Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Разработка биохимических и технологических основ получения заменителей природных восков

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Разработка биохимических и технологических основ получения заменителей природных восков"

МИНИСТЕРСТВО НАУКИ, ВЫСШЕЙ ШКОЛЫ И ТЕХНИЧЕСКОЙ ПОЛИТИКИ РОССИИ

Московский технологический институт пищевой промышленности

На правах рукописи УДК: 663.15: 663.185.1

КРЮКОВА ЕЛИЗАВЕТА ВЯЧЕСЛАВОВНА

РАЗРАБОТКА БИОХИМИЧЕСКИХ И ТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ ОСНОВ ПОЛУЧЕНИЯ ЗАМЕНИТЕЛЕЙ ПРИРОДНЫХ ВОСКОВ

Специальность 03.00.23 - биотехнология

Автореферат ссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук

Москва - 1992

Работа выполнена в Московском технологическом институте пищевс промышленности.

Научный руководитель: доктор химических наук, профессор Ю. А. Султанович

Официальные оппоненты:- доктор" биологических наук, профессо

И. М. Грачева:

кандидат технических наук И. В. Штейн _

Ведущая организация: Научно-исследовательский проектно-конструкторский институт прикладной биохимии

Автореферат разослан ". _" 1992 г.

Защита состоится " 199^ г. на заседани

Специализированного совета К. 063.51.04 Московского технологически института пищевой промышленности по адресу: 125080, Москва, Волоко ламское ш., 11.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института.

Ученый секретарь Специализированного совета, кандидат технических наук, доцент

А. И. Садова

•Л. , ...¡г.мЯ ; .- .;«{ Мйч'^^'П'.и -............■

■ I -

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Одним из перспективных направлений био-эхнологии является использование ферментов для синтеза различных )единений, в том"числе и поверхностно-активных.

Сложные эфиры жирных кислот (СЭЖЮ, представляющие собой не-шогенные поверхностно-активные вещества, широко используются в пличных отраслях промышленности в качестве эмульгаторов, диспер-1Торов, пластификаторов, стабилизаторов и др. Для их получения зработан ряд способов: химических (гомогенный катализ, гетероген-й катализ, катализ в присутствии азеотропообразующего соединения) микробиологических. Однако эти способы имеют существенные недос-тки. Так, при химическом синтезе сложных эфиров реакция идет при сокой температуре, повышенном давлении, в присутствии катализато-(чаще всего концентрированной кислоты). Использование микрооргазмов как продуцентов эфиров нецелесообразно из-за крайне низкого кода целевого продукта. Чащо используют реакции этерификации и >еэтерификации, катализируемые липазами и протекающие в растворе, гако этот способ синтезаСЭ1К требует достаточно трудоемкого (еления фермента и его тщательной очистки.

Поэтому представляется ванным изучить возможность биохимическо-синтеза СЭ1К, при котором используется фермент, локализованный сте с одним из субстратов непосредственно в растительном обьек-

Цель работы. Настоящее исследование посвящено разработке биохи-еских и технологических основ получения липидного комплекса -анителя природных восков, одним из основных компонентов которого шотся сложные эфиры жирных спиртов и «ирных кислот.

Научная новизна. Впервые установлена принципиальная возможност осуществления способа биохимического синтеза СЭЖК, при которо фермент и один из субстратов (жирные кислоты) локализованы в расти тельном объекте (просяной мучке). Изучено влияние строения спирт (числа углеродных атомов, положения гидроксильной группы, разветв ленности углеводородного радикала).и условий проведения фермента тивкой реакции этерификации на ее скорость.

Практическая значимость. Разработана технология получения ли пидного комплекса для косметической промышленности. Синтезировании продукт прошел испытания в рецептурах косметических кремов в качес тве заменителя природных восков (ланолина, воска пчелиного и спер мацета) и некоторых других компонентов. Он продемонстрировал хоро шие структурообразующие свойства, способствовал повышению стабиль ности эмульсий. Разработаны и утверждены технические условия н опытно-промышленную партию липидного комплекса для косметическо промышленности (ТУ 8 РФ 11-125-92) и аппаратурно-технологическа схема и маршрутная технология его получения.

Реализация результатов работы. На Пензенском комбинате медицин ских препаратов "Биосинтез" по разработанной технологии произведен наработка опытной партии липидного комплекса на основе просяно мучки. Получено заключение медико-биологической экспертизы Институ та красоты о возможности использования липидного комплекса в косме тических кремах. На фабрике "Свобода" проведены испытания продукт в качестве заменителя восков в рецептурах косметических кремов.

Апробация,работы. Результаты работы были доложены на конферен ции, посвященной 60-летию 1ЯИПП (Москва, 1991 г. ), на ХХХХ1У науч ко-технической конференции ЛТИХП (Санкт-Петербург, 1991 г. ) и на Всесоюзной конференции молодых специалистов в области прикладно

• J. "

юматографии (г. Нижний Новгород, 1992 г.).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 10 печатных бот, в том числе 1 авторское свидетельство.

Объем и структура рабогы. Диссертация состоит из введения, зора литературы, описания объектов и методов исследования, экспе-кектальной части (5 глав), выводов, библиографического указателя 134 наименований источников). Работа изложена на 135 страницах шинописного текста, включает в себя 29 таблиц и 13 рисунков.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Сырьем для получения СЭЖК служила просяная мучка - побочный гдукт переработки проса в пшено, состоящий из частиц зародыша, ахмалистой пыли, обломков плодовых и семенных оболочек. Просяная пса характеризуется высоким содержанием липидов (до 20% на абсо-*но сухое вещество).

Для 5 партий просяной мучки, полученных в разное время с Орен-ircKoro комбината хлебопродуктов № 2, определяли фракционный и iho-кислотный составы липидов, а также содержание жирных кислот в продукта.

Фракционный состав? липидов просяной мучки определяли методом кослойной хроматографии на пластинках "Силуфоя" в системе раст-ителей гехсан : диэтиловый эфир : уксусная кислота (80:20:1). Он дставлен следующими группами: полярные липиды + моноацилглицери-(ПЛ ♦ МАГ), диацилглицерины (ДАГ), свободные жирные кислоты ), триацилглицерины (ТАГ), воски, зфнры стеринов и углеводороды >. В зависимости от партии и сроков хранения мучки содержание Зоднызс ЖК колебалось от 35. до 50Х ТАГ - от 14 до 35'/..

Жирно-кислотный состав лшшдов просяной мучки, определенный методом газс-аидкостной хроматографии, был представлен следующими основными кислотами: С16 0 --13-17%, (J8¡1 - до 1%, GJ8,t - 1—2%. С18;1 - 19-25%, q8:2 - 57-61%, Сй;4 - 1-3%.

Методом газо-жидхостной хроматографии с внутренним стандартом определили содержание жирных кислот в 1 г просяной мучки. В зависимости от партии оно колебалось от ИЗ до 160 иг/г. составляя в среднем 120 мг/г.

Яипазная активность в просяной мучке составляла 230-300 ед. /г. Ее определяли модифицированным методом Ота (1966). В качестве субстрата использовали 40%-ув эмульсию подсолнечного масла в 2%-ом растворе поливинилового спирта. За единицу липаэной активности принимали к<~чичество фермента, освобождающего 1 мкМ жирных кислот в течение 1 ч при 37°С.

Другим реагентом, для биохимического синтеза СЭХК служили высшие жирные спирты фракции (ТУ 8-35-5139-81) производства Уфимс-

кого нефтеперерабатывающего завода. Их анализ на газовом хроматографе дал следующий состав (в У. от суммы): С14Н,д ОН - 1.5, (j5 ОН - 1.7, С1вН,з ОН - 57.3, <}7'Л„0Н - 2.9, Н^ОН - 28.0, С^ Н^ОН -1.1. С^ ОН - 7.5.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИИ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Изучение процесса биохимического синтеза СЭЯК и низкомолекулярных одноатомных спиртов

С целью- установления принципиальной возможности биохимического синтеза СЭЖК был поставлен следующий опыт. 50 г просяной мучки помещали в коничесхую колбу со шлифом вместимостью 200 мл, добавля-

ли этилового спирта до полного смачивания мучки 0.75 мл/г) и тщательно перемешивали. Реакционную массу инкубировали при комнатной температуре на механической качалке, периодически отбирая пробы. Липиды экстрагировали смесью хлороформ-этанол (2:1). Фракционный состав липидного экстракта исследовали с помощью тонкослойной хроматографии.

После инкубирования реакционной смеси в липидном экстракте было обнаружено новое вещество, отсутствующее в спектре липидов просяной мучки и характеризующееся 79. Оно было идентифицировано как

этиловые эфиры жирных кислот, что подтверждено результатами хрома-то-масс-спектрометрии. При этом происходило снижение массовой доли фракций ЖК и ТАГ. Таким образом, в реакцию этерификации с этиловым спиртом под действием содержащегося в мучке фермента вступали не только свободные ЖК, накопленные в мучке до инкубирования реакционной смеси, но и кислоты, образующиеся при гидролизе ТАГ в процессе инкубирования.

Изучали влияние числа углеродных атомов в спирте на скорость реахции этерификации. Для этого использовали следующие нормальныэ спирты: метиловый, этиловый, пропиловый, бутиловый и гептиловый. Реакционные смеси выдерживали при комнатной температуре в течение двух месяцев, отбирая пробы для экстракции и последующего изучения фракционного состава липидов. • -

Результаты по синтезу СЭЖК нормальных спиртов представлены в табл. 1. Из данных таблицы видно, что время инкубирования реакционной смеси существенно влияет на уровень синтеза сложных зфиров.

Для характеристики процесса синтеза СЭЖК использовали величину начальной скорости реакции у0. Ее вычисляли как тангенс угла наклона кривой зависимости концентрации СЭ в липидном экстракте от Ере-

мени в интервале, когда эта функция имела линейный характер.

Таблица 1

Влияние числа углеродных атомов в спирте на биосинтез СЭХК

Время инкубирования, сут. Содержание фракций, в мольных долях (и. д.) £?д./ сут.

жирные кислоты сложные эфиры

Синтез метиловых эфиров

5 14 0.510 0. 470 . 0.180 0.210 0.036 .

63 0.560 0. 290

Синтез этиловых эфиров

5 14 0.286 0.155 0.465 0. 687 0.093

63 0.069 0. 874

Синтез пропиловых эфиров'

5 14 0.388 0.299 0.411 0. 513 0. 082

63 0.121 0. 748

Синтез бутиловых эфироа

5 14 0.38В 0.200 0. 431 0. 482 0.086

63 0.148 0.653

- Синтез гептиловых эфиров

5 14 0.442 0.137 0.345 0.742 0. 069

63 0. 075 0.827

Установлено, что скорость ферментативной реакции этерификации ЖК просяной мучки нормальными спиртами слабо зависела от числа

углеродных атомов в спирте (табл. 1). Исключение составила реакция с метанолом, что можно, вероятно, объяснить частичной инактивацией фермента.

При анализе жирно-кислотного состава синтезированных эфиров было установлено, что он практически не отличается от состава ЖК липидов просяной мучки. Этот факт свидетельствует о неселективном включении кислот мучки в состав образующихся сложных эфиров.

Исследовали влияние разветвленности углеводородного радикала и положения гидроксильной группы одноатомного спирта на процесс синтеза СЭ. Скорость реакции этерификации ЖК н-пропиловым спиртом (первичный) оказалась в среднем в два раза выше, чем изо-пропиловым (вторичный). Скорость реакции с первичными бутиловыми спиртами (н-бутиловый и изо-бутиловый) была в два раза выше скорости реакции с участием третичного бутилового спирта. Эти данные хорошо согласуются с правилом Меншутхина для химической реакции этерификации, для которой характерна тенденция уменьшения скорости реакции в ряду первичный спирт - вторичный спирт - третичный спирт. Однако для ферментативной реакции этерификации она выражена менее явно.

> Установлено, что строение радикала (раэветвленность его) в ряду первичных спиртов не влияет на скорость ферментативной реакции этерификации.

2. Биохимический синтез СЭЖК и высших жирных спиртов

Данные, полученные при изучении закономерностей биохимического синтеза СЭЖК и низкомолекулярных спиртов, позволили предположить, что аналогичным образом могут быть получены и эфиры высокомолекулярных спиртов.

■ Изучали возможность биохимического синтеза СЭЖК и высших жирных

-а -

спиртов фракции Си*^0 (ВИС). Для этого 5 г ВЖС растворяли в 100 мл гексана, добавляли 50 г просяной мучки и тщательно перемешивали. Смесь инкубировали в течение 21 суток при комнатной температуре, периодически отбирая пробы. Анализ фракционного состава показал, что в липидном экстракте появилось новое вещество о 85-0.87, которое и было идентифицировано Как СЭЖК. Содержание ЖК и ТАГ при этом значительно снизилось.

Поскольку полученные эфиры представляют значительный практический интерес как индивидуальные неионогенные поверхностно-активные вещества, так и основной компонент природных восков, была поставлена задача изучить влияние условий проведения реакции. этерификации на ее скорость.

2.1. Влияние соотношения жирных кислот в просяной мучке и высших жирных спиртов на биосинтез сложных эфиров

Для изучения влияния соотношения ЖК в просяной мучке и ВЖС на биосинтез сложных эфиров готовили 5 образцов реакционной смеси, в которых количество просяной мучки было одинаковым, а спирты в виде гексанозого раствора добавляли в таком количестве, чтобы молярное отношение ЖК : ВЖС было равным 1:0.5, 1:1, 1:1.5, 1:2 и 1:3.

Анализ фракционного состава липидов, выделенных из реакционной смеси на различных стадиях синтеза, показал, что при всех соотношениях сзерх эквимолярного интенсивность накопления эфиров примерно одинакова. При зквимолярнои и меньшем соотношении ЖК и ВЖС за одинаковое время образовывалось значительно меньше эфиров, а количество свободных* ЖК и ТАГ снижалось не столь значительно.

Таким образом, наиболее целесообразным следует считать использование молярного соотношения ЖК : ВЖС, равного 1:1.5.

2.2. Влияние количества гексана, используемого для растворения

высокомолекулярных спиртов, на биосинтез сложных зфиров Известно, что этерификацию с помощью иммобилизованной липазы южно проводить в среде органического растворителя, облегчая таким »бразом диффузии субстратов.

Для приготовления реакционной смеси применяли гексан в различна: количествах: 1) использовали минимальное количество гексана, ;остаточное только для полного смачивания мучки; 2) использовали :роизвольное количество гексана, которое после приготовления реак-ионной смеси удаляли путем вакуумной отгонки: 3) готовили 60%-ую успензию просяной мучки в гексане: 4) готовили 40%-уо суспензию росяной мучки в гексане. Образцы реакционной смеси инкубировали ри комнатной температуре.

Анализ результатов эксперимента показал, что интенсивность интеза• СЭЖК не зависит от того, в каком количестве растворителя вносятся ВЖС на просяную мучку. Однако удалять растворитель путем акуумной отгонки нецелесообразно, так как это увеличивает энерго-атраты и усложняет процесс. Поэтому при проведении лабораторного интеза следует использовать минимальное количество растворителя, остаточное для полного смачивания мучки и равномерного нанесения пиртов. При реализации разрабатываемой технологии в заводских гловиях удобнее применять 4055-ую суспензию просяной мучки в гекса-э, что облегчает транспортировку реакционной смеси по технологи-гсхой линии. 1

Гексан - не единственный растворитель, который был испытан на гадии приготовления реакционной смеси. Для этой цели использовали гиловый, додециловый, изоиропиловый спирты и. хлористый метилен, ¡возможность использования этилового спирта объясняется тем. что

происходил конкурентный синтез этиловых эфиров ХК и в конечно» продукте содержалась смесь эфиров низко- и высокомолекулярных спиртов. Аналогичная•картина, но выраженная менее ярко, наблюдалась при использовании изопропилового и додецилового спиртов. В хлористом метилене, хорошо раствор;.дщем ВКС, реакция не протекала, что связано, вероятно, с инактивацией фермента.

2. 3. Влияние .температуры на биосинтез сложных эфиров '

Для изучения влияния температуры на реакцию этерификации жирных кислот просяной мучки высокомолекулярными спиртами готовили 6 образцов реакционной смеси, • которые инкубировали в течение 7 суток при следующих температурах: -5, +6, +23, +30, +40 и +67°с. В табл. 2 представлены результаты биосинтеза СЭЖК при разных температурах.

Наиболее энергично синтез эфиров происходил при +30°с. Уже через 1 сутки содержание их в липидном экстракте достигло 70%, а количество ЖК уменьшилось до 20X. Накопление эфиров при +23 и +40°с происходило несколько медленнее (60 и 53% после первых суток, соответственно). Повышение температуры до +67°с резко замедлило процесс биосинтеза, что связано, вероятно, с денатурацией фермента.

Для количественного сравнения скоростей ферментативной реакции этерификации в различных температурных режимах использовали величину константы скорости реакции. Для этого определяли порядок реакции методом подбора кинетического уравнения. К экспериментальным данным применили уравнение кинетики 1-ого порядка. Хорошее совпадение (в пределах 950 расчетных значений констант скоростей реакции во всем диапазоне изменения концентрации ЖК для всех исследованных температурных режимов свидетельствовало о правильно выбранном уравнении для описания кинетики реакции. Об этом же свидетельствовала линей-

Таблица 2

Влияние температуры на биосинтез СЭЖК

Время инкубирования, сут. Содержание фракций, б % от суммы

ПЛ + МАГ ДАГ кк ТАГ СЭЖК УВ

-5° С

0.5 1 2 3 5 14.3 13.9 14.2 19.0 20.7 10.2 9.4 9.1 12.0 13.7 45.0 40.4 33.8 25.7 17.6 12.9 8.2 7.7 4.0 3.8 14.3 , 25.2 32.436. 6 41. 3 3.3 2.9 2.8 2.7 2.9

+6° С

0.5 1 , 2 3 5 14.0 7.0 2.6 8.8 8.4 8.9 3.5 1.9 3.0 6.8 40.0 31.8 22.2 12.8 5.9 12.5 10.4 4.5 2.8 сл. 22.0 45.5 66.7 70.4 75.7 2.6 1.9 2.1 2.2 3.2

♦23°С

0.5 1 2 3 5 15.2 7.1 3.5 3.1 6.9 6.9 4.8 0.8 0.3 0.5 33.2 23.3 9.5 4.9 0.9 9.8 2.9 сл. сл. сл. 32.2 60.0 84.3 89.3 89.9 2.7 1.9 1.9 2.4 1.8

+30с »С

0.5 1 2 3 5 6.2 1.2 0.5 2.8 5.3 3.2 0.6 0.4 0.8 0. 7 32.2 20.8 9.2 • 3.5 0.6 9.4 1.4 сл. сл. сл. 47. 9 73.6 88.0 90.5 31.6 1.1 2.4 1.9 2.4 1.8

+40°С

0.5 1 2 3 ' 5 13.4 11.2 2.1 7.1 5.5 6.0 5.3 0.3 0.7 1.8 35.7 23.8 10.9 4.5 1.6 10.3 4.6 0.8 сл. сл. 32.1 52.9 83.4 85.3 89.9 2.5 2.2 2.5 2.4 1.2

' +67°С

0.5 1 2 3 5 18.1 15.1 16.3 19.2 15.1 10.0 7.7 9.7 7.0 11.8 48.5 47.2 44.7 41.2 36.6 9.9 7.3 7.1 7.1 6.8 11.3 19.9 20.1 22.5 27.1 2.2 2.8 2.1 3.0 . 2.6

ность всех кривых, представляющих собой зависимость логарифма текущей концентрации одного из субстратов (ЖК) от времени (рис. 1).

Проведенные исследования показали, что синтез эфиров наиболее активно происходил при +30°с. Однако отличия в скоростях реакции при оптимальной и комнатной температурах столь незначительны - ~9% - (рис. 2), что для промышленного использования можно рекомендовать комнатную температуру.

Рис. 1. Зависимость логарифма текущей концентрации КК от времени в различных температурных интервалах: □ - -5°С: Д -+6°С: • - +23РС; V - +ЗСР С: х - +4(Я С: о - +67° С. Рис. 2. Зависимость константы скорости реакции от температуры.

2.4. Влияние рн среды на биосинтез сложных эфиров С целью изучения влияния рн среды на процесс синтеза СЭКК готовили 5 образцов реакционной смеси с различными значениями рн: 2.1, 4. 5, 6. 8, 8.0 и 9. 8. Смеси инкубировали при комнатной температуре и интенсивном перемешивании. Периодически производили отбор проб и

К, ст.

-1

анализировали фракционный состав липидов.

На рис. 3 представлены результаты биосинтеза СЭЖК при- различных значениях'рн. Наиболее энергично синтезировались эфиры в нейтральной среде. Для всех других значений рн (как кислых, так и щелочных) характерно значительно меньиее относительное содержание фракции эфиров, а, следовательно, и более низкие значения константы скорос-

На основании полученных данных можно судить о том, что именно з нейтральной среде растительная липаза наиболее активно катализирует-синтез СЭИС."

2.5. Выбор растворителя на стадии экстракции липидов из

реакционной смеси Были проведены исследования по выбору растворителя для экстракции липидов из реакционной смеси.

Были испытаны следующие растворители: а) смесь хлороформ-этанол (2:1!; 6) гексак: «) изопропиловый спирт; г\ 80%-ый раствор изопро-пилового спирта в воде.

Для оценки полноты извлечения липидов из реакционной массы определяли остаточное количество ЖК в шротах после каждой из трех ступеней экстракции. Для этого использовали метод газо-кидкостной хроматографии с внутренним стандартом.

Наиболее полно извлекались липиды экстракцией смесью хлороформ-этанол (2:1) (табл. 3). Уже первая ступень экстракции снижала содержание ЖК в шроте в 2.5 раза. Несколько хуже экстрагировались липиды 80%-ым раствором изопропилового спирта в воде.

Установлено, что фракционный состав липидов, извлекаемых из реакционно? смеси различными растворителями, практически не отличался друг от друга.

Таблица 3

Содержание Ж в шротах (в мг/г) после экстракции различными растворителями

^Растворитель Ступень4^. экстракции^. Хлороформ-этанол (2:1) Гексан Изопропиловый спирт 8054-ый раствор изопропилового спирта в воде

1 24.2 - 54.7 49.6 36.6

2 6.5 27.3 22.5 12.2

3 3.0 19.3 15.9 7.5

3. Исследование химического* состава и физико-химических свойств

липиднбго комплекса В зависимости от условий и времени инкубирования реакционной смеси состав образующегося липидного комплекса может быть различ-

ным. В табл. 4 приведена динамика фракционного состава липидов, полученных из реакционной смеси, инкубированной при комнатной температуре и'pH 5.8. Соотношение КК и ВЖС составляло 1:1.5.

Таблица 4

Динамика фракционного состава липидного комплекса

Время инкубирования, сут. Содержание фракций. в % от суммы

ПЛ * МАГ ДАГ ЖК' ТАГ СЭ УВ

0.5 15.2 6.9 33.2 10.8 32.2 1.7

1 7.1 4.8 23.3 2.9 60. 0 1.9

2 3.5 0.8 9.5 сл. 85.3 0.9

5 6.9 0.5 .0.9 сл. 90.9 0.8

7 ' 4.7 0.8 сл. - 92.7 1.8

Экстрагируя липиды из реакционной смеси в различные промежутки времени можно получить комплекс, содержание СЭЖК в котором будет колебаться от 30 до 90%. Если необходимо обеспечить максимальный выход эфиров, то, как видно из табл. 4, реакционную смесь следует выдерживать не менее недели.

Если рассматривать фракционный состав липидного комплекса, образующегося через 12 часов после начала реакции, то можно заметить, что он имеет значительное сходство с составом природных вос-ксв, в частности ланолина, а именно: примерно равные количества сложных эфиров, ЖК и ВЖС (по 30%), наличие небольших количеств ТАГ. и углеводородов, присутствие полярных липидов.

Изучали жирно-кислотный состав выделенной'с помощью колоночной хроматографии фракции СЭ, липидного комплекса с содержанием эфиров "30% (12 часов выдержки) и сравнивали их с составом липидов просяной мучки. Из данных табл. 5 видно, что жирно-кислотные составы всех трех образцов практически одинаковы, что свидетельствует 6

у

том, что при биохимическом синтезе СЭЖК наблюдается неселективное включение ЖК просяной мучки в состав эфиров.

Таблица 5

Изучение селективности включения Ж в состав СЭЯИ

Жирные кислоты Содержание кислот, в % от суммы

липидный комплекс липиды просяной мучки

16:0 17. 4 13.2 15.9

16:1 - сл. 0.8

18:0 1.3 1.5 1.7

18:1 21.2 23.1 19.7

18:2 57.9 60.3 58. 7

18:3 2.2 1.9 2.6

С целью уточнения состава было проведено хромато-масс-спектрометрическое исследование образца липидного комплекса. Разделение компонентов пробы проводили на капиллярной колонке "Ультра-2" в виде метиловых эфиров.

Состав липидного комплекса 'представлен в табл.- 6. В начале хроматограммы были расположены спирты, остаточные кислоты и углеводороды. Вторая половина хроматограммы начиналась с компонента, структуру которого установить не удалось, но содержание его не превышало 2.41'/,. Далее следовали эфиры длинноцепочечных спиртов и ХК.

Сравнивая состав исходных ВЖС с составом синтезированных эфи-ров, сделали вывод о неселективном включении спиртов в состав СЭ£К.

Было определено содержание биологически активных веществ в синтезированном комплексе. . Показано, что он содержит Некоторое

Таблица 6

Хромато-масс-спектрометрический анализ липндного комплекса

№ Копонент %

1 1.12

2 С10 спирт 31.72

3 С1в:0 1.15

4 с20 \г 1.33

5 С13 спирт + С13:1 + 98:2 22. 49

6 СггЧ:в 1.04 2. 84

7 Сго спирт

8 М 440 2. 41

9 2 эфиров С18:( с (J4 спиртом (М480, 478,476) 0. 82

10 S эфир ClS;0 с qs спирт 2.64

И ~12 2 эфиров С18„ с (JB спиртом (М504,506,508) 22. 01

S эфиров C18¡, с (Ja спиртом (М532,534,536) ■ 8. 43

13 2 эфиров С18„ с спиптом (М560, 562,564) 2.00 '

оличество каротиноидов (0.6 иг'/.), в том числе 0.2 нг% (3-каротина, : значительное количество а-.токоферола (300 иг%), что характеризует ипидный комплекс как препарат, обладающий хорошими антиоксидантны-и свойствами. '

Поскольку просяная мучка может быть загрязнена вредными продук-ами промышленного и естественного происхождения, которые могут опасть в конечный продукт, в образце липидного комплекса определя-и содержание микотоксинов, афлатоксинов. хлорорганических пестици-ов и полихлорированных бифенилов. Зеараленон, вомитохсин и афла-эхсюш В1, Б2. С1 и С2 не были обнаружены. Содержание хлороргани-эсхих пестицидов (линдан и его изомеры - 0.0042 мг/кг, ДДТ и сумма

метаболитов - 0.012 мг/кг) и полихлорированных бифенилов (сумма -0.0012 мг/кг) не превышало ПДК, утвержденных для пищевых продуктов.

Изучали некоторые физико-химические свойства липидного комплекса с содержанием СЭ с ЗОх. Липиды предварительно перерастворяли в гексане сvпоследующей отгонкой растворителя для очистки образца oí нелипидных примесей.

Поверхностное натяжение растворов липидного комплекса определяли методом наибольшего давления газовых пузырьков и методом втягивания и отрыва пластины. На рис. 5 представлены графики зависимости поверхностного натяжения растворов липидного комплекса и олеиновой кислоты от концентрации растворов. Установлено, что с увеличением концентрации поверхностное натяжение растворов липидного комплекса уменьшается.

Критическую концентрацию мицеллообразования (ККМ) определяли оптическим методом на спектрофотометре "Спекорд М-40" в УФ и видимой частях спектра. Величина ККМ для липидного комплекса (рис. 6) оказалась чуть ниже .(0.03%) этой величины для олеиновой кислоты (0.04%).

Эти. данные позволяют »охарактеризовать липидный комплекс как

продукт, обладающий хорошими поверхностно-активными свойствами. *

4. Испытания липидного комплекса в рецептурах косметических кремов

Результаты, полученные при исследовании химического состава и физико-химических свойств липидного комплекса (ЛК), позволили предположить возможность его использования в качестве заменителя природных восков.

ЛК вводили в рецептуру крема "Балет" жидкий как заменитель

Рис. 5. Зависимость поверхностного натяжения растворов липидно-го комплекса (□) и олеиновой кислоты (Л) от концентрации. Рис. 6. Зависимость оптической плотности растворов липидного . комплекса (□) и олеиновой кислоты (Д) от концентрации.

ланолина безводного (полная замена - 1%). Поскольку помимо основного компонента (сложных эфиров жирных кислот) продукт содержит до 14У. полярных липидов, снижали концентрацию альфа-лецитина в два раза (с 1.5 до 0.75*/.).

Установлено, что контрольный и опытный образцы крема по основным органолептическим (внешний вид, -консистенция, цвет, запах). и физико-химическим (рН, коллоидная стабильность, термостабильность, вязкость) показателям полностья соответствуют ТУ на данный вид иделия.

Положительные результаты испытаний позволили предположить воз-южность расширения спектра заменяемых полупродуктов. Так, в рецеп-Тру крема "Флора" ЛК вводился в качестве заменителя не только

ланолина безводного (полная замена - 1%), но и оксиэтилированногс ланолина, воска пчелиного и сорбитанолеата (полная замена - по 1%). Контрольный и опытный образцы по основным показателям соответствовали ТУ на данный вид крема.

Проведенные исследования показали, что ЛК при введении его I рецептуры косметических кремов способствует повышению стабильност! эмульсий и проявляет хорошие структурообразующие свойства. Он позволяет заменить крайне дефицитное природное сырье - животные воски, потребность в которых удовлетворяется в настоящее время в основно). за счет импорта.

Б диссертации приведены акты испытаний ЛК в рецептурах косметических кремов, проведенных на фабрике "Свобода".

5. Технологические аспекты получения липидного комплекса

На основании полученных данных была разработана технологи* получения ЛК для косметической промышленности. Основная технологическая схема, представленная на рис. 7, состоит из двух основныл блоков: реакционного и экстракционного. С целью расширения ассортимента косметической продукции в технологическую схему может быть включен третий (кристаллизационный) блок, позволяющий получить ,твердую и жидкую фракции ЛК.

Технология производства липидного комплекса является безотходной. Шрот,' образующийся после экстракции липидов из реакционной массы, может служить компонентом комбикормов.

Был изучен аминохислотный состав шрота. Установлено, что по основным аминокислотам он практически не отличается от состава просяной мучки, широко используемой в качестве ценного компонента комбикормов.

вжс

■ 21 .-гаксан

А V

С5-2 рр-3

Рис. 7. Технологическая схема получения липидного комплекса для косметической промышленности: Р-1 - реактор: Сб-2 - сборник для ■ексана; РФ-3 - емкостной фильтр с мешалкой; Сб-4 [ромеауточный сборник;. К-5 - выпарной куб с теплообменником; 'б-б - сборник кубового остатка; Т-7 - конденсатор паров ексана.

В табл. 7 представлены показатели, введенные в технические условия на липидный комплекс для косметической' промышленности.

Таблица 7

Показатели, характеризующее липидный комплекс для косметической промышленности и введенные в ТУ

Наименование показателя Характеристика

Внешний вид и запах Воскообразная масса светло-желтого цвета с приятным крупяным запахом

Температура плавления, °с 28-34

Кислотное число, мг кон на 100 г не более 10

Число омыления, мг КОН на 100 г не менее 80

кассовая доля влаги и летучих веществ. У, не более 1

На Пензенском комбинате медицинских препаратов "Биосинтез" произведена наработка-опытной партии липидного комплекса для косметической промышленности на основе просяной мучки.

В Институте красоты проведены медико-биологические испытания продукта. Показано, что он не оказывает общетоксического воздействия, отсутствует раздражающее и аллергизируицее действие, препарата. Липидный комплекс разрешен к использованию в косметических кремах. Заключения Института красоты и заместителя Главного санитарного врача России представлены в приложении к диссертации.

ВЫВОДЫ

1. Впервые доказана принципиальная -возможность биоуинмчжхого

синтеза сложных эфиров жирных кислот низко- и высокомолекулярных спиртов на основе липидов просяной мучки.

2. Изучено влияние строения углеводородного радикала одноатомных низкомолекулярных спиртов на скорость ферментативной реакции этерификации жирных кислот просяной мучки. Показано, что число углеродных атомов в спирте мало влияет на скорость, реакции. Скорость ферментативной реакции этерификации жирных кислот первичными спиртами в два раза превышает скорость реакции с участием вторичных и третичных спиртов.

3. Установлено, что максимальная скорость ферментативной реакции этерификации жирных кислот высшими жирными спиртами может быть достигнута при соотношении жирных кислот в просяной мучке и высших жирных спиртов, равном 1:1.5, температуре +30? С, pH В. § и использовании 40%-ой суспензии просяной мучки в гексане.

4. Выявлено неселективное действие фермента по отношение к жирным кислотам и жирным спиртам при включении их в состав эфнров.

5. Синтезированный на основе просяной мучки липидный комплекс близок по содержанию основных компонентов к ланолину и кроме того содержит биологически активные Бещества, в том числе витамин Е, ß-каротин и сумму каротиноидов. v

6. Синтезированный липидный комплекс обладает хорошими поЕерх-ностно-ахтивными свойствами. Величина ККМ составляет 0.03%, oQ 1У_ = 65»10"3 Н/м. "

7: Показана возможность использования липидного комплекса в качестве заменителя природных восков в рецептурах косметических кремов.

8. Разработана технология производства липидного комплекса для косметической промышленности и проведена наработка опытной

партии.

9. Технология производства липидного комплекса является безотходной. Ырот, образующийся после экстракции липидов из реакционной

массы, может служить компонентом комбикормов.

Материалы диссертации опубликованы в работах:

1. Крюкова Е. В., Султанович Ю. А., Колесник Г. Б., Афанасьева Г. А. Разработка технологии получения заменителей природных эмульгаторов с использованием отходов крупяного производства // Научное обеспечение хранения и переработки растительного сырья в пищевой промышленности. Тезисы докладов научной конференции, посвященной

. 60-летию МТИПП, часть 1. - М., 1991. - С. 160-161.

2. Султанович 0. А., Крюкова Е. В., Колесник Г. Б. Способ получения сложных эфиров жирных кислот // Положительное решение о выдаче авторского свидетельства по заявке № 4949940/13 от 26.06.91 г.

3. Султанович Ю. А., .Крюкова Е. В., Виток Л. А. Биохимический синтез сложных эфиров высших жирных спиртов и жирных кислот. I. Подбор условий проведения .биосинтеза // Биотехнология. - 1993. - № 1 (в печати).

4. Султанович Ю. А., Крюкова Е. В., Лукьянов А. Б., Купцова 0. А. Биохимический синтез сложных эфиров высших жирных спиртов и .жирных кислот. II. Влияние температуры на биосинтез // Биотехнология. - 1993. - № 1 (в печати).

5. Крюкова Е. В., Султанович С. А., Свешникова Н. В., Андрианова В. А. Биохимический способ получения сложных эфиров жирных кислот // Прикладная биохимия и микробиология. - 1993. - Т. 29. № 2 (в печати).

6. Крюкова Е. В., Султанович Ю. А., Афанасьева Г. А.. Тонкослойная хроматография как метод контроля кинетики синтеза сложных эфиров

жирных кислот // Тезисы докладов V Всесоюзной конференции молодых специалистов в области хроматографии. - Н. -Новгород, 1992. '

7. Крюкова Е. В., Султанович Ю. А., Недорезова Т. П. Хромато-масс-спектромэтрическое исследование липидного комплекса,полученного биохимическим методом // Там же.

8. Крюкова Е. В., Султанович D/A., Андрианова В. А. Закономерности биохимического синтеза сложных эфиров жирных кислот и одноатомных спиртов // В сб.: "Проблемы и пути повышения качества .пищевых продуктов". - С. - Петербург: С. - Петербургский технолог, ин-т холод, пром-ти, 1992. - С. 72-77,

9. Крюкова Е. В., Султанович Ю. А., Хромыленкова Н. П. Биохимический синтез неионогенных ПАВ и исследование их свойств // Там же, с. 78-80. Г

10. Крюкова Е. В., Султанович O.A., Витюк Л. А. Биохимический синтез аналогов ланолина // Там же, с. 81-83. .

JPoTa^HHTjmOJ'MP"____

Заказ № 122, тираж 100 зкз.