Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование синтеза сложных эфиров, катализируемого липазой просяной мучки

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Исследование синтеза сложных эфиров, катализируемого липазой просяной мучки"

ргг. Ой

г. - ».»о- У-'.'З

¿ и

государственный комитет российской федерации но высшему ооразованию

московская государственная академия пищевых производств

:!а правах рукописи

Лялипа Ирина Копстантповна

УДК 665.001.5 : 664.768 : 577.153

ИССЛЕДОВАНИЕ СИНТЕЗА СЛОЖНЫХ ЭФИРОВ, КАТАЛИЗИРУЕМОГО ЛИПАЗОЙ ПРОСЯНОЙ МУЧКИ

специальность: 03.00.04 - БИОХИМИЯ

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на ссискаяио ученей степени кандидата биологических наук

Москва, 1996 г.

Работа выполнена в Московской государственной академии пщеаых производств

Научный руководитель: доктор химических наук.

профессор Ю.А.Султапович

Официальные оппоненты: д.б.н., профессор А. С. Тихомирова

к.б.н., додзнг Т.Л.Ауэрман

Ведущая организация: Московский государственный

заочниЗ институт пищевой промышленности

Автореферат разослан гарта_ 1996 г.

Защита состоится " I? " апреля 1996 г. в _10_час.

на заседании Специализированного Совета К. 063.51.06 Ь'ГАПП

по адресу: 125090. Москва, Волоколамское шоссе. Л. ауд. _

С диссертациэй мс:.;но ознакомиться в библиотеке академии.

Ученый секретарь Специализированного Созета, кандидат биологических наук,

доцент Т.Г.Гензраг.ова

0Б1ДАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность теш. Современнные достижения в области исследования поведения липолитических ферментов в микроводных средах позволили использовать их для синтеза сложных эфиров. 'Интерес к этой области исследований обусловлен решением как научных. _ так и прикладных задач: возможностью получения сложных эфиров для замены натуральных продуктов или модификации липидов для придания им новых свойстз. Большинство работ в этом направлении выполнено с участием липаз микробного происхождения; липазы выезмх растений мало исследованы в этом аспекте. Высказано предположение, что растительные липазы могут лроязлять свойства, отличные от микробных липаз, и их также . можно использовать в технологии 1.Н111б еЬ а1.. 1989).

Представленная работа является продолжением изучения ферментативного синтеза сложных зфиров с участием просяной мучки и синтетических спиртов (Ю. А. Султанович и др. .1993) на примере оксиэтилированных спиртов. Исследования велись по направлениям, являющимися в настоящее время основными з биотехнологии хира:

1) поиск новых источников получения ферментного препасата липазы:

2) изучение возможностей применения для синтеза сложных эфироз фермента, входящего з состав растительного объекта (просяной мучки), ферментного препарата, полученного из просяной мучки и препарата, модифицированного позерхностно-актизными веществами.

Цели и задачи исследования. Целью настоящей работы явилось получение оксиэтилированных сложных эфиров (ОЭСЗ) из нетрадиционного сырья ферментативным синтезом, выявление основных закономерностей синтеза и подбор условий для его осуществления. В соответствии с этой целью были поставлены следующие задачи:

- осуществить синтез ОЗСЗ на основе просяной мучки с использованием ее липидного комплекса:

- получить частично очищенный ферментный препарат липазы из просяной мучки;

- найти оптимальные условия синтеза 1ЭСЗ на основе просяной мучки и с полученным из нее ферментным препаратом липазы.

Научная новизна.. Зпспвые предложен и осуществлен ферментативный синтез ОЗСЗ с участием липазы просяной мучки.

Установлено, что образование ОЭСЭ на основе просяной мучки осуществляется за счет этерификации свободных жирных кислот и переэтерификации сложных эфиров ее липидного комплекса. Изучено влияние строения спирта (количество присоединенных ¡долей окиси этилена и длины углеводородной цепочки) и условий, где переменными параметрами были: температура, содержание просяной мучки и концентрация спирта, на скорость синтеза ОЭСЭ.

Впервые на основании сравнительного изучения условий выделения и фракционирования ферментного экстракта получен препарат липазы из просяной мучки. Подобраны оптимальные условия для определения липазной активности просяной мучки титриметрическим методом, изучены термостабильность Фермента и влияние ПАВ на липазную активность. Обнаружена корреляция между удельной липолитической активностью и этеришииируюяей активностью препаратов^ полученных в процессе очистки липазы.

Методом диспергирования ферментного препарата з органическом растворителе осуществлен синтез ОЭСЭ. Изучено влияние природы используемого спирта на скорость реакции зтерификации.

Впервые показана возможность модификации липазы просяной мучки с псмоцьй ПАВ с целью использования комплекса липазы и ПАВ з реакциях синтеза сложных эфиров в органическом растворителе.

Практическая значимость. Предложена схема получения ферментного препарата из просяной мучки, липолитическая активность которого составляет 36 ООО мкмоль Ж на г препарата в час. Область его возможного применения - использование в биотехнологии для гидролиза растительных масел л синтеза сложных эфиров. Использование- просяной мучки (побочного продукта переработки проса в паено) в качестве источника препарата липазы, а также применение .дешевых и эффективных методов выделения и очистки липазк позволит сократить расходы, связанные с получением ферментного препарата. Выход препарата из 1 г .просяной мучки составляет 72 - 85 мг сухого вещества.

Полученные на основе липидного комплекса просяной мучки ОЭСЭ являются по международной классификации косметического сырья и полупродуктов натуральным сырьем и относятся к группе модифицированных производных продуктов растительного происхождения.

Апробация работы. Материалы работы долояены и обсуждены на распиренном заседании кафедры "Физическая и коллоидная химия" МГАПП 9 ноября 1994 г."

Публикации. По материала1.! диссертации опубликовано А работы.

Объем диссертации. Работа изложена на 131 странице машинописного текста, содержит Зи таблиц и 19 рисунков. Список литературы включает 136 названий работ, из них 93 на иностранных языках.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В работе использовали просяную мучку, фракционный состав' липидоз которой представлен следующими группами (б % от сушы идентифицированных методом ТСХ фракций): моно- и диацилглицерины (МАГ + ЛАГ) - 3.5%. свободные , жирные' кислоты ■ Ш) - 6С%, триацилг-.ицерины (ТАГ) - 8.5%, сложные эфиры (СЗ) с Rf = 0.33 -20%. с Rf- = 0.91 - 8.0%. Общее содержание .тарных кислот, определенное методом газо-хидксстной хроматографии, составляет 120 мг в 1 г просяной мучки.

Субстратом для синтеза сложных • эфиров слуаили оксиэтилированные спирта (0ЭС, синтанолы). 'полученные на Дзержинском ПС "Капролактам": АЛМ-10 (10 - число присоединенных молей окиси этилена) фракции С12-С14; 0C-2Q (20 молей окиси этилена) фракции С16-С2о; АЦСЗ-12 (12 ыолей окиси этилена) фракции С16-С20. Очистку ОЗС от полизтиленгликолей (ПЭГ). которые неизбенны при синтезе ОЗС, проводили по методу И. Б. Левитсксй с соавторами (197С), основанному на различии температур дегидратации ПЭГ и ОЗС. Длл модельных опытов и сравнительных кинетических исследований Синтеза сложных эфиров в зависимости от природы вносимого спирта использовали цетиловый спирт (Serva) и олеинозув кислоту (Sigma) (или 1-14С-оленьооую кислоту (Araershara)).

Фракционный состав нейтральных лппкдов анализировали методом тонкослойной хроматографии на пластинках SUufcl з системе растворите-ей гексан-диэтллосий эфир-уксусная кислота (80:20:1). Количественный анализ фракций проводили с помощь» декситометгии на приборе "Chromoscan 3". Измерения радиоактивности препаратов

проводили методом жидкостной сцинтилляции на радиометре "Марк II".

Липазную активность определяли модифицированным методом Ota, Yamada (1966). используя в качестве субстрата 40%-ную эмульсию• подсолнечного масла в 2%-нси водном растворе поливинилового спирта (ПВС). Активность липазы оценивали по количеству израсходованной на титрование 0.1 н. МаОН: 1 мл щелочи соответствует 100 мкмоль жирной кислоты, образованной в результате гидролиза подсолнечного масла, и выражали в мкмоль Ж на мг белка з час.

Белок определяли по методу Loury et al. (1951) с предварительным осаждением белков 20%-ной ГХУ (1:1).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 1. Исследование закономерностей ферментативного синтеза оксиьтилирозанных эфиров на основе просяной мучки

Способ получения оксизтилирсванных сложных эФиров. К просяной мучке (10 г) добавляли различные оксизтилированные спирты (АЛМ-10.. 0С-20, АЦСЭ-12). растворенные в хлороформе, и выдерживали реакционную смесь с постоянным встряхиванием при комнатной температуре з течение нескольких недель, периодически отбирая пробы. Относе-ние количества вносимых спиртов к общему содержанию жирных кислот з липидном комплексе лросяной мучки составляло 1:1. 1:1.5. 1:2. Контрольный опыт заключался в следующем: к навеске оксиэтилирозачного спирта добавляли экстракт липидов в хлороформе, выделенных из просяной мучки.

Скорость образования оксиэтилированных сложных эСиров контролировали методом ТСХ по изменению соСтава^ липидного комплекса просяной мучки з оезультате внесения оксиэтилированных ctihdtod. Появившаяся новая хроматографическая зона с Rf = 0.72, отсутствующая в спектре липидов просяной м/чки, была'идентифицирована как фракция образовавшихся ОЭСЭ. В дальнейшем происходило увеличение концентрации синтезируемых веществ (табл.1).

Отмечено, что существенный вклад в образование ОЭСЭ вносит процесс отери^икации жирных кислот просяной мучки. Так, содержание свободных .»ирных кислот в реакционной системе уменьшилось за шесть недоль на 421 для АЛМ-10. на 36/. для ОС-20. на 39% для АЦСЭ-12.

Таблица 1

Динамика изменения состава липидного комплекса просяной мучки в результате ферментативного синтеза оксиэтилированных эфиров на примере спиртов: а) АЛМ-10; б) 0С-20; в) АЦСЭ-12

Время ' Содержание фракции, % от суммы идентифиц. веществ

экспозиции. МАГ + - ;кк ТАГ ОЗСЗ - сз • СЗ

су т. ДАГ ЯГ =0. 32 И=0.Э1

контроль 3,5 60.0 8.5 — ■ 20.0 8.0

а) 3 2.7 58.7 4.5 9.3 18.3 6.5

7 3.2 52.7 3.6 19.5 15.6 5.4

14 4.4- 43.0 4,3 32.0 11.8 4.5

. 21 3.9 34.4 4.3 42.1 10.9 4.4

26 3.6 30.1 4.4 49.2 9.5 3.2

42 2.5 17.8 2.7 68.0- 6.7 2.3

5) 3 2.2 63.0 3.2 7.2 18.1 . 6.2

7 1.9 61.5 3.0 14.7 13.9 5.0

14 2.0 53.3 3.0 24.2 12.4 5.1

21 О '*> С 44.1 3.0 33. 6 11.3 5.2

26 2.4 36.6 3.2 40. Э 11.2 5.7

Л "У 2.0 22,0 3.0 57.2 10.5 5.3

¡) з 3.5 62.6 3. 8 7.0 18.3 4.8

7 3.7 59.6 3.2 14.9 15.0 3.6

14 3.5 54.0 3.1 28.0 12.0 4.4

21 3.0 40.0 3.4 34.2 11.6 4.8

26 3.2 32.1 4.0 45.6 10. 1 5.0

42 3.2 21.0 3.2 57.7 10.3 4.6

Установлено, что скорость убывания свободных ЖК. по сравнении :о скоростью образования ОЗСЗ отстает в среднем на £0%. при этом »тмечено уменьшение содержания фракций слокных эфироз просяной |учки на эту же величину. Было сделано предположение о наличии ещё

одного процесса, участвующего в синтезе ОЗСЭ - переэтерификац* (алкоголиза).

О .скорости образования ОЗСЭ можно судить по величине период полупревращения (t,/a). Установлено, что за время, когда 50% .тар® кислот вступило в реакцию с АЛМ-10. концентрации свободных Ж сложных эфиров с Rf = 0.82 уменьшились в два раза по сравнения исходными (рис. 1), т.е. на 30 и 10%, соответственно. Устачовленс что с остальными фракциями также происходили изменения. Так. течение исследуемого периода содержание триацилглицериноз сложных зфиров с Rf = 0.91 уменьшилось в два раза. Отмеченнь изменения наблюдались также зо время синтеза оксиэтилированнь сложных эфиров со спиртами 0С-20 и АЦСЗ-12.

время, сутки

Рис.1. Динамика изменения содержания оксиэтилирозанкых сложных

эфиров 6)-, свободных тарных кислот (2)---, сложных эфиров

фракции с Я! = 0.82/3)----на примере синтеза с АПМ-10.

Таким образом. установлено. что синтез 0ЭСЭ на основ липидного комплекса просяной мучки осуществляется за счет реакци этерификации свободных жирных кислот и переэторификации ее сложны эфиров. катализируемых одним ферментом - липазой.

В контрольных опытах, проведенных с экстрактами липидов просяной мучки и оксиэтилироэалными спиртами, количественных

и качественных изменений в спектрах липидов в течение двух месяцев не происходило.

Поиск оптимальных условий синтеза ОЭСЭ, где переменными параметрами были: температура, содержание просяной мучки и концентрация оксиэтилированного спирта, показал, что скорость синтеза зависит в' значительной мере от количества органического растворителя1' (рис.2А.Б), т.к. его уменьшение в реакционной системе позволяет увеличить*-концентрацию не только субстратов, но и Фермента. Для сравнения выбраны следующие варианты:' навеска• просяной мучки была постоянной, а количество хлороформа составляло: 10, 50. 100 мл з случае с /ЛМ-10 и 20. 100 мл, когда в качестве субстрата использовался 0С-20.

ОЗСЭ.%

ОЭСЗ.%

12 1в го ¿ц м а <а 13 ао 21

время, сутки время." сутки

Рис.2. Кинетика образования сложных зфис'в на примере спиртов АЛМ-10 (А) и 0С-20 (Б) при различном отношении навески просяной мучки (г), к объему' хлороформа (мл): 3. 5 - 0.1. 2 - 0.2; 4 - 0.5 и 1 - 1:0 г/мл.

В результате уменьшения количества хлороформа в реакционной системе время "полупревращения жирных кислот 6 исследуешх вариантах сократилось до 19.5 суток для АЛМ-10' (кривая 1 на рис. 2 А). до 26 суток для ОС-20 (кривая 4 на рис. 2 Б). Графическим методом определена величина Ц для кривых 2. 3 и 5.. где количество хлороформа составляло 50 и 100 мл. которая равна 56 и 110 суткам.

- а -

соответственно. Зависимость -обратной величины времени полупревращение как характеристики скорости, от содержания просяной мучки в реакционной смеси (рис.3) позволяет оценить

1А СР?

сут

ОЛ

ода

да

0С1

1

——- - —

/1

/ __ у

/

02

СЙ

Ой

из

Ш

влияние органического

растворителя на скорость образования оксиэтилированных сложных эфиров. На начальном участке до соотношения просяной мучки к хлороформу, равном 1:2. установлена прямая зависимость; дальнейшее же уменьшение хлороформа приводило к замедлении синтеза ОЭСЭ. вызванному ограниченной смачиваемостью просяной мучки.

ш. г/мл

Рис.3. Зависимость ^^Чг от отношения навески просяной мучки (г) к объему хлороформа (мл) - и.

Изучение ферментативного синтеза сложных эфиров на основе просяной мучки и возможностей его оптимизации привлекло внимание к исследованию Ферментной системы мучки. Цель дальнейших исследований - с помощью доступных и эффективных методов выделения и очистки получить ферментный препарат липазы из просяной мучки, способный осуществлять синтез сложных эфиров.

2. Получение препарата липазы из просяной мучки 2.1 Сравнительное изучение условий выделения и частичной очистки липазы из просяной мучки

При получении Ферментного препарата важная роль отводится условиям извлечения Фермента. Эффективность условий выделения и очистки липазы оценивали определением липолитической активности экстрактов и препаратов, полученных из просяной мучки, а также

остаточной синтетической активности осадков после экстракции из них белков.

Классическим способом выделения ферментов из семян, богатых липидами, является предварительное обезжиривание их с последующей экстракцией белков буферным раствором. Просяную мучку обрабатывали несколькими объемами холодного ацетона (-10°С) из расчета 500 мл ацетона на 100 г мучки. Результаты экспериментов показали (табл.2). что предварительное обезжиривание просяной мучки холодным ацетоном приводит к увеличению липазной активности в экстрактах в 2.7 - 3. 2 раза по сравнению с экстрактом из необезки-ренной. количество белка в экстрактах также повышается в 1.7 раза.

Таблица 2

Влияние обезжиривания просяной мучки холодным ацетоном и типа экстрагирующего буфера на липазную активность з экстрактах

Просяная мучка Вид буфера Уд. активность, мкмоль Ж/мг«час Белок, иг/ил

Необезжирен. 1/15 М фосфатный. рН 7.4 21 ± 3 2.0 ± 0.3

0. 025 М аммонийный, рН 9.1 23 ± 2 2.0 ± 0.3

Обезжирен. 1/15 М фосфатный. рН 7.4 35 ± 3 3.4 ± 0.1

0. 025 М аммонийный, рН 9.1 49 t 3 3.5 ± 0.2

Сравнение экстрагирующей способности фосфатного и аммонийного буферов показало, что липазная активность вьше в экстракте с аммонийным буфером (табл.2). Установлено. что 30-минутное настаивание просяной мучки с буфером при Ь = +4°С является достаточным для полного извлечения Фермента.

С целью эффективного использования просяной мучки были проведены последовательные экстракции и определены содержание белка и липазная активность в пробах (табл. 3). а также количество получаемых на разных стадиях экстракции сухих веществ (табл.4).

В результате последовательных экстракций аммонийным буфером выход белка из просяной мучки увеличился в 4.5 раза, удельная активность объединенного ферментного экстракта возрасла з 1.2 раза.

Таблица 3

Содержание белка и липазная активность о пробах, полученных на разных стадиях экстракции аммонийным буфером

; N окст- : Уд. активность. I Белок,

! ракции мкмоль 1К/мг»час__мг/мл

1 38 + 2 2.5 ± 0.2

2 57 + 9 1.3 + 0.4

3 77 + 5 1.28 + 0.14 1 70 :!: 7 0.6 л 0. 1

5 не определяется 0.17 титриметрич.методом I

6 ----------------------; 0.08

Таблица 4

Количаственная оценка получаемых на разных стадиях экстракции сухих веществ из просяной мучки (ПЮ

N экст- Содержание ■ Содержание 1 Содержание Отношение ' ракции сух.з-в. , сух. в-в. белка. белок/сухие _мг/г ПМ %_мг/г та в-ва. %

1 78 ! 36 7.1 9 ' |

2 88 ! 40 10.5 12 |

3 36 17 ; 7.4 1 21

; 4 ■ 17_|_8__[гз_!_16__|

Дальнейшее выделение фермента из осадка просяной мучки осуществляли с помощью тритона Х-100 и твина-80. используемых для экстракции липаз из масляничных семян других растений. Экстракцию прочносвязанных белков осуществляли при £ = +4°С в течение часа 0.025 М аммонийным буфером рН - 9.1, используя исследуемые детергенты в различных концентрациях. В супернатанте определяли липззную активность и содержание белка, а осадок сублимационно сушили и исследовали на остаточную этерифицирувдую активность с 1-'"С олеиновой кислотой и цетиловым спиртом.

Увеличение содержания белка при буфер тритона Х-100 (табл.5), а также

Таблица 5

Влияние тритона Х-100 на экстракцию белков просяной пучки

Содержание Содержание белка.

тритона.л(у/ч) мг/г ПМ - -

0.1 1.9

1.0 2.9 + 0.1

экстракт 1.4

добавлении в экстрагирующий' уменьшение этерифицирувщей активности осадков с ростом концентрации детергента свидетельствуют, что тритон Х-100 может быть использован для солюбилизаиии липазы просяной мучки. При использовании твина-80 такой зависимости

не обнаружено.'

Эффективность условий получения фермента, осуществляющего синтез сложных эфиров, оценивали сравнением этерифицирувщей активности обезжиренной просяной мучки и осадков, полученных в результате экстракции из нее белков (табл.6). Обнаружено, что с увеличением липазной активности экстрактов происходит уменьшение синтетической активности полученных осадков.

Таблица 6

Синтетическая активность препаратов просяной »лучки

Исследуемый \ Остаточная активность

препарат | шротов ПМ. %

1.Обезжиренная ацетоном ПН | 100

2.Шрот ПМ после экстракции буфером | 24

3.Шрот ПМ после экстр, тритоном X—1001 9

"Из-за необходимости применения дополнительной очистки препарата от детергента, вызывающего ингибирование липазной активности, мы ограничились следующими условиями получения ферментного препарата : 4х-кратной экстракцией 0.025 М аммонийным буфером рН 9.1 из обезжиренной просяной мучки путем 30-минутного настаивания при Ь = +4' С,

Проведено сравнение Фракционирования экстракта просяной мучки с помощью ПЭГ-6000 и сульфата аммония. При исследовании фракционирования ферментного экстракта просяной мучки с помощью ПЭГ-6000 было обнаружено, что с увеличением концентрации ПЭГ и времени формирования осадка липазная активность полученных фракций уменьшалась.

Фракционирование белков просяной мучки осуществляли с помощью сульфата аммония. Формирование осадка происходило в течение 40 минут при +4 С. Осадок отделяли центрифугированием при 10 ООО об/мин за 10 минут. Освобождение осадка от сульфата аммония осуществляли с помощью 18 часового диализа против воды.

Результаты исследования показали, что фермент с липазной активностью обнаружен во фракции, полученной высаливанием сульфатом аммония до 0.3 от степени насыщения (табл.7).

Таблица 7

Фракционирование белков просяной мучки сульфатом аммония

Степень насыщения (Ш^ ЭО^ Белок., мг/мл Уд. активность, мкмоль)КК/мг*час

о.о-о.з" 0.3-0.6 0.42 ±0.03 • 2.8 ± 0.6 215 г 14. 14 ± 3

экстракт 1.8 ± 0.1 54 ± 4

Таблица 8

Количество препарата (сухих веществ) и содержание в нем белка, полученного из грамма обезжиренной просяной мучки

Сравниваемые »препараты Содержание сух в-в, мг Выход, % Содержание белка, № Выход, ГГ /о

последовательные

экстракции 218 100 28 - 31 100

фракционирование

(НН^), БО^. 30% нас. 71 - 85 36 11 - 14 43

Таким образом, в результате фракционирования экстракта просяной учки сульфатом аммония (0.3 от степени насыщения) повысилась дельная активность препарата в 4 раза. выход ферментного репарата составил 36%, по белку - 43% (табл. 8). Достигнута 0-кратная степень очистки по сравнению с исходным экстрактом, олученныц из необезжиренной просяной мучки.

На основе экспериментальных данных предложена схема получения ерментного препарата с лппазной активностью 36 ООО мкмоль Ж на •препарата в час (рис.45, вктачаюшая следующие этапы:

ЭКСТРАКЦИЯ ЛИПИДОВ

Ацетоновый порошок"

ЭКСТРАКЦИЯ БЕЛКОВ

экстракт липидов ГМ в ацетоне

Объединенный экстракт

I

У

ФРАКЦИОНИРОВАНИЕ

Осадок-

Осадок

V

ДИАЛИЗ

I *

Супернатант (отбрасывают)

СУБЛИМАЦИОННАЯ СУШ 5ис.4. Схема получения ферментного препарата липазы из псосяной мучки.

2.2 Поиск оптимальных условий для определения липазной активности титркметрическим методом и исследование свойств липазы из просяной мучки

Предпосылкой использования липаз служит характеристика тех свойств, которые имеют значение лля применения в технологии: рН -зптимум. температурный оптимум. стабильность, существование

ингибиторов. (специфичность липаз и изменение этих свойств при иммобилизации или при переходе в обедненную водой систему. При исследовании этих свойств определению липазной активности отводится решающая, роль, которая оценивается как результат активности гидролиза триацилглицеринов с участием липаз.

При сравнении различных методов определения липазной активности показано (М. Ваг^гЮуЮй еъ а1.,19Э0), что титриметрический метод является самым подходящим для лабораторных исследований.

При выборе субстрата для определения липазной активности просяной мучки наивысшая активность обнаружена с подсолнечным маслом .по сравнению с другими'исследованными растительными маслами (оливковым, рапсовым,- горчичным).

При исследовании зависимости липазной активности от рН среды

Уд. активность.

мкмоль ¡КК/мг * ч ас -' ! [

, £5 гз 7.8 62 8.В 9.0,

фосфатный 0.1 н. трис-НС1 буфер 0.1 н.

рН среды

Рис.5. Влияние рН среды на липазнуга активность экстрактов из 1 - необезгсиронной просяной мучки: 2 - обезжиренной; 3 - ферментного препарата. •

в экстрактах просяной мучки было обнаружено наличие двух рН оптимумов: в нейтральной зоне при 6.8 в фосфатном буфере и в щелочной зоне при 8.0 в трис-НС1 буфере (рис.5).

Температура, при которой проводили определение липолитической активности, составляла 36 °С; при более высокой температуре наблюдалось расслоение эмульсии во время инкубации.

Установлено, что для липазы просяной мучки период времени, в течение которого сохраняется начальная скорость реакции, равен двум часам. За стандартное время инкубирования при определении липазной активности выбран 1 час, т.к. воспроизводимость результатов при этом времени наибслее. высокая (рис.6).

С.

н'А Ж а го

12 8 4

15 гл 2.5 вреда, часы

Уо. мМ ."Ж/час

Рис.7.

025 0,5 С.75 10

и, мг/мл Зависимость начальной

Рис. 6. Кривая хода ферментатив- скорости гидролиза (Уз) от конной реакции гидролиза. центрации ферментного препарата

(п) в реакционной смеси.

о

Установлено, что для определения липазной активности полученного ферментного препаратя титрнметрическим методом оптимальным является содержание препарата в реакционной смеси от 0.25 до 0.75 мг/мл, что соответствует количеству белка от 0.04 до 0.12 мг/мл (рис.7).

Обнаружено, что в процессе хранения ферментных экстрактоз при

комнатной температуре за 1.5 часа теряется от 30 до 40 % исходной активности липазы. В то :ке время не наблюдали уменьшения лнпазной активности экстрактов из просяной мучки в течение 20 часов хранения при температуре +4°С.

Проведено исследование влияния • поверхностно-активных веществ на липазную активность просяной мучки. Твин-80 и тритон Х-100 наиболее часто используются в качестве солюбилизаторов при экстракции липаз из масляничных семян, а также для очистки гидрофобных белков.' С целью делипидизации ферментов при их очистке применяется также дезоксихолат натрия. Показано активирующее влияние дезоксихолата На на липазную активность семян рапса при добавлении его в низких концентрациях (0.04% (и/у)) ' (Л. Иобш 1зсЬек, К. Тйе^сг. 1980).

Таблица 9

Влияние детергентов (ПАВ) на липазную активность просяной мучки

Тип ПАВ Содержание ПАВ Остаточная активность,%

твин-30, у/у) 0.1 66

1.0 16

4.0 0

тритон Х-100. ,5(у/у) 0. 02 79

0.06 37 •

0.2 7

дезоксихолат На. % (уг/у ) 0.04 75

0. 08 21

0.2 8

Установлено ингибирующее влияние на липазную активность просяной мучки исследованных детергентов. Ингибирующий эффект усиливался з ряду: твин-80. дезоксихолат натрия, тритон Х-100 (табл. 9). В целом, зависимость степени ингибирования липазы просяной мучки от концентрации твина и тритона аналогична установленной ранее для липазы рапса. Увеличения липазной активности в условиях наших опытов в присутствии дезоксихолата Ма не обнаружено, что свидетельствует об эффективности применения обезжиривания просяной мучки перед экстракцией из нее белков.

3. Исследование этерифицирущей способности ферментного препарата просяной мучки

Проведено сравнение этерифицирующей активности сублимациэнно ¿сушенных ферментных препаратов, полученных в процессе выделения очистки липазы просяной мучки: экстрактов из необезжиренной и 5езжире;'ной просяной мучки, после- отдельных стадий экстракции, зеле фракционирования сульфатом аммония и ПЭГ-6000. герифицирующую активность исследуемых препаратов определяли, юпергируя их в .гексане, и оценивали степень конверсии юобразованной 1- "С олеиновой кислоты в цетилолёат в 1. гакционная среда (2мл) содержала: 50 мМ меченой олеиновой «слоты, 75 мМ цетилого спирта, 100 мг ферментного препарата, • 1спергирооанного в гексане, молекулярные сита l'A.

Обнаружено, что этерифицирущей активностью обладают эрментные препараты, полученные в результате, избирательной сстракции (препарат I), после фракционирования сульфатом аммония 3 от степени насыщения (препарат II) и ПЭГ-6000,- 10% насыщения ipenapaT III). За 20 часов инкубации конверсия меченой олеиновой «слоты достигла следующих значений: 8% - z препаратом I, 26% - с »епаратом III и 81% - с препаратом II. В остальных сучаях знверсия равнялась нулю.

.Таблица 10

>авнение липолитической и этерифицирующей активности исследуемых препаратов

>авниваемые | Уд. /»«политическая А, » Уд.этерифицирующая A, i

>епараты i мкмольЖК/мг*час нмольЖК/мг*час

>епарат I ! 57 24

>епарат И ! 214 1400

Обнаружена корреляция между удельной липолитической стивностью и этерифицирующей способностью препаратов, полученных процессе очистки липазы (табл.10). Показано, что наивкспей герифицирующей активностью из исследуемых обладает препарат после наливания сульфатом аммония.

Реакционная среда для синтеза ОЗСЗ с участием ферментногс препарата липазы содержала: 50 мМ олеиновой кислоты, оксиэтилированный спирт АПМ-10 в соотношении к кислоте 1 : (моль/моль), 50 мг ферментного препарата, диспергированого е хлороформе, конечный объем - 1 мл. Инкубирование реакционны? смесей вели при 40°С в течение 5 суток, периодически отбирая пробь Обнаружение хроматографической , зоны', с ЯГ '= .0.7* свидетельствует об образовании. ОЭСЭ. На рисунке 8 (кривая 1) показана зависимость синтеза -ОЭСЭ от времени. Исходя иг кинетических измерений определено время равное 72 часам,

и начальная'скорость (V,,) этерифйкации олеиновой кислоты у оксиэтилированного спирта АЛМ-10, равная 0.8 мМ в час.

2

4

ico izo

время, часы

Рис.8. Кинетические кривые синтеза сложных эфиров по вариантам сравнения: 1 - оксиэтшияюванных на примере спирта с АЛМ-10 в •хлороформе: 2- цетилолеата в гексане при исходной концентрации олеиновой кислоты - 50 мМ и содержании ферментного препарата - 50 j

Для сравнительных кинетических исследований синтеза сложных эфиров в зависимости от природы вносимого спирта использовали цетиловый спирт. Установлено, что включение метки во время синтеза с цетиловьы спиртом происходит во фракцию сложных эфиров с Rf -

0.91. Анализ количественных изменений Фракций, обнаруженных с псмсшыо денситометрии. тагае показал, что синтезируемый цегилолеат накапливается в хроматографической зоне с Rf ='0.91. На рисунке 8 представлена кривая скорости образования цетилолеата при следующих условиях: реакционная смесь содержала 50 мМ олеиновой кислоты. 75 мМ цетилозого спирта, 50 мг Ферментного препарата, диспергированного в гексане. при температуре синтеза 400 С с постоянным встряхиванием. Установлено, что при этих условиях начальная скорость синтеза цетилолеата равна 10.7 мМ в час. ■

Результаты исследований синтеза 0ЭСЭ с помощью фермента, входящего в состав пгосяной мучки, показали, что при оптимальных условиях период полупревращения составил от 20 до 24 суток. Использование ферментного препарата липазы сократило период полупревращения жирных кислот до Зх суток, что позволило предложить обсуждаемый синтез для промышленного получения ОЭСЭ.

Изучение возможности получения комплекса липазы просяной мучки с поверхностно-активными веществами (ПАВ). Из литературы известно, что в условиях неводной среды ферменты, включенные в обращенные мицеллы, обнаруживает1 достаточную стабильность при проведении ферментативных реакций. Эффект увеличения липазной активности при добавлении лецитина сои установлзн для ферментного препарата Pseudomonas fluorescence в синтезе триацилглицерина в микроводных условиях (Kurasiiige et al., 1939). Рядом авторов осуществлена модификация ' липазы P-hizopus deleaar с помощью синтетических гликолипидсв в водном растворе (V.Tsuzuki et- al., 1991; Y.Ckahata. К.Jjiro, 1992). Полученный комплекс показал высокую этерифицнруюшую активность в бензоле по сравнению с другими известными способами использования липазы в реакциях синтеза, а также установлена возможность повторного ого использования.

С целью изучения влияния на активность ферментного препарата липазы просяной 1;.рчки с помощью поверхносгнс-активных веществ нами были исследованы следующие ПАВ: цереброзиды. эфнры пальмитата-стсарата сахаоозы 11, тритон WR-1339, L--1-лецитин, лаурилсаркозинат (Servo).

Предложен слсдусйий способ получения комплекса фермента с ПАВ: ферментный препарат просяной .мучки растворяли в трис-HCl буфере с

pH = 8.0, центрифугировали при 6000 оборотов в минуту 10 минут, полученный раствор смешивали с водной дисперсией ПАВ при соотношении ферментного препарата к ПАВ 1:1 (по Бесу) и оставляли на сутки с постоянным встряхиванием при +4°С, затем сублимационно сушили.

Полученные комплексы фермента с ПАВ показали разную этерифицирующую активность (табл. И), что свидетельствует об избирательном влиянии различных типов ПАВ на этот процесс. Из представленных результатов видно, что препараты липазы с тритоне -WR-1339, сахарозой пальмитат-стеарат 11 и цереброзидами обнаружили наибольшую синтетическую способность.

Таблица 11

Влияние поверхностно-активных веществ на этерифицирующую активность липазы просяной мучки

ПАВ Синтетическая А.

мкмоль Ж/г препарата * час

цереброзиды 21 ¿ 9

тритон WR-1339 22 ± 3

пальм, -стеао. сахарозы 15 i 1

лецитин 10 ± 3

лаурил саркозин 6 ± 1

Сравнение этерифицирующей активности ферментного препарата липазы и комплекса/ полученного в результате модификации его с пальмитат-стеарат сахарозой, показало, что степень этерификации комплекса фермента и ПАВ выше. При одинаковых условиях (50 мМ олеиновой кислоты, 200 мМ цетилового спирта и 100 мг препарата), конверсия олеиновой кислоты за 40 часов инкубации реакционных смесей составила 74% в случае использования полученного комплекса (при содержании в нем 50 мг ферментного препарата) и 27% - с исходным ферментным препаратом. Гидролитическая активность полученного комплекса в 2- 2.7 раз меньше исходной, установленной для ферментного препарата. Она составила 22 и 11 мкмоль ЖК на мг

елка в час для подсолнечного и оливкового масел при исходных начениях: 40 и 30 мкмоль ;Ш/мг в час, соответственно. В то зе ремя. исследуемый детергент не оказывал влияния на активность ипазы просяной мучки при добавлении его в инкубационную среду, то дает основание предположить возможность ' образования срментного комплекса эфира сахарозы с липазой просяной мучки.

ВЫВОДЫ

1. Разработан метод получения ферментного препарата, бладгющего липолитической активность». из просянсй мучки, ключащий обезжиривание просяной .мучки холодным ацетоном, кстрзкцию аммонийным буфером и фракционирование сульфатом '.«иония. В результате достигнута 10-кратная степень очистки, аполитическая активность ферментного препарата составляет 3 ООО мкмоль ЯК на г препарата в час.

2. Подобраны оптимальные условия для определения липазной стивности просяной мучки титриметрическим методом. Субстратом 1уяила эмульсия подсолнечного масла з ПВС. Наивысшие значения -тазной активности получены при рН, равном 8 О, I = 36°С, времени теубирсвакия 1 час, удержании ферментного препарата в закционной смеси от 0.25 до 0.75 мг/мл.

3. Изучены стабильность липазы из просяной мучки при различных :ловиях хранения экстракта и ингнбирующее действие зверхностно-активных зецестз. Ингибиружщий эффект усиливался з 1ду: теин-30. дезоксихолат Ма, тритон Х-100.

4. Впервые показана возможность получения оксиэтилирозанных южных эфиров ферментативным синтезом с участием липазы просяной 'чки з среде органического растворителя.

5. Осуществлен синтез ОЭСЭ на основе липидного комплекса юсяной мучки с целью его модификации. Установлено, . что ¡разевание ОЭСЭ осуществляется за счет реакции этериф-икации фных кислот и переэтернфнкацки слскных эфиров липидного 1мплекса просяной мучки.

С. Показана зависимость скорости ферментативной реакции от держания просяной мучки и концентрации реагирующих веществ,

варьируемых путем изменения в реакционной системе количест: органического растворителя.

7. Исследована этерифицирующая активность полученно1 ферментного препарата просяной мучки. диспергированного орсаническом растворителе. Подобраны условия для изучения кинетш процесса синтеза сложных зфироз с цетиловым спиртом и е! оксиэтилированным производным.'

8. Показана возможность образования комплекса липазы поверхностно-активными веществами на примере эфиров пальмитата-стеарата сахарозы 11, что нашло отражение в увеличен: зтерифициругсщей и снижении гидролитической активности полученно] комплекса в сравнении с исходным ферментным препарате:.! липазы.

Список опубликованных работ

1. Султанович ¡и. А.. Крюкоза Е.В., Лялина И. К. Разработ; биохимических и технологических основ получения липидн: комплексов, содержащих биологически активные соединения.- Сборн материалов по общей и прикладной химии, 24-29 мая 1993. Минск. 3, С. 258-259.

2. Лялина И. К. Получение препарата липаз из просяной мучки. Тези материалов конференции "Биотехнологическая модификац сельскохозяйственного сырья для производства пищевых продуктов М., Вороново, 13 апреля 1995, С. 96.

3. Лялина И.К., Султанович Ю.А. Исследование закономерное! ферментативного синтеза оксиэтилированных эфиров на оснс просяной мучки.- Прикладная биохимия и микробиология (в печати).

4. Лялина И. К. Получение препарата липазы из просяной мучки Прикладная биохимия и микробиология (в печати).