Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Участие металлов в окислительно-восстановительных фотореакциях, сенсибилизированных сульфидом кадмия и катализируемых ферментами

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Участие металлов в окислительно-восстановительных фотореакциях, сенсибилизированных сульфидом кадмия и катализируемых ферментами"

Российская Академия Наук Институт биохимии им. А. Н. Баха

На правах рукописи

НЕДОЛУЖКО Алексей Игоревич

Участие металлов в окислительно - восстановительных фотореакциях, сенсибилизированных сульфидом кадмия и катализируемых ферментами

03.00.04 - биохимия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 1998

Работа выполнена в лаборатории фотобиохимии Института биохимии им. А. Н. Баха РАН

Научный руководитель кандидат биологических наук

В. В. Никандров

доктор химических наук Б. А. Кузнецов доктор химических наук Л. А. Сырцова

Биологический факультет Московского Государственного Университета им. М. В. Ломоносова

Защита состоится 2 июня 1998 г. в 10 часов на заседании Специализированного Совета (К 002.96.01) по присуждению ученой степени кандидата биологических наук в Институте биохимии им. А. Н. Баха РАН (117071, Москва, Ленинский проспект, 33)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологической литературы РАН (Москва, Ленинский проспект, 33).

Автореферат разослан "30" И ЛЬ_ 1998 г.

Официальные оппоненты

Ведущая организация

Ученый секретарь Специализированного Совета, доктор биологических наук

М. И. Молчанов

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Неорганические полупроводники могут выступать в качестве фотосенсибилизаторов рада окислительно-восстановительных реакций, катализируемых ферментами. К настоящему времени показаны процессы образования молекулярного водорода, фотообразования NAD(P)H, фотофиксации СОг, фотосинтеза органических соединений, катализируемые ферментами и сенсибилизированные неорганическими полупроводниками. До сих пор фотореакции с участием полупроводников и ферментов изучались лишь в связи с задачей моделирования определенных биологических процессов. Однако обнаружение биосинтеза полупроводника CdS в микроорганизмах и клетках растений позволяет предположить, что протекание фотосенсибилизированных полупроводниками реакций возможно также in vivo. Необходимым условием участия фермента в фотореакции, сенсибилизированной полупроводником, является обеспечение переноса фотогенерированного в частице полупроводника электрона к активному центру фермента. С этой целью, как правило, используется переносчик электрона. Показан также прямой перенос электрона от полупроводника к ферменту. Было обнаружено, что сенсибилизированная CdS и катализируемая NAD-зависимой гидрогеназой из Alcaligenes eutrophus фотореакция восстановления NAD до NADH может протекать с участием металлического кадмия, фотообразованного на поверхности CdS. Сделано предположение, что металл образуется при фотовоссгановлении катионов решетки CdS я выступает в качестве донора электрона - субстрата для фермента. Фотообразовакие металлического кадмия, сенсибилизированное CdS, показано также in vivo. В фотокатализе химических реакций нанесение металлов на поверхность неорганических полупроводников применяется для изменения каталитических свойств полупроводниковых сенсибилизаторов. Можно ожидать, что модификация поверхности полупроводниковых частиц металлами будет оказывать существенное влияние на протекание реакций, фотосенсибилизированных полупроводниками и катализируемых

адсорбированными на их поверхности ферментами как в модельных, так и в биологических системах.

Следует отметать, что перенос электронов между редокс - белками и металлическими электродами широко исследуется в связи с разработкой биосенсоров и изучением электрохимических свойств редокс-белков. Цель И задачи работы. Целью настоящей работы является исследование механизма участия металлов в окислительно-восстановительных фотореакциях, протекающих в водных суспензиях частиц CdS с участием ферментов. В соответствии с этим поставлены следующие задачи:

1. Осуществить сенсибилизированное CdS фотовосстановление катионов металлов до металлического состояния в условиях протекания ферментативных реакций.

2. Изучить закономерности ферментативных реакций с участием металла в качестве субстрата - донора электрона.

3. Исследовать влияние металлов, нанесенных на неорганические полупроводники, на фотообразование водорода, сенсибилизированное частицами CdS и катализируемое адсорбированной на поверхности частиц гидрогеназой.

Научная новизна. Исследовано влияние модификации поверхности неорганического полупроводника CdS металлами на фотореакции, сенсибилизированные CdS и катализируемые оксидоредуктазами. Показано, что металл может участвовать в реакции в качестве субстрата - донора электрона для фермента или активировать перенос фотогенерированного в полупроводнике электрона на активный центр фермента. Показано, что гидрогеназа Thiocapsa roseopersicina и ферредоксин - NADP оксидоредуктаза Chlorella (и из листьев шпината) катализируют окисление металлического кадмия в водных средах при анаэробных условиях. Обнаружено, что гидрогеназа Т. roseopersicina катализирует также окисление металлического свинца. Изучено влияние неорганического полупроводника и продукта окисления металла на ферментативные реакции с участием металлов в качестве окисляющегося субстрата.

Практическая ценность работы. Полученные в настоящей работе результаты могут быть использованы при разработке систем, преобразующих солнечную энергию в химическое топливо, а также при создании биосенсоров. Сделанные в работе выводы о механизмах участия ферментов в процессах анаэробной биокоррозии могут найти применение при создании материалов, устойчивых по отношению к микробиологической коррозии. Апробация работы. Полученные результаты были представлены на первой всероссийской конференции фотобиологов (Пущино, 1996) и пяти международных конференциях.

Публикации. По теме диссертации опубликовано восемь работ. Структура И объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы. Объем работы составляет страниц. Работа иллюстрирована 28 рисунками и 4 таблицами. Список цитируемой литературы включает работ.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Гидрогеназа из пурпурных бактерий Thiocapsa roseoperslcirta, штамм BBS, была получена по методу (Зорин и Гоготов, 1982) в Институте почвоведения и фотосинтеза РАН, а также в нашей лаборатории. Гомогенность препаратов была проверена аналитическим электрофорезом в 7% полиакриламидном геле. Ферредоксин - NADP - редуктаза Chlorella (FNR) была получена по методу (Lankaster et al., 1982) в лаборатории биохимии хлорогшастов Института биохимии РАН; ферредоксин - NADP - редуктаза из листьев шпината и липоамид-дегидрогеназа из дрожжей Torida (LipDH) были получены от Sigma. Активность гидрогеназы определяли по скорости образования водорода в присутствии 1.5 мМ метилвиологена (MV). В качестве восстановителя для метилвиологена использовали дитиониг натрия (20 мМ) или металлический кадмий. Активности FNR и LipDH определяли по скорости образования соответственно NADPH и NADH (спегарофотометрически) в присутствии 1 мМ метилвиологена, восстановленного металлическим кадмием.

Фотохимические эксперименты проводили в герметичной стеклянной ячейке, термостатируемой при 25 С. Перед экспериментами ячейку продували инертным газом для удаления кислорода. Добавление растворов и газов в ячейку осуществляли введением шприцем через резиновую пробку. При определении состава газовой фазы, ячейку на 10 секунд подключали в линию газового хроматографа СЬгот-4. При определении С02 наблюдаемую кинетическую зависимость корректировали с учетом растворимости СО2 по оригинальному методу.

Источником освещения служила галогеновая лампа накаливания КГМ-500 мощностью 500 Вт. При помощи граничных светофильтров из спектра излучения лампы выделялся участок 350 - 600 нм.

Количество белка, связанного с твердыми частицами, определяли, центрифугируя суспензию и измеряя количество фермента в супернатанте спектрофотометрически или по ферментативной активности. Для определения концентрации ИАЮН и КМ>РН в суспензии частиц СсК суспензию центрифугировали при 6000 g и определяли концентрацию НАБ(Р)Н в супернатанте спектрофотометрически. Идентификацию ЫАОН и ИАОРН проводили с помощью Ь-глутаматдегидрогеназы в присутствии 0.01 М а-кетоглутарата и 0.08 М фосфата аммония.

Количество металла (Сё, РЬ) в системе определяли двумя способами.

(а). Добавляли кислород и 10"4 М МУ После полного окисления восстановленного металлом МУ определяли количество кислорода, не вступившего в реакцию, и по уравнению:

2Ме° + Ог + 4Н+ -> 2Ме2* + 2Н20 вычисляли количество металла в образце.

(б). Добавляли 104 - 10'3 М МУ и 0.1 мг гидрогеназы. Измеряли полное количество выделившегося водорода. Количество металла определяли, считая, что протекают реакции

Ме° + 2МУ2+ -> Ме2+ + 2МУ+ 2МУ* +2Н* >2Жг* + Н1

При измерении количества РЬ° добавляли также 10"2 М Ыа^НРСи или На^Оз для ускорения реакции.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Раздел состоит из пяти глав. В гл. 1 приведен фактический материал по действию металлов (Сё, РЬ или Ag) и гидрогеназы Шосарза гозеоретста в качестве катализаторов сенсибилизированного С<В фотообразования водорода. С целью определения механизма активации металлами сенсибилизированного СёБ и катализируемого гидрогеназой фотообразования водорода исследованы: сенсибилизированное Сей фотовосстановление катионов металлов (гл. 2), влияние гидрогеназы на фотообразование газообразных продуктов (С02, СО, Н2), сопровождающее образование металлического кадмия в водных суспензиях СёБ, содержащих формиат (гл. 3), ферментативные реакции с участием металлического кадмия и свинца в качестве субстрата (гл. 4). Механизм фотообразования водорода в суспензиях Сей, содержащих металл и гидрогеназу, обсуждается в гл. 5.

1. Влияние металлов на фотообразование водорода,

сенсибилизированное саэ и катализируемое гидрогеназой

При освещении в анаэробных условиях водных суспензий СсВ, содержащих донор электрона, наблюдается образование водорода, которое катализируется металлом, связанным с частицами полупроводника. Добавление гидрогеназы ТЫосарча гсиеорепШпа приводит к увеличению скорости фотообразования водорода пропорционально количеству адсорбированного на частицах Сс18-металл фермента. Во всех исследованных системах наблюдается неаддитивность каталитического действия металла и гидрогеназы в реакции фотообразования водорода (скорость фотообразования Н2 в присутствии одновременно металла и гидрогеназы выше, чем сумма скоростей, наблюдающихся в присутствии каждого из катализаторов). Таблица 1 суммирует данные по скоростям фотообразования водорода, сенсибилизированного СсВ и катализируемого гидрогеназой и металлами.

Таблица 1

Сенсибилизированное CdS фотообразование молекулярного водорода, катализируемое металлами и/или гидрогеназой Thiocapsa roseopersicina (нмоль/мин)

катализатор Металл

Cda Cdb Pbc Pbd Age

- 0.5 0.5 0 0

металл 3 2 1 0 <0.5

гидрогеназа 7 9 1 4

металл + гидрогеназа 25 20 35 50 28

Условия:

Во всех экспериментах количество гидрогеназы составляло 60 мкг.

* 2 M NaCOOH и 5 мг CdS Aldrich в 1 мл 0.05 M MES, рН 6.5, 3.5 мкмоль Cd° ((*) -происходит фотовосстановление ионов кристаллической решетки CdS до металла; (**) -получено экстраполяцией кинетической зависимости) ь 2 M NaCOOH и 5 мг CdS Fluka в 1 мл 0.05 M MES, рН 6.5,10 мкмоль Cd° 0 2 M NaCOOH и 5 мг CdS Fluka в 1 мл 0.05 M MES, рН 6.5, 8 мкмоль Pb° d 0.1 M деггиотреитол и 5 мг CdS Aldrich в 1 мл 0.05 M MES, рН 6.0, 1.5 мкмоль Pb° ° 0.1 M ЭДТА и 5 мг CdS Aldrich в 1 мл 0.05 M MES, рН 5.3, добавлено 1 мкмоль Ag*

Активность гидрогеназы в фотореакции составляет 25-80% активности фермента в реакции образования Н2 с использованием восстановленного метилвиологена. Следует отметить, что при использовании формиата в качестве донора электронов фермент частично ингибирован образующимся при освещении СО.

С увеличением количества связанного с CdS металла скорость катализируемого гидрогеназой фотообразования водорода растет (рис. 1). Насыщение скорости фотообразования водорода для кадмия и свинца происходит при количестве

металла около 6 мкмоль, для серебра значение насыщающей концентрации металла на порядок ниже.

г

■а § 20 г

X

£ ю о

О 4 8 12 Ме°, мкмоль

Рис. 1. Зависимость скорости фотообразования водорода,

сенсибилизированного СёЭ и катализируемого гидрогеназой, от количества металла. Условия см. табл. 1. (Системы Ь, с, е).

2. ФОТОВОССТАНОВЛЕНИЕ КАТИОНОВ МЕТАЛЛОВ В ВОДНЫХ СУСПЕНЗИЯХ оаэ

В настоящей работе исследованы процессы фотосенсибилизированного С<й восстановления С<12+, РЬ2+, до металлического состояния. Образование металлического кадмия в водных суспензиях Сс18. Фотосенсибилизированное СсВ образование металлического кадмия возможно как за счет восстановления катионов С<1г+, так и вследствие катодной фотокоррозии полупроводника:

СН2+ + 2е~ —> Сс1° Сс1Б+2е" +Н* —> СН° +БН" Ъ'+гЪ*-*!?

где Б - донор электрона, е и И - фотогенерированные в CdS носители заряда. Эксперименты показали, что для фотосенсибилизированного СйЭ образования металлического кадмия необходимо присутствие определенных доноров электрона. При рН 6.5 максимальная скорость фотообразования металла наблюдается в присутствии 2М формиата. При этом образование металла сопровождается выделением эквимолярного количества С02 (фотохимические процессы в этой системе подробно описаны в гл. 3). Фотообразование кадмия

протекает и при использовании вместо формиата некоторых других доноров электрона: сульфита (рН 8) или тартрата.

Фотообразование металлического кадмия происходит после добавления соли кадмия к суспензии С(й. При использовании препарата СсК фирмы АМпск металл образуется и в отсутствие добавленного Сс12+ за счет восстановления ионов кристаллической решетки полупроводника. В этом случае выход металлического кадмия достигает 13% от количества СЛ5. Другие образцы СёЭ, в частности, Сс18 фирмы Пика, не обладают этим свойством, их освещение в присутствии формиата приводит к образованию незначительных количеств восстановителя (не более 0.1% отСсБ).

Поскольку не было отмечено существенных отличий между условиями образования металла из кристаллической решетки СйБ и из добавленных катионов Сс12+, как и выхода анионов сульфида в раствор при восстановлении ионов решетки С<1Б АЫПсЬ, мы предполагаем, что образование металла в СёБ АШпск протекает за счет нестехиометрических ионов Сс12+, присутствующих в этом образце.

В наших экспериментах эффективное фотообразование металлического кадмия наблюдалось в присутствии: формиата. Для объяснения этого эффекта мы предположили, что процесс фотообразования Сё" в присутствии формиата протекает с участием С02" анион-радикалов. Фотообразование металла происходит при восстановлении С02" радикалами пары (СсРе'), образующейся при захвате электрона зоны проводимости ловушкой в долгоживущее локализованное состояние.

С<1г++е;ь->(СсРе-)

(саг+е-)+сюг->са0+со2

В присутствии других доноров электрона, образующих свободные радикалы при освещении (тартрат), восстановление Сс12+ может протекать по сходному механизму.

При увеличении количества металлического кадмия в системе скорость фотовосстановления добавленного Сс1:+ уменьшается, видимо, вследствие увеличения рекомбинации электрон-дырочных пар на поверхности покрытой

металлом частицы CdS. Максимальное количество Cd°, которое нам удалось получить, составило около 30% от CdS.

Образование металлического свинт в процессе сенсибилизированного CdS фотовосстановления РЬ2*. Освещение суспензии CdS, содержащей донор электрона (формиат, дитиотреитол), в присутствии катионов свинца приводит к образованию металлического свинца. Скорость фотовосстановления свинца в присутствии формиата существенно выше, чем фотовосстановлепия кадмия. В отличие от фотообразования кадмия, фотообразование свинца протекает при использовании тиосоединения (дитиотреитол) в качестве донора электрона. В этом случае, однако, большая часть добавленной в систему соли свинца образует PbS.

Поскольку свинец - значительно более электроположительный металл, чем кадмий, его поведение в реакциях восстановления акцепторов электрона отличается от поведения кадмия. Так, при добавлении MV свинец восстанавливает виологен частично (в отличие от Cd, восстанавливающего MV количественно), что происходит вследствие установления равновесия между парами РЪ°/РЬ2+ и MVTMV44, которое может быть смещено в сторону окисления металла добавлением анионов, связывающих РЪ2+ (НР04г", S032"). Образование металлического серебра при сенсибилизированном CdS фотовосстановлении Аг*. Фотовосстановление Ag+ проводили в суспензии CdS, содержащей 0.05М MES-буфер рН5.3 и 0.1М EDTA. При добавлении AgNOj суспензия CdS темнеет вследствие образования Ag2S. Рентгеноструктурный анализ предосвещенной суспензии выявил присутствие наряду с AgiS восстановленного Ag°, которое отсутствовало в образце, не подвергавшемся освещению. По-видимому, металлическое серебро образуется при восстановлении комплекса Ag+ с EDTA или свободных катионов Ag+.

3. Фотохимические процессы в водных суспензиях CdS,

содержащих формиат и гидрогеназу

Образование металлического кадмия и газообразных продуктов в системе CdS - формиат - гидрогеназа. При освещении водных суспензий CdS (Aldrich) в присутствии формиата и MES, в анаэробных условиях, мы наблюдали

образование металлического кадмия (за счет восстановления ионов С<12+ кристаллической решетки полупроводника) и газообразных продуктов: С02, СО и Н2 (Рис. 2). В процессе фотосенсибилизированного СсШ разложения формиата прослеживаются две стадии. Первая характеризуется накоплением металлического кадмия в системе, при этом водород не образуется. На второй стадии скорости образования металлического кадмия и С02 резко падают, одновременно начинается выделение водорода и происходит скачкообразный рост скорости образования СО. С течением времени скорости фотообразования газообразных продуктов достигают стационарных значений. Сравнение скоростей образования продуктов позволяет предположить протекание реакций:

сан+нсосг=са°+н4 + со2

2НСОО" + 2Н+ = 2С02 + 2Н2

нсоо-+н*=со+н2о

Рис. 2. Образование металлического кадмия и газообразных продуктов (Н2, £ С02, СО) при освещении 5 мг Сей

о

* (АЫпсЩ в 1 мл 2 М формиата в 0.05 М Х МЕЙ-буфере рН 6.5 (в отсутствие гидрогеназы). Левая ось - С<1° (X), С02 (♦), СО (■); правая ось - Н2 (Д).

Следует подчеркнуть, что в отсутствие гидрогеназы скорость образования Н2 весьма низка по сравнению со скоростями конкурирующих процессов -образования металла (на первой стадии фотореакции) и СО (на стационарном участке). Добавление гидрогеназы приводит к активации фотообразования водорода, а также других газообразных продуктов реакции - СО и С02 (Табл. 2). Стационарная скорость образования водорода линейно возрастает с увеличением количества адсорбированного на полупроводнике фермента.

Время освещения, мин

Таблица 2

Влияние гидрогеназы Т. говеоретЫпа на стационарные скорости образования газообразных продуктов в процессе освещения системы Сей - Сс<8 - формиат

Количество гидрогеназы, мкг Скорости образования продуктов реакции, нмоль/мин Квантовый выход фоторазложения формиата (по формуле (1))

Н, (С02) со

0 3 90 0.019

60 30 120 0.031

Прекращение освещения приводит к остановке образования С02 и СО, в то время как Н2 продолжает выделяться (в отличие от системы, не содержащей гидрогеназы) за счет катализируемого ферментом окисления металлического кадмия.

Механизмы образования газообразных продуктов и квантовый вьисод фоторазложения формиата (в отсутствие гидрогеназы). Для реакции фотообразования водорода можно предложить несколько механизмов. В зависимости от механизма для образования одной молекулы водорода может требоваться один фотон (при восстановлении протонов СО2' радикалами) или два фотона (при окислении СО*" радикалов дырками полупроводника). Фотосенсибилизированное С<ЗБ образование водорода подавляется, если протекает реакция восстановления С<12+, и начинается только после исчерпания Сс12+. Такое поведение связано с присутствием конкуренции между процессами образования металла и образования Н2, поскольку оба протекают с расходом электронов зоны проводимости.

Из кинетических кривых образования СО и С02 можно предположить, что процессы образования этих продуктов являются конкурирующими. Образование СО, по-видимому, представляет собой альтернативный путь превращения СОг' радикалов. Предполагается, что СО образуется в результате восстановления С02" радикалов электронами зоны проводимости.

СО^ + ЬР+е" ->СО+ОНГ

С учетом изложенных механизмов образования С<3°, Н2, СО и С02, квантовый выход фоторазложения формиата (отношение числа фотогенерированных электрон - дырочных пар, участвующих в образовании продуктов реакции к числу поглощенных фотонов) равен

где Ыр - число фотонов, поглощенных частицей полупроводника в единицу времени, п1 и п^ - число фотонов, требующееся для образования одной молекулы Н2 и С02 соответственно (от 1 до 2). Для Сей АЫпск после достижения стационарных скоростей образования продуктов фек составляет около 2 %.

Влияние гидрогеназы на величину квантового выхода фоторазложения формиата. Увеличение скоростей образования всех газообразных продуктов фоторазложения формиата в присутствии гидрогеназы (Табл. 2) означает увеличение величины квантового выхода фоторазложения формиата. Увеличение скорости разложения формиата в присутствии щдрогеназы происходит вследствие активации процесса переноса электронов на Н4, который является скорость - определяющим, что было подтверждено исследованием влияния добавленного акцептора электронов (С<12+) на скорости фотообразования газообразных продуктов. Ускорение катодной полуреакции (восстановление протонов) вызывает, в свою очередь, ускорение анодной (образование С02* радикалов). Образующиеся в результате дополнительные С02" радикалы не могут быть восстановлены с образованием СО (т.к. гидрогеназа не катализирует эту реакцию). Для объяснения наблюдающегося увеличения скорости образования СО в присутствии гидрогеназы может быть предложена следующая реакция:

Близкие величины прироста скоростей образования СО и С02 после добавления фермента свидетельствуют в пользу указанного механизма.

(1)

2С07 + Н+ -» СО, + СО+ ОН"

4. Катализируемые ферментами реакции окисления

металлического кадмия и металлического свинца.

В нашей работе процессы катализируемого ферментами окисления металлов были исследованы для трех различных ферментов: шдрогеназы Thiocapsa roseopersicina (HG), ферредоксин-NADP оксидоредуктазы Chlorella и из листьев шпината (FNR), липоамид-дегидрогеназы из дрожжей Tonila (LipDH). Все эксперименты проводились в 0.05 М MES-буфере при рНб.5. Адсорбция ферментов на частицах металлического кадмия и покрытых металлом частицах CdS. При добавлении любого из исследованных ферментов к водной суспензии частиц CdS, содержащих на поверхности фотообразованный металл, белок адсорбируется на частицах (сходные результаты были получены для адсорбции ферментов на чистом CdS). При весовом отношении фермент/(Сй5-Са°) до 0.01 не менее 90 % белка находится в адсорбированном состоянии. На частицах металлического кадмия (полученного электрохимическим восстановлением соли кадмия) связываются только HG и LipDH, но не FNR. Вероятно, частицы CdS, несущие фотогенерированный Cd0, обладают дополнительными центрами связывания по сравнению с частицами электрохимически полученного Cd0. Все дегидрогеназы сохраняли ферментативную активность при иммобилизации на твердых частицах. Окисление метачлического кадмия. катализируемое гидрогеназой. Катализируемое гидрогеназой окисление металлического кадмия было исследовано в суспензии порошка металлического Cd, и в суспензии частиц CdS, содержащих на поверхности металлический Cd. Скорость реакции была пропорциональна количеству адсорбированного на частицах фермента. В обоих случаях в контрольных опытах без гидрогеназы образования водорода не было зафиксировано.

В суспензии частиц металла катализируемое гидрогеназой образование водорода (сопровождающееся окислением металла) протекало с постоянной скоростью. В суспензии частиц CdS, содержащих фотогенерированный металл на поверхности, скорость образования водорода падала по мере окисления металла. Максимальная скорость образования водорода гидрогеназой при окислении Cd составляла в суспензии частиц металла до 25%, а в суспензии CdS

до 50% от скорости образования водорода, наблюдаемой в присутствии метилвиологена в насыщающей концентрации.

Между количеством образовавшегося водорода и количеством окислившегося металла экспериментально было получено соотношение 1:1. Кинетика катализируемого гидрогеназой окисления металлического кадмия, нанесенного на CdS. По мере исчерпания металла скорость его окисления быстро падает (Рис. 3). Падение скорости не связано с изменением активности или десорбцией фермента. Добавление CdCl2 не влияет на скорость окисления металлического кадмия. Этот факт показывает, что в наших условиях катализируемое гидрогеназой окисление Cd можно рассматривать как необратимый процесс. Экспериментальные результаты позволяют предположить, что падение скорости окисления металла по мере его расхода связано преимущественно с перемещением фермента с металлической поверхности на полупроводниковую по мере уменьшения отношения площади поверхности металла к площади поверхности полупроводника при окислении металла.

Предполагая, (а) существование обратимого равновесия между растворенным ферментом, ферментом, адсорбированным на поверхности CdS, и ферментом, адсорбированным на поверхности Cd°; (б) пропорциональность между количеством связанного на поверхности фермента и площадью поверхности; (в) пропорциональность между скоростью ферментативной реакции и количеством фермента, адсорбированного на металле, получаем выражение для зависимости скорости реакции от времени:

d[Cd\_ v^srAt)

dt ¿0,(0+«WO

где Sed и SCds - площади поверхности Cd и CdS соответственно, а отражает отношение вероятностей связывания фермента с Cd и CdS (при а >1 фермент сильнее связывается с CdS, чем с Cd°), Vmax - скорость реакции в случае, когда вся поверхность CdS покрыта металлом (т.е. Scds = 0).

Рис. 3. Зависимость скорости образования водорода при катализируемом гидрогеназой

окислении Cd от количества Cd, оставшегося в системе (для двух различных значений начального количества металла). Условия см. Рис. 2 + 60 мкг падрогеназы. Сплошные линии - аппроксимация выражением (2) с параметрами: (aS/cr)=45 мкмоль, (а/?)=5.2 и 9.4.

Считая, что Sed ~ o[Cd], где о - площадь поверхности единицы количества металла и Sc<dt) = S - fBcÁt). где Хи/) - константы, причем S - площадь поверхности чистого CdS, а /? зависит от начального количества металла (для мономолекулярного слоя металла /9=7, в остальных случаях /?</), получаем

X ю о

Cd , мкмоль

d[Cd] dt

1 -ар+-

ccS

(2)

<Л.Сс1}{ 0

Учитывая, что окисление металла стехиометрически связано с образованием водорода, мы можем аппроксимировать экспериментальные результаты по окислению кадмия (рис. 3) зависимостью (2). Результаты аппроксимации показывают, что при величине начального количества металла 4.8 мкмоль поверхность частицы полностью покрыта металлом, и связывание фермента с CdS по крайней мере в 10 раз более сильное, чем связывание с металлом. По мере окисления металла фермент быстро переходит на образующуюся поверхность CdS, что и выражается в резком падении скорости реакции. Катализируемое гидрогеназой окисление металлического свинца, нанесенного на СЖ В отсутствие фермента образования водорода в системе зарегестрировано не было. В присутствии гидрогеназы происходит образование водорода со скоростью, пропорциональной количеству адсорбированного на частицах фермента. Начальная скорость реакции линейно зависит от количества металла приблизительно до 6 мкмоль; при больших количествах РЬ°

наблюдается насыщение. Так же как и при окислении Сё°, по мере окисления металлического свинца скорость реакции падает. Падение скорости более резкое, чем при окислении С<1, и вызвано не только перемещением гидрогеназы на освобождающуюся поверхность СёБ, но и влиянием образующегося в ходе реакции РЬ2+, что было проверено добавлением соли свинца в систему (рис, 4). Уменьшение скорости образования Н2 в присутствии РЬ2+ может происходить по двум причинам: (а) вследствие инактивации фермента катионом свинца и (б) в результате сдвига редокс-потенциала и приближению системы к состоянию равновесия. Данные рис. 4 хорошо аппроксимируются выражением

4Я2] V,К ~

Л ~К1+[РЬи] (>

кщ - константа равновесия (константа инактивации) кЖ^В

уго Ь]

1'0 - скорость реакции в отсутствие РЬ2+ которое получается в предположении существования равновесия между РЬ2+, гидрогеназой и 1:1 комплекса фермента с катионом свинца; кроме того было обнаружено, что растворенная гидрогеназа (0.06 г/л) образует нерастворимый осадок с 10"3 М РЬ2+. Эти данные свидетельствуют в пользу инактивации фермента катионом свинца.

Уменьшение скорости реакции в присутствии РЬ2+ можно также объяснить, предположив, что фермент катализирует обратную реакцию восстановления свинца, и присутствие РЬ2+ изменяет редокс-потенциал среды. Значение редокс-потенциала пары РЬ°/РЬ2+ Е в начале реакции было оценено по восстановлению метилвиологена в -0.35 В (отн. н. в. э.). Появление РЬ2+ в растворе приводит к сдвигу Е в сторону более положительных значений. В результате скорость образования водорода уменьшается вследствие протекания обратной реакции, а также инактивации гидрогеназы при неполном восстановлении ее активного центра (редокс-потенциал фермента Е? составляет -0.23 В).

О 4 8 12 [Pb2+], мМ

Рис. 4. Зависимость обратной величины скорости образования водорода при катализируемом гидрогеназой окислении РЬ° от концентрации РЬ". Условия: 4.5 мкмоль Pb° на 5 мг CdS в 1 мл 2 M формиата в 0.05 M MES рН 6.5. 60 мкг гидрогеназы. Сплошная линия -аппроксимация выражением (3) с к = 1.2 мМ.

Из двух возможных механизмов влияния РЬ+ на скорость образования водорода, экспериментальные данные в большей степени свидетельствуют в пользу инактивации фермента в результате связывания с катионом РЬ2+. Окисление металлического свинца показано также в присутствии ЫАО-зависимой гидрогеназы А1са1'щепе$ еЫгорЪш.

Окисление металлического кадмия, катализируемое ферредоксин-ШРР оксидоредуктпазой (РЫЮ. Показано, что П®. катализирует процесс окисления металлического кадмия с восстановлением до ЫАВРН. Скорость

образования КАОРН при работе от металла составляет до 4 % от скорости образования КАЭРН от восстановленного метилвиологена в тех же условиях. Окислению подвергался только Сс1, нанесенный на СсВ, но не металл в виде порошка. Как показали эксперименты, ЕЪШ. адсорбируется на СсЙ, но не адсорбируется на металле. Перенос электрона от металла на активный центр ЛЖ наблюдается лишь в присутствии С<й. При этом, по-видимому, окисляется металл, непосредственно прилегающий к адсорбированному на С<18 ферменту. Нам не удалось показать катализ окисления металлического С(1°, близким по структуре ферментом - липоамид-дегидрогеназой (1лрБН), хотя фермент связывался как с частицами Сей, покрытыми металлом, так и с частицами Сс10, и связанный белок обладал ферментативной активностью.

Максимальные наблюдавшиеся в экспериментах скорости катализируемых ферментами реакций окисления металлических Сс1 и РЬ приведены в Табл. 3.

Таблица 3

Максимальные скорости катализируемого ферментами окисления

металлов

в 1 мл 2 M NaCOOH + 0.05 M MES pH 6.5

4-10 мкмоль металла, фотообразованного на 5 мг CdS

Фермент Количество Скорость реакции, нмоль/мин

фермента, мкг Cd° Pb°

HG 60 35 17

NLH 25 12* 1

FNR 50 3 -

LipDH 35 0 -

- Shumilin I. A. et al., 1993

Механизм участия ферментов в качестве катализаторов процессов окисления металла. Полученные экспериментальные данные свидетельствуют о возможности обмена электронами между металлом и активным центром фермента. Необходимым условием протекания реакции является контакт фермента с металлической поверхностью. В ходе реакции имеет место непосредственный перенос электрона металла на активный центр фермента, подобно тому, как это происходит при работе фермента, адсорбированного на электроде или освещенном полупроводнике.

По-видимому, окисление металла протекает по электрохимическому механизму. В этом случае процесс можно представить как сумму двух полуреакций: анодной реакции окисления металла и катодной реакции образования восстановленного продукта (водород, НАЕ>(Р)Н). Скорость процесса может возрастать при активации полуреакций. Металлические кадмий и свинец обладают весьма высокими значениями величины перенапряжения (около 1.5 В), необходимого для начала образования водорода, поэтому скорость растворения этих металлов при нейтральных рН в анаэробных условиях ничтожна. В присутствии фермента скорость растворения металла возрастает за

счет ферментативного катализа катодной полуреакции восстановления ферментативного субстрата (Н+, NADfP)4).

Полученные результаты позволяют сделать вывод о существовании не рассматривавшегося ранее механизма участия гидрогеназы в процессах микробиологической коррозии. Согласно существующим представлениям роль гидрогеназы в процессах анаэробной коррозии сводится к ускорению катодной полуреакции за счет эффективного окисления образующегося при коррозии водорода. С учетом показанного в нашей работе прямого переноса электрона металла на активный центр фермента, мы предлагаем альтернативный путь участия гидрогеназы (и других оксидоредуктаз) в процессах растворения металлов - катализ непосредственно катодной полуреакции, то есть восстановления протонов (NAD(P)+).

5. Механизм каталитического действия металла и гидрогеназы в процессах фотообразования молекулярного водорода, сенсибилизированных CdS.

Совокупность полученных экспериментальных данных позволяет предположить, что в водной суспензии частиц CdS, содержащей донор электрона и гидрогеназу, металл может оказывать влияние на протекание ферментативной реакции двумя способами:

(1) фермент катализирует окисление металла (Cd, Pb) в темновой реакции при постоянной регенерации последнего в фотореакции, сенсибилизированной CdS

Ме° + 2Н- > Ме2+ + Н2

Me2t + D" >Me° + D*

(D - окисляющийся фотогенерированными дырками донор электрона)

(2) присутствие металла на поверхности CdS повышает эффективность процесса переноса фотогенерированного в CdS электрона на активный центр фермента

2Н+ + 2е~... >

D"* + 2h* D+

Такая возможность была предположена на основании того факта, что присутствие металлического серебра в системе CdS - гидрогеназа приводит к росту скорости образования Н2, хотя серебро не подвергается окислению, а

также на основании анализа изменения скорости образования Н2 после прекращения освещения системы СёБ - Сс1 - гидрогеназа. По-видимому, каталитическое действие металла в данном случае связано с изменением условий адсорбции фермента на частице СсВ (например, изменения ориентации фермента на поверхности частицы при покрытии ее металлом). Не исключено также, что присутствие металла приводит к увеличению эффективности разделения фотогенерированных в полупроводнике носителей заряда. Таким образом, в системе донор электрона - С£)Э - металл - гидрогеназа возможны четыре различных пути образования водорода:

Мс1

2е;ь + 2Н*->Н2 (а)

2е;ь+2Н+ Н2 (Ь)

Ме'+ЬусЬт^епак

2е;ь + 2Ш -> Н2 (с)

Ме° + 2Н+ -> Н, + Меи ...

2 (й)

(а) - (с) представляют собой фотореакции, (<1) - темновая реакция. Наблюдаемая скорость фотообразования водорода представляет собой сумму этих четырех процессов (в случае серебра, трех ((а) - (с)), поскольку серебро не может служить субстратом для фермента). Данные, приведенные в Табл. 1, показывают, что во всех исследованных системах основной вклад в фотообразование водорода вносят процессы (с) и (ё), отражающие совместное каталитическое действие металла и гидрогеназы.

Схемы, представленные на рис. 5 и 6, иллюстрируют два пути участия металлов в процессе фотообразования водорода в водных суспензиях Сей, содержащих донор электрона, металл и гидрогеназу.

А Б

Рис. 5. Схема, иллюстрирующая участие металла в фотообразовании водорода в качестве регенерируемого субстрата гидрогеназы. А. Фотосенсибилизированное полупроводником восстановление металла Б. Катализируемое гидрогеназой окисление металла в темновой реакции

Рис. 6. Схема, иллюстрирующая участие металла в фотообразовании водорода в качестве активатора переноса электронов зоны проводимости полупроводника к ферменту.

ВЫВОДЫ

1. Показано активирующее действие металлов (Сс1, РЬ, Ag) в реакции фотообразования водорода, сенсибилизированной СйЭ и катализируемой гидрогеназой из пурпурных бактерий Ткюсарха гояеорегзюта. На основании данных о неаддитивности каталитического действия металла и гидрогеназы в

процессе сенсибилизированного СЖ фотообразования Н2 предложен механизм совместного действия металла и гидрогеназы.

Предполагается, что совместное каталитическое действие металла и гидрогеназы реализуется двумя путями: (1) фермент катализирует окисление металла (Сс1, РЬ) в темновой реакции при постоянной регенерации последнего в фотореакции, сенсибилизированной Сс13; (2) присутствие металла на поверхности С(й повышает эффективность процесса переноса фотогенерированного в СёЭ электрона на активный центр фермента.

2. Показано, что металлический кадмий и свинец могут выступать в качестве субстратов - доноров электрона для гидрогеназы Ткюсарза говеоретста. Окисление металла стехиометрически связано с образованием продукта ферментативной реакции - молекулярного водорода. Активность гидрогеназы в реакции образования водорода при использовании в качестве субстрата металлического кадмия составляет около 50% активности фермента, использующего в качестве субстрата восстановленный метилвиологен. Катализируемое гидрогеназой окисление металлического свинца ингибируется продуктом реакции - катионом РЬ2+.

3. Проведено сравнительное исследование катализируемого гидрогеназой окисления частиц металлического кадмия и кадмия, связанного с поверхностью СёБ. Показано влияние адсорбции фермента на поверхности СйБ на кинетику реакции.

4. Установлено, что ферредоксин - ИАВР - оксидоредуктаза способна использовать металлический кадмий в качестве субстрата при восстановлении ИАОР до КАБРН. Необходимым условием реакции является адсорбция гидрогеназы на частицах СсЦ, покрытых металлом.

5. Сенсибилизированное СсЗБ фотовосстановление катионов С<12+, РЬ2+, А§+ до металлического состояния осуществлено в условиях протекания ферментативных реакций. Получены данные, указывающие на участие свободных радикалов, образующихся при фотоокислении карбоновых кислот (формиат, тар-фат), в восстановлении катионов металлов.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Никандров, В. В.; Шумилин, И. А.; Недолужко, А. И.; Зорин, А. А.; Попов, В. О.; Красновский, А. А. Участие фотогенерированного в неорганическом полупроводнике металла в окислительно-восстановительных реакциях при сопряженном действии полупроводника и фермента. Доклады Академии наук. 1994. Т. 335. № б. С. 802-805.

2. Nikandrov, V. V.; Shumilin, I. A.; Nedolushko, A I.; Popov, V. О. Participation of the metallic cadmium photogenerated in CdS in the enzyme-catalyzed reactions of hydrogen production and NAD+ reduction. X International Conference on Photochemical Conversion and Storage of Solar Energy. Interlaken, Switzerland, 1994. Book of abstracts. P. 153.

3. Nedoluzhko, A. I.; Shumilin, I. A.; Nikandrov, V. V. Coupled action of cadmium metal and hydrogenase in formate photodecomposition sensitized by CdS. Journal of Physical Chemistry. 1996. Vol. 100. № 44. P. 17544-17550.

4. Shumilin, I. A.; Nedoluzhko, A. I.; Nikandrov, V. V.; Popov, V. O. Metals as a novel type of enzyme substrate. Oxidation of Cd(0) by hydrogenases. FASEB Journal. 1996. Vol. 10. № 6. A970.

5. Nedoluzhko, A. I.; Beloplotova, Ya. V.; Nikandrov, V. V. Mediatorless photoinduced electron transfer from CdS semiconductor particles to the enzymes and cytochrome c. 12th International Congress on Photobiology. Vienna, 1996. Book of abstracts, P127.

6. Недолужко, А. И.; Семенова, A. H.; Никандров, В. В. Ферментативные реакции, фотосенсибилизированные неорганическими полупроводниками: влияние металла, фотоосажденного на поверхности CdS. I Всероссийская конференция фотобиологов. Пущино, 1996. Сб. тезисов, стр. 35-36.

7. Nedoluzhko, А. 1.; Shumilin, I.A; Nikandrov, V. V. Photodecomposition of formate under coupled action of CdS and hydrogenase. XI International Conference on Photochemical Conversion and Storage of Solar Energy. Bangalore, India, 1996. Book of abstracts.

8. Недолужко, А. И.; Белоплотова, Я. В.; Никандров, В. В. Фотохимические реакции, сенсибилизированные частицами сульфида кадмия, содержащими на поверхности металлы и редокс-белки. Труды II съезда фотобиологов России. Пущино, 1998. В печати.

Издательство АО "Диалог-МГУ".

ЛР № 063999 от 04.04.95 г. Подписано к печати 27.04.98 г. Усл.печ.л. 1,4. Тираж 80 экз. Заказ 469. Тел. 939-3890, 928-2227,928-1042. Факс 939-3891. 119899, Москва, Воробьевы горы, МГУ.