Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование физиологического состояния цианобактерий и микроводорослей во взаимодействии с ионами ванадия

ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации по теме "Исследование физиологического состояния цианобактерий и микроводорослей во взаимодействии с ионами ванадия"

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ им. М.В. ЛОМОНОСОВА

Биологический факультет

На правах рукописи

САВАНИНА Янина Вячеславовна

УДК 582.232:57.083.13; 192:546

ИССЛЕДОВАНИЕ ФИЗИОЛОГИЧЕСКОГО СОСТОЯНИЯ ЦИАНОБАКТЕРИЙ И МИКРОВОДОРОСЛЕЙ ВО ВЗАИМОДЕЙСТВИИ С ИОНАМИ ВАНАДИЯ: МЕХАНИЗМЫ УСТОЙЧИВОСТИ, РОЛЬ МЕТАЛЛОСВЯЗЫВАЮЩИХ БЕЛКОВ.

03.00.25 - Клеточная биология

АВТОРЕФЕРАТ Диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 1998

Работа выполнена на кафедре клеточной физиологии и иммунологи] биологического факультета Московского государственного Университета им. М. В. Ломоносова.

Научный руководитель: доктор биологических наук

профессор М. В. Гусев

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор М. М. Умаров

кандидат биологических наук К. С. Бурдин

Ведущая организация:

институт физиологии растений РАН

Защита состоится_декабря 1998 г. в _на заседа

нии специализированного совета Д.053.05.095 при Московском госу дарственном Университете им. М.В. Ломоносова по адресу: 119899, Москва, Воробьевы горы, МГУ, биологический факультет, ауд __ .

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического фа культета МГУ.

Автореферат разослан _ ноября 1998 г.

Ученый секретарь диссертационного совета Д.053.05.095 в Московском государственном университете им. М. В. Ломоносова кандидат биологических наук Н.В.Воробьева

Актуальность проблемы. По объему поступления в водную среду металлы являются основной группой загрязняющих веществ, главный биологический ущерб наносят тяжелые металлы (ТМ), т.е. металлы плотностью более 5 г/см3. Особое положение ТМ среди загрязнителей связано как с возможностью их накопления и передачи по пищевым цепям, так и с высокой токсичностью, которая приводит к множеству взаимосвязанных изменений на разных уровнях организации: клеточном, популяционном и на уровне сообществ и экосистем, в последних возможны структурные сдвиги и смена видового состава (Reddy, Prasad, 1990). Токсическое действие ТМ прежде всего сказывается на первичных продуцентах - микроводорослях и цианобактериях.

Исследования взаимодействия фитопланктонных организмов с ТМ позволяют проанализировать общие проблемы биогеохимического круговорота веществ в биосфере, геохимии отдельных элементов, существования организмов в экстремальных условиях, физиологической роли ТМ и представляют большой интерес для решения как теоретических вопросов микробиологии и экологии, так и практических задач биотехнологии и охраны окружающей среды. В этих исследованиях можно выделить следующие направления:

1) выяснение действующих концентраций ТМ. вызывающих гибель отдельных видов в водоемах:

2) определение устойчивости объектов к воздействию ТМ и выяснение ПДК на этой основе;

3) удаление и концентрирование ТМ из промышленных стоков, природных водоемов и почв.

Микроводоросли и цианобактерии наравне с гетеротрофными микроорганизмами могут использоваться для детоксикации и извлечения ценных металлов из металлсодержащих стоков, поскольку способны как переводить ТМ в менее опасные формы, так и аккумулировать металлы из водной среды и донных отложений в количестве, многократно превышающем потребность в них, как в компонентах минерального питания; накапливаются и те металлы, которые не используются в метабо-

лизме (Nagase et al., 1994; Whiston et al., 1995).

Ванадий - широко используемый в промышленности элемент, годовое поступление которого из антропогенных источников в окружающую среду составляет до 4 -106т (Бандман, 1989). Основными свойствами ванадия можно считать переменную валентность и биофильность. Ванадий не является необходимым элементом для роста высших растений, но используется некоторыми зелеными, желто-зелеными, бурыми водорослями; содержится в альтернативных нитрогеназах почвенных бактерий. Бактерии рода Pseudomonas, обладающие ванадатредуктазной активностью, способны в анаэробных условиях использовать ванадат в качестве конечного акцептора электронов, восстанавливая его до V4+ и V3*. Подавляющее большинство работ по изучению физиологического действия ванадия проводится на теплокровных позвоночных (Бандман, 1989; Юркова, Ляликова, 1990; Render, 1991; Itoh et al., 1996).

Цель и задачи исследования. Цель настоящей работы состояла в изучении физиолого-биохимических ответов цианобактерий и микроводорослей на повышенное содержание ванадата (V5+) в водной среде, определении действующих концентраций ванадата. влияния внешних условий на его биоаккумуляцию и проявление токсического эффекта и выяснении причин устойчивости исследуемых организмов к ванадату.

Исходя из цели работы были поставлены следующие задачи:

1) поиск наиболее чувствительных объектов для биотестирования сточных вод на наличие ванадата (определение токсичности, а не концентрации), выяснение пределов их чувствительности, наиболее чувствительных и специфических тест-параметров и влияния внешних условий на проявление токсического эффекта металла;

2) изучение возможности использования устойчивых культур - ак-сеничных или смешанных альго-бактериальных пар - для удаления ванадия из сточных вод: .

3) выяснение внутриклеточных механизмов, определяющих устойчивость к ванадию, в частности, возможности индукции синтеза в клетках цианобактерий и микроводорослей низкомолекулярного белка, спе-

цифически связывающего ванадий.

Научная новизна. В работе показано, что ванадий (V5+) токсичен для фитопланктонных организмов - цианобактерий и зеленых микроводорослей. Полученные данные позволяют предполагать, что токсический эффект ванадия связан со стимуляцией образования свободных радикалов кислорода при взаимодействии ионов металла с компонентами клетки; предложена схема, позволяющая объяснить устойчивость клеток цианобактерий к этому загрязнителю.

Для детоксикации среды от ванадия предложено использовать смешанно-раздельные культуры цианобактерий с гетеротрофным бактериальным компонентом; показано, что устойчивостью данной ассоциации микрорганизмов к ванадату можно управлять, воздействуя на внеклеточный метаболизм цианобактерий путем изменения условий культивирования.

Впервые выделен белок, образующийся в клетках цианобактерии Anacystis nidulans при воздействии ванадия, который по совокупности свойств определен как металлотионеин, специфически связывающий ванадий. До настоящего времени в отечественной и зарубежной литературе сведений о существовании металлотионеина, содержащего ванадий не было. Предложена методика обнаружения низкомолекулярных ти-олсодержащих белков в клетках цианобактерий и микроводорослей.

Практическая ценность. Результаты работы могут быть использованы: при проведении лекционных курсов и практических занятий по физиологии клетки; при разработке методов тестирования водной среды с целью получения качественной экспресс-оценки суммарного загрязнения воды и измерения специфического вклада металлов в общую токсичность среды; при разработке методов детоксикации среды от ванадия с использованием диализных культур цианобактерий, а также смешанных культур цианобактерий с бактериями рода Pseudomonas.

Апробация работы. Материалы диссертации были доложены на международной конференции памяти академика РАН E.H. Кондратьевой "Ав-тотрофные микроорганизмы" (Москва 1996); заседании кафедры клеточ-

ной физиологии и иммунологии биологического факультета МГУ (Москва, 1996), V Международной конференции "Новые информационные технологии в медицине и экологии" (Ялта-Гурзуф, 1998).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 8 печатных работ.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов исследования и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 200 страницах, иллюстрирована 7 таблицами и 20 рисунками.

В обзоре литературы изложены современные представления о взаимодействии цианобактерий и микроводорослей с тяжелыми металлами, рассмотрены основные механизмы повреждающего действия ТМ, влияния внешних условий на их биоаккумуляцию и проявления токсического эффекта, проанализированы возможные механизмы устойчивости клеток к ТМ.

Список литературы содержит 418 наименований, из них 331 зарубежных авторов.

Объекты и методы исследования.' Объектами исследования служили аксеничные культуры цианобактерий Anacystis nidulans. АпаЪаепа variabilis, Nosloe mscorrn и Spirullina platensis и зеленых одноклеточных микроводорослей Dunaliella maritima и Scenedesmus quadri-caucta из коллекции кафедры клеточной физиологии и иммунологии биологического факультета МГУ. В экспериментах по смешанно-раздельному культивированию использовали штаммы грамотрицательных бактерий рода Pseudomonas. Ps. putida и Ps. fluorescens (штаммы F-10 и 239) из коллекции кафедры микробиологии МГУ.

Клетки фотосинтезирующих микроорганизмов выращивали в стандартных условиях в люминостате при круглосуточном освещении, освещенности 1500 лк и температуре 25-27° в качалочных колбах с объемом среды 150 мл в диализной и периодической культуре на минеральных средах: S. platensis -.на среде Зарука (Zaroukk, 1966),

остальные цианобактерии и 5. quadricauda - на среде "С" (Kratz, Myers, 1955), D. maritima - на среде Абдуллаева и Семененко(1974).

Используемые в токсикологических экспериментах культуры истощали на минимальных средах в условиях диализа. Истощение и культивирование клеток проводили в диализных мешках фирмы Serva, с размерами пор, пропускающими соединения с молекулярной массой до 15 кДа. Полученный двойной сосуд заполняли средой: 50 мл в мешке. 100 мл вокруг мешка и стерилизовали в автоклаве при 1 атм. 1 час. Культуру цианобактерий помещали внутрь диализного мешка, а гетеротрофные бактерии при совместном культивировании - в среду, находящуюся снаружи мешка (Гусев и др., 1988). Для моделирования разового или суточного сброса токсикантов культивирование проводили, соответственно, без смены или со сменой внешней среды.

Факторы воздействия применялись в следующих концентрациях: ва-надат (NH4V03) - 0,1 - 700 мг/л; железо Fe2(S04)3 - 1 мг/л, фосфат (Pi) (КН2Р04) - 1,15 г/л и цистеин - 100 мг/л. Выбор факторов (кроме цистеина) и их концентраций был обусловлен содержанием соответствующих металлов в промышленных стоках и природных эвтрофи-цированных водоемах; для выяснения физиологического действия каждого из токсикантов в отдельности и в сочетании и их вклада в токсический эффект использовали метод полнофакторного эксперимента.

Плотность клеточных суспензий определяли нефелометрически на спектрофотометре фирмы Hitachi (Япония), модель U-2000 при 538 нм. Содержание каротиноидов, фикоцианина и хлорофилла а определяли на том же спектрофотометре при 450-480, 630 и 675-680 нм соответственно.

Скорость фотосинтетического выделения и темнового поглощения 02 клетками микроорганизмов определяли полярографически, используя закрытый Pt-электрод, насыщающая интенсивность света составляла 0,05 Втх смг.

Ванадий в биологическом материале и культуральной жидкости определяли с 4-(2-пкридилазо)-резорцином. Для определения накопления

металлов субклеточными фракциями часть биомассы разрушалась на ультразвуковом дезинтеграторе с последующим дифференциальным центрифугированием гомогената. Биохимический анализ культуральной жидкости вели сразу же после отбора проб, клетки осаждали при 2-3 т. х g. В супернатанте определяли содержание углеводов, гликолевой кислоты и белка. Экспериментальные данные статистически обработаны. В приводимых таблицах за исключением специально оговоренных параметров приводятся усредненные данные трех повторностей, выраженные в % к контролю.

Выделение низкомолекулярных белков (до 10 кД) проводили по модифицированной нами методике с использованием диализной мембраны фирмы Serva с диаметром пор, пропускающих молекулы до 10-15 кД. В полученном диализате определяли содержание ванадия, белка и тиоло-вых групп.

Очистку белка проводили гель-фильтрацией на сефадексе G-75. Фракции богатого сульфигидрильными группами белка с молекулярной массой около 10 кДа, характеризующиеся высоким содержанием ванадия подвергали дальнейшей очистке на хроматографической колонке с ДЕ-АЕ-целлюлозой. Очищенный препарат использовали для получения УФ-спектра поглощения на спектрофотометре фирмы Сагу (США), модель 14 DS, и для исследования кинетики реакции с 5,5'-дитиобис-(2-нит-робензойной) кислотой.

Результаты иссследования.

Анализ взаимодействия цианобактерий и микроводорослей с ва-надатом; поиск наиболее чувствительных объектов для биотестирования сточных вод на наличие ванадия. В первой части работы исследовались изменения физиологических параметров шести культур фотосин-тезирующих микрорганизмов - цианобактерий и микроводорослей, вызванные воздействием ванадата. Наблюдаемые изменения выражаются в ингибировании роста клеток, подавлении фотосинтетической" активное-

ти, снижении содержания хлорофилла и фикобилинов, увеличении содержания каротиноидов в клетках, а также углеводов и гликолата в культуральной жидкости (табл. 1. 2).

Таблица 1

Влияние ванадата (100 мг/л) на рост (1), скорость фотосинтетического выделения о2 (2). содержание хлорофилла (3) и каротиноидов (4) в клетках; углеводов (5) и гликолата (6) в культуральной жидкости цианобактерий и микроводорослей на 9-е сутки культивирования.

Культура Варианты опытов

1 2 3 ■4 5 6

А. nidulans 45 43 47 155 178 286

А. variabiIis 83 71 76 93 241 CO

N. mscorum 95 76 84 145 162 169

S. platensis 87 84 93 163 1S8

S. quadricauda 65 95 79 402 166

100% содержание клеток составляет 35-47 -10б/мл, углеводов - 25-32 мкг/мл, гликолата - 15-25 мкг/мл и скорость выделения 02 - 50-58 мкмоль ■ мг"1 хлорофилла • ч"1.

Причины, определяющие устойчивость цианобактерий к ванадию. Устойчивость к токсическому действию ТМ можно определить как способность некоторых видов выживать при концентрациях металла, летальных для других видов, либо способность популяции адаптироваться к таким концентрациям токсиканта, которые прежде ингибировали ее рост или были летальными.

К вызванным ТМ повреждениям чувствительны все типы клеточных

компонентов. Степень проявления токсического эффекта металла обусловлена его концентрацией в клетке и продолжительностью действия, и чем выше концентрация металла, тем больше количество компонентов нуждающихся в защите. Таким образом, устойчивость к действию ТМ в определенной степени зависит от условий культивирования и состояния культуры. Причины, определяющие устойчивость цианобактерий к воздействию тяжелых металлов можно представить в виде схемы (Рис. 1).

освещенность

КЛЕТКА

(цивнсбзктесии. шкрсвсссгссди)

Рис. 1. Механизмы устойчивости клеток к воздействию ванадата.

I - факторы внешней среды (на схеме в эту группу входят и некоторые характеристики культуры);

II - неспецифические внешние защитные приспособления и внутриклеточные механизмы {стрелки обозначают некоторые физиологические параметры клетки, изменяющиеся под действием ванадата):

III - специфические механизмы защиты, возникающие в ответ на токсическое действие металла.

- И -

Внешние структуры клетки (Рис 1, II) служат определенным барьером проницаемости: клеточными оболочками цианобактерий связывается до 25% ванадия (Рис. 2). У "устойчивых" цианобактерий толстая клеточная стенка и полисахаридаый слизистый чехол. Особенно развит чехол у цианобактерии N. mscorwn, она же наиболее устойчива к ва-надату (табл. 1). Клетки А. nidulans в отличие от большинства цианобактерий чехла не образуют. Из исследованных зеленых водорослей более устойчива Sc. quadricauda с толстой клеточной стенкой, клеточная стенка у D. maritima отсутствует.

Из шести исследованных культур наибольшей чувствительностью к ванадату обладают культуры А. nidulans и D. maritima: изменения физиологических параметров регистрируются в присутствии 0.1-1 мг/л ванадата, другие цианобактерии и микроводоросль S. quadricauda реагируют на концентрации более 10 мг/л. Таким образом, культуры, которые характеризуются чувствительностью к ванадату, практически лишены внешних защитных приспособлений; определение других механизмов устойчивости проводилось главным образом с этими культурами при концентрации ванадата 10 мг/л (пороговая концентрация .по .влиянию на общий санитарный режим водоемов).

Выраженные хелатирующие свойства среды культивирования (среда Зарука содержит 0,01 М р-р ЭДТА) определяют повышенную устойчивость к ванадату S. platensis (табл. 1), поскольку при добавлении в среду "С" аналогичных концентраций ЭДТА устойчивость А. nidulans значительно возрастает.

На устойчивость к ванадию влияют вещества, которые часто содержатся в природных и сточных водах вследствие эвтрофикации и промышленных загрязнений: фосфат, железо и тиоловые соединения.

Избыток фосфата в среде культивирования приводит к снижению содержания хлорофилла и подавлению роста А. nidulans (Рис. ЗА) и D. maritima (табл. 2), что согласуется с представлением об усилении токсического действия ТМ на фитопланктон в эвтрофицированных водоемах (при повышенной концентрации фосфатов) (Стормер и др.,

Рис. 2. Распределение ванадия (%) в различных субклеточных фракциях цианобактерии А. nidulans, осаждающихся при 4-5 т.х g (клеточные стенки и неразрушенные клетки, 23%), 10 т. х g (крупные фрагменты тилакоидов, 16%) и 100 т.х g (мелкие и средние фрагменты тилакоидов 12%), а также надоса-дочная жидкость, 49%.

Таблица 2

Влияние ванадата (10 мг/л), железа, фосфата и цистеина на количество клеток (1), содержание хлорофилла (2), углеводов (3) и фотосинтетическое выделение 02 (4) клетками А. nidulans и D. maritima на 5-е сутгси культивирования.

Варианты опытов А. nidulans D. maritima

1 2 3 4 1 2 . 3 4

V 62 90 213 65 64 82 190 65

V + Fe 92 95 220 86 91 94 . 180 93

V + PI 54 72 395 49 50 71 295 41

PI 86 92 270 74 87 86 250 74

V+ цистеин 88 92 205 82 93 90 180 90

100% содержание клеток составляет 3,5 и 4.8 • 106/мл', углеводов -3,24 и 11,2 мкг/мл и скорость выделения 02 - 50 и 58 мкмоль ■ мг"1 хлорофилла • ч"1 для А. пгйи1апэ и Б. тгШт соответственно.

1981). Усиление общего токсического эффекта при совместном дейс-

12%

твии ванадата и фосфата может быть результатом увеличения аккумуляции ванадия либо суммарного воздействия токсикантов.

Повышение аккумуляции ванадия в присутствии избытка фосфатов может объясняться связыванием металла на поверхности клеток в виде нерастворимых фосфатов либо внутриклеточными инертными метаболическими включениями: фосфатами связывается до 90% ванадия в животных клетках; гранулы, содержащие ванадий и фосфат, обнаружены в клетках бактерий рода Pseudomonas, устойчивых к ванадату (Reheier, 1991; Юркова, Ляликова, 1991).

При внесении ванадата совместно с железом или цистеином в культурах А. nidulans и D. maritima на 20-25% снижается ингибирую-щий эффект ванадата на рост культур и фотосинтетическое выделение кислорода (табл. 2). Защитное действие железа может быть обусловлено несколькими причинами: 1) повышением pH среды культивирования, при котором ванадий переходит в форму У4+и V3+. менее токсичную чем V5+; 2) снижением аккумуляции ванадия клетками; 3) внутриклеточным взаимодействием Fe3+ и токсикантов. Механизмы устойчивости клеток к ТМ, не зависящие от факторов внешней среды (Рис. 1, II), можно условно подразделить на 2 группы: внеклеточные, связанные с предупреждением проникновения металла в клетку, и внутриклеточные, основанные ■ на изменениях метаболизма клеток, содержащих ионы металла.

Механизм воздействия ТМ часто можно предсказать по характеру их распределения в клетках, поскольку токсичность и детоксикация металла в значительной-степени определяется его способностью к образованию комплексных соединений при взаимодействии с компонентами клеток (Логинов, Бинеев, 1990). До 50% поглощенного клетками циа-нобактерий ванадия взаимодействует с компонентами тилакоидных мембран и растворимой фракции клетки, включающей ядерный аппарат, цитоплазматические белки и другие компоненты (Рис. 2).

В литературе токсический эффект ванадата для животных клеток объясняется 'тем, что поглощенный V5+ восстанавливается в клетках

до V4+ и V3+, стимулируя образование супероксидных анион-радикалов и гидроксильных радикалов на свету при взаимодействии с тиолосо-держащими компонентами мембран (Schalnkln-Kestenbaum et al., 1991; Fodor et al., 1994). К механизмам, которые обеспечивают защиту клеток от повреждений, возникающих при воздействии ванадата, относятся ферменты, дезактивирующие супероксидные анион-радикалы и Н202_ экзо- и эндогенные тиолы, также каротиноиды (Prakash. Rao, 1995), являющиеся наиболее мощными естественными тушителями активных форм кислорода (табл. 1).

На основании полученных данных можно предположить, что для определения токсичности ванадата можно использовать не только стандартные тест-параметры (рост, фотосинтетическую активность и пр.), но и те, которые связаны с особенностями его токсического воздействия, - увеличение содержания физиологических антиокислителей, ка-ротиноидов и гликолата (табл. 1, 2).

На культуре А. nidulans нами показана также возможность использования для определения токсичности ванадий-содержащих сред таких параметров как увеличение каталазной активности и увеличение скорости вымывания электролитов из клеток (связанное с повышением мембранной проницаемости вследствии перекисного окисления мембранных липидов). Увеличение проницаемости мембран наблюдается в первые несколько часов и может использоваться для самой ранней диагностики загрязнения среды ванадатом.

В присутствии ТМ большинство цианобактерий синтезирует повышенное количество органических веществ, главным образом отрицательно заряженных полисахаридов (Bender et al., 1995), другим рас-постраненным экзометаболитом является гликолат. Защитная роль гли-колевой кислоты, интенсивно выделяемой клетками в присутствии ванадата (табл. 1, 2), предположительно связана с ее антиокислительными свойствами (Сакевич, 1994).

Повышение устойчивости, наблюдаемое при внесении ванадата на поздних стадиях культивирования (особенно в диализной культуре),

связано со значительной плотностью клеток в малом объеме и повышенной концентрацией экзометаболитов. В диализном мешке культуры А. nidulans на 9-е сутки в присутствии 10 мг/л ванадата содержание углеводов составляет 86,3 мг/л, что значительно выше, чем в окружающем объеме (18,2 мг/л) и в периодической культуре (28,0 мг/л); при добавлении культуральной жидкости из диализного мешка в периодическую культуру (в количестве не менее 1/50 мл) ее устойчивость к ванадату возрастает. Кроме того, pH среды старых культур циано-бактерий увеличивается до 8-10, при этом на микрорганизмы действуют уже не ионы, а комплексы металлов, токсический эффект которых ниже.

Усиление экскреции внеклеточных метаболитов предположительно вызывается ионами металла, которые, проникая в клетку, воздействуют на метаболизм (Moffet, Brand, 1996). Токсические ионы обезвреживаются в среде в результате комплексообразования либо сорбции на поверхности осадка, если соосадитель не содержит соле- и комплек-сообразущих групп (Appana, Whitmore, 1995).

Приблизительно на 7-е сутки после добавления ванадата в концентрации более 1 мг/л наблюдается появление рыхлого осадка, содержащего ванадий и углеводные компоненты, после чего активизируется рост культур; более всего этот эффект выражен у S. quadricau-da (табл. 1). Таким образом, можно предполагать, что интенсивное выделение клетками водорослей и цианобактерий в среду органических веществ обеспечивает внеклеточную детоксикацию ванадия. Эта же способность, по-видимому, определяет высокую устойчивость смешанно-раздельных диализных культур цианобактерий и бактерий рода Pseudomonas относительно аксеничных.

Использование устойчивых культур - аксеничных или смешанных альго-бактериальных пар - для удаления ванадия из сточных вод. При

высеве придонных осадков промышленных сточных вод. содержащих ва-надат, на жидкие среды с минимальной концентрацией питательных ве-

ществ нами обнаружено сообщество микрорганизмов, главным образом бактерий рода Pseudomonas, устойчивых к данной концентрации ванадия и способных в полуанаэробных условиях восстанавливать ванадат (V5+ до V3+).

Для создания смешанных альго-бактериальных пар мы использовали лабораторные штаммы бактерий рода Pseudomonas: Ps. putida, неустойчивую к концентрации ванадата до 1 г/л, и устойчивую Ps. fluo-rescens (Trevors, 1989; Юркова, Ляликова, 1990).

Рост А. nidulans в смешанно-раздельной культуре с Ps. putida в присутствии неорганического фосфата или ванадия подавляется в меньшей степени, чем аксеничной культуры А. nidulans (Рис. 3 А, Б). Снижение ингибирующего эффекта ванадата на фотосинтез составляет на 2-е сутки 40% в паре А. nidulans и Ps. putida и 70% - А. nidulans и Ps. fluorescens. Более выраженный характер эта зависимость приобретает при дальнейшем культивировании: если в аксеничной культуре А. nidulans можно говорить о гибели клеток на 6-е сутки, то в паре с Ps. putida А. nidulans поддерживается в стационарном состоянии до 21 суток культивирования, а в паре с Ps. fluorescens на 9-е сутки культивирования наблюдается даже подъем фотосинтетической активности (табл. 3).

В системе автотроф-гетеротроф при условии культивирования на минеральной среде ключевым элементом является автотроф, как единственный продуцент органического вещества. Зависимость цианобакте-рий и бактерий от условий культивирования и состава среды создает предпосылки для управления подобной системой.

Сравнение содержания продуктов экскреции в культуральной жидкости аксеничной и смешанной культур указывает на зависимость роста бактерий в первую очередь от• поступления в среду углеводов (табл. 3). Накопление углеводов в диализном мешке способствует длительному сохранению высокой жизнеспособности аксеничной культуры цианобактерий(Гусев и др., 1987) и внеклеточному связыванию металла, но в смешанной культуре неблагоприятно для роста бактерий.

, i

в

i

й

А *

* *

♦ 1 ■ 2

A3

*4

А А

ж ж

10

20

Рис. 3. Зависимость скорости роста клеток аксеничной культуры nidulans (А), клеток у!. nidulans б смешанно-раздельной культуре с Ps. putida (Б) и клеток Ps. putida в смешанно-раздельной культуре с A. 7u-dulans (Б) от добавления в среду ванадата (2), фосфата (3) и их комбинации (4); 1 - в отсутствии добавок.

■ *

i 8 *

В

10

10

20

х

20

Время культивирования, сутки

В смешанных пасах Pseudomonas с А. variabilis и /V. ~uscc~ гит устойчивость пиакобактврий практически ке изменяется, ко нозрастает степень дезактивации среды от ванадата; можно пред--'■полагать. что устойчивость А. nidulans б смешанной культуре к действию ванадия повышается благодаря связыванию определенной части металла бактериальным компонентом (табл. 3).

Усиление роста бактериального компонента в смешанно-раздельной культуре, способствует связыванию им большей части ванадия. Рост бактерий рода Pseudomonas в смешанной культуре стимулируется такими .добавками, как ванадат и фосфат (Рис. 3 В).

А

ж

Ж

X

способствующими повышенной экскреции углеводов цианобактериями (табл. 2). Соответственно устойчивость цианобактерий в смешанно-раздельной культуре выше, чем в аксеничной.

Таблица 3

Влияние ванадия на скорость фотосинтетического выделения 02 (1), содержание углеводов (2) и гликолата (3) в культуральной жидкости (вне диализного мешка) цианобактерий в аксеничной и смешанно-раздельной культуре с бактериями на 9-е сутки культивирования; остаточная концентрация ванадия в среде, мг/л (4).

Объекты Варианты опытов

1 2 3 4

А. nidulans 43 175 290 50

+ Ps. fluorescens 76 1-2 120 8-9

+ Ps. putida 67 1-2 135 12-15

A. variabiIis 70 240 148 7-8

+ Ps. fluorescens 75 1-2 130 2-3

100% содержание углеводов составляет 25-32 мкг/мл, гликолата -15-25 мкг/мл и скорость выделения 0г - 50-58 мкмоль • мг"' хлорофилла -ч"1; исходная концентрация металла - 700 мг/л.

Клетки А. пгйиЬапв накапливают до 1-1,3 мкг У/мг, N. тзсогит - до И мкг У/мг сухой биомассы. В первые 0,5 - 1,5 часа накапливается около 30% ванадия (что соответствует уровню накопления металла поверхностными структурами клетки (рис. 2), в последующие 45-47 ч. накапливается 70-90% оставшегося металла (Рис. 4).

В течение последующих 1-2 суток культивирования концентрация ванадата в культуральной жидкости снижается от 100 до 3-4 мг/л," а

я t-л t * го о

S ¡10

а §

I *

1 = 5

§ ьс

о 2

к (3

X

10 20 30 40 50

• 1

Время, ч я 2

Рис. 4. Динамика накопления ванадия клетками цианобактерии A. nidulans (1) и N. mus-согит (2).

затем начинает постепенно увеличиваться. В среду культивирования A. nidulans возвращается до 20-25% ранее поглощенного ванадата.

Одновременно в среде культивирования цианобактерий наблюдается появление SH-содержащих соединений и низкомолекулярного белка (проходящего через диализную мембрану). Можно предположить, что ранее поглощенный металл выводится из клеток совместно с этими соединениями.

Очистка среды от ванадата смешанно-раздельной культурой более эффективна: при поддержании постоянной концентрации металла (700 мг/л) содержание ванадата в культуральной жидкости смешанной культуры на 2-е сутки снижается в 7,5-10 раз, а в аксеничной культуре A. nidulans - только в 1,5-2,5 раза (табл. 3); в последующие сутки увеличение содержания металла в среде не наблюдается.

Обнаружение, выделение и характеристика низкомолекулярного ва-надий-связыващего белка цианобактерий. Специфическое связывание большей части поглощенных клетками металлов в клетках осуществляется остатками цистеина в молекуле специализированных цитоплазма-тических белков - металлотионеинов (Рис 1, III).

До 50% поглощенного ванадия связывается растворимой фракцией клеточного гомогената, содержащей цитоплазматические белки, что позволяет предполагать наличие металлотионеинов в клетках изучаемых цианобактерий (Рис. 2). Все существующие на данный момент методики выделения металлотионеинов и подобных им белков достаточно

сложны, так как они разработаны для получения чистых препаратов (Dieter. 1992). Поскольку общими признаками для этих белков является молекулярная масса до 10 кДа и высокое содержание тиоловых групп, общий фонд металлотионеиноподобных белков мы определяли по упрощенной методике: для разделения клеточного гомогената использовали диализную мембрану, в полученном экстракте измеряли концентрации белков и тиоловых групп.

В клетках цианобактерий увеличение содержания низкомолекулярных белков определяется со 2-х суток культивирования, в клетках D. maritima - с 5-х; максимальное содержание низкомолекулярных белков наблюдается соответственно на 5-е сутки - для A. niäulans и на 7-9-е для D. maritima. Количество низкомолекулярного белка и SH-групп в клеточном гомогенате коррелирует с вносимой концентрацией металла и в отсутствии ванадата практически не изменяется. Интенсивность их синтеза выше у устойчивых объектов: б клетках N. muscorum и A. variabilis общее содержание низкомолекулярных селкоЕ и SH-групп возрастает по сравнению с контролем в 5,3 и 5 раз, в клетках A. nidulans - в 1,3 и 2,1 раза (Рис. 5); максимальное содержание наблюдается у N. muscorum-при поддержании постоянной кок-

—*—2 надата + цистеина ' соответс-

раста культуры. 1 - контроль,

молекулярной массой < 10 кДа,

надата, ванадата + Pj, и ва-

üulans в зависимости от воз-

2, 3 и 4 - в присутствии ва-

в клеточном экстракте А. т-

Рис. 5. Содержание белков с

о

—*-4 твенно.

о

2

4

6

S

Время культивирования, сутки

центрации V5* 100 мг/л - 4,1 и 7,9 раза соответственно.

В клетках А. п%би1апз содержание низкомолекулярных белков возрастает при совместном внесении ванадата и фосфата, последующее резкое снижение содержания низкомолекулярных белков наблюдается одновременно с общим угнетением культуры. При внесении ванадата совместно с цистеином содержание низкомолекулярных белков возрастает и удерживается на достаточно высоком уровне (рис. 5), одновременно наблюдается снижение ингибирующего эффекта ванадата на рост культур и фотосинтетическое выделение кислорода (табл. 2). Повышение устойчивости большинства растительных объектов к действию ТМ в присутствии серусодержащих соединений в основном связано с увеличением синтеза низкомолекулярных металлсвязывающих белков (Obataetal., 1994).

В настоящее время в отечественной и зарубежной литературе нет сведений о существовании металлотионеинов, включающих ванадий в качестве металлического компонента, информация о металлотионеинах цианобактерий неполная и нуждается в уточнении. Известно, что ме-талл-связывающие белки цианобактерий относятся к классу II МТ и имеют лишь немногие сходные черты с металлотионеинами млекопитающих (Ка- gl, КоЗнпа, 1987). В связи с этим представлялась необходимой подробная процедура выделения и очистки белка существование которого в экспериментальном материале предполагалось на основании косвенных данных.

Препарат ванадий-тионеина мы выделяли из гомогената клеток А. nidu.la.ns после ее 5-суточной инкубации с 1 мМ V5*. В процессе гель-фильтрации препарата на сефадексе 0-75 отбирали материал, соответствующий нескольким параметрам, типичным для металлотионеинов: 1) молекулярная масса около 10 кДа, 2) заметный пик оптического поглощения при 250 нм, 3) высокое содержание сульфгидрильных групп (приблизительно в 7,5 раз выше, чем в контроле), 4) значительное содержание ванадия (около 40% от общего количества связанного металла). Отобранный материал составлял около 8% от нанесенного на колонку, что на порядок выше, чем в контроле.

После объединения, концентрирования и обессоливания очистку препарата проводили посредством ионобмекной хроматографии на ДЕАЕ-целлюлозе. Выход ванадий-тионеина (МТ(У)-Ап) составляет 35%, белок элюирует при 0,13 М ЫаС1 и содержит более 50% всего ванадия, нанесенного'на колонку; большинство остальных белков и около 12% ванадия элюируют при концентрации МаС1 Еыше 0,65 М.

Спектр поглощения очищенного препарата в УФ-области обнаружива-

5 1,5

220 240 260 280 Длина волны, нм

Рис. 6. Спектр оптического поглощения очищенного препарата ва-кадий-тионеика.

ет сходство с таковыми для металлотионеинов. Максимум поглощения при 250 нм, как и у большинства известных металлотионеинов. возможно, связан с наличием занадий-тиолатного комплекса (рис. 6).

-о,з

■р

< -0,5

X -0,9 Й

!-„

сл

3 -1,5

-1,8

20 40

Время,мин

60

Рис. 7. Кинетика реакции голо-У-тионеина А. п-штапэ с ДТНБК.

Для получения информации о металлсвязывающих центрах белка исследовали кинетику связывания этого препарата, с 5, 5'-дитиобис-(2-нитробензойной) кислотой. В процессе реакции образуется тио-нитрофенильный анион в количестве, прямо пропорциональном количеству прореагировавших БН-групп.

Реакция протекает в' две фазы.

что объясняется наличием в металлотионеинах двух классов тиоловых групп (Dunn. 1987). "Терминальные" группы, реагирующие в течение первой, быстрой стадии, в данном случае составляют около одной трети всех тиоловых групп. В дальнейшем высвобождаются и реагируют "связывающие" сульфгидрильные группы (Рис. 6).

Таким образом, настоящий полипептид удовлетворяет всем требованиям к номенклатуре металлотионеинов и может быть определен как представитель II класса - ванадий-тионеин. В клетках А. nidulans этот белок синтезируется в ответ на действие ванадата и специфически связывает часть поглощенного металла, выполняя в данном случае детоксикологическую функцию.

ВЫВОДЫ.

1. Исследовали ингибирующий эффект ванадия на рост, фотосинтетическую активность и содержание пигментов у 4 видов цианобактерий и 2 видов зеленых микроводорослей. Для определения токсичности ванадия в водной среде наиболее чувствительными тест-объектами из исследованных культур являются цианобактерия А. nidulans и зеленая водоросль D. maritima. Наиболее чувствительными тест-параметрами для А. ntdulans является выживаемость клеток, для D. maritima - подвижность клеток. Наиболее специфичными - каталазная активность и тиолсодержащие низкомолекулярные белки.

2. Для очистки среды от ванадия предлагается использовать диализные культуры цианобактерий - аксеничные (А. variabilis и N. muscorum) и смешанные, включающие бактерии рода Pseudomonas. В смешанно-раздельных культурах цианобактерии обеспечивают поступление органических веществ для роста бактерий на минеральной среде, бактериальный компонент активно поглощает ванадий из среды.

3. Предложена схема причин устойчивости цианобактерий и микроводорослей к тяжелым металлам, которые могут быть разделены на:

1) факторы внешней среды, 2) неспецифические механизмы защиты кле-

ток, включая пассивные защитные приспособления, и 3) специфические механизмы защиты, возникающие в ответ на действие конкретного токсичного металла.

4. Показана возможность регуляции устойчивости цианобактерий к ванадату в аксеничных и смешанных культурах с бактериальным компонентом:

- устойчивость аксеничных культур к ванадату возрастает при повышении рН, в присутствии ионов железа и экзогенных тиолов; избыток фосфатов способствует ее снижению:

- устойчивость смешанно-раздельной культуры к ванадию возрастает под действием ванадата или фосфата, стимулирующих накопление в среде цианобактериальных экзометаболитов.

5. Интенсивное выделение углеводов и гликолата и возрастание количества каротиноидов и антиокислительных ферментов в клетке под действием ванадата можно рассматривать в качестве неспецифических защитных механизмов цианобактерий и микроводорослей к воздействию тяжелых металлов.

6. Культивирование цианобактерий и микроводорослей в присутствии ионов ¥5+ индуцирует синтез богатого цистеином низкомолекулярного белка, специфически связывающего ванадий. Впервые выделен белок из клеток А. тбигапв. удовлетворяющий всем требованиям к номенклатуре металлотионеинов, который может быть классифицирован как металлотионеин II класса.

Работы, опубликованные по теме диссертации.

Лебедева:А.Ф., Саванина Я.В., Савельев И.Б. 1993. Пресноводные микроводоросли как тест-культуры для оценки содержания ванадия в среде//Вестн. МГУ. Сер. 16 "Биология", N 2. 12-17.

Лебедева А.Ф., Саванина Я.В., Савельев И.Б. 1993. Распределение ванадия в клетках цианобактерий АпасузЫэ пгйиЫпБ и Коэсос шизсогит: взаимосвязь с БН-содержащими низкомолекулярными белка-ми//Вестн. МГУ. Сер. 16. "Биология", N4. 58-61.

Саванина Я.В., Лебедева А.Ф., Савельев И. Б. 1994. Смешанно-раздельное культивирование цианобактерий Anacystls nldulans и Nostoc muscorum и бактерий рода Pseudomonas в присутствии вана-дия//Вестн. МГУ. Сер. 16. "Биология". N 2. 29-34.

Саванина Я.В., Адани А.Г., Лебедева А.Ф., Савельев И.Б., Гусев М. В. 1995. Образование ванадий-тионеина клетками Anacystis nidulans при высоких концентрациях металла//Вестн. МГУ. Сер. 16 "Биология". N 1. 38-46.

Лебедева А.Ф., Саванина Я.В.. Савельев И.Б. 1996. Смешанно-раздельное культивирование цианобактерии Anacystis nldulans и бактерий рода Pseudomonas в присутствии ванадия//тез. конф. памяти Е. Н. Кондратьевой "Автотрофные микроорганизмы", М.. "Диалог-МГУ". 43.

Гусев М.В.. Лебедева А.Ф., Саванина Я. В.. Барский Е.Л. 1997. Устойчивость культур цианобактерии Anacystis nidulans и микроводоросли Dunaliella maritima к токсическому действию ванадия: влияние фосфата, железа и цистеина//Вестн. МГУ. Сер. 16 "Биология", N 3. 12-17.

Лебедева А. Ф., Саванина Я. В., Барский Е.Л., Гусев М. В. 1998. Устойчивость цианобактерий и микроводорослей к действию тяжелых металлов: роль металлсвязывающих белков//Вестн. МГУ. Сер. 16 "Биология". N 2. 42-48.

Саванина Я.В., Пахомкина Б.С., Лебедева А.Ф., Дольникова Г.А. 1998. Смешанно-раздельное культивирование цианобактерий Anacystis nidulans. АпаЪаепа variabilis и llostoc muscorum с бактериями, выделенными из ванадийсодержащего промышленного водоема//тез. докл. V Международной конференции "Новые информационные технологии в медицине и экологии" Украина, Крым, Ялта-Гурзуф.

Издательство АО "Диалог-МГУ". JIPN 063999 от 04.04.95 Подписано к печати 23.11.98 г. Усл.печ.л.1,5. Тираж 70 экз. Заказ 1150. Тел. 939-3890, 939-3891, 928-1042. Тел./факс 939-3891. 119899, Москва, Воробьевы горы, МГУ.

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Саванина, Янина Вячеславовна, Москва

МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА, ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ И ОРДЕНА ОКТЯБРЬСКОЙ РЕВОЛЮЦИИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ им. М.В. ЛОМОНОСОВА

БИОЛОГИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ Кафедра клеточной физиологии и иммунологии

САВАНИНА ЯНИНА ВЯЧЕСЛАВОВНА

ИССЛЕДОВАНИЕ ФИЗИОЛОГИЧЕСКОГО СОСТОЯНИЯ ЦИАНОБАКТЕРИЙ И МИКРОВОДОРОСЛЕЙ ВО ВЗАИМОДЕЙСТВИИ С ИОНАМИ ВАНАДИЯ: МЕХАНИЗМЫ УСТОЙЧИВОСТИ, РОЛЬ МЕТАЛЛСВЯЗЫВАЮЩИХ БЕЛКОВ.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель профессор Гусев М.В.

Москва 1998

ОГЛАВЛЕНИЕ

I. ВВЕДЕНИЕ 4

II. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 7

1. Физиологическая роль металлов, их

влияние на фотосинтезирующие организмы 7

1) роль ванадия как загрязнителя И

2. Влияние внешних факторов на аккумуляцию тяжелых металлов 12

3. Токсическое действие тяжелых металлов 26

1) Влияние различных факторов на проявление токсического эффекта тяжелых металлов 27

2) Влияние тяжелых металлов на-физиологические процессы 33

4. Распределение тяжелых металлов в клетке;

механизмы токсичности и устойчивости. 41

1) связывание металлов в клетках 44

2) влияние металлов на биохимические

процессы в растительной клетке 47

5. Механизмы адаптаций клеток к действию

тяжелых металлов 56

6. Металлотионеины, общие сведения. 68

1) классификация металлотионеинов 69

2) первичная структура белка 69

3) вторичная структура белка, связывание

металлов 72

4) биосинтез: регуляция, зависимость от

различных факторов ■ 75

5) физиологическая- роль металлотионеинов 82 7. Тест объекты и тест-параметры , 90

1) требования, предъявляемые к тест-

культурам 90

2) возможность использования металло-

тионеинов в качестве биоиндикаторов 93

III. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 95

1. Объект и методы исследования. 95

2. Результаты и их обсуждение. 107

1) анализ взаимодействия цианобактерий и микроводорослей с ванадатом; поиск наиболее чувствительных объектов для биотестирования сточных вод на наличие

ванадия.^ 108

2) причины, определяющие устойчивость цианобактерий к ванадию. . 121

3) использование устойчивых культур -аксеничных или смешанных альго-бактериальных пар - для удаления

ванадия из сточных вод. 140

4) обнаружение, выделение и характеристика низкомолекулярного ванадий-связывающего белка цианобактерий 151

IV. ВЫВОДЫ 165

V. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 167

Список принятых сокращений

ДТНБ - дитионитробензойная кислота

МТ - металлотионеин

ПАР - 4-(2-пиридилазо)-резорцин

ПОЛ - перекисное окисление липидов

ТМ - тяжелые металлы

ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота

СБН/ОЗ-БС - восстановленная/окисленная форма глутатиона

I. ВВЕДЕНИЕ

Исследование взаимодействия фотосинтезирующих микроорганизмов с тяжелыми металлами (ТМ) позволяет проанализировать общие проблемы биогеохимического круговорота веществ в биосфере, геохимии отдельных элементов, существования организмов в экстремальных условиях, физиологической роли ТМ. Все это представляет большой интерес как для решения теоретических вопросов микробиологии и экологии, так и практических задач биотехнологии и охраны окружающей среды. По объему поступления в водную среду металлы являются основной группой загрязняющих веществ. Тяжелые металлы (ТМ), т.е. металлы плотностью более 5 г/см3, наносят главный биологический ущерб. ^ - /

Особое положение ТМ среди загрязнителей связано как с возможностью их накопления и передачи по пищевым цепям, так и с высокой токсичностью. Фитопланктонные организмы как первичные продуценты являются теми компонентами водных экосистем, на которых прежде всего сказывается токсическое действие ТМ, вызывая множество взаимосвязанных изменений на разных уровнях организации: клеточном, популяционном и на уровне сообществ и экосистем, в последних наблюдаются структурные сдвиги и смена видового состава (Милованова, 1993; Reddy, Prasad, 1990).

Одно из направлений исследований заключается в выяснении дейс-твующхуконцентрацйй ТМ, вызывающих гибель отдельных видов микроводорослей и цианобактерий в водоемах, разрушение сообществ, падение биологической продуктивности. Другая важнейшая задача - определение устойчивости этих групп микроорганизмов к воздействию ТМ и выяснение ПДК на этой основе (Rai et al., 1994).

Наряду с количественным и качественным определением загрязняющих веществ в водной среде химическими и физическими методами, для оценки степени загрязнения во многих случаях удобно использовать организмы-индикаторы. Использование в качестве биоиндикаторов загрязнения морей и пресных водоемов одноклеточных водорослей имеет определенные преимущества. Накопление металлов разными тканями многоклеточных организмов существенно отличается: большая часть поглощенного металла содержится в молодых частях слоевищ макроводорослей, верхушках водяных мхов и пр. (1). Реакции на отравление многоклеточных организмов опосредованы рядом факторов и сложны для интерпретации, в качестве примера можно привести такое защитное приспособление как слизь, покрывающая тело рыб (2). В отличие от других гидробионтов одноклеточные водоросли находятся в постоянном контакте со средой и зависимы от окружающих условий в большей степени, чем мелкие многоклеточные формы, поскольку у них меньше возможностей отделить свою внутреннюю среду от внешней. Так, например, они не могут изолироваться, пережидая неблагоприятные условия (как бактерии'или моллюски). Обмен веществ между клеткой микроорганизма и средой осуществляется всей ее поверхностью, поэтому внутриклеточные процессы исключительно зависят от условий среды, некоторые процессы метаболизма даже протекают снаружи(3) (Работно-ва, 1990; Возжинская, Камнев, 1994; МаШ1оуа, 1991).

Удаление и концентрирование ТМ из промышленных стоков, природных водоемов и почв, определяемое способностью некоторых гетеротрофных микроорганизмов, в частности бактерий и дрожжей, аккумулировать большие количества ТМ из водной среды и донных отложений, является одним из важнейших направлений биотехнологии металлов. Для разработки эффективных методов исследуются механизмы данного

процесса, выясняется влияние на него внешних условий и ведется выделение наиболее активных видов и штаммов биоаккумуляторов (Экологическая биотехнология, 1990).

Применение устойчивых к загрязнению ТМ видов и штаммов микроводорослей и цианобактерий для биологической очистки соответствующих промышленных стоков может служить альтернативным подходом к детоксикации и извлечению ценных металлов. Существует целая группа химических элементов, называемых редкими металлами (Т1, 1\По,

Та, Мо, Щ и используемых в промышленности, которые становятся загрязнителями из-за недостаточной очистки сточных вод, в тоже время их концентрация в земной коре невелика, а добыча связана с определенными трудностями. При очистке сточных вод могут быть использованы такие свойства водорослей как детоксикация ТМ и их соединений и непосредственное концентрирование; накапливаются и те металлы, которые не используются в метаболизме. Кроме того, в отличие от гетеротрофных микроорганизмов микроводоросли не требуют сложных органических сред для культивирования (Саенко, 1992; Naga-эе et а1., 1994; Ш1з1;оп еЪ а1., 1995).

II. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. Физиологическая роль металлов, их влияние на фотосинтезирующие организмы

Уровень ТМ в среде возрастает в связи с загрязнением отходами и стоками промышленных предприятий, сельского хозяйства, добычи и переработки полезных ископаемых. Живые системы не только существуют в среде со значимыми концентрациями ионов металлов, но и включают некоторые из них в свой метаболизм (обведены на Рис. 1).

Большинство этих металлов оказывает влияние на функционирование фотосинтезирующих организмов по двум направлениям. Первое -

Ы Ве

I Иа Мё | |-1

I К Са | Бс Т1 I V Сг Мп Ре Со Ш Си 1п \

I-1 Ч ,-,

ЕЬ Бг У НГ №з | МО |Тс Ки Рб Ag Сб.

I_|

Сб Ва Ьа гг Та Ш Ре Об 1г Pt Аи /. , Рисунок 1. Биологически важные металлы.

непосредственное включение в активный центр ферментативных систем в качестве активных^ групп или компонентов простетических групп ферментов (Бе, '-'"Мп, Си; Мо) и второе - активация их отдельных компонентов в качестве кофакторов, соединяющих фермент с субстратом

путем образования хелатов (Zn, ''е Мп и Mg), либо кофакторов, переводящих фермент в активную форму путем влияния на гидратацию белков и связанную с ней конформацию (двух-и одновалентные ионы) (табл. I). Некоторые металлсвязывающие белки, способные осуществлять ре-гуляторные функции в клетке или контролировать метаболизм металлов, содержат ионы металлов, организованные в кластеры; наличие подобных структур обнаружено в группе железо-серных (Fe-S) белков, компонентов электронно-транспортной цепи (ЭТЦ) и у металлотионеи-нов (Чернавина, 1970; Эрлих, 1981; Леменовский, 1997; Abdul1а, Cmielnicka, 1989).

Таблица I.

1 металл | 1 взаимодействие | функции металла

1 1 металл-лиганд | 1

1 Na, К | 1 очень слабое | осмотический баланс

Mg, Ca | среднее | активация энзимов

Zn, Ni | сильное | кислоты Льюиса

переходные| очень сильное | катализаторы окислитель-

металлы | 1 но-восстановительных ре-

1 1 акций

Fe, Си | i очень сильное | | переносчики кислорода

В среднем 25-35% всех известных ферментов содержит ионы железа, цинка, меди, марганца, молибдена, кобальта, никеля и др.(табл. II, Дедюхина, Ерошин, 1992; Attridge е! а!., 1995).

Таблица II.

1 I Хим. элемент 1 Функции, ферменты |

1 Железо Каталаза, пероксидаза, сукцинатдегидрогеназа, |

ксантиноксидаза, аконитаза, цитохромы |

окисление Ре(11) и Ре(Ш) - основа энергети-|

ческого обмена клеток автотрофных железобакте-1

рий 1

1 Марганец Супероксиддисмутаза аргиназа, пируваткарбокси-1

лаза, гликозилтрансфераза, ацетил-КоА-карбок-|

силаза, изоцитратдегидрогеназа. |

реакции фотолиза воды |

I Медь Супероксиддимутаза, нитритредуктаза, цианид- |

резистентная оксидаза, полифенолоксидаза |

I Магний Фосфодиэстераза, гексокиназа, транскетолаза,|

ацетил-КоА-синтетаза, глютатионсинтетаза и др.|

1 Никель Гидрогеназа, редуктаза метилкофермента М, |

карбонмонооксиддегидрогеназа, уреаза . |

1 Молибден Ксантиноксидаза, нитратредуктаза - |

1 Цинк Оксидоредуктазы, трансферазы, гидролазы, лиа- |

зы, изомеразы, лигазы |

1 Кобальт Витамин В12, метилмалонил-КоА-мутаза, ацетил- |

орнитаза; кофактор в связывании молекулярного |

азота; для некоторых азотфиксирующих организ- |

1 мов его можно заменить ванадием | |

При исследовании потребления Zn и Со фитопланктонными организмами было показано, что они в определенной степени взаимозаменяемы: цианобактерия Synechococcus bacillaris нуждается в Со, но не Zn, a Emiliania huxleyi - частично замещает потребность в Со цинком. Диатомовые водоросли Thalassiosira pseudonana и Т. осеапгса нуждаются в Zn, но способны вместо него использовать Со: при снижении внеклеточной концентрации Zn потребление Со возрастает в 700 раз (Sunda, Huntsman, 1995).

О физиологической роли и участии в каких-либо специфических реакциях Cd, Cr, Ni,, Hg, Pb практически ничего не известно. Они связываются клеточными оболочками, обнаруживаются в активно делящихся клетках (меристемах многоклеточных организмов). В минимальных концентрациях многие из них стимулируют фотосинтез и дыхание микроводорослей, то есть в определенной степени они связаны с обменом веществ (Reddy, Prasad, 1989).

Ванадий (V) используется некоторыми зелеными, желто-зелеными, бурыми водорослями: в концентрации 20 мкг/л стимулирует рост и синтез хлорофилла (5-аминолевулиновой кислоты) у Chlorella sp. и Scenedesmus oblicus; вместе с негемовым Fe (в форме V03) входит в состав бромпероксидаз Ascofilium nodosum, Fucus vasiculosum и Со-rallina pilulifera и альтернативных нитрогеназ некоторых почвенных бактерий. Бактерии рода Pseudomonas: Ps. fluorescens, Ps. chroma-tofilium, Ps. vanadiumreduc tans и Ps. isachencovii, обладающие ва-надатредуктазной активностью, способны в анаэробных условиях использовать ванадат в качестве конечного акцептора электронов, восстанавливая его до V4+ и V3+ (Бандман, 1989; Юркова, Ляликова, 1990; Rehder, 1991; Itoh et al., 1996).

1) роль ванадия как загрязнителя.

Ванадий (V) находится в пятой группе периодической системы. В соединениях проявляет валентность +5,+4,+3,+2. Отличается высокой химической устойчивостью в пресной и морской воде, водных растворах минеральных солей. Широко распространен в природе в составе минералов: ванадинита, деклюазита, карнотита; в меньших количествах содержится в железофосфористых рудах, углисто-кремнистых сланцах, бокситах, нефти. В целом в земной коре содержится от 9 - Ю-3 до 135 -10"3%. В мировом океане присутствует в форме У02(0Н)32~, средняя концентрация 1,5 мкг/л, годовой захват железомарганцевых конкреций составляет 3,2 тыс тонн. В речной воде со взвесью содержится до 65 мкг/л, главным образом в виде крупных коллоидных частиц Ч0г (ОН)2~. В промышленности используется в основном 4- и 5-валентный V, например при производстве различных марок стали: износоустойчивых, жаропрочных, сверхпроводимых сплавов для постоянных магнитов, различных катализаторов.

Годовое поступление ванадия в окружающую среду составляет 4 • 106 т, при этом до 1,7 •105 т поступает за счет промышленности и транспорта и до 1 • 105 т - за счет энергетических предприятий (ТЭЦ), выводится же только 5 ■104 т в год. В сточных водах металлургических предприятий содержится до 700 мг/л, после очистки - до 340 мг/л V, столько же содержат сбросовые воды ТЭЦ (Бандман, 1989; ИесПау еЪ а1., 1990; ИеИбег, 1991).

Методы определения У5+ в воде основаны на цветовой реакции с ортофосфорной, салицилгидроксамовой и уксусной кислотами, с 8-гид-роксихинолином, Мензоил-]\Ьфенилгидроксиламином в сильнокислой среде (чувствительность метода- 0,05-40 мг/л); для определения со-

держания ванадия в биологических пробах используют спектральные методы (Бандман, 1989). Пороговая концентрация ванадата внешне выражается в появлении желтой окраски и горького вкуса и составляет О,1 мг/л; пороговая концентрация по влиянию на общий санитарный режим - 10 мг/л.

Природными аккумуляторами ванадия являются грибы Aspergillus niger и Amantia muscaria, содержание металла в которых в 108 раз выше, чем в среде; морские макроводоросли, накапливающие до 2, 5 г ванадия на т. биомассы; беспозвоночные, включая асцидии Tunicata, содержание ванадия в которых в 107 превышает содержание в среде, моллюск Pleurobranchus, голотурию Stichopus тоЪгг, полихету Pseudopotamilia оссеlata (до 7,15 мг/г сухой биомассы). В хромогене крови Ascidia phallosia mammilata содержится 18,5% ванадия, часть металла находится в клетках-ванадоцитах при рН=3 в форме V3+ (Render, 1991; Nakai et al., 1992).

Цианобактерии участвуют в накоплении ванадия в ванадиеносных горючих сланцах, которые содержат до 500 г/т ванадия, чем и может объясняться высокая концентрация ванадия в сбросовых водах ТЭЦ: основная масса органического вещества данного топлива представляет собой остатки цианобактерий (Горленко, Погребкова, 1987). Количественные значения накопления ванадия прокариотными организмами представлены в табл. III.

2. Влияние внешних факторов на аккумуляцию тяжелых металлов

Клетки микроводорослей способны накапливать ТМ из водной среды в количествах, превышающих потребность в них как в компонентах минерального питания. Аналогичным образом накапливаются металлы, ко-

Таблица III.

объекты Содержание ванадия в клетках,

% от сухой биомассы

содержание ванадия в среде

0, 3 г/л** 0,7 г/л*

P. vanadiumreductance 0,025 0, 013

P. isachencovii 0. 011 0, 013

Micrococcus к5 0, 026 0, 028

Nostoc puctiforme 0, 1 0, 25

Phormidium laminosum 0, 23 0,43 •

*) концентрация V в сточных водах металлургических

предприятий **) концентрация V после очистки

торые не используются в метаболизме (ОагаИат а1., 1993; ДОМзЪоп а1., 1995). От 20 до 96% добавленных металлов удаляется из среды за счет связывания клетками микроводорослей. В прямой зависимости находятся увеличение в водохранилищах биомассы зеленых, диатомовых водорослей и цианобактерий и степень дезактивации воды от Сб, Мп, Сг, Бе (Мисюра, 1991). Зеленые водоросли являются более эффективными биоаккумуляторами, чем бурые или красные (Иао е1 а1., 1995). Некоторые морские микроводоросли: Tetrasetms вр., ВипаЫ-еЫа ЬегЫоЬесЬа и РНаеойасЫит ЬггсогпиЬит способны расти непос-

редственно на сточных водах и полностью удалять из них Cd, Cu, Fe, Mn и Zn в концентрации до 10"6 М; иммобилизованные клетки Aphano-capsa pulchra поглощают из сточных вод 75-94% Cd и Zn (при исходной концентрации 14-38 мкг/мл); Chlorella sp. и Selenastrum sp. поглощают 67-98% растворенных Cu, Pb и Cr (Subramanlan et al., 1994; Brady, Duncan, 1994; Whiston et al., 1995).

Аккумуляция большинства TM коррелирует с их содержанием в среде: такая зависимость наблюдается, например, у термофильных циано-бактерий при накоплении Zn, Sn, Ag, Со и отсутствует для Cu, РЬ и Cd: при ничтожно малом содержании в водоеме они существенно накапливаются биомассой цианобактерий, зеленых и диатомовых водорослей Pediastrum tetras (Божков, Могилевская 1994; Revis, Merks, 1989).

Anabaena braunii поглощает кадмий активнее, чем медь. Естественные сообщества морского фитопланктона, а также чистая культура Platymonas viridis при эквимолярном содержании в среде накапливают металлы в последовательности N1) Мп> Со; зеленые водоросли Scene-desmus sp., Selenastrum sp. и Chlorella sp. - в последовательности Ag> Cu> Cd> Zn. Из смеси Zn, Co и Cd S. quadricaud