Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Защитные механизмы автотрофной цианобактерии Nostoc muscorum от токсического воздействия ионов кадмия
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия
Автореферат диссертации по теме "Защитные механизмы автотрофной цианобактерии Nostoc muscorum от токсического воздействия ионов кадмия"
На правах рукописи
Бреховских Александр Андреевич
механизмы автотрофной цианобактерии ЛЬзйкг ттсогшп от токсического воздействия ионов кадмия
03.00.04 - биохимия
АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Москва 2006
Работа выполнена в лаборатории фотобиохимии Института биохимии им. А.Н.Баха РАН
Научный руководитель:
кандидат биологических наук О.Д. Бекасова
Официальные оппоненты:
доктор биологических наук, профессор Н.В. Карапетян доктор биологических наук Л.М. Герасименко
Ведущая организация: Московский Государственный Университет им. М.В Ломоносова, биологический факультет
заседании диссертационного совета К 002.247.01 по присуждению ученой степени кандидата наук в Институте биохимии им. А.Н. Баха РАН по адресу: 119071, Москва, Ленинский проспект, д. 33, корп. 2.
С диссертацией можно ознакомиться в Библиотеке биологической литературы РАН по адресу: 119071. Москва. Ленинский пооспект, д. 33, корп. 1.
Защита диссертации состоится « 2 / » М.0срТ(К 2006 г. в
часов на
Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук
яоо £ А
Общая характеристика работы Актуальность проблемы. Кадмий относится к группе самых опасных элементов, так как способен нарушать многие физиологические и метаболические процессы путем прямого ингибирования или активации, а также непрямым воздействием на регуляторные механизмы, образуя прочные комплексы с аминокислотами и другими биомолекулами, содержащими HS- и RS-группы, заменяя металлы в металлсодержащих ферментах. Цианобактерии могут аккумулировать кадмий наряду с другими тяжелыми металлами быстро и в больших количествах. Генетическая модификация цианобактерий усиливает их устойчивость к токсичным элементам и способность аккумулировать тяжелые металлы (Shi et al., 1998). Изучение конкретных видов, характеризующихся устойчивостью к высоким концентрациям Cd2+, представляется актуальным как в практическом, так и теоретическом аспектах. Практический интерес обусловлен использованием цианобактерий, при разработке технологий осаждения и удаления тяжелых металлов из промышленных стоков биоаккумуляцией - более эффективным и дешевым способом удаления токсичных металлов из окружающей среды по сравнению с физико-химическими методами. Теоретический интерес обусловлен обнаружением способности у некоторых микроорганизмов, в том числе и N muscorum, к биосинтезу наночастиц CdS в процессе детоксикации ионов Cd2+. CdS - неорганический полупроводник, обладает фотохимической активностью и способен фотосенсибилизировать биохимические окислительно-восстановительные реакции (Красновский и др., 1979). К настоящему времени осуществлен ряд ферментативных реакций, фотосенсибилизированных неорганическими полупроводниками, включая сульфид кадмия (Никандров и др. 1994). С перспективой технического использования созданы системы на основе гидрогеназы, сопряженной с CdS в качестве фотосенсибилизатора, способные к выделению молекулярного водорода (Недолужко, 1998). Наночастицы со свойствами полупроводников находят широкое применение в фотокатализе и других областях науки и техники благодаря уникальным фотофизическим и химическим свойствам, которые зависят от размеров частиц (Бучаченко, 2003). С целью получения наночастиц определенного размера и свойств развиваются методы их синтеза и биосинтеза. Привлекательность фикобилиновых пигментов для стабилизации наночастиц заключается в идентичности туннельных полостей в центре пигментных молекул, что существенно для синтеза одноразмерных чадгип. когда требуются очень
Я ОС. НАЦИОНАЛЬНАЯ , БИБЛИОТЕКА |
малые реакционные объемы. Возможность стабилизации наночастиц сульфида кадмия фикобилипротеинами ранее не исследовалась.
Дели и задачи исследования. Целью нашей работы было изучение защитных механизмов цианобактерии Nosloc muscorum штамм ВКМ-16 от воздействия ионов кадмия. Поставленная цель определила задачи диссертационной работы:
1. Изучить влияние ионов кадмия в широком диапазоне концентраций (10"6 10'2 М) на жизнеспособность N muscorum и микроорганизмы, обитающие в его слизистой оболочке.
2. Выявить возможные способы детоксикации ионов CdJ+ N muscorum, включая участие экзополисахаридов и фикобилиновых пигментов в связывании ионов Cd2+.
3. Синтезировать наночастицы сульфида кадмия in vitro, используя фикоэригрин в качестве белковой матрицы; выяснить влияние условий синтеза на размер наночастиц CdS; исследовать их спектральные и фотохимические свойства.
4. Получить бактериологически чистую культуру N. muscorum и выяснить ее устойчивость к ионам Cd2+.
5. Выделить из альгологически чистой культуры N muscorum бактерии-спутники, устойчивые к токсическому действию кадмия, охарактеризовать их и исследовать способность к связыванию ионов Cd2+.
Научная новизна. Показано противоположное действие низких и высоких концентраций кадмия на биомассу, морфологию, фотосинтетический аппарат и выделение экзополисахаридов N muscorum. Обнаружено активное и избирательное выделение полисахаридов N muscorum во внешнюю среду в условиях кадмиевого стресса. Впервые установлено, что кадмий индуцирует усиление экскреции полисахаридов, состав которых отличается от такового в отсутствие кадмия: доминирующим моносахаридом становится глюкозамин, который легко присоединяет ионы Cd2+.
Обнаружено, что при концентрации кадмия <10"4М, не влияющей на скорость роста и морфологию цианобактерии, перенос энергии от ФС2 к ФС1 усиливается одновременно с активацией защитных механизмов от кадмия, тогда как при концентрации Cd2+ 10"3 М, инициирующей отмирание клеток, перенос энергии между фотосистемами сильно уменьшается.
Обнаружена высокая Сё-связывающая способность К-фикоэритрина. Впервые доя стабилизации наночастиц Сс18 использован фикоэритрин. Выяснено влияние условий синтеза на размер и свойства наночастиц.
Из слизистой оболочки N. тшсогшп выделены бактерии устойчивые к токсическому воздействию кадмия. Они способны выделять сероводород и связывать кадмий. На основании сравнительного филогенетического анализа с использованием последовательностей генов 16Б рРНК, установлено, что выделенный штамм относится к виду 8Хепо1горкотопа5 таЫорЫНа
Практическая значимость. Полученные результаты значительно расширяют современные представления о защитных механизмах N тшсогит от высоко токсичных ионов С<12+ и могут быть полезны при разработке биотехнологических методов очистки промышленных сточных вод и городских водоемов от тяжелых металлов.
Обнаруженное свойство К-фикоэритрина быстро и в больших количествах связывать ионы Сё2+ может быть использовано в терапии острых и хронических отравлений кадмием.
Предложен новый способ стабилизации наночастиц Сей при помощи К-фикоэритрина. Полученные результаты могут быть использованы в разработке лекарственных препаратов и открывают новые возможности для С<!-нейтронозахватной терапии.
Способность 5. таИорЫНа образовывать сульфид и связывать ионы кадмия представляет интерес в связи выяснением механизмов биосинтеза наночастиц со свойствами неорганических полупроводников; использования их в качестве флуоресцентных меток в биологических системах; важна для оценки вклада микроорганизмов в трансформацию соединений тяжелых металлов и детоксикащпо окружающей среды.
Структура и объем лиссертании. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на страницах машинописного текста, включает рисунков и ^^таблиц. Список литературы в ключает^£1 ^наименований, в том числе^ зарубежных изданий.
Апробация работы. Материалы диссертации представлены на научных конференциях:
• Автотрофные микроорганизмы. К 75-летию со дня рождения академика Елены Николаевны Кондратьевой. Московский Государственный Университет им. М.В. Ломоносова, биологический факультет. 2000.
• International conference 'Primary Processes of Photosynthesis in Bacteria and Plant Photosystem И' and traditional XVII th' Pushcheno Readings in Phosynthesis'. 2002.
• International Symposium Biochemical Interactions of Microorganisms and Plants With Technogenic Enviromental Pollutants. Saratov. 2003.
• Динамика и структура в химии и биологии. Всероссийская Школа-Симпозиум. Институт химической-физики им. H.H. Семенова РАН. 2004.
• XIV Российский симпозиум по растровой электронной микроскопии и аналитическим методам исследования твердых тел (РЭМ-2005), Черноголовка, 2005.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 10 печатных работ (5 статей и 5 тезисов докладов).
Материалы и методы исследования
Объекты исследования: Штамм ВКМ-16 N muscorum, полученный из коллекции Института биохимии и физиологии микроорганизмов РАН, культивировали на минеральной среде Кратца-Майерса (КМ) (Kratz, Myers, 1955) при 28 °С, непрерывном поступлении воздуха, обогащенного С02, освещённости 6000 люкс, pH 7.5. Начальный объём среды с концентрацией N muscorum 2 ± 0.2 мг сухой биомассы/ мл составлял ~ 100 мл. От случайных бактериальных загрязнений культура была предварительно очищена фильтрованием через мембранный фильтр "Synpor" (диаметр пор 1,5 мкм) в сочетании с промыванием стерильной средой и воздействием ультразвуком в течение 15 секунд с последующей фильтрацией и пересевом на 1,4% агаризованную среду КМ.
Бактерии-спутники выращивали на среде с добавлением глюкозы и пептона по 1 г/л (КМсп), для выращивания микроорганизмов на твердой среде вносили агар - 14 г/л.
Бактериальные загрязнения N. muscorum определяли по окрашиванию ДНК флуоресцентным красителем DAPI (4,6-Diamino-2-phenylindole) (Whittaker et al., 1991). Препараты просматривали под эпифлуоресцентным микроскопом.
Бактерии-спутники N. muscorum выделяли из слизистой оболочки- а) накопительной неочищенной культуры; б) культуры после освобождения её от случайных бактериальных
загрязнений; в) культуры N. тшсогит инкубированной с 10"2 М, 10"3М и Ю^М Cd(N03)2 в течение 2 месяцев. Для посева на чашки Петри отбирали по 0.5 мл соответствующей культуры, растирая шпателем, и этим же шпателем делали посев на вторую чашку Петри. Отбирали колонии бактерий, рост которых по штриху был визуально однороден. Морфологическую однородность выделенных культур контролировали микроскопированием. Из пробирок со скошенным агаром штаммы пересевали в жидкую среду, отмечали характер роста и делали посев на чашки Петри. Чистоту выделенных культур контролировали по однородности выросших колоний.
Видовую принадлежность выделенных штаммов бактерий-спутников определяли по филогенетическому положению микроорганизмов на основании секвенирования гена 16S рРНК в Центре «Биоинженерия» РАН. ДНК выделяли из бактерий согласно методу (Булыгина и др., 2002). Для проведения полимеразной цепной реакции и дальнейшего секвенирования ПЦР-фрагментов гена 16S рРНК пользовались универсальной праймерной системой (Edwards et al, 1989)
Выделение экзополисахаридов из культуральной среды. Отбирали пробу, добавляли 96%-ный этанол в отношении 1:1 для осаждения полисахарида. Через 1 сутки пробы центрифугировали при 15000 об/мин в течение 10 мин. Осадок трижды промывали этанолом при центрифугировании (10 мин, 15000 об/мин) и растворяли в дистиллированной воде.
Концентрацию экзополисахаридов определяли методом Дюбуа, основанным на появлении желто-оранжевого окрашивания при добавлении фенола и серной кислоты к moho-, олиго- или полисахаридам (Dubois et al., 1956).
Состав экзополисахаридов определяли по спектрам поглощения гидролизованного полисахарида (Ikawa, Niemann, 1949). Разложение на компоненты спектров поглощепия гидролизованных экзометаболитов осуществляли, как описано в работе (Литвин, Гуляев, 1969).
Выделение сероводорода определяли на жидкой среде по потемнению индикаторной бумаги с ацетатом свинца (Егоров, 1995) и по потемнению среды Kligcr агар (Kligler, 1918).
Гистохимическое определение ионов кадмия выполняли по реакции с дитизоном (Серегин, Иванов, 1997).
g
Концентрацию ионов кадмия в среде определяли двумя методами. 1) Потенциометрически в присутствии 0,1 М NaN03 с помощью рН/мВ-метра ("Эксперт-001", Россия), в котором измерительным электродом был ион-селективный электрод для кадмия "Эком-Cd". Диапазон линейности электродной функции Cd-селективного электрода 10"7 М - 10'2 М Cd2+ при рН 6,0. Крутизна электродной функции 26,5 мВ при 20 "С.
2) На атомно-эмиссионном спектрофотометре с индуктивно-связанной плазмой "IRIS Advantage" фирмы "Thermo Jarrel Ash" (США). Длина волны измерения 228,802 нм. Скорость подачи раствора 1,85 мл/мин. Мощность плазмы 1150 Вт.
Синтез наночастиц CdS на R-фикоэритрине включал: связывание ионов кадмия фикоэритрином, синтез сульфида кадмия и фракционирование частиц. Кадмий-фикоэритриновый комплекс получали при добавлении Cd(N03)2 в концентрации от 10"5М до 10"2 М к 1,8 10"6 М раствору R-фикоэритрина. Образование комплекса Cd2+ с R-фикоэритрином обнаруживали по тушению флуоресценции R-фикоэритрина и по снижению концентрации свободных ионов Cd2+ в среде. Синтез CdS инициировали добавлением 0,3 М Na2S к Cd2+^HK03pmpnHOBOMy комплексу. Количество сульфида варьировали от 3,0 до 60 мМ. Через 30 мин инкубирования при комнатной температуре препарат центрифугировали в течение 10 мин при 8 °С и 3000 g.
Размер наночастип CdS определяли по спектрам поглощения и по электронным микрофотографиям.
Электронно-микроскопические исследования проводили совместно с д.г-м.н. В.Т. Дубинчуком в просвечивающем электронном микроскопе BS-540 (Чехия) с приставкой РЭМ-201 для микрозондового анализа При этом использовали германий-литиевый детектор при напряжении 25 кВ. Счет в зоне возбуждения 1000 имп/мин, площадь зоны возбуждения варьировали в пределах 2-10 мкм2. Препараты для просвечивающей электронной микроскопии, микрорентгеиоспектрального и микродифракционного анализа готовили испарением небольшой капли образца на поддерживающей медной сетке.
Капиллярный электрофорез выполняли на приборе «Капель 103Р» (Россия) в 0,1 мМ трис-буфере с добавлением 0,3 % полидиаллилдиметиламмоний хлорида, рН 8,2. Внутренний диаметр капилляра 75 мкм, эффективная длина 50 см, общая длина 60 см.
Пробы вводили 5 секунд при избыточном давлении 50 мбар. Рабочее напряжение 15 кВ, детектирование при 254 нм.
Спектральные измерения выполнены при помощи следующих спектрофотометров: СФ-18, Hitachi-557, Beckman coulter DU 650, Specord UV-VIS "Carl Zeiss" и флуориметров: MPF-4, "Hitachi", RF-5301 PC "Shimadzu".
Результаты и их обсуждение
Влияние ионов кадмия на биомассу и морфологию N. muscorum в зависимости от концентрации и длительности воздействия. Исследование воздействия кадмия в различных концентрациях на N. muscorum показало, что в присутствии 10*4 М Cd(NC>3)2 цианобактерия оставалась жизнеспособной в течение нескольких месяцев наблюдений, при этом морфология клеток, прирост биомассы, скорость выделения кислорода и интенсивность дыхания были такими же, как в культуре без кадмия (рис. 1 а, б; табл. 1).
Таблица 1. Изменения биомассы N. muscorum (мг-сух. биомассы / мл) при инкубировании с Cd2+
Продолжительност Концентрация Cd(N03)2, М
экспозиции, сутки 0 ю-4 5-104 10
0 1,72+0,06 1,74+0,01 2,14+0,13 1,76±0,03
3 1,75+0,15 - - 1,55±0,09
9 1,96+0,18 2,02±0,12 2,24+0,04 1,24±0,05
Изменение биомассы за 9 суток + 0,24 + 0,28 + 0,10 -0,52
Рост цианобактерии замедлялся и размер клеток уменьшался, если в культуральную среду вносили 5 • 10'4 М Cd(NOз)2 (рис. 1 в). Ионы (М2+ в концентрации 10'3 М вызывали снижение биомассы на 30 % за 9 суток, распад нитей на фрагменты и отдельные клетки, удерживаемые общей слизью (рис. 1 г). Через три-четыре недели инкубирования с 10"3 М СёСМООг слизистые оболочки отделялись от трихомов, формировались скопления колониальной слизи, содержащие сгустки частиц, имевших вид кристаллитов, зёрен и более массивных образований в виде друз. Слизистая оболочка трихомов, а также сгустки слизи, отделившиеся от нитей колоний, образовывали комплекс с дитизоном жёлто-оранжевого цвета. Интенсивность цвета и площадь окрашенных участков увеличивалась с
возрастанием концентрации кадмия и длительности •экспозиции (в пределах 1 часа). Часть бактерий-спутников также приобретали оранжевую окраску в присутствии дитизона. В
При инкубировании N. тшсогит с ионами С<12+ поглощение культуральной среды в УФ- и видимой области при длинах волн короче 600 нм монотонно увеличивалось (рис. 2, кривые 2, 3). Именно такое поглощение при длинах волн короче 400 нм без четко выраженных максимумов характерно для С<18. Максимум флуоресценции смещался от 440 нм в длинноволновую область, при этом вид спектра и интенсивность излучения зависели от концентрации кадмия в среде (рис. 2, кривые 4-6). Эти изменения в спектрах поглощения и флуоресценции культуральной среды после инкубации цианобактерии с кадмием позволяют предположить, что связанный кадмий хотя бы частично накапливается э кзометабо лита ми в виде сульфида кадмия.
отсутствие Сс!2+ окрашивание исходной культуры дитизоном не происходило.
щ Рис. 1. Цианобактерия N тшсогит, выращенная на среде ' без кадмия (а), в присутствии Сё2+: 10"4 М (б), 5 • 10"4 М (в), Ё 10"3 М (г), (а), (б) - контрастированы тушью, (г) - фазовый
контаст. Длительность инкубирования 7 суток.
6
I Рис. 2. Спектры поглощения (1-3) и флуоресценции (4-6) культуральной среды после
30 инкубирования в ней N тшсогит без кадмия (1,
20 о 4) и в присугствии 10"4 М (2, 5) и 10~3 М С<ЦЖ>3)2 8.
ю о (3, 6); дифференциальный спектр поглощения
0 -§■ культуральной среды после инкубирования в ней
N. тшсогит («с 10"4 М Сё(К03)2» минус «без кадмия») (7, 8). Длительность инкубирования 7 суток (кривые 1-7) и 35 суток (кривая 8).
200 300 400 500 600
Длина волны, нм
Роль внеклеточных полисахаридов N. тшсогит в детоксикапин ионов кадмия.
Удельное содержание полисахаридов, экскретируемых цианобактерией N. тшсогит при плотности культуры 2 г/л сухой биомассы, было равно 0,7 ±0,01 г глюкозных единиц в расчете на 1 г сухой биомассы. После экспозиции N. тшсогит с С(12+ содержание экзополисахаридов в культуральной среде возрастало. Динамика концентрации экзополисахаридов в культуральной среде зависела от количества вносимого кадмия и продолжительности инкубирования с ним N. тшсогит (рис. 3).
Рис. 3. Изменение содержания экзополисахаридов в культуральной среде в зависимости от концетрации С<12+ в среде и длительности инкубирования N. тшсогит. Цифры у кривых: 1 - 0 М, 2 - 10"4 М, 3 -5-10"4М, 4 -10"3 М С<1(Ж>з>2.
S 160
i 140
8 120
о X 100
ГХ О 80
i 60
8 X 40
о 20
£
К
-Н'
2 4 6 К сутки
Одновременно с изменением концентрации экзополисахаридов изменялась их первичная структура, о чём свидетельствуют различия в спектрах поглощения гидролизованных экзополисахаридов (рис. 4). После инкубирования N. тшсогит с 10"3 М С<1(Ж>з)2 основной максимум в спектре поглощения смещался к 325 им и обнаруживался дополнительный при 272 нм (рис. 4 б; кривая 1).
220 240 280 280 300 320 340 360
длина волны, нм
о.в
| 0.4
220 240 260 280 300 320 340 ЗвО
длина волны, нм
Рис. 4. Спектры поглощения гидролизованных экзометаболитов, выделяемых N. тшсогит в культуральную среду, а - в отсутствие кадмия, б - в присутствии 10'3 М Сс1(Ж)з)2. Длительность инкубирования 9 суток. Цифры у кривых: 1 - экспериментальная кривая , 2 - сумма компонентов разложения, 3 - глюкозамин, 4 - глюкуроновая кислота, 5 - арабиноза, 6, 7, 8 - неидентифицированные компоненты, 9 - галактоза, 10 - глюкоза, 11 - рамноза.
Разложение спектра поглощения гидролизованного полисахарида на спектры индивидуальных моносахаридов позволило конкретизировать изменения, происходящие в первичной структуре полисахарида при инкубировании N. тшсогит с кадмием (рис. 4). Спектр поглощения гидролизованного полисахарида из контрольного опыта без кадмия (рис. 4 а), раскладывается на спектры следующих моносахаридов: глюкозамин, глюкуроновая кислота, галактоза, глюкоза, арабиноза, рамноза (перечислены в порядке уменьшения их вклада в основную полосу поглощения) и 3-х неидентифицированных компонентов, поглощение которых описывается гауссовыми кривыми с максимумами при 215 нм, 227 нм и 263 нм. Возможно, последние обусловлены поглощением неуглеводных компонентов экзометаболитов (см. рис. 2, кривая 8). Спектр поглощения полисахарида, присутствующего в культуральной среде после инкубирования N. тшсогит с Сё, раскладывается на меньшее количество компонентов, при этом явно доминирует поглощение ппокозамина (рис. 4 б).
Таким образом, комплексные определения концентрации экзополисахаридов в культуральной среде, коррелирующие с толщиной слизистой оболочки, изменения первичной структуры экзополисахаридов и биомассы цианобактерии, а также связывания ионов кадмия (по реакции с дитизоном) после инкубирования с ионами кадмия в различных концентрациях позволяют заключить, что N тшсогит способен к активному и избирательному выделению ионов кадмия во внешнюю среду для дистанционной детоксикации. Способ защиты обеспечивается, по-видимому, активацией синтеза полисахарида измененной первичной структуры.
Изменчивость фотосинтетического аппарата N. ттсогит при воздействии ионов кадмия.
Основными компонентами в пигментной системе N. тшсогит штамм ВКМ-16 являются хлорофилл, фикоэритрин, фикоцианин, аллофикоцианин и каротиноиды. В качестве минорного компонента содержится фикоэритропианин. Каждый из основных пигментов представлен двумя и более спектральными формами (табл. 2).
Кадмий при всех исследованных концентрациях вызывал изменения в фотосинтетическом аппарате. Однако, если при концентрации их удавалось
регистрировать только при 77 К, то при 5-Ю"4 М Сё2' после 9 суток инкубации
изменения обнаруживались спектральными методами при комнатной температуре, а при 10'3 М С62+ изменения наблюдались даже визуально по обесцвечиванию культуры.
Из данных, суммированных в табл. 2, следует, что отличия в спектрах поглощения N. тшсогит до и после инкубирования с 10"4 М Сс12+ заключались в смещении максимумов поглощения на 1-4 нм и возникновении новых полос при длинах волн < 410 нм (обусловленных, по-видимому, поглощением наночастиц Сёв), 586 нм (С<1-фикобилипротеиновый комплекс) и > 730 нм (хлорофилл-белковые комплексы, модифицированные кадмием). После инкубирования с 10"3 М С62+ поглощение в красной области сильно снижалось, по сравнению с контролем в результате обесцвечивания хлорофилла и основной максимум смещался от 678 к 666 нм; полосы поглощения в области 470-540 нм отсутствовали, что указывает на деструкцию каротиноидов; полос в области < 410 нм становилось больше, что, возможно, отражает возрастающее разнообразие частиц Сей по размерам и носителям (табл. 2). Предположение подтверждается появлением новых полос излучения в низкотемпературном спектре флуоресценции N. тшсогит после инкубирования с 10"4 М С(12+ и 10"3 М Сс12+, измеренных при селективном возбуждении светом, поглощаемым преимущественно хлорофиллом (430 нм) или фикобилипротеинами (530 нм) (табл. 2, последний столбец).
Возгорание длинноволновой флуоресценции хлорофилла (> 700 нм) после инкубирования N. тшсогит с 10"4 М С(12+, измеренных при селективном возбуждении светом поглощаемым преимущественно хлорофиллом (430 нм) или фикобилипротеинами (530 нм) указывает на усиление переноса возбуждения в ФС1 (рис. 5 кривые 1,2). Вывод подтверждается тем, что в спектре возбуждения флуоресценции при 770 нм доминируют полосы, соответствующие максимумам поглощения фикобилипротеинов.
Сопоставление спектров флуоресценции N. тшсогит до и после инкубирования с 10"3 М С(12+ позволяет заключить, что перенос энергии возбуждения от фикобилипротеинов на хлорофилл практически не происходит, собственная флуоресценция хлорофилла снижается почти на два порядка (рис. 5 кривые 1,3).
Таблица 2. Положение отрицательных пиков (нм) во второй производной низкотемпературного спектра поглощения N. тшсогит в зависимости от концентрации ионов кадмия в среде, длительность инкубации 7 суток
Компонент Концентрация С^* в среде, М
0 ю-4 10
СсЮ - 391 Р450«>
- 393 - Р470
398 Р485
406 Рп500
415 415 416
Хлорофилл 419 418 427
- - 433
443 445 448
472 471 -
п477 477 -
500 -
Каротиноиды п 507 507 -
509 - -
514 514 -
— 532 -
544 540 -
549
Фикоэритрин 558 559 554 Р560
571 569 573 Р585
576
Комплекс - 586 586 Б594
Сё-фикобилипротеин
Фикоэритроцианин 596 599 598
- - 607
Фикоцианин - - 618 Р622
621 622 627
631 633 637
Аллофикоцианин 658 659 659
Форма 674 673 672
хлорофилла 686 686 683
714 714 -
С(1-хлорофилл 733
белковые комплексы 751 Р760
767
786
Цифры в сочетании с буквой Р указывают положение максимумов
флуоресценции (нм), возникающих в присутствии кадмия
560 600 000 700 длина волны, нм
600 650 700 750 длина волны, нм
800
Рис. 5. Спектры флуоресценции N. тшсогит при 295 К в зависимости от концентрации ионов кадмия в культуральной среде, (а) Х^ =430 нм, (б) Х^ =530 нм. Цифры у кривых: 1 - контроль без кадмия, 2 -10"4 М С<12+, 3 -10~3 М Сё2+.
Связывание ионов кадмия К-Фикоэритрином
Поскольку мы обнаружили, что фикобилиновые пигменты связывают ионы кадмия в N. тшсогит, представляло интерес исследовать синтез Сёв при участии фикобилиновых пигментов в модельных системах. Для решения этой задачи был выбран Я-фикоэршрин (пигмент красной водоросли), как наиболее стабильный из всех фикобилиновых пигментов.
При добавлении к раствору Я-фикоэритрина ионов кадмия в концентрации от 7-10"5 до 3,5-10*2 М потенциал кадмиевого электрода увеличивался, что свидетельствует об уменьшении концентрации свободных ионов Сё2+ в среде. Измерения ЕС(| показали, что при варьировании концентрации Сс12+ в указанных пределах 1,8 мкМ фикоэритрин за короткое время связывал от 20 до 70 % С<12+. В результате образовывался С<12+-фикоэритриновый комплекс.
При связывании ионов кадмия К-фикоэритрин оставался хорошо растворимым в воде, но поглощение и интенсивность флуоресценции Я-фикоэритрина снижались в той или иной степени в зависимости от количества связанного им кадмия и рН среды.
Зависимость размера частиц СёЭ от условий синтеза. При добавлении сульфида натрия к Сё-фикоэритриновому комплексу синтезировались частицы СёБ и обесцвечивался Я-фикоэритрин. Частицы были устойчивы и не выпадали в осадок. Исследование зависимости размера частиц Сйв от соотношения концентраций в2": С<12+ : Я-фикоэритрин и рН среды показало, что он зависит главным образом от соотношения концентраций ионов в2" и С<12+ (рис. 6); зависимость от рН среды незначительна (рис. 7), а концентрация пигмента вовсе не влияла на размер синтезируемых частиц ѫ (рис. 8).
Размер наночастиц колебался от 2 до 5.6 нм в зависимости от условий синтеза, указанных в подписях к рисункам 6-8.
Рис. 6. Зависимость оптических свойств С(18 от соотношения концентраций ионов сульфида и кадмия во время синтеза (реакционная смесь содержала 8 мМ Сс12+, 2 мкМ К-фикоэритрин и [в2"] в мМ, указаны у кривых): а -спектры поглощения частиц Сёв, стабилизированных Я-фикоэритрином, б поглощение при 350 нм (Л35о) и интенсивность
флуоресценции при 500 нм
450
длина волны, нм
650
(^ооХ ^кюб400 нм частиц С<Ш в 0,01 М трис-буфере, рН 7,5.
Рис. 7. Спектры поглощения при различных рН (цифры у кривых) (а) и зависимость интенсивности флуоресценции при 500 нм (Коэб - 400 нм) от рН (б) для наночастиц С<й (образец - 1.0 мкМ К-фикоэритрин, 10 мМ Са2+, 48 мМ Б ).
500 550 длина волны, нм
Лоо-этк ея
-052*0 \ 1 Л1
Рнс. 8. Спектры поглощения при различных концентрациях Я-фикоэритрина (цифры у кривых, в мкМ) (а) и зависимость интенсивности флуоресценции наночастиц С<« при 500 нм (Ко* = 400 нм) от концентрации Я-фикоэритрина (б); условия синтеза: 12 мМ- С<12+, 14 мМ-в2", рН 8.7.
длина волны, нм
Размер и фазовое состояние наночастиц Сё8. Определения размеров частиц по микрофотографиям показали, что присутствовали частицы размером от 2 нм до 1,1 мкм. Доминировали частицы 6,05 нм. Среднеквадратичное отклонение составляло 1,82 нм (рис. 9).
Рис. 9. Распределение по размерам частиц стабилизированных Я-
фикоэритрином. Среднеквадратичное отклонение 1,82. На вставке -электронная микрофотография
доминирующих частиц и
микродифракционная картина
характерная для них. Условия синтеза: 0,5 М С(12+, 1,8 мкМ Я-фикоэритрина,
О 10 20 30 40 50 во 70 80 90 100 0.3 М В ПрОПОрЦИИ
диаметр частиц, нм [82"]/[Сй2+]= 1,2.
На вставке рис. 9 представлена электронная микрофотография наиболее мелких частиц. Они из-за небольшого количества вещества, давали слабую микродифракционную картину, на которой присутствовал 1-2 максимума (рис. 9). Поэтому достоверно определить фазовое состояние наночастиц размером < 6 нм не удалось. Среди крупных частиц имелись кристаллические, аморфные и двухфазные аморфно-кристаллической структуры. Энергодисперсионный спектр рентгеновского характеристического излучения одной из частиц представлен на рис. 10. Крупных частиц было очень мало.
Рис. 10. Энергодисперсионный спектр рентгеновского харакгеристическо! о излучения частицы С<18, синтезированной на Я-фикоэритрине. На вставке электронная микрофотография, на которой стрелками отмечены кристаллическая (1) и аморфная (2) частицы Сёв, и соответствующие им
микродифракционные картины.
Спектры поглощения и флуоресценции наночастиц сульфида кадмия, изображенных на микрофотографиях, представлены на рис. 11.
дЪ/дх2
Рис. 11. Спектральные характеристики наночастиц С<18, синтезированных на Я-фикоэритрине. а - спектр поглощения (1) и его вторая производная (2). б — спектр флуоресценции при \Ютб 400 (1), 360 (2), 340 нм (3), 320 нм (4) и спектр возбуждения флуоресценции, Л^ 500 нм (5).
Переходы при 406 и 395 нм, определенные по второй производной спектра поглощения (рис. 11 а, кривая 2), соответствуют размеру частиц Сей 3,2±0,2 нм. Именно такого размера частицы проявляются по второй производной спектра поглощения цианобактерии N. тизеогит инкубированный с кадмием. Размер наночастиц СсШ, стабилизированных Я-фикоэритрином, определяемый по спектру поглощения, согласуется с данными литературы (табл. 3).
В таблице 3 приведены лишь несколько работ из большого числа публикаций, в которых указываются размеры наночастиц СсЙ. Анализ данных литературы показал, что разброс в положении перехода из основного состояния в возбуждённое для частиц одного <* и того же размера колеблется от 1 до 8 нм по выборкам из 3-5 работ и в значительной мерс определяется структурой наночастиц, методом определения их размеров, а также * гомогенностью используемых матриц.
Таблица 3. Зависимость положения перехода из основного состояния в возбужденное
частиц CdS от их размера
Размер частиц, нм Положение пика перехода, нм Ссылка
2,5±0,5 330 Lingdong Sun et al., 2000
2,8 350 Wang, Heiron, 1987
2,8 365 Dameron, Winge, 1990
3,2 ±0,2 396-406 Собств. данные
4,0 455 Wossraeyer et al., 1994
5,6 462 Wossmeyer et al., 1994
Размер частиц Сс18, определяемый по спектрам поглощения, совпадает с диаметром туннельного пространства в центре гексамера, тогда как размер доминирующих частиц, определяемый по микрофотографиям, совпадает с длиной туннеля. Расхождение в определении размеров наночастиц по микрофотографиям и спектрам поглощения, по-видимому, связано с гипохромным эффектом и обратной зависимостью интенсивности поглощения от размера частиц (чем больше размер, тем меньше коэффициент экстинкции) (ТппсМе е1 а1., 2001). По этим причинам переход при 480 нм, соответствующий размеру частиц 6 нм, проявляется слабо и только по второй производной спектра поглощения.
Флуоресцентные свойства наночастиц С<18. Спектр флуоресценции наночастиц сульфида кадмия размером от 3,2 до 5,6 нм в водном растворе Я-фикоэритрина характеризуется максимумами излучения при 470 нм и 520 нм (Сс18) и 575 нм (Д-фикоэритрин) (рис. 11). Соотношение полос в спектре флуоресценции не зависело от длины волны возбуждающего света и не изменялось при разбавлении даже в 70 раз. Вместе с тем в спектре возбуждения флуоресценции проявлялись несколько излучающих центров: при 280-290, 360, 395 и 440 нм (рис. 11 б, кривая 5). Последний был четко выражен при ХрИ 500 нм. Излучающие центры не удалось разделить методами капиллярного электрофореза и фракционирования этанолом. На электрофореграмме Сей, стабилизированных 11-фикоэритрином, имелся только 1 пик, а спектры поглощения супернатанта и суспендированного осадка, полученных при фракционировании наночастиц этанолом, совпадали. Совокупность этих данных свидетельствует, что наночастицы состоят из кластеров разных размеров, связанных молекулой Я-фикоэршрина в гстероагрегат (рис.12). На модели наночастица С<18 диаметром 3.2 нм, синтезируемая в полости Я-фикоэритрина, представлена как совокупность кластеров разных размеров, между которыми происходит миграция энергии возбуждения. Кластеры плотно упакованы в единый гетероагрегат, который тесно связан с хромофорными группами Я-фикоэритрина. На разный размер кластеров указывает сложная форма спектра излучения флуоресценции и зависимость положения максимума в спектре возбуждения флуоресценции от длины волны регистрации. О плотной упаковке кластеров в гетероагрегате свидетельствует миграция энергии возбуждения между кластерами. Постоянное соотношение между полосами излучения кластеров Сс18 и 11-фикоэритрином, которое не зависит от "к^с, свидетельствует о возможной ассоциации наночастицы СсЙ с
хромофорными группами 11-фикоэритрина. Образованию гетероагрегата, по-видимому, благоприятствует неоднородность полости фикоэритрина: наличие гидрофильных и гидрофобных зон, а также различных функциональных групп (-вН, -МН, -СООН), связывающих Сё2+.
Рис, 12. Схематические модели II-фикоэритрина с наночастицей С<18 в центральной полости (а) и наночастицы Сёв как гетероагрегата (б), а - Я- * фикоэритрин в форме гексамера (ар)67 изображен в виде двух параллельно расположенных дисков - тримеров • (аР)з, в центральной полости локализована наночастица СёЯ; б -стрелки указывают перенос энергии возбуждения между кластерами (1) разных размеров и на хромофорные группы (2) Я-фикоэритрина, как конечные акцепторы.
Фотохимические свойства наночастиц С<18. Освещение УФ-светом Сёв, стабилизированного Я-фикоэригрином, в анаэробных условиях в присутствии 7,8 мМ метилвиологена сопровождалось восстановлением последнего. Концентрация восстановленного метилвиологена не превышала 64 нМ после 40 мин освещения. Фотовосстановление метилвиологена сопровождается вторичным синтезом С<Ш.
з»м
-н
Энм
10-12 ни
Бакгерии-сиупшкя и их роль в детоксикации ионов кадмия С целью выяснения возможной роли бактерий-спутников в образовании кристаллитов сульфида кадмия культурой цианобактерии эти микроорганизмы были выделены из исходного N. тшсогит, а также из культур, инкубированных в течение 2-х месяцев с 10'3 Ми 10"4 М С(1(ЫОз)2. В ходе исследования выделено 29 штаммов. Для штаммов, выделенных из предварительно очищенной культуры, все многообразие сводится к основным 3 типам: короткие подвижные палочки (длина 1-2 мкм), длинные подвижные палочки (длина более 2 мкм) и мелкие кокки. В ходе работы были отобраны чистые 14 штаммов гетеротрофных бактерий и проверена их способность к образованию НзЯ на жидкой среде КМсп с добавлением по 0.02% цистина и цистеина. 8 штаммов выделяли Нгв с разной интенсивностью. Для дальнейшей работы отобраны штаммы 1А и 2А, выделенные из исходной культуры N тшсогит, и штаммы 1В и 2В, выделенные из
культуры цианобактерии, инкубированной с 10"3М С(1(ЫОз)2 в течение двух месяцев, которые наиболее интенсивно выделяли Н28 и хорошо росли.
Влияние кадмия на интенсивность роста сопутствующих микроорганизмов изучено на
жидкой и агаризованной среде. Динамика роста исследованных штаммов в отсутствие и в
присутствии 10'3М Сс1(МОз)2, типична для периодических культур (рис. 13). В
присутствии СА2+ рост 1В, 1А и 2А штаммов начинался с некоторой задержкой и менее
интенсивен по сравнению с контролем. Скорость роста штамма 2А на среде с С(12+ резко
увеличивалась после 10-дневного периода адаптации и к концу периода наблюдения
плотность культуры в два раза превышала таковую в контроле.
Рис. 13. Влияние кадмия на рост гетеротрофных бактерий,
выделенных из культуры N. тшсогит. Бактерии (штаммы 1А, 2А, 1В, 2В) выращены в отсутствие кадмия (кривые 1А, 2А, 1В, 2В) и в присутствии 10" 3М Сё(ИОз)2 (кривые 1А+С4 2А+С<1, 1ВКМ, 2В+Сё) на жидкой среде КМсп. Оптическая плотность измерена на СФ-18 при 600 нм. Ошибка измерений 0,05 а
сутш
При использовании агаризованной среды с Ю"4!^ С(3(ЫОз)2 и в контроле без кадмия, посев проводили из суточных культур с одинаковой плотностью в разведениях 10"3 и 10"4. В контроле для всех культур рост обнаруживался через 1 сутки и в обоих разведениях на 3 сутки был сплошной рост. На средах с добавлением С(12+ культуры 1В и 2В образовывали газон на 3 сутки в 10"3 разведении, а в 10"4 выросло от 12 до 90 точечных колоний. Следует отметить, что при концентрации 10"3М С<1(МОз)2 на агаризованной среде бактерии не растут.
Связывание ионов кадмия сопутствующими микроорганизмами
Исследование связывания кадмия с использованием дитизона культурами, выросшими на агаризованной среде, содержащей 10"4 М Сс12+, показало, что только культура 2В связывает С<1 в этих условиях. Таким образом, среди гетеротрофных бактерий, обитающих в слизистой оболочке N тшсогит, имеются устойчивые к кадмию бактерии, которые способны выделять сероводород и связывать ионы кадмия. Установлено, что штамм 2В относится к кластеру видов рода &епо1горИотопаз внутри подразделения
гамма-протеобактерий. Согласно анализу последовательностей генов 168 рРНК изучаемый штамм относится к гетерогенному виду 5. таНорЫИа.
Влияние кадмия на рост 51 таНорМИа на жидкой среде показано на (рис. 14).
Рис. 14. Кривые роста 5". такорЫИа на среде КМсп: 1 - без кадмия, 2-е Ю^М Сё(Ы03)2, 3 -2.5-1 (ИМ Сс1(М03)2, 4 - 5'10"4М Сс^Ш^, 5 - 7.5-1(Им Са(Ы03)2, 6 - 103М Сс1(М03)2. Оптическая плотность, измерена на СФ-18 при 600 нм. Ошибка измерений 0,03 О.
сутки
При концентрации > 2.510"4М Сс1(М03)2 в среде в первые сутки биомасса культуры увеличивалась медленнее, чем в контроле, так как происходила адаптация клеток к кадмию. После 1-2 суток культура интенсивно начинала расти с общим повышением плотности суспензии и накоплением в среде продуктов метаболизма, способных связывать кадмий. В итоге снижалось количество свободных ионов С<12+, приходящихся на клетку.
Связывание ионов кадмия 5. таЬоуЫНа
При внесении ионов С(12+ 10"3 М в суспензию клеток, отмытых от среды в воде, и перемешивании в течение 5 минут, концентрация свободных ионов кадмия не менялась. Это указывает на то, что сами клетки не способны связывать ионы кадмия в больших количествах. Связывание ионов кадмия отмечалось в процессе роста клеток. При внесении 5-10"4М Сс1(М03)2 в среду с цистеином концентрация кадмия снижалась до 9-Ю"5 М, а в среде без цистеина до 3 10'4 М, вследствие связывания С<12+ компонентами среды. После начала роста клеток при оптической плотности суспензии клеток 0,03 концентрация кадмия оставалась прежней. Однако, как только биомасса клеток увеличивалась до 0,2 Д концентрация кадмия в среде резко понижалась до Ю^ Ю"7 М. Снижение концентрации ионов С<12+ связано с образованием Сёв. Образование наночастиц С(Ш в кулыуре 5. таНорЫИа видно по разнице спектров поглощения культуральной среды после осаждения клеток 5. та1юрЫНа центрифугированием (рис. 15). На кривой 2 рис. 15 явно выражено плечо в области 350 нм, характерное для
наночастиц Сей размером 2,8 нм, тогда как в спектрах поглощения клеток 5 таМорЫНа отмытых от среды наблюдалось монотоноое увеличение поглощения в УФ- и синей областях спектра. Источником в2" был сероводород, образующийся в среде в процессе роста 5. такорЫИа.
1,0
ф
X
Ю
3
Н 0,5
0,0
Рис. 15. Спектры поглощения среды КМсп с 0.02% цистеином после осаждения Б. таНорЫИа, инкубированной без кадмия (1) ис5-10-4МСа(ЫОз)2(2).
300 320 340 360 380 длив волны, нм
400
Таким образом, присутствие гетеротрофных бактерий-спутников способных выделять сероводород повышает устойчивость N. тшеогит к кадмию. В целом отношения N. тшеогит со спутниками, устойчивыми к кадмию и способными продуцировать сульфид симбиотические. Это подтверждается тем, что выделенные клоны аксеничной культуры N тшеогит утрачивали способность роста и погибали через 1-3 месяца. Отсюда следует, что создание искусственной ассоциации цианобакггерии с гетеротрофными бактериями, устойчивыми к Сс12+ может обеспечить связывание ионов Сс!2+ и повысить устойчивость цианобактерии к токсическому действию этого тяжелого металла.
Заключение
Совокупность собственных и литературных данных позволяет заключить, что присутствие солей кадмия в среде стимулирует в цианобактериях активацию системы защиты от С<12+, которая направлена на снижение концентрации свободных ионов токсичного металла и включает следующие механизмы: ускоренный синтез и выделение во внешнюю среду полисахаридов измененной первичной структуры для дистанционной детоксикации ионов кадмия; трансформирование Сс12+ в менее токсичные частицы и кристаллиты Сей и Сё° на слизистой оболочке при участии бактерий-спутников, а также
в клетках при помощи фикобилиновых пигментов и специфического металлсвязывающего белка, типа металлотионеина, синтез которого индуцируют ионы кадмия.
Рис. 16. Гипотетическая схема системы защиты цианобактерии N. ттсогит от ионов
Схематическое изображенеие системы защитных механизмов от ионов кадмия представлены на рис. 16. Перечисленные механизмы дополняют друг друга и действуют одновременно. Энергетические затраты, связанные с преодолением Сс1-стресса, могут компенсироваться в результате активации ФС 1.
Выводы
1. Полисахариды, выделяемые N. тюсогит в культуральную среду, способны связывать ионы кадмия, предохраняя тем самым клетки от токсического воздействия С(12+. Впервые показано, что в присутствии ионов кадмия выделение полисахаридов усиливается и происходит изменение в их составе: доминирующим моносахаридом становится глюкозамин.
2. Обнаружено, что в культуре N. тшсогит инкубированной с кадмием в концентрации
не влияющей на скорость роста и морфологию, наблюдается усиление переноса энергии от ФС2 к ФС1, тогда как при концентрации Сё2+ 10'3 М,
инициирующей отмирание клеток, перенос энергии между фотосистемами сильно уменьшается.
3. Фикобилиновые пигменты способны связывать ионы кадмия in vivo и в водных растворах Показано, что в спектрах поглощения и флуоресценции N. muscorum инкубированной с ионами кадмия образуются новые полосы, которые могут быть отнесены к CdS и Cd-белковым комплексам.
4. Синтезированы наночастицы сульфида кадмия с использованием R-фикоэритрина в качестве стабилизатора. Размер частиц, связанных с R-фикоэритрином, зависит главным образом от соотношения концентраций ионов S2" и Cd2+, концентрация R-фикоэритрина не влияет на размер синтезируемых частиц CdS. Совокупность данных спектрального анализа, электронной микроскопии и капиллярного электрофореза свидетельствуют, что частицы CdS диаметром >3.2 нм представляют собой гетероагрегаты.
5. Высокая стабильность частиц CdS, совпадение их размеров с размерами (3.5 х 6 нм) полости в центре гексамера R-фикоэритрина, а также сходство электрофореграмм свободного R-фикоэритрина и в комплексе с CdS указывают, что наиболее вероятным местом синтеза наночастиц являются туннельные полости пигмента.
6. Из альгологически чистой культуры N. muscorum выделены бактерии-спутники, устойчивые к токсическому действию кадмия (в концентрации до 1 мМ) и способные выделять сероводород. Установлена принадлежность одного из кадмий-устойчивых штаммов к виду S maltophilia, предположительно участвующего в синтезе наночастиц CdS. Симбиотические взаимоотношения N muscorum со спутниками, устойчивыми к кадмию и способными продуцировать сульфид, повышают устойчивость цианобактерии к действию тяжелых металлов.
Список работ, опубликованных по материалам диссертации
1. Москвина М.И., Бреховских A.A., Бекасова О.Д., Никандров В.В. Роль слизистой оболочки цианобактерии Nostoc muscorum в связывании и детоксикации ионов кадмия // В сб. Автотрофные микроорганизмы, 2000, Москва, С. 124-125.
2. Бекасова О.Д., Бреховских A.A., Москвина М.И. О механизме детоксикации ионов кадмия цианобактерией Nostoc muscorum при участии ее внеклеточных полисахаридов // Биофизика, 2002, Т. 47, № 3, С. 515-523.
3. Bekasova O.D., Brekhovskikh A.A., Nikandrov V.V. Double-side action of cadmium ions on energy excitation transfer in cyanobacterium Nostoc muscorum // XVII Pushchino Readings in Photosynthesis and International Conference Primary Processes of Photosynthesis in Bacteria and Plant Photosystem II, 2002, Pushchino, Russia, P. 7-8.
4. Москвина М.И., Бреховских A.A., Никандров В В. Роль гетеротрофных спутников цианобактерии Nostoc muscorum в синтезе сульфида кадмия // Микробиология, 2003, Т. 72, № 2, С. 284-285.
5. Бекасова О.Д., Бреховских А.А. Влияние кадмия на поглощение и перенос энергии возбуждения в цианобактерии Nostoc muscorum // Биофизика, 2004, Т. 49, № 4, С. 692-714.
6. Brekhovskikh А.А., Moskvina M.I., Nikandrov V.V. The role of the heterotrophic bacteria associated to cyanobacterium Nostoc muscorum in detoxification of Cd and formation of CdS // Biochemical interactions of microorganisms and plants with technogenic environmental pollutants, 2003, Saratov, Russia, P. 9-10.
7. Bekasova O.D., Brekhovskikh A. A. Molecular mechanisms of cyanobacterial protection against cadmium ions // Biochemical interactions of microorganisms and plants with technogenic environmental pollutants, 2003, Saratov, Russia, P. 7-8.
8. Бреховских A.A., Бекасова О.Д. Наночастицы CdS в белковой матрице - R-фикоэритрине // Неорганические материалы, 2005, Т. 41, № 4, С. 400-406.
9. Бекасова О.Д., Бреховских А.А., Брыкина Г. Д., Дубинчук В.Т., Мочалова B.C., Котельников А.С. R-фикоэритрин как природный лиганд для детоксикации ионов кадмия и туннельная магрица для синтеза наночастиц сульфида кадмия // Прикладная биохимия и микробиология, 2005, Т. 41, № 3, С. 308-314.
10. Бекасова О.Д., Бреховских А.А R-фикоэритин, как молекулярная матрица для синтеза наночастиц сульфида кадмия И XIV Российский симпозиум по растровой электронной микроскопии и аналитическим методам исследования твердых тел (РЭМ-2005), 2005, Черноголовка, Россия, С. 239-240.
Подписано к печати 30 01.06 Тираж 100 экз. Заказ № 15 Отпечатано в ООП МГУ
XOOG{\ .
2-Г78 24 78
»
Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Бреховских, Александр Андреевич
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.
ВВЕДЕНИЕ.
ЧАСТЬ 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.
1. Распространение кадмия в окружающей среде и его токсичность по отношению к человеку.
2. Способы очистки воды от кадмия.
3. Механизмы защиты микроорганизмов от тяжелых металлов.
4. Токсическое действие тяжелых металлов на цианобактерии.
4.1. Проникновение кадмия в клетку, локализация и места воздействия.
4.2. Фотосинтетический аппарат цианобактерии и воздействие на него кадмия.
4.2.1. Фотосистема 1.
4.2.2. Электронтранспортная цепь.
4.2.3. Фотосистема II.
4.2.4. Фикобилиновые пигменты.
4.2.5. Фикобилисомы.
4.2.6. Перенос энергии возбуждения от фикобилиновых пигментов на реакционные центры.
4.2.7. Перераспределение энергии возбуждения между фотосистемами.
5. Устойчивость микроорганизмов и растений к ионам кадмия и других тяжёлых металлов.
5.1. Полисахариды слизистых оболочек и их роль в связывании тяжелых металлов.
5.2. Адсорбция тяжёлых металлов на поверхности клеток.
5.3. Внутриклеточная аккумуляция кадмия.
5.3.1. Металлсвязывающие белки.
5.3.2. Связывание ионов Cd белками.
5.3.3. Внедрение сульфида в Cd-белковый комплекс.
6. Фотохимическая активность биосинтезированных кристаллитов CdS.
ЧАСТЬ. 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ.
1. Основные объекты исследований.
1.1. Цианобактерия N. muscorum.
1.2. Stenotrophomonas maltophilia., один из выделенных спутников
N. muscorum.
1.3. Фикобилиновый пигмент R-фикоэритрин.
2. Условия выращивания цианобактерии.
3. Получение бактериологически чистой (аксеничной) культуры
N. muscorum.
3.1. Метод многократных пересевов.
3.2. Метод изоляции гормогониев.
3.3. Проверка на бактериальные загрязнения аксеничной культуры N. muscorum.
4. Выращивание бактерий-спутников.
5. Выделение бактерий-спутников N. muscorum.
5.1. Отмывание клеток от среды.
6. Выделение экзополисахаридов.
7. Определение концентрации экзополисахаридов.
8. Определение состава экзополисахаридов.
9. Качественное определение сероводорода.
9.1 Определение H2S по индикаторной бумаге с ацетатом свинца.
9.2. Определение H2S на железосодержащем агаре Клиглера.
10. Определение концентрации хлорофилла.
11. Определение ионов кадмия.
11.1. Гистохимическое определение.
11.2. Потенциометрический метод.
11.3. Спектрофотометричесий метод.
12. Метод определения филогенетического положения микроорганизмов, основанный на секвенировании гена 16S рРНК.
12.1. Выделение ДНК.
12.2. Полимеразная цепная реакция гена 16S рРНК и секвенирование полученных продуктов.
12.3. Анализ нуклеотидных последовательностей 16S рРНК.
13. Синтез наночастиц CdS на R-фикоэритрине
14. Исследование фотохимических свойств CdS на R-фикоэритрине.
15. Электрофоретическая подвижность наночастиц CdS, стабилизированных R-фикоэритрином.
16. Электронно-микроскопические исследования.
17. Спектральные измерения.
18. Разложение спектров поглощения и флуоресценции.
19. Фотографирование.
ЧАСТЬ 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.
Глава 1. Влияние ионов кадмия на N. muscorum в зависимости от их концентрации и длительности воздействия.
1.1. Морфология N. muscorum в отсутствие кадмия.
1.2. Морфологические изменения N. muscorum в зависимости от концентрации Cd2+ в среде.
1.3. Влияние кадмия на биомассу N. muscorum.
Глава 2. Роль внеклеточных полисахаридов N. muscorum в детоксикации ионов кадмия.
2.1. Обнаружение ионов кадмия, связыванных полисахаридами, по окрашиванию дитизоном.
2.2. Определение связывания ионов кадмия полисахаридами по спектрам поглощения и флуоресценции культуральной среды
2.3. Зависимость концентрации экзополисахаридов в среде от концентрации кадмия и длительности его воздействия на
N. mitscorum.
2.4. Изменение состава экзополисахаридов после инкубирования
N. muscorum с ионами кадмия.
Глава 3. Воздействие Cd на пигментную систему N. muscorum.
3.1. Образование кадмий-пигментных комплексов.
3.2. Нарушения в пигмент-пигментном взаимодействии.
Глава 4. Синтез CdS в водном растворе R-фикоэритрина.
4.1. Связывание Cd2f R-фикоэритрином.
4.2. Частицы CdS: размер, морфология, фазовое состояние.
4.3. Зависимость размера частиц CdS от условий синтеза.
4.4. Флуоресценция CdS, синтезированного на R- фикоэритрине.
4.5. Стабильность наночастиц CdS.
4.6. Фотохимические свойства CdS.
4.7. Структурная организация наночастиц CdS.
Глава 5. Сопутствующие микроорганизмы N. muscorum, штамм ВКМ-16.
5.1. Описание сопутствующих микроорганизмов, выделенных из N. muscorum.
5.2. Образование H2S сопутствующими микроорганизмами.
5.3. Влияние кадмия на рост сопутствующих микроорганизмов.
5.4. Аккумуляция ионов кадмия сопутствующими микроорганизмами.
5.5. Филогенетическое положение штамма 2В.
5.6. Влияние кадмия на рост S. maltophilia.
5.7. Связывание ионов кадмия продуктами метаболизма
S. maltophilia.
5.8. Детекция CdS в культуре S. maltophilia по спектрам поглощения.
Введение Диссертация по биологии, на тему "Защитные механизмы автотрофной цианобактерии Nostoc muscorum от токсического воздействия ионов кадмия"
В настоящее время особенно актуальна проблема загрязнения окружающей среды тяжёлыми металлами. Кадмий - один из наиболее токсичных тяжёлых металлов. Образуя прочные комплексы с аминокислотами и другими биомолекулами, содержащими тио- или алкилтиогруппировки (RS-), заменяя биометаллы в металлсодержащих ферментах, кадмий нарушает многие физиологические и метаболические процессы, как путем прямого ингибирования или активации, так и непрямым воздействием на регуляторные механизмы (Siedlecka, Krupa, 1999; Зеленин, 2000; Vymazal, 1987). Загрязнение окружающей среды тяжёлыми металлами привело к распространению устойчивых к металлам микроорганизмов. Во многих случаях устойчивость к тяжёлым металлам определяется плазмидами. Изучение конкретных видов, характеризующихся
О 4устойчивостью к высоким концентрациям Cd , представляется актуальным как в практическом, так и теоретическом аспектах. Практический интерес обусловлен использованием ряда микроорганизмов, включая цианобактерии, при разработке технологий осаждения и удаления тяжелых металлов из промышленных стоков биоаккумуляцией - более эффективным и дешевым способом удаления токсичных металлов из окружающей среды по сравнению с физико-химическими методами. Теоретический интерес обусловлен обнаружением способности у некоторых микроорганизмов, в том числе и N. musconim, к биосинтезу наночастиц CdS на поверхности или внутри клеток в процессе детоксикации ионов Cd . Детоксикация ионов кадмия через биосинтез CdS внутри клеток происходит в несколько этапов. Вначале происходит хелатирование и транспорт Cd глутатионом и родственными соединениями. На следующем этапе сульфид внедряется в комплексы кадмия с фитохелатинами. Именно на этом этапе формируются кластеры, а затем и кристаллиты CdS. Образование комплексов CdS-PC снижает токсичность кадмия. Механизм синтеза CdS у микроорганизмов и растений одинаковый (Pickering et al., 1999).
Способность микроорганизмов к детоксикации кадмия через образование кристаллов сульфида кадмия представляет особый интерес, так как они являются неорганическими полупроводниками и, обладая фотохимической активностью, способны фотосенсибилизировать биохимические окислительно-восстановительные реакции (Красновский и др., 1979; Никандров, 2000). Наночастицы неорганических полупроводников используются в качестве флуоресцентных меток в биологических системах (Chan, 2002; Larson, 2002). Взаимодействие металлсодержащих частиц с биополимерами - белками, полисахаридами клеток - играет роль в ферментативном катализе (Бучаченко, 2003).
В живых организмах синтезируются и другие полупроводники, например, оксид железа, магнентит, селенит. Частицы гидратированного оксида железа (гидроокись железа) образуются в результате окисления ионов двухвалентного железа внутри ферритина; процесс катализируется и регулируется металлотионеином. Кристаллы магнетита, обладающие магнитными свойствами образуются в магнитосомах магнитобактерий. Бактерия Stenotrophomonas maltophilia восстановливает селенат и селенит до селена (Dungan et al., 2003). Кристаллиты CdS образуются в слизистой оболочке фотосинтезирующей цианобактерии Nostoc muscorum (Бекасова и др., 1999, 2000). Однако механизм синтеза (источник сульфида) оставался не выясненым.
Наночастицы наряду с нанотрубками и нанопроволоками представляют собой основные объекты высоких технологий, которые перспективны в создании новых материалов и миниатюризации многих элементов наноэлектроники, наномеханики, нанофизики, наноинформатики (Бучаченко, 2003; Помогайло и др., 2000). Для получения наночастиц CdS применяются также методы биосинтеза (Никандров, 2000). В настоящее время налажен промышленный способ получения наночастиц сульфида кадмия из дрожжей Shizosaccharomyces pombe. Наночастицы CdS, синтезированные дрожжами, применялись для создания элементов микроэлектроники, потому что они обладают свойством идеального диода (Kowshik et al., 2002). Вместе с тем на данном этапе существуют фундаментальные проблемы выяснения механизма биосинтеза полупроводников бактериями. Ведутся работы по поиску путей активации роста гетеротрофных микроорганизмов, способных к синтезу полупроводников, с перспективой технического использования (Никандров, 1994, 2000; Недолужко, 1998).
С целью получения наночастиц-полупроводников определенного размера и свойств широко развиваются методы их синтеза. Наночастицы CdS синтезированы, в различных средах, таких как полимеры, стекло, тонкие пленки, монослои, мицеллы, липосомы (Lingdong et al., 2000; Brucher et al., 1998; Wang et al., 1994; Vassiltsova, 1999). В ряде работ (Shelli et al., 2000; Green et al., 2003; Bae et al, 1998; Dameron et al, 1989; Dameron, Winge, 1990) для стабилизации наночастиц CdS в водных растворах использовались аминокислоты, пептиды и белки, обогащенные SH-группами. Из белков в качестве лигандов для стабилизации наноразмерных частиц CdS использовался бычий сывороточный альбумин (Nedoluzhko et al., 2000; Nayar et al., 2001), ферритин (Wong et al., 1996), монослои каналообразующих белков (Wang, Uphaus, 1994; Cobbett, 2000). В качестве стабилизаторов наночастиц CdS применяются также ДНК (Shelli et al., 2000) и АТФ (Green et al., 2003). Вместе с тем проблема получения одноразмерных частиц с одинаковыми свойствами остаётся, поиск гомогенных матриц продолжается.
Выяснение возможности стабилизации наночастиц сульфида кадмия фикобилиновыми пигментами представляет интерес как для выяснения механизмов биосинтеза наночастиц со свойствами неорганических полупроводников, так и в связи с актуальной проблемой их использования в качестве флуоресцентных меток в биологических системах.
Цель работы: изучить защитные механизмы цианобактерии Nostoc muscoriun штамм ВКМ-16 от воздействия ионов кадмия.
Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Бреховских, Александр Андреевич
Выводы
1. Полисахариды, выделяемые N. muscorum в культуральную среду, способны связывать ионы кадмия, предохраняя тем самым клетки от
9 -Iтоксического воздействия Cd . Впервые показано, что в присутствии ионов кадмия выделение полисахаридов усиливается и происходит изменение в их составе: доминирующим моносахаридом становится глюкозамин.
2. Обнаружено, что в культуре N. muscorum инкубированной с кадмием в концентрации не влияющей на скорость роста и морфологию, наблюдается усиление переноса энергии от ФС2 к ФС1, тогда как при концентрации Cd 10" М, инициирующей отмирание клеток, перенос энергии между фотосистемами сильно уменьшается.
3. Фикобилиновые пигменты способны связывать ионы кадмия in vivo и в водных растворах. Показано, что в спектрах поглощения и флуоресценции N. muscorum инкубированной с ионами кадмия образуются новые полосы, которые могут быть отнесены к CdS и Cd-белковым комплексам.
4. Синтезированы наночастицы сульфида кадмия с использованием R-фикоэритрина в качестве стабилизатора. Размер частиц, связанных с R-фикоэритрином, зависит главным образом от соотношения концентраций ионов S ' и Cd , концентрация R-фикоэритрина не влияет на размер синтезируемых частиц CdS. Совокупность данных спектрального анализа, электронной микроскопии и капиллярного электрофореза свидетельствуют, что частицы CdS диаметром >3.2 нм представляют собой гетероагрегаты.
5. Высокая стабильность частиц CdS, совпадение их размеров с размерами (3.5 х 6 нм) полости в центре гексамера R-фикоэритрина, а также сходство электрофореграмм свободного R-фикоэритрина и в комплексе с CdS указывают, что наиболее вероятным местом синтеза наночастиц являются туннельные полости пигмента.
6. Из альгологически чистой культуры N. muscorum выделены бактерии-спутники, устойчивые к токсическому действию кадмия (в концентрации до 1 мМ) и способные выделять сероводород. Установлена принадлежность одного из кадмий-устойчивых штаммов к виду S. maltophilia, предположительно участвующего в синтезе наночастиц CdS. Симбиотические взаимоотношения N. muscorum со спутниками, устойчивыми к кадмию и способными продуцировать сульфид, повышают устойчивость цианобактерии к действию тяжелых металлов.
Заключение
Вышеизложенные результаты доказывают, что высокая устойчивость N. muscorum к токсическому воздействию ионов кадмия обусловлена функционированием целой системы защитных механизмов. Комплексные определения концентрации и первичной структуры экзополисахаридов в культуральной среде, связывания ионов кадмия полисахаридами (по реакции с дитизоном), биомассы и морфологии цианобактерии после инкубирования
9 4
N. muscorum с ионами Cd в различных концентрациях показали, что N. muscorum активно и избирательно выделяет полисахариды во внешнюю среду в условиях Cd-стресса. Кадмий индуцирует усиление экскреции полисахаридов измененной первичной структуры: доминирующим моносахаридом становится глюкозамин, который легко присоединяет ионы Cd . Прослеживается связь структуры внеклеточных полисахаридов с их функцией протектора от токсического воздействия тяжелых металлов.
Сравнительное изучение воздействия Cd в различных концентрациях на перенос энергии возбуждения между пигментами в N. muscorum показало двойственный эффект ионов кадмия на этот процесс: при концентрации Cd инициирующей отмирание клеток, перенос энергии от ФС 2 к ФС 1 уменьшается или совсем не происходит, тогда как при концентрации кадмия не влияющей на скорость роста и морфологию цианобактерии, перенос энергии возбуждения от ФС 2 к ФС 1 усиливается. Последнее коррелирует с потребностью клеток в дополнительной энергии для синтеза полисахаридов в больших количествах и металлсвязывающего белка, типа металлотионеина. Не исключено участие CdS в качестве дополнительного донора электрона, когда расход энергии клеткой повышается с усилением обменных процессов, направленных на детоксикацию кадмия. В модельных системах, используя в качестве донора электрона наночастицы CdS, стабилизированные фикоэритрином, мы наблюдали фотовосставление метилвиологена, значение восстановительного потенциала у которого близко к таковому ферредоксина (Ео' = -0,43 В), акцептору электрона ФС 1. Вывод согласуется с данными об
О 4увеличении фотохимической активности ФС 1 при воздействии ионов Cd на Synechococcus elongatus (Tumova, Sofrova, 2002) значительное увеличение отношения АТФ/АДФ при экспозиции цианобактерии Synechocystis aquatilis с кадмием (Pawlik, Skowronski, 1999), а также серией работ об участии металлов в окислительно-восстановительных фотореакциях, сенсибилизированных CdS и катализируемых ферментами (Никандров и др, 1994; Nedoluzhko et al., 1996; Никандров, 1998, 2001; Задворный и др., 2000).
Выяснение условий синтеза наночастиц CdS, стабилизированных фикоэритрином, и исследование их физико-химических свойств представляет самостоятельный интерес, благодаря уникальным фотофизическим и химическим свойствам наноразмерных частиц неорганических полупроводников, обусловивших их широкое применение в различных областях науки и техники. Синтез CdS на фикоэритрине аналогичен синтезу наночастиц в структурированных средах, имеющих туннелеобразные свободные пространства, подобные порам в цеолитах (Wang, Herron, 1987) или в белковых монослоях свернутых в трубку (Wang et al., 1994). Такого типа белки могут использоваться, когда требуются очень малые реакционные объемы. Описаны сотни белковых систем, имеющих туннельные пространства (Trindade et al., 2001). Функции подобных белков in vivo связаны с процессами регуляции и узнавания. Концентрация таких белков in vivo ничтожно мала, что осложняет их применение на практике, тогда как содержание фикоэритрина в водорослях достигает 60 % от суммарного белка. К тому же R-фикоэритрин хорошо изучен н охарактеризован, имеется в каталогах ведущих фирм-производителей химреактивов. Использование R-фикоэритрина для синтеза и стабилизации CdS обеспечивает получение наночастиц одного размера и устойчивых по свойствам, если избегать условий, вызывающих диссоциацию R-фикоэритрина. Полученные результаты могут быть использованы в разработке лекарственных препаратов и открывают новые возможности для Cd-нейтронозахватной терапии.
Как показывают результаты работы, культура цианобактерии N. muscorum, в которой ранее обнаружено образование кристаллитов CdS, содержит значительное количество гетеротрофных бактерий-спутников. Некоторые бактерии-спутники устойчивы к токсическому действию ионов о кадмия при концентрации до 1(Г М и способны выделять сероводород. Учитывая это, можно заключить, что синтез кристаллитов CdS в культуре цианобактерии N. muscorum происходит в результате взаимодействия ионов кадмия с образуемым спутниками сульфидом. Таким образом, высокая устойчивость N. muscorum к кадмию обусловлена переводом кадмия в нерастворимую, менее токсичную форму в результате связывания кадмия с компонентами слизистой оболочки цианобактерии и экзометаболитами бактерий-спутников. В целом отношения N. muscorum со спутниками, устойчивыми к кадмию можно признать симбиотическими, обеспечивающими повышение устойчивости цианобактерии к действию тяжелых металлов.
Совокупность собственных и литературных данных позволяет заключить, что присутствие солей кадмия в среде стимулирует в цианобактериях активацию системы защиты от Cd , которая направлена на снижение концентрации свободных ионов токсичного металла и включает следующие механизмы: ускоренный синтез и выделение во внешнюю среду полисахаридов измененной первичной структуры для дистанционной
7 4детоксикации ионов кадмия; трансформирование Cd в менее токсичные частицы и кристаллиты CdS и Cd° на слизистой оболочке при участии бактерий-спутников, а также в клетках при помощи фикобилиновых пигментов и специфического металлсвязывающего белка, типа металлотионеина, синтез которого индуцируют ионы кадмия. Схематическое изображение системы защитных механизмов от ионов кадмия представлено на рис. 67.
Рис. 67. Гипотетическая схема системы защиты цианобактерии N. muscorum от ионов Cd2+.
Перечисленные механизмы дополняют друг друга и действуют одновременно. Энергетические затраты, связанные с преодолением Cd-стресса, компенсируются в результате активации ФС 1.
Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Бреховских, Александр Андреевич, Москва
1. Бекасова О.Д., Бухое Н.Г., Карапетян Н.В. Темновые и фотоиндуцированные изменения поглощения и флуоресценции фикобилисом в присутствии дитионита // Биохимия. 1981. Т. 46. № 2. С. 287-295.
2. Бекасова О.Д, Муслимое И.А., Красновский А.А. Фракционирование фикобилисом синезеленой водоросли Nostoc muscorum II Молкул. Биол. 1984. т. 18. №1. С. 262-271.
3. Бекасова О.Д., Орлеанский В.К., Никандров В. В. Аккумуляция кадмия, титана и алюминия цианобактерией Nostoc muscorum II Микробиология 1999. Т. 68, №6, С. 851-859.
4. Бекасова О.Д., Холоденко Н.Я., Макаров А.Д. Аденилаткиназная активность фикобилисом, выделенных из синезеленой водоросли Mycrocystis aerogenosa И Биохимия. 1981. Т. 46. № 3. С. 525-529.
5. Белокобыпьский А.И., Цибахашвили Н.Я., Рчеулишвши А.Н., Хизанишвжи А.И., Мосулишвили JT.M. Связывание ионов Cd(II) с С-фикоцианином в процессе роста клеток Spirulina platensis II Биофизика. 2001. Т. 46. Вып. 4. С. 652-655.
6. Бурдин КС., Полякова Е.Е. Металлотионеины, их строение и функции // Успехи современной биологии. 1987.103. 390-402.
7. Бучаченко A.JI. Нанохимия прямой путь к технологиям нового века // Успехи химии, 2003. том 72. №5. 419-437.
8. Войткевич Г.В. Возникновение и развитие жизни на Земле. -М: Наука. 1988. 144 с.
9. Герасименко Л.М., Гончарова И.В., Жегалло Е.А., Заварзин Г.А., Зайцева Л.В., Орлеанский В.К, Розанов А.Ю., Ушатинская Г.Т. Процесс минерализации (фосфатизации) нитчатых цианобактерий // Литология и полез. Ископаемые. 1996. №2. С. 208-214.
10. Герасименко Л.М., Гончарова И.В., Зайцева Л.В. Влияние содержания фосфора в среде на рост и минерализацию цианобактерий // Микробиология.1998. Т. 67. № 2. С. 249-254.
11. Герасименко Л.М., Заварзин Г.А., Розанов А.Ю., Ушатинская Г. Т. Роль цинобактерий в образовании фосфатных минералов // Журн. Общ. Биол.1999. Т. 60. №4. С. 415-430.
12. Глазовская М.А., Добровольская Н.Г. Геохимические функции микроорганизмов. МГУ. Москва. 1984. 153 с.
13. Егоров Н.С. Руководство к практическим занятиям по микробиологии, 3-е издание. -М. Изд-во МГУ. 1995. с.224.
14. Ерохина Л.Г., Красновский А.А. Влияние денатурирующих воздействий на спектры поглощения и флуоресценции фикоэритрина из Callithamnion rubosum. II Молекул, биол.1968. Т. 2. № 4. с. 550-561.
15. Заварзин Г.А. Лекции по природоведческой микробиологии / Отв. ред.
16. Н.Н.Колотилова. Ин-т микробиологии. М.: Наука. 2003. 348с.
17. Заварзин Г. А., Колотилова Н.Н. Введение в природоведческуюмикробиологию // Книжный дом "Университет". 2001. 256 с.
18. Задворный О.А., Зорин Н.А., Гоготов И.Н, Горленко В.М. Свойствастабильной гидрогеназы пурпурной серной бактерии Lamprobactermodestohalophilus II Биохимия. 2004. Т. 69. № 2. С. 204-210.
19. Задворный О.А., Зорин Н.А., Гоготов И.Н. Влияние ионов металлов нагидрогеназу пурпуной серобактерии Thiocapsa roseopersicina II Биохимия.2000. Т. № 11. С. 1525-1529.
20. Зеленин КН. Что такое химическая экотоксикология // Соросовский образовательный журнал. 2000. Т.6. № 6. С. 32-36.
21. Иванов А.Ю., Гаврюшкин А.В., Сиунова Т.В., Хасанова Л.А., Хасанова З.М. Устойчивость некоторых штаммов бактерий рода Pseudomonas к повреждающему действию ионов тяжёлых металлов // Микробиология. 1999. Т. 68. №3. С. 366-374.
22. Карамушка В.И., Грузина Т.Г., Ульберг З.Р. Аккумуляция золота (III) клетками цианобактерии Spiralinaplatensis // Микробиология. 1995. Т. 64. № 2. С. 192-196.
23. Карапетян Н.В. Организация и функция пигмент-белковых комплексов фотосистемы 1 цианобактерий Spirulina // Биол. Мембраны. 1998. Т. 15. С. 461-471.
24. Карапетян Н.В. Фотосистема 1 цианобактерий: организация и функции // Успехи биологической химии. 2001. Т. 41. С. 39-76.
25. Карапетян Н.В. Тримеры фотосистемы 1 цианобактерий: организация и функционирование // III Съезд Фотобиологов России. Воронеж. 2001. С. 8687.
26. Кипраанова Е.А., Смирнов В.В., Бойко О.И., Фацевич Т.А. Усвоение минеральных форм серы и азотное питание Xanthomonas maltophilia!I Микробиология, 1995, том 64, №3, с.ЗЗ 1-335.
27. Козлов Ю.Н. Оловянишникова Г.Д., Шкуропатова В. А. // Тезисы докл. на
28. Всесоюзной конф."Преобразование световой энергии в фотосинтезирующихсистемах и их моделях" Пущино, 26-30 июня 1989 г., С. 35-36.
29. Красновский А.А., Брин Г.П., Луганская А.Н., Никандров В.В.
30. Фотосенсибилизация окислительно-восстановительных реакций сульфидомкадмия // Докл. АН СССР. 1979. т. 249. № 4. С. 896-899.
31. Красновский А.А., Евстигнеев В.Б., Брин Г.П., Гаврилова В.А. Выделениефикоэритрина из красных водорослей, его спектральные и фотохимическиесвойства // Докл. АН СССР. 1952. Т. 82. № 6. С. 947-950 .
32. Кузин A.M. Биологически активные полисахариды // Успехи биологическойхимии. 1954. Т. 2. С. 256-276.
33. Лебедева А.Ф., Саванина Я.В., Барский Е.Л., Гусев М.В. Устойчивость цианобактерий и микроводорослей к действию тяжелых металлов: роль металлсвязывающих белков // Вестник Московского Университета. Сер. 16. Биология. 1998. № 2. 42-49.
34. Литвин Ф.Ф., Беляева О.Б., Гуляев Б.А., Сипещеков В.А. II Тр. Моск. об-ва испытателей природы. 1973. Т. XLIX. Проблемы биофотохимии. М.: Наука. С.132-147.
35. Литвин Ф.Ф., Сипещеков В.А, Шубин В.В. Исследование миграции энергии между нативными формами хлорофилла при -196 °С методом сенсибилизированной флуоресценции // Биофизика. 1976. Т. 21. №. 4. С. 669675.
36. Мажорова Л.Е., Болычевцева Ю.В., Рахимбердиева М.Г., Терехова КВ., Карапетян Н.В. Световая деградация фотосистемы 1 у цианобактерии Spirulina platensis в условиях холодвого стресса // // III Съезд Фотобиологов России. Воронеж. 2001. С. 127-128.
37. Недолужко A.M. Участие металлов в окислительно-восстановительных фотореакциях, сенсибилизированных сульфидом кадмия и катализируемых ферментами / Автореф. Дисс. канд. биол. наук. 1998.
38. Недолужко A.M., Белоплотова Я.В., Никандров В.В. Фотохимические реакции, сенсибилизированные частицами сульфида кадмия, содержащими на поверхности металлы и редокс-белки // Труды II съезда фотобиологов России. Пущино. 1998.
39. Овчаренко Ф.Д., Улъберг З.Р., Гарбара С.В., Коган Б.С., Перцов Н.В. II Докл. АН СССР, 1985,284,711.
40. Оловяниитикова Г.Д. Фотохимические свойства хлорофилла и его металлоаналогов / Автореф. канд. хим. наук. 1979.
41. Панкратова Е.М. Азотфиксирующие цианобактерии как основа микробных консорцумов // Автотрофные микроорганизмы: К 75-летию со дня рождения академика РАН Е.Н. Кондратьевой, МГУ им. М.В. Ломоносова, 2000, 140141
42. Пиневич А.В., Аверина С.Г. Оксигенная фототрофия // СПб.: Изд-во С.-Петерб. Ун-та. 2002. 236 с.
43. Помогашо А.Д., Розенберг А. С., Уфлянд И.Е. Наночастицы металлов в полимерах / М.: Химия, 2000. 672с.
44. Попова В.В. Влияние селена и цинка на рост Spirulina platens is и оптимизация внутриклеточного накоплении этих элементов // автореферат диссертации на соискание ученой степени к.б.н. По специальности биотехнология 2004.
45. Саванина Я.В., Лебедева А.Ф., Гусев М.В. Способноть цианобактеий и микроводорослей к накопелнию тяжелых металлов и возможность их использования для очистки водной среды // Вестн. Моск. Университета. Сер. Биология. 1999. №3. С. 3-12.
46. Саванина Я.В., Лебедева А.Ф., Гусев М.В. Микроводоросли и цианоактерии: устойчивость к действию тяжелых металлов // Вестник Московского Университета. Сер. 16. Биология. 2001. № 3. 14-24.
47. Смирнов В.В, Киприанова Е.А. Бактерии рода Pseudomonas. Киев: Наук, думка, 1990, 220
48. Сообщение UCS-INFO.412, 29 апреля 1999 г. Juhasz A.L., Stanley G.A., Britz M.L.
49. Уильяме У.Дж. Определение анионов / Справочник. Пер. с англ.-М.: Химия. 1982. 624 с.
50. Хаулт Дж., Крик Н., Смита П., Стейли Дж., Уилльямс С. Определитель бактерий Берджи ЦТ Л. Москва "Мир". 1997. 430 с.
51. Черепков К.А. Черныш Г.И., Динельт В.М., Сухарев Ю.И. Утилизация вторичных материальных ресурсов в металлургии // М.: Металлургия. 1994. 224 с.
52. Шишкова Е.И. Аккумуляция ионов металлов экзополисахаридами N. linckia //Алгология. 2005. Т. 15. № 2. С. 172-180.
53. Щербов Д.П., Матвеец М.А. Аналитическая химия кадмия / Ред. Ю.Ю.Лурье; АН СССР. Институт геохимии и аналитической химии. М.: Наука. 1973. 254 с.
54. ЭдсолДж., ГатфрендХ. Биотермодинамика/М.: Мир. 1986. ЭйхлерВ. Яды в нашей пище/М.: Мир 1985 г. 214 с.
55. Adams D.G., Duggan P.S. Heterocyst and akinete differentiation in cyanobacteria //New Phytologist. 1999. V. 144. № 1. P. 3-33.
56. Aiking H., Stijnman A., Garderen С. V., Heerikhuizen H. V., RietJ. V. T. Inorganic phosphate accumulation and cadmium detoxification in Klebsiella aerogenes NCTC 418 growing in continuous culture // Appl. Environ. Microbiol. 1984. V. 47. P. 374-377.
57. Anderson J.M. Photoregulation of the composition, function and structure of thylakoid membranes // Ann. Rev. Plant. Physiol. 1986. V.37. P. 93-136.
58. Babich H., Stotzky G. Effects of Cadmium on the Biota: Influence of
59. Environmental Factors // Adv. Appl. Microbiol. 1978. V. 23. P. 55-117.
60. Bae W., Abdullah R., Mehra R.K. Cysteine-mediated synthesis of CdSbionanocrystallites // Chemosphere. 1998. Vol. 37. № 2. P. 363-385.
61. Bae W., Mehra R.K. Properties of glutathione- and phytochelatin-capped CdSbionanocrystallites // J. Inorg. Biochem. 1998. Vol. 69. № 1-2. P. 33-43
62. Barbas J., Santhanagopalan V., Blaszczynski M., Ellis W.R. Jr., Winge D.R.
63. Conversion in the peptides coating cadmium sulfide crystallites in Candidaglabrata II J. Inorg. Biochem. 1992. Vol. 48. ЛЬ 2. P. 95-105.
64. Barber J., Kuhlbrandt W. Photosystem II // Curr. Opin. Struct. Biol. 1999. v. 9. P.469.475.
65. Barber S.A., Lee R.B. The effect of microorganisms on the absorption ofmanganese by plants // New Phytol. 1974.Vol. 73 P. 97-106.
66. Bellezza S., Paradossi G., De Philippis R., Albertano P. Cytochemical andphysico-chemical characterisation of exopolysaccharides in Leptolyngbya sp.strains from Roman hypogea: looking for new approaches in conservation of stone*
67. Journal of Applied Phycology. 2003. V. 15. P. 193-200.
68. Bender J., Rodriguez-eaton S., Ekanemesang U.M. and Philips P. Charactererization of metal-binding bioflocculants produced by the cyanobacterial component of mixed microbial mats // Appl. Environ. Microbiol. 1994. Vol. 60. № 7. P. 2311-2315.
69. Bruce D., Salehian O. Laser-induced optoacoustic calorimetry of cyanobacteria. The efficiency of primary photosynthetic processes in state 1 and state 2 // Biochim. Biophys. Acta. 1992. V. 1100. P. 242-250.
70. Bruchez M. Jr., Moronne M., Gin P., Weiss S., Alivisatos A.P. Semiconductor nanocrystals as fluorescent biological labels // Science. 1998. V. 281. № 5385. P. 2013-2015.
71. Canaani O.D., Gantt E. Circular dicroism and polarized fluorescence characteristics of blue-green algal allophycocyanins // Biochemistry. 1980. V. 19. P 2950-2956.
72. Capuano V., Braux A.S., Tandeau N. de Marsac, Houmard J. The "anchor polypeptide" of cyanobacterial phycobilisomes. Molecular characterization of the Synechococcus sp. PCC6301 apcB gene // J. Biol. Chem. 1991. V. 266. P. 72397247.
73. Chang W.R., Jiang Т., Wan Z.L., Zhang J.P., Yang Z.X., Liang D.C. Crystal Structure of R-phycoerythrin from Polysiphonia urceolata at 2.8 A Resolution // J. Mol. Biol. 1996. V. 262. № 5. P. 721-731.
74. Chereskin B.M., Clement-Metral J.D., Gantt E. Characterization of a purified Photosystem II-phycobilisome particle preparation from Porphyridium cruentum //PlantPhysiology. 1985. V. 77. P. 626-629.
75. Cobbett C.S. Phytochelatins and their roles in heavy metal detoxification // Plant Physiology. 2000. V. 123. N 3. P. 825-832.
76. Coblenz A., WolfK. The role of glutathione biosynthesis in heavy metal resistance in the fission yeast Schizosaccharomyces pombe II FEMS Microbiol. Rev. 1994. Vol. 14. №4. P. 303-308.
77. Costley S.C., Wallis F.M. Bioremediation of heavy metals in a synthetic wastewater using a rotating biological contactor 11 Water Res. 2001. V. 35. P. 3715-3723.
78. Crowley DE, Wang YC, Reid CPP, Szansiszlo PJ. Mechanism of iron acquisition from siderophores by microorganisms and plants // Plant and Soil 1991. Vol. 130. P. 179-198.
79. Demidov A.A., Borisov A. Yu. Computer simulation of energy migration in the C-phycocyanin of the blue-green algae Agmenellum quadruplicatum II Biophys. J. 1993. V. 84. P. 1375-1384.
80. Dodds W.K., Gudder D. A., Mollenhauer D. The ecology of Nostoc II J. of Phycol. 1995. Vol. 31. P. 3-18.
81. Dorssen R.J., Breton J., Plijiter J.J., Satoh K., Gorkom H.J., Amesz J. Spectroscopic properties of the reaction center and of the 47 kDa chlorophyll protein of Photosystem III I Biochim. Biophys. Acta. 1987. V. 893. P. 267-274.
82. Dubois M., Gilles К., Hamilton J.K., Rebers P.A., Smith F. Colorimetric method for determination of sugars and related substances // Analytical Chemistry. 1956. Vol. 28. № 3. P. 350-356.
83. Duysens L.N.M. The discovery of the two photosynthetic systems: a personal account //Photosynth. Res. 1989. V. 21. P. 61-79.
84. Fernandez-Pi nas F., Mateo P., Bonilla I. Effect of Cadmium in the Bioelement Composition of Nostoc UAM208: Interaction with Calcium// Bull. Environ. Contam. Toxicol. 1997. Vol. 58. P. 543-549.
85. Fernandez-Pi nas F., Mateo P., Bonilla I. Ultrastructural-changes induced by selected cadmium concentrations in the cyanobacterium Nostoc Uam208 // Journal Plant Physiology. 1995. V. 147. № 3-4. P. 452-456.
86. Fromme P., Melkozernov A., Jordan P., Krauss N. Structure and function of photosystem I: interaction with its soluble electron carriers and external antenna systems // FEBS Letters. 2003. V. 555. P. 40-44.
87. Fujimori E., Pecci J. Dissociation and Association of Phycocyanin // Biochem. 1966. V. 5. № 11. P. 3500-3508.
88. Fyfe W.S. The enviromental crisis: quantifying geosphere interactions// Science.1981. V. 213. № 4503. P. 105-110.
89. Gabrielli D.R., Piccini E. Copper thionein in Tetrahymena pigmentosa II J. Eukaryotic Microbiol. 1995. V. 42. №3. 21
90. Giddings Т.Н., Wassman C., Staehelin L.A. Structure of the thylakoids and envelope membranes of the organelles of Cyanophora paradoxa II Plant Physiol. 1983. V. 71. P. 409-417.
91. Glaser A.N. Phycobilisomes: structures and dynamics // Ann. Rev. Micribiol.1982. V.36. P. 173-198.
92. Glaser A.N. Light guides. Directional energy transfer in a photosynthetic antenna // J. Biol. Chem. 1989. V. 264. № 1. P. 1-4.
93. Glazer A.N., Yeh S.W., Webb S.P. Clark J.H. Disc-to-disc transfer as the rate-limiting step for energy flow in phycobilisomes // Science. 1985. V. 227. P. 419423.
94. Gloaguen V., Morvan H. And Hoffman L. Released and capsular polysaccharides of Oscillatoriaceae ( Cyanophyaceae, Cyanobacteria ) // Alg. Studies. 1995. V. 78. P. 53-69.
95. Gloaguen V., Morvan H., Hoffman L. Metal accumulation by immobilized cyanobacterial mats from a thermal spring // Environmental Science. Health. 1996. V.31.P. 2437-2451.
96. Grassi M, Mingazzini M, Mosca L., Onorato L. Metal complexation mechanisms in the gree alga Selenasrum capricornutrum II 2nd European Phycological Congress. Italy. 1999. Books of abstracts, p. 134.
97. Green M., Taylor R., Wakefield G. The synthesis of luminescent adenosine triphosphate passivated cadmium sulfide nanoparticles // J. Mat. Chem. 2003. 13. №8. 1859-1861.
98. Grill E., Winnacker E.L., Zenk M.H. Phytochelatins // Methods Enzymol. 1991. Vol. 205. P. 333-341.
99. Grossman A.R., Schaefer M.R., Chiang G.G., Collier J.L. Environmental effects on the light-harvesting complex of cyanobacteria// J. Bacteriol. 1993. V. 175. P. 575582.
100. Halfen L.N., Castenholz R.W. Gliding motility in the blue-green alga Oscillatoria princes II J. Phycol. 1971. V. 1971. P. 15-22.
101. Hall J.L. Cellular mechanisms for heavy metal detoxification and tolerance // J. experim. Botany. 2002. Vol. 53. № 366. P. 1-11.
102. Henglein A. Small-particle research: Physicochemical properties of extremely small colloidal metal and semiconductor particles // Chem. Rev. 1989.V. 89. P. 1861-1873.
103. Holmes J. D., Farrar J. A., Richardson D. J., Russell D. A., Sodeau J. R. Photoprotection through Extrac Rauser W.E. Phytochelatins and related peptides. Structure, biosynthesis, and function. // Plant Physiology. 1995. Vol. 109. P. 11411149.
104. Howden R., Goldsbrough P.B., Andersen C.R., Cobbett C.S. Cadmium-Sensitive, cadi Mutants of Arabidopsis thaliana Are Phytochelatin Deficient 11 Plant. Physiol. 1995. Vol. 107. P. 1059-1066.
105. Jensen Т.Е., Baxter M., Rachlin J. W. Uptake of Heavy Metals by Plectonema boryanum (Cyanophyceae) into Cellular Components, Especially Polyphosphate Bodies: an X-ray Energy Dispersive Study // Environmental Pollution. (Ser .A). 1982. V. 27. P. 119-127.
106. Jin-An He, Yi Zhen Ни, Li-Jin Jiang Photodynamic action of phycobiliproteins: in situ generation of reactive oxygen species // Biochim. Biophys. Acta. 1997. V. 1320. №2. P. 165-174.
107. Jordan P., Fromme P., Witt H. Т., Klukas O., Saenger W., Krauss N. Three-dimensional structure of cyanobacterial photosystem I at 2.5 A resolution // Nature. 2001. V. 411. P. 909-917.
108. Kagi J.N.R. Purificarion and primary structure of snail metallothionein. Similarity of the N-terminal sequenence with histones H4 and H2A // Eur. J. Biochem. 1993. 216. №3.739-746.
109. Kesseler A., Brand M.D. Localisation of the sites of action of cadmium on oxydative phosphorilation in potato tuber mitochondria using top-down elasticity analisis//Eur. J.Biochem. 1994. V. 225. P. 897-906.
110. Kirilovsky D., Ohad I. Functional assembly in vitro of phycobilisomes with isolated photosystem II particles of eukaryotic chloroplasts // J. Biol. Chem. 1986. V. 261. №26. P. 12317-12323.
111. Kligler I. J. Modifications of culture media used in the isolation and differentiation of typhoid, dysentery, and allied bacilli // J. Exp. Med. 1918 V. 28. № 3. P. 319322.
112. Kneer R., Zenk M.H. The formation of Cd-phytochelatin complexes in plant cell cultures//Phytochemistry. 1997. Vol. 44. P. 69-74.
113. Korgel B.A., Monbouquette H. G. Synthesis of size-monodisperse CdS nanocrystals using phosphatidylcholine vesicles as true reaction compartments // J. Phys. Chem. 1996. V. 100. № 1. P. 346-351.
114. Kozdroj J., Dirk van Elsas. Response of the bacterial community to root exudates in soil polluted with heavy metals assessed by molecular and cultural approaches // Soil Biology & Biochemistry. 2000. V. 32. P. 1405-1417.
115. Kratz W.A., Myers J. Nutrition and growth of several blue-green agae // Amer.J. Bot. 1955. V. 42. P. 282-287.
116. Kuhlbrandt W. Dual approach to a light problem // Nature. 2003. V. 426. № 6965. P. 399-400.
117. Malekzadeh F., Farazmand A., Ghafourian H., Shahamat M, Levin M., and Colwell R.R. Uranium accumulation by a bacterium isolated from electroplating effluent // World Journal of Microbiology & Biotechnology. 2002. Vol. 18. № 4. P. 295-300.
118. Maxon P., Sauer K., Zhou J., Bryant D.A., Glazer A.N. Spectroscopic studies of cyan obacte rial phycobilisomes lacking core porypeptides // Biochim. Biophys. Acta. 1988. V. 977. P. 40-51.
119. Mehra R.K., Miclat J., Kodati V.R., Abdullah R., Hunter T.C., Mulchandani P. Optical spectroscopic and reverse-phase HPLC analyses of Hg(II) binding to phytochelatins // Biochem. J. 1996. Vol. 314. P. 73-82.
120. Mehra R.K., Mulchandani P., Hunter T.C. Role of CdS Quantum Crystallites in Cadmium Resistance in Candida glabrata II Biochem. Biophys. Res. Commun. 1994. Vol.200. P. 1193-1200.
121. Mimuro M., Lipschultz C.A., Gantt E. Energy flow in the phycobilisome core of Nostoc sp. (MAC): two independent terminal pigments // Biochim. Biophys. Acta. 1986. V. 852. P. 126-132.
122. Mullen M. D., WolfD. C., Ferris F. G., Beveridge T. J., Flemming C. A., Bailey G. W. Bacterial sorption of heavy metals // Appl. Environ. Microbiol. 1989. V. 55. P. 3143-3149.
123. Mullineaux C. W. Allen J.F. Fluorescence induction transients indicate dissociation of photosystem II from the phycobilisome during the state 2 transition in the cyanobacterium Synechococcus 6301 // Biochim. Biophys. Acta. 1988. V. 934. P. 96-107.
124. Murasugi A., Wada-Nakaga\va C., Hayashi Y. Formation of cadmium-binding peptide allomorphs in fission yeast // J. Biochem. (Tokyo) 1984. Vol. 96. P. 13751379.
125. Murata N. Control of excitation transfer in photosynthesis. Light-induced change of chlorophyll a fluorescence in Porphyridium cruentum II Biochim. Biophis. Acta. 1969. V. 172. P. 242-251.
126. Navar S., Sinha A, Das S., Das S. K., Rao P.R. In situ synthesis of nanosized cadmium sulfide using bovine serum albumin // J. Materials Sci. Lett. 2001. V. 20. №23. P. 2099-2100
127. Nies D. H. Efflux-mediated heavy metal resistance in prokaryotes // FEMS Microbiology Reviews, 2003, 27, 313-339.
128. Nies D. H. Microbial heavy-metal resistance // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1999. V.51.P. 730-750.
129. Nies D. H. Resistance to cadmium, cobalt, zinc, nickel in microbes // Plasmid. 1992. V. 27. P. 17-28.6 hEocha C. Biliproteins of Algae // Ann. Rev. Plant Physiol. 1965. V 16. P. 415434.
130. PanajJ J.U., Josel F. Selection by anion-exchange chromatography of exopolysaccharide mutants of the cyanobacteium Synechocystis strain PCC 6803 // Appl. Environ. Microbiol. 1989. V. 55. P. 1452-1456.
131. Park CH, Keyhan M, Matin A. 1999. Purification and characterization of chromate reductase in Pseudomonas putida. Abs. Gen. Meet. Amer. Soc. Microbiol. V. 99. P. 536.
132. Pawlik B, Skowronski T. Transport and toxicity of cadmium its regulation in the cyanobacterium Synechocystis aquatilis II Envron. Experim. Bot. 1999. V. 34. P. 225-233.
133. Presta A., Creen A.R., Zelazowski A., Stillman M.J. Copper binding to rabbit liver metallothionein: formation of a continuum of copper (I) thiolate stoichiometric species // Europ. J. Biochem. 1995. 227. № 1-2. P. 227-270.
134. Prosperi С. H. A cyanophyte capable of fixing nitrogen under high levels of oxygen//J. Phycol. 1994. V. 30. P. 222-224.
135. Rachlin J.W., Jensen Т.Е., Warkentine B. //Arch. Environ. Contam. Toxicol. 1984. V.13.P. 143-151.
136. Rai L.C., Gaur J.P., Kumar H.D. Phycology and heavy-metal pollution // Biol. Rev. 1981. V. 56. P. 99-151.
137. Reddy G.N., Prasad M.N. Heavy metal binding proteins. Polypeptides: occurrence, structure, synthesis and function // Environ. Experimen. Botany. 1990. V. 30. № 3. P. 251-264.
138. Reese R.N., Wagner G.J. Properties of tobacco (Nicotiana tabacum) cadmium-binding peptide(s). Unique non-metallothionein cadmium ligands // Biochem. J. 1987. Vol. 241. P. 641-647.
139. Renter W, Nickel C., Wehrmeyer W. Isolation of allophycocyanin В from Khodella violacea results in a model of the core from hemidiscoidal phycobilisomes of Rhodophyceae IIFEBS Lett. 1990. V. 273. P. 155-158.
140. Reuter W., Wehrmeyer W. Core substructure in Mastigocladus laminosus phycobilisomes. II. The central part of the tricylindrical core — АРсм — contains the "anchor" polypeptide and no allophycocyanin В // Arch. Microbiol. 1990. V. 153. P. 111-117.
141. Riethman H., Bullerjahn G., Reddy K.J., Sherman L.A. Regulation of cyanobacterial pigment-protein composition and organization by environmental factors//Photosynth. Res. 1988. V. 18. P. 133-161.
142. Rippka R. Isolation and Purification of Cyanobacteria // Methods in enzymology 1988. V. 167. P. 3-27.
143. Robinson N.J., Jackson P.J. "Metallothionein-like" metal complexes in angiosperms; their structure and function // Physiol. Plant. 1986. V. 67. P. 499506.
144. Salt D.E., Pickering I.J., Prince R.C., GlebaD., Dushenkov S., Smith R.D., Raskin I. Metal Accumulation by Aquacultured Seedlings of Indian Mustard // Environ. Sci. Technol. 1997. Vol. 31. P. 1636-1644.
145. Salt D.E., Prince R.C., Pickering I. J., Raskin I. Mechanisms of Cadmium Mobility and Accumulation in Indian Mustard // Plant Physiol. 1995. Vol. 109. P. 14271433.
146. Schirroer Т., Bode W., Huber R. Refining three-dimensional structures of two cyanobacterial C-phycocyanins at 2.1 and 2.5 A resolution. A common principle of phycobilin-protein interaction // J. Mol. Biol. 1987. V. 196. P. 677-695.
147. Schluchter W.M., Bryant D.A. Molecular characterization of ferredoxin NADP+ oxidoreductase //Biochemistry. 1992. V. 31. № 12. P. 3092.
148. Scot, J. A., Palmer S. J. Sites of cadmium uptake in bacteria used for biosorption // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1990. V. 33 P. 221-225.
149. Shubin V. V., Murthy S.D.S, Karapetyan N. V., Mohanty P. Origin of the 77 К variable fluorescence at 758 nm in the cyanobacterium Spirulina platensis II Biochim. Biophys. Acta. 1991. V. 1060. P. 28-36.
150. Singh N., Astahana R.K., Kayastha A.M., Pandey S., Chaudhary A.K., Singh S.P. Thiol and exopolysaccharide production in a cyanobacterium under heavy metal stress // Process Biochemistry. 1999. V. 35. P. 63-68.
151. Singhal R.K., Anderson M.E., Meister A. Glutathione, a first line of defense against cadmium toxicity // Faseb. J. 1987. Vol. 1. P. 220—223.
152. Skorzynska-Polit E., Baszynski T. Does Cd use Ca channels to penetrate into chloroplasts? a preliminary study // Acta Physiologiae Plantarum. 2000. V. 22. P. 171-178.
153. Speiser D.M., Ortiz D.F., Kreppcl L., Scheel G., Mcdonald G., Ow D.W. Purine biosynthetic genes are required for cadmium tolerance in Schizosaccharomyces pombeHMo\cQ. Cell. Biol. 1992. Vol. 12. P. 5301—5310.
154. Sudo Grant Burgess J., Tane Masa H., Nakamura N., Matsunaga T. Sulfated exopolysaccharide production by the halophilic cyanobacterium Aphanocapsa haiophytica II Curr. Microbiol. 1995. V. 30. P. 219-222.
155. Sutherland I. W. Structure-function relationships in microbial exopolysaccharides // Biotech. Adv. 1994. V. 12. P. 393-448.
156. Swings J., De Vos P., Van den Mooter M., De Ley J. Transfer of Pseudomonas maltophilia Hugh 1981 to the genus Xanthomonas as Xanthomonas maltophilia (Hugh 1981) comb, nov // Int. J. Systematic Bacteriol. 1983. V.33. №2. P. 409413.
157. Tabita F.R. Carbon dioxide fixation and its regulation in cyanobacteria // TheCyanobacteria in P. Fay and C. Van Baalen (eds.). Elsevier. Amsterdam. 1987. P. 95-117.
158. Tebo В. M. Metal precipitation by marine bacteria: potential for biotechnological applications // Genet. Eng. 1995. V. 17. P. 231-263.
159. Trevors J.T., Stratton G.W., Gadd G.M. Cadmium Transport, Resistance, and Toxicity in Bacteria, Algae, and Fungi // Can. J. Microbiol. 1986. V. 32. P. 447464.
160. Trindade Т., O'Brien P., Pickett N.L., Nanocrystalline Semiconductors: Synthesis, Properties, and Perspectives // Chem. Mater. 2001. V.13. № 11. P. 3843-3858. Tiimova > E., Sofrova D. Response of Intact Cyanobacterial Cells and their1. L
161. Photosynthetic Apparatus to Cd Ion Treatment // Photosynthetica. 2002. V. 40. № l.P. 103-108.
162. Van Diujvendik-Matteoli M.A., Desmet G.M. On the inhibitory action of cadmium on the donor side of Photosystem II in isolated chloroplasts // Biochim. Biophys. Acta (B). 1975. V. 408. № 2. P. 164-169.
163. Volesky В., Prasetyo /. Cadmium removal in a biosorption column // Biotechnol. Bioeng. 1994. V. 43 P. 1010-1015.
164. Vymazal J. Toxicity and Accumulation of Cadmium with Respect to Algae and Cyanobacteria: a Review// Toxicity Assessment: An International Quarterly 1987. V. 2. P. 387-415.
165. WangJ.Y., Uphaus R.A., Ameenuddin S., RintoulD.A. Formation ofnanoscale size cadmium sulfide within a channel protein monolayer // Thin Solid Films. 1994. V. 242. № 1-2. P. 127-131.
166. Wang R.T., Stevens C.L.R., Myers J. Action spectra for photoreactions I and II of photosynthesis in the blue-green alga Anacystis nidulans II Photochemistry and Photobiology. 1977. V. 25. P. 103-108.
167. Wehrmeyer W., Zimmermann C., Ohki K., Fujita Y. On a new type of cyanobacteria phycobilisome exemplified in Phormidiwn persicinum Gomont // Eur. J. Cell Biol. 1988. V. 46. P. 539-546.
168. WilJtfors G. H., Neeman A., Jackson P. J. Cadmium-binding polypeptides in microalgal strains with laboratory-induced cadmium tolerance // Mar. Ecol. Prog. Ser. 1991. V. 79. P. 163-170.
169. Williams W.P., Allen J.F. State 1/State 2 changes in higher plants and algae. Photosynthesis //Photosynth. Res. 1987. V. 13. P. 19-45.
170. Wintermans J.F.G.M., De Mots A. Spectrophotometry characteristics of chlorophylls a and b and their pheophytins in ethanol // Biochim. Biophys. Acta. 1965. V. 109. №2. P. 448-453.
171. Yan Li, Fuzhi Hunag, Ziehen Li, Oingmin Zhang, Zhennan Gu The lecithin vesicle mediated mineralization of cadmium sulphide // J. Mater. Sci. Lett. 1999. V. 18. № 22. P. 1821-1823.
172. Yongchi Tian, Chagjun Wu, Fendler J. H. Fluorescence activation and surface-state reactions of size-quantized cadmium sulfide particles in Langmuir-Blodgett films//J. Phys. Chem. 1994. V. 98. № 18. P. 4913-4918.
173. Zenk M.H. Heavy metal detoxification in higher plants // Gene. 1996. Vol. 179. P. 21-30.
174. Zuber H. The structure of light-harvesting pigment-protein complexes // in J. Barber (ed.). "Light reactions" Topics in Photosynthesis. 8. Elsevier. Amsterdam. 1987. P. 157-259.
-
Бреховских, Александр Андреевич
-
кандидата биологических наук
-
Москва, 2006
-
ВАК 03.00.04
- Влияние свинца на структуру фототрофных микробных комплексов почвы
- Использование цианобактерий в агробиотехнологии
- Ультраструктурная пластичность цианобактерий
- Комплексы водорослей, цианобактерий и грибов городских почв и их реакции на действие поллютантов
- Исследование физиологического состояния цианобактерий и микроводорослей во взаимодействии с ионами ванадия
