; Wilson,Tan-Wilson,1987) о причинах деградации ингибитора трипсина при прорастании семян.

Ингибиторы протеиназ ' находятся на 40-60% в связанном с про-теазами состоянии,но на третьи сутки происходит почти полный

(-----)протеаз, ЕАПАаэы (- »1- 1>- «), БАЭЭ- эстеразы

(-«-о-) и белков-ингибиторов трипсина (-)в

семядолях (А) и зародышах (Б)семян люпина желтого сорта Пламенный в процессе прорастания

распад комплекса. Опыты позволили также установить, что фитогормо-

ны (эпибрассинолид) в концентрации Ю М оказывают анаболическое действие на активность протеодитических ферментов и белков-ингибиторов протеиназ в течение первых двух суток прорастания семян люпина желтого,что говорит о важности контроля протеиназно-инги-

биторной системы фитогормонами.

Подтверждением роли протеиназно-ингибиторного комплекса в прорастании семян люпина являются опыты по прямому действию препарата ингибитора трипсина. Повышенные дозы коммерческого препарата ингибитора из сои затормаживали прорастание семян, благодаря связыванию протеаз в неактивный комплекс. Низкие же

(ЮМ) дозы ингибитора трипсина, наоборот,значительно повышали энергию прорастания семян,вызывали усиленное корнеобраэование при дальнейшем росте проростков. Возможно,это обусловлено их действием на ауксиновый обмен растений люпина.

Динамика активности протеолитических ферментов и белков-ингибиторов протеиназ в процессе созревания семян люпина. Процесс созревания семян люпина сопряжен также с изменением активности протеиназно-ингибиторной системы. Начальный этап созревания характеризуется высокой активностью кислых, нейтральных и щелочных протеаз. Активность же ингибиторов трипсина незначительна. Они начинают синтезироваться, когда содержание сухого вещества составляет около 20% и начинается синтез вицилиноподобных белков. Период интенсивного накопления вицилино- и легуминоподобных белков характеризуется спадом активности ферментов,и в зрелых семенах она имеет минимальное значение. Активность же ингибиторов максимальна. Установлена видовая специфичность в уровне активности системы протеаза-ингибитор. Так, активность всех исследуемых протеаз в начальный период созревания у сортов люпина желтого в 5 раз выше,чем у люпина узколистного. У сортов желтого кормового люпина наблюдается и более высокий уровень содержания запасного белка, чем у сортов узколистного люпина.

С созреванием семян увеличивается доля (до 87%) низкомолекулярных белков (до 30 кД), что подтверждает факт накопления ингибиторов протеиназ. Изоформы ингибиторов сосредоточены для люпина желтого при ОЭП 0,71 й 0,85, а для люпина узколистного- при 0,50 и 0,75.

Переход ингибиторов в связанное с ферментами состояние можно рассматривать как один из механизмов регуляции их активности. Благодаря образованию комплекса протеаза-ингибитор предупреждается распад запасных белков.

Протеиказно- иигибиторная система в процессе роста и развития растений лотна. Протеазы играют важную роль в реутилизации азо-'тистых соединений из вегетативных органов. Но, к сожалению, имеется незначительное число сведений, касающихся,в основном, протеаз листьев злаковых культур (Павлов, 1980; Кондратьев и др. 1981,1983). Тем не менее, данные о протеазах,участвующих в транспорте азотистых соединений из вегетативных органов, и особенно о регуляции их активности, дают возможность более полно раскрыть механизм формирования белкового комплекса семян за сч^т

азотсодержащих соединений листьев,что может иметь как научное, так и практическое значение.

Листья исследованных видов люпина, различающихся по белковости, содержат ферменты,расщепляющие казеин при оптимуме рН 6,6; гемоглобин при оптимуме рН 4,0-4,5 и БАЛА -при оптимуме рН 8,0-8,5. В процессе "вегетации происходит—изменение активности различных классов протеаз. До фазы бутонизации активность ферментов находится приблизительно на одном и том же уровне. В листьях желтого люпина (сорта БСХА-382 и Пламенный) максимум активности протеаз обнаруживается на 20 день после цветения, у сортов же узколистного (Омега и Казан) и многолетнего люпина- на 15-18, у белого (Синий парус)- на 30 день после цветения, что связано с различным периодом их вегетации. Следует отметить, что активность ферментов в листьях узколистного и многолетнего люпина в 2-3 раза ниже, чем у люпина желтого и белого.

Максимум активности исследованных видов ферментов связан с более интенсивным процессом реутилизации азотистых соединений в этот период, идущих на построение белковых молекул. Отток полипептидов и аминокислот из листьев в формирующиеся семена подтверждается и снижением содержания белка у них. Причем, сорта люпина желтого,обладающие более высокой активностью ферментов в листьях,имеют и более высокое содержание белка (до 47%) в семенах, чем,например, сорта узколистного люпина (около 38%).

В листьях люпина удалось впервые обнаружить активность ме-таллопротеиназы, фермента, расщепляющего субстрат аэокол. Активность фермента является максимальной в стареющих листьях ( фаза 30-40 дней после цветения). Оптимум действия этого фермента лежит в области рН 8,5-9,0. Возможно, металлопротеиназа участвует в распаде белков в листьях на поздних этапах вегетации.

Использование синтетических ингибиторов и активаторов протеаз ( ЯМСФ, ПХМБ, ^ДТА, 1,10 - фенантролина, пепстатина и др.) в концентрации 1x10 М показало, что основными протеазами, функционирующими в вегетирующих листьях люпина являются сериновые и цистеи-новые. В стареюших листьях активность протеазы ингибировалась фе-нантролином, что подтверждает ее принадлежность к классу металло-протеинаэ.

При изучении вопроса о регуляции активности различных классов протеаз в листьях люпина,основное внимание было направлено на исследование роли ингибиторов протеиназ в этом процессе.

Как оказалось, максимальная активность белков-ингибиторов протеи-наз (трипсина) у всех видов люпина наблюдается в фазе цветения, после чего заметно ее снижение. Это подтверждается и электрофорезом нативной ингибиторсодержащей фракции белков в ПААГ. Выявлены изоформы ингибиторов при ОЭП 0,13; 0,26 и 0,33 в фазе цветения люпина желтого " рис. 2" В листьях узколистного люпина ингибитор-ные воны находятся при ОЭП 0,48; 0,53 и 0,60, у белого- при 0,64 и 0,62; у многолетнего- при 0,20; 0,50 и 0,61.

ОЭП ............ ■ Ш1-»т ..'Л

,хз ЩЩШт

' tum I. I

0,26-jwl mm Ы,

0,33--. „ "

12 3

Рис. 2. Идентификация белков-ингибиторов трипсина на электро-фореграммах ингибиторсодержащей фракции белков листьев люпина желтого сорта Пламенный на равных фазах развития; 1- фаза бутонизации; 2- фаза цветения; 3-фаза 20 дней после цветения; +т- с добавлением трипсина

В фазе плодообрааования люпина наблюдалось также уменьшение доли высокомолекулярных (60-100 кД) белков в среднем на 20-25%.

Наблюдаемое уменьшение содержания ингибиторов в листьях люпина в период начала формирования семян, когда отмечается максимальная активность протеаз, связано,возможно, с их регуляторной функцией. Подтверждением этому является ингибирование активности ЕАПАазы (на 40%),нейтральных (на 12%) и кислых (на 22%) протеаз под действием ингибиторов трипсина из люпина.

Таким образом,анализируя полученные результаты,основные этапы действия протеиназно-ингибиторной системы в растениях люпина можно представить в виде следующей схемы " рис. 3".

Прорастание семян сопряжено с разрушением комплекса протеа-

семена, модифицированный белок

ЦПР, АПР.СПР

ч-

- ИНГ

семена, запасной белок + ИНГ

ЦПР.СПР <-

АПР + ИНГ

ЦПР СПР АПР

формирующиеся семена, запасной белок + ИНГ

ЦПР + ИНГ

ЦПР

АПР

семена, пептиды, аминокислоты

лист,фаза старения,ами нокислоты, пептиды

ЦПР

АПР.СПР

ЦПР

СПР, МНР

лист,

белок

ЦПР, АПР, СПР

--

+ ИНГ

лист фаза цветения, белок

ЦПР.СПР -ИНГ

лист, белок, фаза плодоебразо-вания

ИНГ+ЦПР

I

Рис. 3. Схема основных этапов действия протеиназно-ингибиторной системы в онтогенезе люпина ЦПР- цистеиновая протеиназа; СПР- сериновая протеиназа; АПР- аспартильная протеиназа; МПР-металлопротеиназа; ИНГ- ингибиторы протеиназ.

за-ингибитор из-за расщепления ингибиторов цистеиновыми протеина-зами. Образованные пептиды и аминокислоты при гидролизе белка идут на построение белка листьев, в жизнедеятельности которых активное участие принимают ¡циссеиновые.сериновые и аспартильные протеазы. Активация протеав наблюдается при снижении ингибиторной активности в листьях в фазе плодообраэования. В .этот период обнаружено появление и металлопротеинази. Высокая активность протеиназ обнаруживается на йачальных этапах созревания семян, когда активность ингибиторов минимальна. На всех стадиях роста и развития люпина наблюдается взаимосвязь между протеиназами и белками- ингибиторами, что говорит о важной роли протеиназно-ингибиторной системы в белковом обмене растений.

видкшше и штъхижадвдшЕ свойства кошокйггов прот0шазно- ннгишторной систему люпина

эндогенной прсугеккааы №» .тетина, ее фитши>-хкмм-чеекме свойства и субстгеття специфичность. Протеолитические ферменты выд"Ивны иг> немногих растений. Особое внимание уделено фер-

менту, обладающему высокой активностью по отношению к БАШ и функции которого,к сожалению,окончательно не выяснены. В чистом виде этот фермент выделен из некоторых злаковых и бобовых растений ( Белозерский, Дунаевский, 1980; Caldwell et al. ,1976; Duranti,Cerletti, 1989) ;

БАПАазу из муки семян люпина желтого сорта Кастрычник экстрагировали 0,05 M фосфатным буфером рН 7,8. Из экстракта высаливали фракцию 40-80% сульфатом ашония и наносили на колонку с биогелем Р-30. Зракция, активная по отношению к БАШ, выходила узким пиком. Ее обессоливали и пропускали через DEAE-Toyopearl 650 HW. БАПАаза десорбировалась с колонки 0,15 M NaCl в 0,005 M фосфатном буфере, рН 7,4. Активную фракцию осаждали сульфатом аммония и рехроматографировали на колонке с Р-30. Препарат был очищен в 121 раз. При электрофорезе в ПААГ давал одну четкую зону и два минорных компонента Молекулярная масса препарата по данным электрофореза в денатурирующих условиях равна 55£ 3,2 кД. Активность фермента равна 51,9 ед/мг белка.

Показано, что ингибирования активности фермента не наблюдалось под влиянием 0,5 мМ ФМСФ, но ПХМБ ( 0,5 мМ ) полностью подавлял активность БАПАазы. На активность протеазы не оказывали влияния ионы Zn,Ca, Мп и Fe в концентрации 0,5 мМ. Полученные данные говорят о принадлежности БАПАазы из семян люпина к классу цистеи-новых протеиназ. БАПАаза же, выделенная из ржи и гречихи принадлежит к классу сериновых протеиназ (Белозерский,Дунаевский,1990 ). Но так как БАПА является субстратом Трипсина,то ее можно назвать трипсиногрдобной протеиназой. Константа Михаэлиса препарата, равна 2x10 М. Фермент устойчив в течение 5 суток при 4° С. При 37°С полная инактивация наступает в течение суток. БАПАаза гидролизует амидные и эфирные связи. Она расщепляет протамин и гистоны. Обнаружена способность БАПАазы гидролизовать Bot-конглютине полииеп-тид с Мм 47 кД,а Bji -конглкггине- 35кД при инкубации (1:1) в течение 24 и 48 часов при 37°С. Возможно, эта протеиназа играет роль 'в модификации запасных белков, после чего они расщепляются другими протеазами.

БАПАаза, выделенная подобным способом из листьев люпина желтого имела молекулярную массу около 63 кД. Как и из семян, фермент из листьев является цистеиновой протеиназой. Константа Михаэлиса равна 1,75х 10. М. Активность фермента составляет 47,4 ед/мг белка. БАПАавы за.24 и 48 ччеов значительно гидролизовала большую

и малую субъединицу (55 и 16 кД) РДФК/О, основного белка листьев.

Таким образом, на основании проведенных исследований БАПАзы из семян и листьев разных видов люпина можно сделать заключение о сходстве их свойств и, возможно, выполняемых функций.

Выделение и физико-хжемеские свойства белков-ингибиторов трипсина из лжпина. В литературе относительно ингибиторов "протеи-" наз у люпина имеются лишь сведения об отсутствии и незначительном содержании ингибиторов трипсина в семенах этой культуры ( Бен-кен,Степанова,1986; Naoko, Sature,1988).

Нами впервые белковые ингибиторы протеиназ выделены из семян люпина многолетнего,желтого и белого (А.с. 1389055 ; Домаш, 1991; Домаш и др. 1993). Общая схема выделения ингибиторов трипсина из семян люпина многолетнего и желтого представлена на рис. 4. При электрофорезе в ПААГ в денатурирующих условиях препаратов ингибиторов обнаружено по одной зоне. Молекулярная масса ингибитора из люпина многолетнего равна 10* 1 кД; желтого- 18,6 ± 1,2 кД "рис.5"; белого 18,6 ± 0,5 кД; узколистного- 18,7 ± 0,54 кД.

Титрование ингибиторами из люпина ферментов показало, что линейный характер ингибирования трипсина препаратом из семян люпина многолетнего сохраняется до 80% '-'рис. 6". У других видов люпина -до 50% ингибирования. Все виды ингибиторов из семян люпина являются неактивными по отношению к цистейновым и микробным протеи-назам. Константа ингибирования трипсина для люпина многолетнего равна 1,5x10 м, для желтого,белого и узколистного соответстЕеннно 2x10 ; 1,0х 10 ; 1, 3x1 (Г® М. Ингибитор трипсина из люпина многолетнего, как видно, является наиболее эффективным среди растений семейства бобовых.

Для аминокислотного состава ингибиторов характерно высокое содержание аспарагиновой, глютаминовой кислот,треонина,серина,аргинина. Для люпина многолетнего характерно высокое содержание по-луцистина ( около 12%,для других видов- около 3%.). Отсутствие триптофана в препаратах подтверждается и спектром флуоресценции и ультрафиолетовым спектром.

Ингибиторы устойчивы в области рН 3-11,к действию 6М мочевины, 5% ТХУ,пепсина (1 час,37°0,рН 2,1). Для ингибитора из люпина многолетнего характерна более высокая термоустойчивость ( кипячение в течение; 30 минут снижало активность на 38%). Устойчивость к де'натурационпнм воздействиям объясняется наличием дисульфидных свяэой и, возможно, большим количеством гидрофобных взаимо-

осадок

семена

I

мука

супернатант

экстракция 0,2 М ИаС1, центрифугирование, 8 тыс. г, 15 мин

осадок

фильтрат

осадок

подкисление до рН 4,0

.центрифугирование, 12 тыс. в, 20 мин

супернатант

высаливание сульфатом аммония.до 0,85

- осадок

растворение в 0,05 И трие-НС1 буфере, рН 8,0 центрифугирование 20 тью. е, 15 мин

супернатант

аффинная хроматография диализ лиофилизация

растворение в 0,05 II ацетатном буфере,рН 4,0

ионообменная хроматография ' на КМ- сефадексе А-25

I ^

элюат

■v

диализ против дистил. воды

- лиофилизация

ингибитор

Рис.4. Схема выделения ингибиторов трипсина ■ из семян люпина многолетнего и желтого

кД I 2 2 I *Д

12,3- —

а б

Рис. 5. Электрофорез ингибиторов трипсина из семян люпина многолетнего (а) и желтого (б) в ШАГ в денатурирующих условиях; 1- белки-маркеры; 2- выделенный ингибитор

Рис;, г,. Угнетение активности триисийа (1),химотрипсина (Я), паиаина (3) и субтиливина (4) ингибитором из семян люпина многолетнего.

Действий.

Для ингибиторов из всех видов люпина характерно отсутствие в КД-спектре отрицательного экстремума при 222 нм, что свидетельствует о присутствии лишь^ - спиралей ( Greenfield, Fas-man, 1969). Это подтверждается и расчетом упорядоченных структур, которые составляют около 20%.

Модификация остатков аминокислот показало наличие аргинина в реактивном центре ингибиторов.

Все типы ингибиторов содержат около 3% углеводов (гексоз и пентоз).

Таким образом, на основании исследования физико-химических свойств белковых ингибиторов трипсина из семян разных видов люпина можно предположить, что ингибиторы из семян люпина желтого,белого и узколистного относятся к семейству ингибитора Кунитца из сои; а из люпина многолетнего- к семейству ингибитора Баумана-Бирк.

О целью изучения физико-химических свойств и разнообразия выполняемых функций проведено выделение ингибиторов протеиназ и из листьев разных, видов люпина.

Ингибиторы из листьев люпина многолетнего и люпина желтого сорта Кастрычник выделяли путем экстракции 0,2 М NaCl,осаждения балластных белков, хроматографии НЖ на акрилексе Р-30, трипсин-сефарозе и• КМ-сефадексе А-25. Основная масса белка элюи-ровалась 0,25 М ацетатным буфером, pH 6,9. Очистка ингибитора составляла 273 раза

Молекулярная масса ингибитора трипсина, из листьев люпина многолетнего,определенная методом электрофореза в ПААГ, составляла 12,5 ± 0,8 кД,а из листьев люнина желтого- 19 ± 1,2 кД. Ингибитор из листьев многолетнего люпина, как и ингибитор из семян, эффективно подавлял активность трипсина, слабее- химотрипсина и не действовал на активность папаина, субтилизина. Константа инги-бирования дфя люпина многолетнего составляет 1x10 м,а для желтого-. 1,5x10 М. Ингибитор из листьев люпина многолетнего был более термоустойчив,чем из листьев люпина желтого. Для ингибиторов трипсина.из листьев люпина характерно более высокое, чем в семенах содержание глютаминовой кислоты, серина и более низкое содержание ароматических аминокислот.

Исходя из полученных данных можно заключить, что для ингибиторов -из семян и листьев люпина характерна генетическая обуслов-

ленность их физико-химических свойств. Имеющиеся различия связаны, возможно, с физиологическими функциями, выполняемыми ими.

Выделение и свойства белков-ингибиторов эндогенных протеиназ бобовых растений--------'-----------------------

Регуляция протеолиза с помощью ингибиторов является актуальной и в то же время дискуссионной. В литературе сравнительно мало сведений относительно существования, выделения и свойств белковых ингибиторов эндогенных протеиназ С Белозерский, Дунаевский, 1982; Shain, Mayer,1968; Baumgartner,1976). Но дополнительные данные по этому вопросу,несомненно, способствуют раскрытию биологических функции природных ингибиторов.

Ингибиторы эндогенных протеиназ выделяли иэ семян и листьев люпина многолетнего, желтого и кормовых бобов путем экстракции 0,005 M фосфатным буфером, pH 7,4. Экстракт нагревали до 60°С (5 мин) и центрифугировали. НЖ концентрировали и наносили на колонку с Р-30. Основная масса балластных белков выходила с начала пропускания буфера. Белки-ингибиторы эндогенной протеиназы (БАПАазы) десорбировались с колонки частично с ингибитором трипсина. Активную фракцию концентрировали, диализовали против исходного буфера и пропускали через колонку с ДЗАЗ- Toyopearl 650 HV. Белок-ингибитор вымывался с колонки 0,2 M NaCl в исходном буфере. Его концентрировали, обессоливали и использовали для работы (Домаш, Заб-рейко,1995)..

Результаты исследований показали, что молекулярная масса препарата из семян люпина многолетнего, определенная методом гельфильтрации равна 25 ± 3 кД. , а электрофорезом- около 20 кД. Линейная зависимость между количеством ингибитора и ферментативной активностью БАПАазы сохранялась до 55% подавления активности. Полное ингибирование фермента наступает при 125 мкг ингибитора. Подобными свойствами обладали ингибиторы и из семян и листьев люпина желтого. Следует отметить, что выделенные ингибиторы из исследованных нами растений тормозят активность БАПАазы по принципу "перекрестного действия", что говорит о возможной общности механизма регуляции эндогенных протеиназ у растений.

_В процессе прорастания семян содержание ингибиторов эндогенных протеиназ снижается и на четвертые сутки они полностью исчезают как в зародышах, так и семядолях.

Таким образом, можно заключить, что регуляция протеолитй-ческих ферментов происходит с участием ингибиторов эндогенных протеинаэ, которые существуют у всех без исключения растений, но обладают различными физико-химическими свойствами, специфичными для каждого вида

Локализация протеиназ и белювых ингибиторов в клеточных структурах бобовых растений

До настоящего времени малочисленны и достаточно противоречивы данные о локализации протеаз и белковых ингибиторов в растительных клетках. Дальнейшее исследование этого вопроса важно для установления их физиологических функций. В своей работе мы использовали люпин, кормовые бобы и горох.

Результаты показали, что белковые тела люпина содержат БАПА-аэу и ингибиторы трипсина Кроме того, в этих органеллах присутствует кислая фосфатаза и аспартильная протеиназа (Соболев, 1985; Белозерский с сотр. ,1993). Белки ядер люпина содержат ингибиторы трипсина, -а кормовых бобов, кроме того, и ингибиторы хи-мотрипсина, субтилизина и цистеиновых протеиназ, Хпоропласты и митохондрии люпина обнаруживают незначительное содержание ингибиторов цистеиновых протеиназ (папаина.фицина). Хпоропласты же кормовых бобов содержат ингибиторы трипсина, цистеиновых протеиназ, а мембраны митохондрий - и ингибиторы субтилизина. В хлоропластах и митохондриях кормовых бобов обнаружены нейтральные, кислые проте-азы, БАПАаза и даже металлопротениназа.

•В хлоропластах листьев гороха присутствует нейтральная и кислая протеиназа, БАПАаза и металлопротеинаэа, активность которых составляет соответственно 9,0; 4,5; 20,9 и 3,2 ед/ мг белка Кроме, того, они содержат ингибиторы трипсина и большое количество ингибиторов цистеиновых протеиназ. Мембраны митохондрий также богаты ингибиторами цистеиновых протеиназ и трипсина.

Результаты проведенных исследований позволяют предположить, что протеиназно-ингибиторная система играет роль не только в деградации и биосинтезе запасных белков, но и в функционировании различных клеточных структур.

белки- ингибиторы протеиназ как факторы ишиштбта растений

-----------------Предполагается,что одной из функций Белковых ингибиторов

протеиназ является защита растений от поражения вредными насекомыми и микроорганизмами ( Richardson, 1977; Мэсолов, Валуева, 1993). Для подтверждения этого предположения проводили всесторонние исследования с растениями люпина, ржи, ячменя и картофеля.

Результаты показали наличие корреляционной зависимости (г= 0,62) между активностью ингибиторов трипсина в зародышах семян люпина и устойчивостью растений к фузариоэу. Показана такая же закономерность для клубней и листьев картофеля, . что дает возможность использовать ее в качестве теста на устойчивость к болезням. Подтверждением роли протеиназно-ингибиторной системы в устойчивости растений к фитопатогенной инфекции являются опыты с растениями ржи, ячменя и картофеля, показавшие, что в ответ на заражение происходит накопление белков-ингибиторов протеиназ, причем в устойчивых сортах на 20-30 Z больше,чем в неустойчивых. Это,возможно,связано с индуцированным синтезом ингибиторов de novo. Наблюдаются изменения и в активности нейтральных,кислых протеиназ и БАПДазы, а также в электрофоретическом спектре ингиби-торсодержащей фракции белков.

Показано также участие ингибиторов трипсина в устойчивости растений картофеля к вирусным болезням ( Амбросов, Домаш и ДР. ,1979).

Обработка посевов картофеля комплексонатами, совместно с микроэлементами Zn, В и Мо способствует снижению концентрации X-вирусов в листьях картофеля. Это связано и с повышением активности ингибиторов трипсина на 18-75%, в зависимости от варианта опыта, у менее устойчивого сорта Темп и на 30-90% у более устойчивого сорта Добро.

Различные варианты обработки клубней картофеля ингибиторами трипсина приводили к снижению концентрации вирусов в листьях растений,выросших из них. Излученные результаты дают основание для разработки способов иммунизации растений к вирусным болезням.

В растениях, наряду с ингибиторами трипсина и химотрипсина известны ингибиторы,. специфичные к сериновым протеиназам микроорганизмов. Но к сожалению, ' сведений по этому вопросу очень мало

(Richardson, 1977;' Mosolov et al. ,1979; Конарев Ал. ,1992).

Проведенные исследования дали возможность обнаружить впервые в семенах и листьях люпина и некоторых других бобовых культур наличие ингибиторов протеиназ возбудителей фитопатогенной инфекции. Муку семян люпина экстрагировали 0,005 М фосфатным буфером, после чего в экстракте осаждали балластные белки, НЖ концентрировали и пропускали ■■ через акрилекс Р-30. Активную фракцию хроматографиро-вали на ДЗАЭ- целлюлозе. Молекулярная масса белка, ингибирувдего активность протеиназ гриба рода Fusarium равна около 26кД (определена методом гельхроматографии). Ингибитор подавлял активность F. oxysporum и F. sambucinum. Линейная зависимость между количеством внесенного в инкубационную среду ингибитора и ферментативной активностью сохранялась до 65% подавления активности. Белок незначительно подавлял активность трипсина, не действовал на субти-лиэин и ферменты Aspergillus aliaceus.

Белки,способные ингибировать активность микробных протеиназ выделены из семян и листьев люпина многолетнего, желтого и кормовых бобов. Следует отметить, что белки из семян и листьев кормовых бобов,, в противоположность белкам из. люпина, подавляли активность субтилизина и протеиназы Aspergillus aliaceus, но не действовали на активность ферментов Fusarium. Полученные нами новые данные показывают существование в каждом виде растений ингибиторов, функцией которых является нейтрализация протеаз фитопа-тогенных микроорганизмов, специфичных для каждого вида растений.

Замечено также, что экстракт из клубней картофеля способен ингибировать активность протеаз фитопатогенного гриба рода Fusarium. Установлено, что различные по устойчивости к F. sambuainum сорта картофеля по-разному ингибировали протеазы гриба, которые являются белками с молекулярной массой 25-28 и 68-98кД и относятся к классу сериновых. Результаты анализа дали возможность разработать способ определения устойчивости картофеля к микромицетам F.sambuoinum ( А. с. 1470271).

Подтверждением защитной роли белков-ингибиторов протеиназ являются и данные по прямому действию их на рост и развитие F. sambucinum. Добавление ингибитора, выделенного из картофеля, в культуральную среду до конечной концентрации 0,05 и 0,1% способствовало снижению биомассы мицелия гриба на 90%. Препарат в концентрации 0,1% снижал диаметр колоний гриба на чашках Петри на 58% через 72 часа. Снижение активности протеолитических ферментов

в культуральной жидкости составляло около 70%. Ингибитор (0,01-0,1%) снижал на 45-86% объем пораженной ткани картофеля, вызванной грибом ( A.c. 1584167 ).

Угнетающее действие оказывал ингибитор трипсина из люпина многолетнего на рост и развитие гриба F. oxysporum (Дорожкин, Домаш и др. 1985). Он снижал число проросших спор, развитие ростовых--------- -

трубок и др.

Таким образом, полученные данные дают возможность более ■ полно понять механизмы иммунитета растений к фитопатогенной инфекции и показать, что белки-ингибиторы протеиназ являются одним из факторов устойчивости растений к болезням.

БШШ ИНГИБИТОРЫ ПРОТЕИНАЗ КАК ОДИН ИЗ ПОКАЗАТЕЛЕЙ качества белка

Питательная ценность семян с. х. культур зависит не только от количества и качества белков (аминокислотный состав,переваримость и др.), но и от присутствия токсических,антипитательных веществ. Предполагается, что одними из таких веществ являются ингибиторы протеиназ ( трипсин,химотрипсин). Скармливание белка, даже высокой биологической ценности, не дает положительных результатов в связи с недостаточной его утилизацией из-за связывания пищеварительного фермента трипсина ингибиторами в неактивный комплекс. Об актуальности рассмотрения вопроса об ингибиторах протеиназ, как одном из антипитательных факторов говорит ряд Международных конференций,посвященных этому вопросу (Вена 1973; Нью-Йорк, 1986 и др.).

Для проверки предположения о действии ингибиторов трипсина на качество белка исследовали действие этих веществ на переваримость белка in vitro в семенах с. х. культур. Результаты показали отсутствие корреляционной зависимости между переваримостью белка в семенах люпина желтого и ингибиторами (г- - О,Об). Но для диких видов, более богатых ингибиторами, коэффициент корреляции равен - 0,97± 0,02, т. е с увеличением содержания ингибиторов переваримость белка уменьшается. Тесная корреляционная зависимость отмечена и для белков семян гороха (г- -0,64t 0,12). У диких видов гороха, по данным некоторых авторов (Singh, Jambunathan, 1979), переваримость белка была на 35% ниже, чем у культурных видов. Взаимосвязи между указанными показателями

для злаковых культур (ячмень,рожь,тритикале) не отмечено.

Для изучения действия различных доз препаратов ингибиторов трипсина на переваримость белка гороха, в инкубационную смесь вносили от 0,5 до 3,5 мг ингибитора. Оказалось, что с повышением дозы препарата переваримость белка in vitro постепенно снижается и при дозе 2,6 мг в среде составляет 25Z от контроля,после чего кривая выходит на плато.

Основные пути снижения содержания ингибиторов трипсина в семенах с. х. культур. Одним из путей снижения содержания ингибиторов протеиназ. в семенах с. х. культур является селекция. Однако этот путь является трудным и длительным. При этом, следует иметь в виду, что снижение содержания ингибиторов может вызвать и снижение устойчивости к болезням. Но, зная уровень ингибиторов у сортов бобовых растений, можно при прочих равных условиях исключить сорта с большим уровнем ингибиторов. Среди бобовых культур особенно остро стоит проблема снижения содержания ингибиторов у сои.. Существует ряд технологических способов обработки семян этой культуры с целью их инактивации. Прогревание муки при 100 С в течение 15,60 и 12.0 минут' снижает активность соответственно на 13,20 и 60%. В последнее время в производстве используются термовструдер-ные установки для обработки зерна (Мельцер и др. ,1990). Проведенные, совместно с Институтом тепло- й маосообмена AHB, опыты по действию различных режимов термовструдирования зерна на активность ингибиторов трипсина показали, что она снижается в зависимости от режима на 60-100%. Со снижением активности ингибиторов наблюдается повышение степени декстриниэации крахмала, переваримости белка и др. фи этом, не аамечено отрицательного влияния на содержание белка и его аминокислотный состав. Подученные данные позволили разработать режимы термовструдирования верна на основе использования показателя активности ингибиторов трипсина в качестве теста Этот показатель включен в Технические Условия "Компоненты еерновые термовструдированные" и используются в настоящее время в АО "ЭКОШЛ".

* Таким обравом, доказано,что белки-ингибиторы протеиназ, наряду с целым рядом биологических свойств могут снижать и качество белка ееыяк с. х. растений, что'необходимо учитывать.

Исследования позволили также показать возможность применения белка семян кормового люпина ( из-за незначительного содержания ингибиторов протеиназ) в сыром виде,без тепловой обработки, для

пшцевых и кормовых целей.

выводы

1. Показан широкий спектр уровня активности белков-ингибиторов^ протеиназ у растений различных систематических групп. Впервые установлена видоспецифичность в активности протеаз и белковых ингибиторов для растений рода Ьлципиэ. Установлено наличие в семенах и листьях исследованных видов и сортов люпина протеаз с оптимумом действия при рН 4,5; 7,0; 8,0 и 9,0. Выявленная видовая и сортовая специфичность в электрофоретическом спектре ингибиторсо-держащей фракции белков семян ряда высших растений дала возможность разработать способ отбора высокобелковых форм люпина узколистного и показать, что белки-ингибиторы протеиназ могут служить в качестве маркеров в генетике и селекции растений.

2. Установлено участие белков-ингибиторов 6 регуляции активности эндогенных протеиназ люпина Изучение динамики протеиназ-но-ингибиторной системы показало,что прорастание семян сопряжено с повышением уровня активности нейтральных,кислых протеаз,БАПАазы и БАЗЭ-эстеразы. Так,активность цистеиновых протеиназ в прорастающих семенах люпина увеличивается к 48 часам прорастания почти в три раза. Швышение же активности' БАЭЭ-эстеразы происходит лишь в первые сутки прорастания. Наблюдающееся снижение активности ингибиторов протеиназ в процессе прорастания семян люпина связано с их деградацией цистеиновой протеиназой. Отмечен более высокий уровень протеиназ и белковых ингибиторов в зародышевой оси семян люпина.

Созревание семян люпина связано с падением активности протеиназ и повышением уровня активности ингибиторов трипсина,которые обнаруживаются при содержании сухой массы вещества около 20%, в период начала синтеза вицилиноподобных белков. Показано существование ингибиторов в связанном с протеазами состоянии в зрелых семенах.

3. С помощью хроматографичесютх методов анализа впервые установлено наличие в семенах и листьях исследованных видов бобовых растений белковых ингибиторов эндогенных протеиназ,изучены их свойства и сделано заключение о возможном существовании у всех без исключения растений ингибиторов эндогенных протеиназ,но с различными физико-химическими свойствами.

4. Впервые установлена локализация протеиназ и белковых ингибиторов в различных клеточных структурах растений люпина,кормо-

вых бобов и гороха В частности, обнаружено наличие в алейроновых зернах, митохондриях, хлоропластах и ядрах указанных растений цистеиновых протеиназ,БАПАазы, металлопротеиназы,белковых ингибиторов трипсина, химотрипсина, субтилизина и папаина Полученные данные подтверждают регуляторную роль протеиназно-ингибиторной системы в клеточном метаболизме высших растений.

5. Из семян люпина желтого и многолетнего хроматографически-ми методами выделена эндогенная пептидгидролаза БАПАаза, исследованы ее биохимические свойства и установлена принадлежность этого фермента .к классу цистеиновых протеиназ и ее способность растоплять субъединицы - и ß -конглютина

6. Установлено участие протеиназно-ингибиторной системы в белковом обмене листьев люпина при биосинтезе запасного белка Выявлена роль сериновых,аспартильных и цистеиновых протеаз в транспорте азотистых веществ из вегетативных органов в репродук-' тивные. Впервые показано наличие в листьях люпина металлопротеиназы, максимальная активность которой наблюдается в стареющих листьях.

7. Впервые из семян и листьев разных видов люпина выделены в чистом виде ингибиторы трипсина, исследованы физико-химические свойства и показана их видовая специфичность. Ингибиторы трипсина из семян и листьев люпина желтого, белого и узколистного принадлежат к семейству ингибитора Кунитца из сои, а- из люпина многолетнего- к семейству ингибитора Баумана-Бирк. Наиболее низкая величина константы ингибирования характерна для люпина многолетнего

8. Полученные в результате исследований данные позволили не только подтвердить предположение о защитной функции белковых ингибиторов протеиназ, но и значительно расширить это представление. Показана способность их подавлять активность протеаз рода Fusarium, задерживать рост и развитие фитопатогенного гриба,а также снижать концентрацию Х-вирусов в . растениях картофеля. Присутствие ингибиторов протеиназ в растениях можно считать одним из механизмов устойчивости к болезням. На основании исследований сделано предположение о наличии у каждого вида растений ингибиторов протеиназ фитопатогенных микроорганизмов,специфичных для этого растения.

9. Показано, что на воздействие неблагоприятных факторов внешней среды (пестицидов,гербицидов,повышенных доз минеральных

удобрений,радиационного загрязнения и др.) растение отвечает изменением активности отдельных компонентов системы протеолиза. Предлагается использовать эти показатели в качестве теста на техногенные воздействия.

10. Исследование-ингибиторов _протеиназ как показателя качества белка, в частности отрицательное действие на его перевари- -мость, указывает на необходимость снижения содержания ингибиторов в семенах растений, отличающихся их высоким содержанием. Тер-мовструдирование является наиболее эффективным способом снижения содержания ингибиторов трипсина в семейах растений. Показатель активности этих белков предлагается использовать для разработки его различных режимов, что нашло практическое применение.

Обоснована возможность применения белка семян кормового люпина в сыром виде, без тепловой обработки, для пищевых и кормовых целей.

СПИСОК ОСНОВНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ГО ТЕШ ДИССЕРТАЦИИ

1. Физико-химические свойства белков бобовых растений и изменение их в процессе формирования урожая / Мироненко А. К, Домаш Е К , Рогульченко И. В., Заболотный А. И., Троицкая Т. М., Можар Т. А. // •

Регуляция роста и питание растений: Мн. 1972. -С. 105-111.

2. Выделение вицилино - и легуминоподобных белков из семян желтого люпина / Мироненко А. Е , Троицкая Т. М. , Щурхай С. Ф. , Домаш а И. // Прикл. биох. и микробиол. -1978. - Т. 14, в, 5. -С. 752-758.

3. Мироненко А. В. , Домаш В. И., Щуцкая О. В. Белки- ингибиторы протеаз у растений картофеля,различных по устойчивости к вирусным болезням. // Вирусные болезни растений и меры борьбы с ними. Ереван, 1978. - С. 73-74.

4. Влияние М-вируса на содержание белков-ингибиторов протеаз у растений картофеля. / Амбросов А. Л.,Домаш Е И. .Щуцкая О. В. .Чехова А. а // Защита растений. Мн. ,1979,- Т. IV. - С. 3-7.

5. Активность белков-ингибиторов протеаз в семенах различных сортов желтого и белого кормового люпина. / Мироненко А. В. Домаш Е И,, Чехова А. Е , Шарова 3. Н . // Прикл. биох. и микробиол. -1979.-Т. 15. - С. 760-763.

. .. 6. Домаш В. I. Актыунасць бялкоу-1нпб1тарау пратэ1наз жоутага кармавога луб!ну 1 гх - тэрмаустойл^васць. // Весц! АН БССР, сер. б1ялаг. навук. - 1979. -И 4. - С. 49-51.

7. Активность белков-ингибиторов протеаз в семенах различных по устойчивости к болевням сортов люпина / Дорожкин Е А., Миронен-ко А. В., Чёкалинская Н. И., Домаш Е И., Нитиевская Е И. // Докл. АН БССР. - 1980. - N 7. - С. 645-647.

8. Содержание и динамика активности белков-ингибиторов про-теиназ люпина. / Мироненко А. Е , Домаш Е И., Чехова А. Е , Ходорцова Л.Ф. .Воронов А.Т. // Зизиолого-биохимич. основы регулирования роста и обмена веществ раст. Мн. .1981. - С. 11-19.

9. Домаш Е Е Биохимические показатели качества зерна кормового люпина.// Научно-методол. основы селекции интенсивных сортов зерновых культур, устойчивых к неблагоприятным факторам климата. Жодино. ,1981.- С. 66-69.

10. Залежнасць ф1э1ка-х1м!чных уласщвасцей оялкоу бабовых расл1н ад ix б1ялалчных асабл1васцей i умоу вырошчвання.,/ Mipa-ненка А. Е , Забалотны А. I.. Домаш Е I., Рагульчанка I. R // Весщ АН БССР. сер. 61ЯЛ. н. -1981. - N 2.- С. 117-122.

11. Ценные сортообразцы люпина иа содержание белка и его качество. / Домаш R И. .Мироненко А. Е .Чехова А. Е .Полканова Т. Е .Ходорцова Л. Ф. // Селекция и семеноводство. - 1983. -N. 6. -С. 26-27.

12. Мироненко А. Е . Домаш Е И., Рогульченко И. Е Новое в увеличении производства растительных кормовых белков. Оба. инф. БелНИ-ИНТИ.Мн. .1983.- 48с.

13. Домаш R К . Чехова А. Е Белки-ингибиторы протеиназ люцерна // Ботаника. Мн., 1984. -Е 26. -С. 140-141.

14. Влияние ингибитора протеиназ из семян люпина на Fusarium oxysporum. / Дорожкин Е А., Домаш Е И.. Штиевская В. Л , Мироненко А. Е .-Чехова А. Е // ДАН БССР. - 1985. -Т. 29. -С. 551-653.

15. В1ях1М1чная характеристика насення жоутага кармавога луб i ну. / Домаш Е I. ,М1раненка А. Е . Шарова З.М.,Чэхава А.М.// Весщ АН БССР,сер. 61ЯЛ.Н. -1987. -N 1. -С. 24-27.

16. Домаш Е I. .ИМраненка А. Е .Чэхава А. М. BiaxiMi чная характарыстыка бялковага комплексу луб1ну жоутага айчыннай i замежнай с:ёлёкцы1. // Весщ АН БССР. ,сер. б!ял. навук. - 1987. -N 2. -С. 39-42.

• '17. A.c. 1389055, СССР,МКИ А 61 К 35/28,ДСЕ Способ получения ингибитора трипсина / Домаш Е И.. Мироненко А. В.. Чехова А. Е Опубл. 28.04.1986. - 4«с.

18. A.c. 1470271 СССР.МКИ А 01Н 1/04. Способ оценки устойчивости картофеля к микромицетам Fusarium sambuclrmm Fuck. / Дорожкин Е "А. .Домаш Е К , Вельская С. И. .Новикова ДМ. Опубл. 07.04.89,

Вал. N 13. - 4с.

19. Белковый комплекс люпина. / Домаш ЕИ., Шфоненко А. а ,Ро-гулъченко И. В. .йванцов JI В. // Докл. ВАСХНИЛ. - 1989.- N 9.- 0.19-23.

20. Домаш В. И., Королева 0. С., Котловская Г. а Содержание бел-каГактивность и злектрофореткческий состав ингибиторсодержащей

фракции семян гороха. // Химия природн. соедин. - 1989. -------------------

N2. -С. 243-247.

21. Физиология шюдообразования люцерны./' Волынец А.П.,Про-хорчик Р. А. , Пшеничная Л. А. Майснер А. Д., Минько И. Ф., Вудкевич Т. А. , Кауров И. А., Вулко О. П., Заболотный А. И., Домаш Е И., Мощук П. А., Пикун П. Т. , Сельвесюк В. Л. , Ионов \L П. Минск: Наука и техника,1989,- 208с.

22.. Домая Е К , Кот ловская Г. Н Уровень активности ингибиторов трипсина в семенах различных с. х. культур. // Теоретическая и прикладная карпология: Материалы Всес. конф.- Кишинев: Шгиинца, 1989.-С. 116.

23. Домаш В. I. .Буснюк ЕЕ Актыунасць пратэал1тычных фермента^ i 1нг1б1тарау трыпс1ну у насенн! луб1ну у працэсе ix паспя-вання. // Весщ АН БССР, сер. 61ЯЛ. навук.-1990. - N3. - С. 17-21.

24. A.c. 1584167, ДСП, СССР.МКИ А01 N 65/00. Способ получения средства для защиты растений. / Дорожкин Е А., Домаш Е И., Новикова Л. М. Опубл. 18.06.87,- 4с. '

25. Домаш В. И., Свистунова 0. R , Кот ловская Р. Н. Система "протеаза-ингибитор" прорастающих и созревающих семян люпина. //$мзиология семян: формирование,прорастание,прикладные аспекты. -Душанбе.-1990. - С. 178-181.

26. Мирокенко А. Е, Домаш Е И. .Рогуль ченко И. В. Белки культу-ных и дикорастущих кормовых растений. - Минск: Наука и техника, 1990.-2000.

27. Домаш В. И. Природные ингибиторы протеинаэ растений: физико-химические свойства и биологические функции. // Актуальные проблемы современной биохимии.-Минск, 1991.-С. 3-4.

28. Домаш В. И. Белковый ингибитор трипсина из семян люпина белого (Lupinus albus L.). // ДАН BCCF. -1991. -T.XXXY. -N 11. -С. 1039-1041.

29. Домаш В. И. .Буснюк O. E .Забрейко С. А. Изменение активности протеолитичеоких ферментов и ингибиторов трипсина в листьях разных видов люпина в процессе его роста и развития. // Физиол. и биохимия культурн. раст. - 1S93. - N2,- С. 170-175.

30. Перспективные образцы сои для условий БССР. / Давыденко О. Г.,Понятовекая В . Н. .Миронова Т.П.,Домаш ЕИ.// Селекция и семеноводство. -1993. - N 2. -С. 16-18.

31. Выделение и свойства ингибиторов трипсина из семян люпина желтого и многолетнего. / Домаш Е И., Забрейко С. А.. Эимачева А. Е .Иевлева Е. Е.Мосолов ЕЕ// Химия природн. соед. - 1993.- N 6.

- С. 879-884.

32. Пат. 1877751 СССР, МНИ А 01 Н 1/04. Способ отбора высокобелковых форм люпина узколистного. / Домаш Е И., Буснюк 0. Е , Забрейко С; А.., Купцов ЕС., Миронова Т. Е Заявл. 01.07.91: Опубл. 30.08.93, Бюл. N 12. - 4 с.

33. Экзопротеазы гриба Fusarium sambucinum Fuck и их взаимодействие с ингибиторами./ Кладницкая Г.Е.Валуева Т. А., Домаш Е И.., Новикова JL М., Мосолов В. Е // Прикл. биохимия и микро-биол. -1994.-N 1.-С. 21-28.

34. Влияние аккумуляции радионуклидов аварийных выпадений ЧАЭС на фотосинтетические процессы и азотный обмен люпина желтого. / Заболотный А. И.,Гончарова Н.В.,Домаш В. И. ,Шевердов ЕЕ // . 4иэиол. и биохимия культ, раст. - 1995.-Т. 27, N3.- С. 130-134.

35 Прищепа И. А., Домаш В. И. Изменение активности белков-ингибиторов протеиназ в семенах зерновых культур под влиянием средств химизации. // Научн. тр. БелНИИ защиты раст. - 1995. - Е18.

- С. 127-139.

36. Домаш К И., Забрейко С. А.- Белки-ийгибиторы из семян люпина многолетнего как возможные регуляторы активности протеолити-ческмх ферментов.// Докл. АН Беларуси. - 1995. -Т. 39, N2. -С. 70-73.

37-60 - тезисы докладов на Международных и Республиканских съездах и конференциях.

РЭЗЮМЕ

Домаш Валянш на 1ос1фауна

Пратэ1назна- 1нг1б1тарная сютэма вышэйшых расл1н: уласшвасш i б1ялаг1чныя функцы!

Ключавыя словы: пратзй1аэы,бялк1-1нпб1тары, рэгуляцыя,дэг-радацый.б1яс4нтэз, лакал¡зацыя, луб1н, Ыдаспецыфшнасць.

Аб'ект даследавання- уласшвасш 1 б1ялапчныя функцы! пра-тзтазна- 1нпб1тарнай сютэмы шэрагу вышэйшых расл1н. Мэта работы- даць цэласнае представление аб б1ях!м!чных уласщвасцях 1 б1ялапчнай рол! сютэмы пратэтаза- 1нпб1тар шэрагу вышэйшых — расл1н-1 выявть магчымасщ прымянення^яе для рашэння пытанняу

б1ях!М11, 1мун1тэту 1 селекцьи расл1н. Асноуныя метады даследа---------------

вакня - гелевая, Юнаабменная 1 аф1нная храматаграф!я, электрафа-рээ у ПААГ у натыуных 1 дэнатурыруючых умовах.

Установлена в 1 давая спецыф1чнасць ва узроун! актыунасш пра-тэ!назна- 1нпб1тарнай сютэмы 1 роля у працэсах дэградацш 1 б!яс1нтэзу наэапашаных бялкоу луб!ну. Упершыню з насення 1 л1сцяу розных В1дау луб1ну вылучана эндагенная пратэ!наза 1 яе бялковы 1нМб1тар, вывучаны 1х ф1з!ка- Х1м1чныя уласц!васц1 1 субстратная спецыф1чнасць. Паказана роля бялкоу- 1нг1б1тарау у рэгуляцы1 ак-тыунасщ пратэ1наз 1 здольнасць прыгнятаць актыунасць, рост Г развище фиапатагеннай 1нфекцы1, на падставе чаго распрацаван спосаб ацэнк1 устойл!васш бульбы да сухой фузарыезнай гн1л! 1 спосаб атрымання сродку для абароны расл1н. Упершыню паказчык ак-тыунасЩ 1нпб1тарау трыпс!ну выкарьютан у якасц! б1ях1М1чнага тэсту пры распрацоуванн! рэшмау тэрмауструдзернай апрацоук! зерня у камб1кармавой прамысловасщ. Матэрыялы даследаванняу знаход-зяць выкарыстанне таксама у селекцыйных установах Беларус1 ; у вышэйшых вучэбных завядзеннях. Яны могуць быць прыменены,акрамя таго, для атрымання прэпаратау 1нгчб1тарау пратэ1наз, скарыстоу-ваемых у б!ях!м1чных даследаваниях 1 медыцыне.

РЕЗЮМЕ

Домаш Валентина Иосифовна

Протеиназно-ингибиторная система высших растений:

свойства и биологические функции Ключевые слова: протеиназы,белки-ингибиторы,регуляция,деградация, биосинтез, локализация, люпин, видоспецифичносць.

Объект исследования - свойства и биологические функции про-теиназно-ингибиторяой системы ряда высших растений. .Цель работы-дать целостное представление о биохимических свойствах и биологической роли системы протеаза-ингибитор ряда высших растений и

выяснить возможности применения ее для решения вопросов биохимии, иммунитета и селекции растений. Основные методы исследования -ге-левая,ионообменная и аффинная хроматография, электрофорез в ПААГ в нативных и денатурирующих условиях.

Установлена видовая специфичность в уровне активности протеиназно-ингибиторной системы и роль в процессах деградации и биосинтеза запасного белка люпина Впервые из семян и листьев разных видов люпина выделены эндогенная протеинава и ее белковый ингибитор, изучены их физико-химические свойства и субстратная специфичность. Показана роль белков- ингибиторов в регуляции активности протеиназ и способность угнетать рост и развитие фитопато-гедаой инфекции, на основании чего разработан способ оценки устойчивости картофеля к сухой фузариозной гнили и способ получения, средства для защиты растений. Впервые показатель активности ингибиторов трипсина использован в качестве биохимического теста при разработке режимов термовструдерной обработки зерна в комбикормовой промышленности. 1&териалы исследований находят использование также в селекционных учреждениях Беларуси и в высших учебных заведениях. Они могут быть применены,кроме того, для получения препаратов ингибиторов протеиназ, используемых в биохимических исследованиях и медицине.

SUMMARY

- Domash Valentina Iosiphovna Proteinase- Inhibitor System of Higher Plants: Properties and Biological Functions

Key words: proteinases, proteins-inhibitors, regulation, degradation,biosynthesis,localization, lupin, specific difference.

Object of investigations - properties and biological functions of proteinase - inhibitor system of a number of higher plants. The aim of work was to give an integral notion about biochemical properties and biological role of proteinase-inhibitor system of higher plants and to elucidate potentialities in its use for biochemistry, immunity and plant selection questions decision. The basic investigation methods were gel, ion-exchange and affinity chromatography, electrophoresis in polyacrylamid gel in native and denaturation

conditions.

Specific difference in level of proteinase-inhibitor system activity and its role' in lupin protein degradation and

biosynthesis - processes- have__been__establ ished. Endogenous

proteinase and its protein inhibitor have been isolated from-----------

leaves and seeds and their physico- chemical properties and substrate specificity have been studied for the first time. The role of proteins-inhibitors in proteinase activity regulation and ability to oppress the activity, growth and development of phytopathogenous infection have been shown. On the grounds of above mentioned the method to estimate the potatoes resistance to dry Fusarium mould and the way of production of plants protection agent fiave been worked out. The indicator of tripsin inhibitors activity was used for the first time as biochemical test in designing seed heat treatment regimes in a formula feed industry. Investigation materials find an application in selection institutions of Belarus, in education process at Higher Schools. They could be applicated also in order to receive proteinase inhibitor preparations used in medical biochemical investigations.