Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Действие КВЧ излучения на зеленую микроводоросль PLATYMONAS VIRIDIS ROUCH

ВАК РФ 03.00.18, Гидробиология

Автореферат диссертации по теме "Действие КВЧ излучения на зеленую микроводоросль PLATYMONAS VIRIDIS ROUCH"

- С МАГ «35

МОСКОВСКИЙ ОРДрЩгрШИНА, ОРДЕНА ОКТЯБРЬСКОЙ РЕВОЛЮЦИИ И ОРДЕНА" ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ им.М.В. ЛОМОНОСОВА

БИОЛОГИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

На правах рукописи

УДК 581.132:582.264:528.232

Лапшин Олег Михайлович

ДЕЙСТВИЕ КВЧ ИЗЛУЧЕНИЯ НА ЗЕЛЕНУЮ МИКРОВОДОРОСЛЬ PLATYMONAS VIRIDIS R0UCH.

03.00.18 - гидробиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1994

Работа выполнена на кафедре физиологии растений и кафедре клеточной физиологии и тшунологии Биологического факультета Московского государственного университета им. М.В.Ломоносова

Научный руководитель: доктор биологических наук

А.Х. ТАМБИЕВ

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

профессор В. М. ГОРЛЕНКО кандидат биологических наук С. Е. ПЛЕХАНОВ

Ведущее учреждение: Институт физиологии растений РАН

сОР

Защита состоится {" Г/.'.' в

час

на заседании Специализированного Совета Д.053.05.71 в Московском государственном университете им. М.В.Ломоносова по адресу:

119899, Москва, Воробьевы горы, Биологический факультет МГУ

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке им. А.М.Горького Биологического факультета МГУ

Автореферат разослан: 199Сгода

Ученый секретарь

Специализированного совета /"""^тС г~/ о

кандидат биологических наук А. Д. ДМИТРИЕВА

Актуальность проблемы. В настоящее время микроводоросли яв-лются обязательными участниками биотехнологического произ-юдства, дающего полезную продукцию, комплексов аквакультуры, (амкнутых циклов, растительных ассоциаций, их успешно вводят в гекоторые наземные агрофитоценозы. Широкое использование микрово-юрослей и цианобактерий в пищевых и кормовых целях (в том числе 1 качестве витаминных добавок) может помочь снизить нарастающий 1ефицит белка. Стимулирующее действие различных факторов на рост шкроводорослей будет не только увеличивать выход их биомассы, но I способствовать обогащению среды такими ценными соединениями, как витамины, гормоны, ферменты, антибиотики, пигменты и т.д.

Выбранный нами для исследования стимулирующего действия физический фактор - электромагнитное излучение миллиметрового диапазона низкой интенсивности (КЗЧ-излучение) широко изучался в последние 25 лет в медицине и на некоторых биологических объектах, что привело к созданию в ряде случаев практической КВЧ-тера-пии, однако его действие никогда не проверялось на фотосинтезиру-ющих объектах, что придает актуальность поставленной проблеме.

Цель и задачи исследования. В соответствии со сказанным целью настоящей работы явилось изучение закономерностей действия КВЧ-излучения на фотосинтезируюпше объекты - микроводоросли. Поставленная цель определила решение следующих конкретных задач:

- разработку методик и вариантов облучения культур микроводоросли на агаризованной среде,

- отработку оптимальных параметров облучения, при которых достигается максимальный стимулирующий эффект в накоплении биомассы объекта,

- изучение изменений физиологических параметров культур под действием КВЧ-излучения,

- изучение действия КВЧ-излучения на фотосинтетическую активность облученных клеток микроводоросли и объяснение общих механизмов наблюдаемого явления.

Научная новизна и практическая значимость работы. В работе впервые показано выраженное стимулирующее действие КВЧ-излучения на фотосинтезирующие объекты - микроводоросль Platymonas viridis Rouch. Разработаны методики облучения и выявлены оптимальные параметры облучения (временные, частотные, мощностные), обеспечивающие достижение максимального стимулирующего эффекта и ускорение роста водоросли. Показан резонансный эффект при действии КВЧ-излучения. Изучено стимулирующее действие КВЧ-излучения на уровень фотосинтетических процессов и накопление пигментов в клетках микроводорослей. Показана корреляция мехду величиной стимулирующего действия и реакционной способностью выделяемых экзометаболитов, что дает возможность использовать изменения окислительной (ОА) и антиокислительной (АОА) активности среды как физиологический критерий состояния облученных и необлученных культур микроводорослей.

Изучена в норме и при облучении циркадная (часовая, суточная) ритмика изменений реакционной способности экзометаболитов микроводорослей, определяемая периодическими изменениями в их количественном и качественном составе, показано увеличение экскреции рибофлавина (витамина Ва) под действием КВЧ-облучения. Установлен стимулирующий эффект комбинированного облучения (КВЧ-излучения и импульсного сантиметрового излучения), превышающий эффект отдельно взятых видов излучения.

Используемый в работе объект исследования - зеленая морская микроводоросль Р. viridis, будучи примененной в марикультуре, может с упехом выполнять роль первого звена трофической цепи, обладает таким ценным для интенсивного культивирования качеством, как устойчивость к механическим воздействиям, и вполне пригодна как нетрадиционный источник кормового и пищевого белка. Ценность ее определяется также присутствием высокомолекулярных жирных кислот, а в экзометаболитах обнаружен ряд полезных и биологически активных соединений. Эта микроводоросль обладает также высокой устойчивостью к химическим загрязнениям среды, на чем основываются возможности использования ее при очистке илов биологических заводов.

Обнаруженная стимуляция роста и накопления биомассы фотосин-гетическими организмами (микроводорослью) под действием КВЧ-излу-1ения, сопровождающееся интенсификацией фотосинтетических провесов и увеличением содержания пигментов в клетке, может в 1ерспективе быть эффективно использована в фотобиотехнологии.

Апробация работы. Результаты исследований представлялись на 1-м Всесоюзном симпозиуме " Теоретические основы аквакультуры" (Москва, 1983), Всесоюзной конференции "Промышленное культивирование микроводорослей"(Москва, 1985), конференции "МГУ - Главмик-робиопром" (Москва, 1986), 6-м Всесоюзном семинаре "Применение мм излучения низкой интенсивности в биологии и медицине" (Москва, 1986), 1-й Всесоюзной конференции "Актуальные проблемы современной альгологии" (Киев, 1987), 8-м Международном биотехнологическом симпозиуме (Париж, 1988), 7-м Всесоюзном семинаре"Примене-ние КВЧ излучения низкой интенсивности в биологии и медицине" (Москва, 1989), 5-м международном симпозиуме по микробной экологии (Киото, 1989), Международной конференции "Фотосинтез и фотобиотехнология" (Пущино, 1991).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 20 работ, получено 2 авторских свидетельства.

Объем и структура. Диссертация изложена на ... страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, изложения полученных результатов, обсуждения, выводов и .списка использованной литературы (... источник, из них отечественных авторов ...), содержит ... таблиц и ... рисунка.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Морская зеленая микроводоросль Platymonas viridis Rouch. была выделена из Севастопольской бухты Черного моря и описана Роу-хияйнен (1966). Представляет собой форму, имеющую 4 жгутика, клетки эллиптические, симметричные, длиной 10-14 мкм и шириной 5-10 мкм. В отдельных опытах использовалась макрофитная агаро-носная черноморская водоросль Phyllophora nervosa (DC) Grev.

В работе использовали аксеничную культуру P.viridis, полученную ранее (Тамбиев, Кирикова, Паньков, 1986), которую выращивали в условиях накопительного культивирования на минеральной среде Гольдберга в модификации Кабановой (1958) в колбах на 750 мл с объемом минеральной среды 250 мл в люминостате при температуре 26°С и круглосуточном освещении 2000-2500 лк. Согласно литературе указанные условия были для данной микроводоросли оптимальными (Спекторова, 1970, Силкин и др., 1977). В качестве посевного материала и для облучения брали 6-8 суточную культуру активно растущих водорослей.

Определение числа клеток проводили подсчетом в камере Горяе-ва, средний объем клеток определяли с использованием электронного счетчика частиц Coulter Channeliser (Каултер) марки "ZBIC". Плотность суспензии водорослей определяли на фотоэлектроколориметре КФК-2 (зеленый светофильтр), сухую биомассу весовым методом (Владимирова, Семененко, 1962). Удельную скорость роста ( сут"^) определяли как отношение разности логарифмов значения числа клеток в начальный и конечный момент времени к его продолжительности (Финенко, Ланская, 1971). Количество мертвых клеток определяли окраской эритрозином (Сиренко,1975), рН культуральной жидкости определяли на потенциометре типа "рН 340".

Облучение электромагнитным излучением миллиметрового диапазона низкой интенсивности (КВЧ-излучением) проводили однократно генератором высокочастотных сигналов Г4-141 и импульсным генератором обратной волны с релятивистским электронным пучком. Водоросли облучали на агаризованной среде в чашках с фторопластовыми крышками, проницаемыми для КВЧ-излучения. После облучения контрольную и облученную культуры микроводорослей с чашек Петри переносили в колбы с большим количеством среды. Начальное содержание клеток микроводорослдей во всех вариантах уравнивали по оптической плотности. Каждый опыт ставили в трех повторностях.

Реакционную способность (окислительную - OA и антиокисли-•ельную - АОА активность) определяли методом химических моделей Тамбиев, 1974, 1984), в качестве модели использовали 3,4-диокси->енилаланин (ДОФА). OA и АОА определяли соответственно по повыше-шю или понижению скорости реакции автоокисления ДОФА в контроле [ при добавлении культуральной жидкости микроводоросли, содержали экзометаболиты ( по отношению тангенсов углов наклона каса-•ельной к кривой на участке максимальной скорости автоокисления в :онтроле и в опыте ). Измерения проводили на оригинальных уста-говках "Аквакон" моделей 3 и 4. Спектры поглощения суспензий це-шх клеток водорослей снимали на спектрофотометре Hitachi 15-20 : использованием интегрирующей сферы.

Фотосинтетическую активность определяли полярографическим гетодом с электродом Кларка (Гришина и др., 1971). Хлорофилл в метках определяли количественно в 80% ацетоне по методу Арнона 1949). Определение рибофлавина (витамина ВА) в культуральной шдкости микроводоросли проводили (Букин и др., 1955) на флуори-гетре ЭФ-ЗМА с использованием стандартного раствора рибофлавина.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

1.Ростовые характеристики культуры Р.viridis.

В условиях накопительной культуры зеленая микроводоросль '.viridis растет в общем по S-образной кривой. Лаг-фаза составля-;т 12 часов, как известно, у ряда видов планктонных водорослей ее гродолжительность может зависеть от возраста инокулята (Финенко, [анская,1977). Фаза интенсивного роста составляет у Р.viridis жоло 16 дней, затем наступает стационарная фаза, к началу 'кото-гай количество клеток достигает 2,01-2,02 млн/мл, максимальная ¡иомасса (0.45-0,47 г/л) совпадает с количеством клеток.

Рост культуры сопровождался подщелачиванием среды до 1,7-8,9, что особенно было заметно в первые сутки роста, в стаци-шарной фазе pH несколько снижался. Удельная скорость роста юстигала наибольшей величины на 2-е сутки, затем начинала снижаться в фазе интенсивного роста и особенно падала в стационарной >азе, количество мертвых клеток было незначительно и не превышало 1-6% в конце фазы интенсивного роста .

Как известно из литературы, получение такой интегральной характеристики выделяемых в среду экзометаболитов и внеклеточны: продуктов цианобактерий и микроводорослей, как реакционна5 способность, позволяет судить об изменениях в их количественном i качественном составе и о связанном с этим физиологическом состоянии продуцента (Тамбиев, 1974, 1984). Для ряда видов морских водорослей, в том числе для Р.viridis, была показана резко выраженная ОА экзометаболитов на всех фазах роста культур, ее изменена при этом соответствовали физиологическому состоянию культур (прохождению фаз роста, нарастанию числа клеток и процента мертвыз клеток и т.д.) (Тамбиев, Золотухина, Иванова, Паньков, 1983, Тамбиев ,1984). В начале процесса роста Р.viridis ОА экзометаболито! испытывает небольшой подъем, затем несколько уменьшается на 2-oî день , после чего ОА резко возрастает по мере роста числа клеток и, пройдя через максимум примерно в середине фазы интенсивногс роста, начинает падать, достигая уровня, имевшегося в начале фазь (удельная скорость роста также падает) (рис.1). С начала стационарной фазы падение ОА замедляется, делаясь постепенным.

При изучении зависимости скорости автоокисления химической модели (ДОФА) от pH была показана относительная независимость ее в диапазоне pH от 6 до 8,8 - 9,0.

2.Количественные закономерности действия КВЧ-излучения на культуру микроводоросли Р.viridis.

Как показали опыты, КВЧ-излучение влияет на скорость роста и накопление биомассы Р.viridis и проявление этого влияния зависит от времени облучения. Из табл.1 видно, что оптимальное стимулирующее время облучения составляет 60 мин и его увеличение приводит к уменьшению стимуляции и даже ингибированию прироста. Удельная скорость роста быстрее падала у необлученной культуры, во время стационарной фазы к 30-му дню рост необлученной культуры практически прекращался, в то время как облученная культура показывала некоторый рост. Процент мертвых клеток был выше у необлученной культуры с начала фазы интенсивного роста.

Таблица 1.

Влияние КВЧ излучения па прирсст биомасс» у необлученноп (Т) и облученной (II) культур Г. г/л, ^ - 8,34 мм.

' " т -1

| | I

Время I Возраст льтури, сут I |

облуче- I-1 Стимуляция 1

ния.шш I 30 2Г 30 ('роста на 30-е I

I-|сутки, % |

I I II I Л I II I |

15 10,05 0,16»* 0.31 :.бо** 0.40 0,91** 1 228

30 10, 05 0,18** 0.31 С. 40 0,92* 1 230

60 ¡0, 05 0,15 0.31 :.54* С. 40 1,15** 1 288

120 10,12 0,16 0.27 :.28* С. 44 0,49 1 111

360 10,16 0,16 0.4С :.4о 0.57 0,52** 1 91

-1-1-г

Примечание: различия значима при : » р>0.Э5; ** р>0,99

ОД. число

Гпс.1. То!::'^:^'"'^ с::чссС::?сть 5::?о"2тайплятов (2)

: "л" 9.

Кратность облучения отрицательно сказывалась на стимулирующем эффекте: увеличение облучения до 3-х раз приводило к снижения стимуляции и накопления биомассы микроводоросли. Изменения реакционной способности среды (ОА) коррелировали с изменениями биомассы и величиной стимулирующего действия, наибольшей величине ОЬ соответствовало оптимальное время облучения, а его увеличение приводило к снижению ОА и появлению АОА (рис. 2).

В действии КВЧ-излучения на микроводоросль Р.viridis отчетливо проявлялась частотная зависимость, которая была описана на других, нефотосинтезирующих объектах (Гуляев и др., 19В6, Бецкий и др., 1988). Бе все проверенные нами частоты оказывали хорошо выраженную стимуляцию, лучше всего она проявлялась на длинах волн 6,06; 7,10 и 8,34 мм (рис.3). Как видно, подъемы ОА соответствуют наибольшей стимуляции.

При влиянии КВЧ-излучения наблюдался резонансный эффект, описанный ранее (Гуляев и др., 1986), когда небольшое изменение длины волны (на 0,05 мм) вызывало значительные изменения в накоплении биомассы и ОА среды (табл.2). В диапазоне длин волн от 8,20 до 8,34 мм наибольший эффект проявлялся при 8,34 мм, где стимуляция на 30-й день достигала 241%; меньший эффект достигался при длине волны 8,30 мм, а облучение при длинах волн 8,20 и 8,25 мы приводило к ингибированию роста. Максимальная ОА среды соответствовала наибольшей стимуляции, а при ингибировании роста наблюдалась, как видно, даже АОА.

Была также получена зависимость действия КВЧ-излучения от падающей мощности. При длине волны 8,34 мм и неоптимальном времени облучения (30 мин) и диапазоне мощностей от от 1 до 2,9 мВт/сы прирост биомассы и интенсификация фотосинтеза наблюдались при значениях 1; 1,5 и 2 мВт/см? в остальных случаях они практически отсутствовали.

ол

Глс.2. Ц-гли:"- Г.1т:-г г.""--?т!л из н?*!гпсш'с ;icai:unomic!i cr.ocoí'-mr Г',) срслн (?^эомсга-

Сс.".::г?з Г.

Cîit.c:"!X- - с^.-учсина.- гулы:ça, rtji:x -

HOr'.TTvçr::!1", "-Iri-avi: na itp'jrix р^пэня'тки ir;" r« с:.т-

OA Б

i.i %

2DO- (.о- QO-

е.6 /

о? / / / /

160 0.6 / N

« / 1 1

Но IM / . / \ 1 !

120 / Od i 1 Í \ 1

É.CÍ 6.25 éíé 7,1 >,1 7,3 N-!

90

So

ЛОЛ

Г::г.З. *::•:** ИГ'-'/'.—'м^ш:! птзчсЛ г.*»:!:'; J-C-.ttiu ra

-гт::: Г. u?üM.

---(ГО. чЭ г. г.

— — — -".г:'."Trini г:тсгоог'"С1 ь СД.ЛСЛ)

Резонансная зависимость в действии КВЧ излучения на зеленую водоросль Platymonas viridis.

(Б-биомасса, PC-реакционная способность (ОА, АОА).

Возраст культуры, сутки Г1 1 Условия 1 облучения 1 (длина волны, мм) 1 в Б г/л i 1 PC 1 в % 1к контролю 1 Стймуляциз накопление биомассы ]

10 1 1 8,20 0, 18 1 1 107 90

1 8,25 0, 22 1 119 110

1 8,30 0, 21 1 111 105

1 8,34 0, 35 1 191 175

1 контроль 1 0, 20 1 137 100

20 1 1 8,20 0, 41 1 84 76

1 8,25 0, 52 I 158 96

1 8,30 0, 92 1 216 170

1 8,34 1, 10 1 258 204

1 контроль 1 0 сл 1 148 i 100

30 1 1 8,20 0 54 1 1 84 62

1 8,25 0 86 1 142 99

1 ■ 8,30 1 9 I 184 218

1 8,34 2 1 1 199 241

1 контроль 1 0 87 1 137 i 100

3.Действие КВЧ-излучения на фотосинтетические процессы в клетках микроводорослей.

Как показали опыты, КВЧ-излучение оказывало значительное действие на уровень фотосинтетических процессов в клетках микроводорослей. Значения полученной стимуляции фотосинтеза, как было показано, совпадали с уровнем стимуляции выхода биомассы и зависели на оптимальной длине волны от времени облучения (табл.3). Видно, что стимуляция фотосинтеза наблюдалась на всех фазах роста и особенно проявлялась даже при неоптимальном времени облучения в стационарной фазе (30 сут), когда выделение кислорода значительно падало в контроле у необлученной культуры. Облучение в течение 120 мин вызывало ингибирование фотосинтетической активности.

Интенсификация фотосинтеза сопровождалась увеличением после облучения содержания хлорофилла в клетках: на 20-е сутки в клетках Р.viridis хлорофилл увеличивался с 12,2 (контроль) до 16,7 мг/мл, а выделение кислорода соответственно с 22,2 до 31,0 мкмоль/мг хлорофилла в мин (биомасса возрастала с 0,4 до 1,01 г/л). При исследовании форм пигментов временная зависимость также выражена, но не столь отчетливо, хотя было заметно, что облучение в течение 15 и 30 мин в большей степени влияло на увеличение количества хлорофилла, а в течение 60 мин - на возрастание количества каротиноидов. Были получены максимумы поглощения целых клеток ( 672 и 647 нм, соответствующие хлорофиллу а и Ь), идентичные по числу и положению у облученных и необлученных культур, но разница в оптическом поглощении говорила об увеличении количества пигментов после облучения.

Важным на наш взгляд фактом явилось то, что стимулирующее действие однократного облучения на микроводоросль сохранялось в последующих пассажах, заметно ослабевая к 3-му пассажу, т.е. имело пролонгированный характер. Повышенное количество пигментов в клетках при этом сохранялось . Постепенное ослабевание эффекта действия КВЧ-излучения в последующих пассажах можно скорее объяснить затуханием реакций, например, цепного типа, обуславливающих проявление стимулирующего эффекта, чем воздействием облучения на геном клеток фотосинтетиков. Сохранение эффекта действия КВЧ-излучения также отмечалось у нескольких поколений дрожжей (Исаева, 1991).

Изменение фотосинтетической активности необлученной и облученной

культуры Р. У1Г1СИБ В процессе роста. - 8,34 мм »

1Возраст Время Биомасса, Выделение 04, Интенсивность

1 культуры облучения в г/л в нмоль/мин/Е фотосинтеза

1в сутках в мин. в %

15 0,20+0,04 15,5 +3,7 100

1 10 30 0,19+0,08 20,0+5,2 129,0

60 0,25+0,03 20,0+2,1 129,0

120 0,20+0,02 10,0+4,8 64,5

контроль 0,20+0,02 15,5+4,8 100

15 0,61+0,11 27,4+4,3 119,1

1 20 30 0,61+0,13 30,0+6,2 130,4

60 0,70+0,17 32,0+4,1 139,1

120 0,47+0,19 25,0+8,1 108,6

контроль 0,42+0,09 23,0+2,0 100

15 1,00+0,12 6,4+2,1 200,0

1 30 30 1,10+0,16 8,0+2,4 250,0

60 1,20+0,09 11,2+2,9 350,0

120 0,72+0,18 2,0+0,3 62,5

| контроль 0,68+0,11 3,2+0,7 100

Изменение биомассы и физиологических параметров Р.viridis при воздействии КВЧ-излучения (20 сут).

1 1 Параметры 1 облучения 1 1 Б г/л PC % Ojt ' мкмоль-мг i хл-ла«час i

1 17,1 мм 130 мин 1 0,50 146 120 21 i

1 17,1 мм 160 мин 1 0,57 187 146 27 :

1 18,34 мм 130 мин 1 0,53 120 124 23 i

1 18,34 мм 160 мин 1 0,69 190 168 24

1 1 контроль 1 0,40 100 105 29

Б - биомасса, РС - реакционная способность (ОА), % к контролю, 0^- фотосинтетическое выделение кислорода,. 0г|- поглощение кислорода.

Представляло интерес получить данные по влиянию КВЧ-излуче-ния на взаимосвязь процессов фотосинтеза и дыхания. Конкурентные взаимоотношения между дыханием и фотосинтезом описаны у различных объектов, например, цианобактерий (Барский и др., 1987). Как показали опыты, облучение сдвигает взаимодействие между этими процессами в сторону более благоприятного для клеток процесса - фотосинтеза (табл.4).

4. Действие КВЧ-излучения на ритмические процессы в клетках микроводорослей.

Несмотря на то, что ряд аспектов экскреции органических соединений водорослями и цианобактериями изучен достаточно хорошо (Горюнова, 1966, Fogg, 1968, 1971,1983, Хайлов, 1971, Hellebust, 1974, Sharp, 1977, Тамбиев, Кирикова, 1981, Сакевич, 1985, Сирен-ко, Козицкая, 1988), временная ритмика выделения экзометаболитов отмечалась на различных видах водорослей лишь в нескольких работах (Чернов, 1972, Косенко, 1974, Полищук, 1977, Сакевич и др., 1985).

Нами была исследована суточная и часовая ритмика изменений реакционной способности экзометаболитов микроводорослей, определяемая периодическими изменениями в их составе и накоплением в среде, а также действие на нее КВЧ-излучения. На ранних сроках роста Р.viridis изучалась зависимость между количеством клеток, их объемом, OA и АОА культуральной жидкости; эти три параметра непрерывно прослеживались в течение 1,5 суток после пересева микроводоросли на свежую среду, а также далее в течение нескольких отдельных суток роста. Полученные закономерности даны на рис. 4.

Видно, что после пересева водоросли в первые часы ( пересев в 9 час утра) прироста клеток не наблюдается, так как проходит лаг-фаза, но в этот же период резко возрастает средний объем клеток (от 220 до 285 мкм), который начинает не менее резко падать за 4 часа до начала первого деления, продолжает падать во время деления и достигает минимума к его окончанию. В литературе известны колебания размеров и объемов клеток водорослей (Сакевич и др., 1985). Указанное возрастание среднего объема клеток Р.viridis могло бы быть объяснено сдвигами в осмотическом равновесии, либо накоплением клетками фотосинтезированных продуктов;

часы от посева 11 « 13 лз 1 7 <1 15 19 23

время суток

?::с.4. Часовая рптыкка ~з;.;екекп:1 реакционно;: способности (РС) среды (экзомегаболптов) (I), объема клеток (2) к числа клеток (3) за 1-2 сутки роста кеоблучекной культури Р, гчги(Со5. 4 - РС облучекнс;: культуры (/ - 8,34 кл).

при этом трудно объяснить резкое падение объема до начала первого деления. В недавно появившихся работах описан изогамный ауто-миксический половой процесс у микроводоросли Р.viridis, клетки которой размножаются, прикрепившись к субстрату и достигнув определенной плотности (Иванова, 1987, Иванова, Ивановский , 1988, 1989). Возможно поэтому, что до первого деления и на протяжении его более крупные клетки Р.viridis из внесенного инокулята начинают прикрепляться к стенкам сосуда, а в суспензии, просчитываемой прибором, остаются клетки меньшего объема.

ОА культуральной жидкости, как видно, резко повышается сразу после посева, увеличиваясь в течение часа на 55-58% к контролю, что можно приписать известному в литературе культуральному шоку (Хайлов, 1971), однако уже через 2 часа ОА возвращается к исходным значениям, после чего она начинает снова повышаться, достигая следующего максимума к 15 час дня, что идет параллельно с возрастанием уровня фотосинтеза. Затем ОА начинает падать, переходя в АОА приблизительно за 4 часа до окончания лаг-фазы, что происходит параллельно с резким уменьшением объема клеток. Это продолжается лишь до начала первого деления, когда АОА сразу же перестает увеличиваться, пройдя через свой нижний максимум, и во время деления, продолжающегося около 4-х часов, возвращается к ОА. Как только деление прекратилось, ОА тут же снижается, переходит в АОА, которая достигает наибольшего значения (22%) в промежутке между делениями. Тем не менее с началом второго деления АОА снова проходит через максимум, начинает уменьшаться и возвращается к его окончанию в небольшую ОА, но с окончанием деления картина повторяется - ОА сменяется AÖA.

Объем клеток, как видно, в то же время испытывает колебания, находящиеся как бы в противофазе к изменениям реакционной способности: возрастает сразу после окончания первого деления, падает с началом второго и возрастает после его окончания (рис.4).

Начальное число клеток (30-35 тыс/мл) за первые 36 часов возрастает в 4 раза, удельная скорость достигает наибольшей величины ко 2-м суткам роста, далее понижаясь, pH в то же время меняется с 7,5-7,6 до 8,5-8,7. В более поздние сроки культивирования темп клеточных делений снижался, они проходили в более растянутые сроки и, начиная с 3-х и до 12-13 суток роста наблюдался, как говорилось, устойчивый максимум OA в 15 часов , становившийся постепенно менее выраженным, и связанный с циркадной ритмикой фотосинтеза.

Необходимо отметить, что выявленная ранее закономерность относительно экскреции в среду морскими микроводорослями в норме значительных количеств соединений с окислительными свойства-:!: (Тамбиев, 1984) и наблюдавшаяся нами в отношении Р.viridis, под: -вердилась в наших опытах и на макрофитной агароносной черноморской водоросли Phyllophora nervosa. У нее наблюдался устойчивый дневной максимум OA , объясняемый дневной ритмикой фотосинтеза, что совпадает с литературными данными (Чернов, 1972). По мере инкубации таллома Pi nervosa происходило уменьшение абсолютной величины пиков от 600-650% по отношению к контролю на 1-й день до 240-300% на 7-е сутки, что является следствием, видимо, физиологического ухудшения состояния водоросли, содержавшейся в непроточных условиях. Некротизированная площадь таллома достигает к 7-м суткам 10-15%, а к 25-м суткам, когда некроз достигает '60-70% площади, OA среды переходило в АОА, составляя 70-80% от контроля. Использование большей биомассы P. nervosa, вносимой в среду (отфильтрованную морскую воду), показывало более выраженную последовательность изменений реакционной способности. Суточная периодичность изменений 0А и недельная цикличность высоты дневного максимума отмечалась у выращиваемой дальневосточной макрофитной водоросли Ahnfeltia tobuchiensis (Золотухина и др., 1989), сходная картина наблюдалась у бурой водоросли Dictyopterix divaricata (Тамбиев, 1991).

Полученные нами и литературные данные дают возможность использовать реакционную способность экзометаболитов водорослей как критерий физиологического состояния культур микроводорослей и инкубируемых либо культивируемых макрофитных водорослей (Тамбиев, Золотухина и др., 1983, 1985), клеточных суспензий из талломов макрофитных водорослей (Тамбиев, Романова, 1991). Так, по изменениям ОА и АОА среды на ранних сроках роста Р.viridis можно судить о начале и завершении делений.

Данные, полученные нами по ритмике реакционной способности экзометаболитов Р.viridis свидетельствуют о том, что адаптация к новой среде культуры микроводорослей продолжается 1,5-2 суток, после чего устанавливается постоянная картина циркадных рит-мов(рис.4). На адаптацию макрофитных водорослей к новым условиям также требуется около двух суток (Чернов, 19?2). Ритмические изменения реакционной способности экзометаболитов, связанные с физиологическим состоянием культур или талломов, могут быть использованы для выявления тонких колебаний метаболизма водорослей, в том числе под действием различных факторов, которые зачастую невозможны для регистрации другими методами.

КВЧ-излучение, как показали опыты, влияет на ритмику реакционной способности экзометаболитов, определяемую экскретированными в среду соединениями (рис.4). У облученной культуры Р.viridis величина первого максимума ОА несколько выше (посев в 12 часов), что происходит вследствие наложения на культуральный шок действия облучения, второй максимум, связанный с дневным максимумом фотосинтеза, также больше, так как синтез экскретируемых соединений идет активнее у облученной культуры. Первое деление начинается раньше (через 11 часов), второе деление наступает у необлученной культуры через 16-17 часов после посева, а у облученной - через 14-15 часов, т.е. при наблюдаемом сходстве ритмики в первые сутки роста облучение способно сокращать длину лаг-фазы, ускорять наступление первого и всех дальнейших делений, что, видимо, можно объяснить стимулированием накопления энергии в период интерфазы.

Наибольшая разница у облученных и необлученных культур Р.viridis наблюдается на вторые сутки роста, когда у последней, начиная с 24 часов после посева, идет постепенное падение OA с переходом ее в АОА , в то время как у облученной культуры OA продолжает повышаться, что свидетельствует об экскреции окислителей в среду и лучшем физиологическом состоянии микроводоросли.

Выявленные нами циркадные ритмы экскреции органических соединений, связанные с ритмическими процессами деления клеток и с периодическими изменениями физиологических характеристик, свидетельствуют о том, что КВЧ-излучение ускоряет наступление фаз роста, связанных с интенсивным нарастанием численности- клеток, а также облегчает процесс адаптации культуры к новой среде. Циркадные процессы у микроводорослей некоторые исследователи объясняют периодическими изменениями положения органелл в клетке или циклическими изменениями проницаемости мембраны (Полищук, 1977) и не исключено, что КВЧ-излучение влияет на эти процессы. Во:- тг-также информационое воздействие на ход внутриклеточных бис;, гг-ческих часов, определяющих циркадную ритмику.

Большая величина у облученной культуры Р.viridis второго и последующих часовых максимумов OA по сравнению с необлученной культурой , что связано с повышением фотосинтетической активности и делением клеток, дали возможность предположить увеличение из облученных клеток экскреции органических соединений, которая по данным некоторых авторов увеличивалась у представителей морского фитопланктона при интенсификации фотосинтетической активности (Holmes, Williams, Eppley, 1967), а у макрофитных водорослей являлась светозависимым процессом (Sieburth, 1969, Пешеходько, Тит-лянов, Беликов, 1976, 1978). Опыты показали, что КВЧ-излучение влияло на экскрецию рибофлавина культурами Р.viridis при облучении А=8,34 мм и Р=1,8 мВт/см? В среде облученной культуры на 10 сутки роста находилось 5 мкг/л рибофлавина (витамина Вг ), в то время как в среде необлученной культуры рибофлавина практически не обнаруживалось. На 20-е сутки в среде облученной культуры рибофлавина было почти в 2 раза больше (7,5 мкг/л и 4 мкг/л), при этом биомасса облученной и необлученной культуры различалась в 1,5 раза.

5. Влияние комбинированного облучения на культуру микроводоросли Р.viridis.

Были проведены опыты по исследованию комбинированного воздействия на культуру Р.viridis двух видов электромагнитного излучения: непрерывного однократного КВЧ-излучения по описанной схеме и импульсного излучения в сантиметровом диапазоне. Для КВЧ-излучения с длиной волны 8,34 мм использовалось как оптимальное (60 мин), так и неоптимальное время облучения (30 мин), после чего на культуру воздействовали 5 импульсами с длиной волны 3 см, длительностью импульса 10 не, время между импульсами 6 мин, средняя плотность падающей мощности - 200 кВт/см?

На 30 сутки роста при оптимальном времени облучения прирост биомассы после комбинированного воздействия составлял 219% к контролю, чему соответствовали более высокие значения ОА и фотосинтетической активности. При этом при раздельном воздействии прирост биомассы в те же сроки после только непрерывного однократного облучения в условиях данных опытов был ниже и составлял 190%, соответственно понижались значения ОА и фотосинтетической активности; прирост биомассы под действием только импульсного облучения к 30 суткам составлял 117% к контролю.

Далее нам предстояло выявить оптимальное число импульсов, вызывающее в комбинации с непрерывным облучением максимальный прирост биомассы. Из методических соображений (возможность предварительного облучения большего числа проб без нарушения физиологического состояния культур) для дальнейших опытов было выбрано оптимальное время 30 мин. Предварительное непрерывное облучение проводили на длине волны 8,34 мм при мощности 1,52 мВт/см? число импульсов варьировало от 1 до 11. Были получены два пика стимуляции прироста биомассы при 4-5 и 7-8 импульсах.

Была также проверена обратная последовательность в этой комбинации: сначала культура Р.viridis облучалась импульсами в диапазоне от 1 до 11, затем на нее в течение 30 мин воздействовали непрерывным облучением в тех же условиях. Такая последовательность в общем не оказывала высокого стимулирующего действия на прирост биомассы, он не превышал 135-140% к контролю на 30-е сутки роста при 4-5 импульсах, в других вариантах прирост был меньше, а при 2-3 импульсах контроль по биомассе превышал опыт.

В последние годы появилось несколько работ по действию ВЧ-излучения на фотосинтезирующие объекты. Стимуляция роста и акопления биомассы отмечалась у цианобактерий и микроводорослей ТатЫеу et а1., 1986, Тамбиев и др., 1986, Гусев, Тамбиев, Кири-ова, 1990, Тамбиев, Кирикова, 1991); КВЧ-излучение вызывало у ысших растений изменения мембранного потенциала клеток, которые, о мнению авторов, (Петров, 1989, 1991, Ре^оу, 1989, Петров, ецкий, 1989) связаны с активированием АТФ-синтетазных комплексов клетке. Было показано, что КВЧ-излучение влияло на пролифера-ивную активность клеток высших растений (Шестопалова и др., 989); отмечалось повышение всхожести семян некоторых культур под ействием облучения (Петров и др., 1991).

Данные, полученные в результате исследований, проведенных олее чем за 20 лет, по действию КВЧ-излучения на нефотосинтези-ующие объекты, позволили авторам высказать различные точки зре-ия на механизмы действия облучения (Бецкий.Голант, Девят-ов,1988, Голант,1991, Бецкий 1991, Хургин и др., 1991, Алексеев др., 1991). Проведенной нами работы пока недостаточно, чтобы ать точную расшифровку механизмов действия КВЧ-излучения на фо-осинтезирующие объекты. Учитывая полученные нами, а также данные еречисленных и недавно вышедших работ (Маркарова и др., 1992, амбиев и др., 1993) по влиянию КВЧ-излучения на поглощение и вы-еление ионов, на соотношение фотосинтеза и темнового дыхания и •д., можно говорить об определенной роли изменений состояния проницаемости) мембран, которые составляют, видимо, основу сти-улирующего воздействия на рост и накопление биомассы объектов, го не противоречит мнению о том, что эффекты воздействия разви-аются, в основном, либо в самих мембранах клетки, где могут воз-икать, например, акусто-электрические колебания, влияющие на ме-аболизм (Девятков и др., 1982, Бецкий., 1991), либо влияют посредовано через цитоплазму клеток (Гайдук, Цейтлин, 1991).

Можно, повидимому, считать, что миллиметровые волны при од-экратном воздействии избирательно влияют у фотосинтетиков на чень чувствительные структуры и звенья метаболизма, что приводит развивающимся сдвигам и накапливающемуся впоследствии проявле-ию физиологических эффектов. Сейчас недостаточно данных, чтобы эворить о специфичности или общности этих механизмов для фо-эсинтезирующих и гетеротрофных организмов.

Выводы.

1. Разработаны методики облучения КВЧ-излучением культу; микроводоросли на агаризованной среде.

2. Обнаружено выраженное стимулирующее действие миллиметро вых волн - КВЧ-излучения на фотосинтезирующие объекты - зелену: микроводоросль Platymonas viridis Rouch. Отработаны оптимальны параметры облучения, при которых достигается максимальный стиму лирующий эффект в накоплении биомассы микроводоросли.

3. Изучены частотные, временные, мощностные закономерност действия КВЧ-излучения на микроводоросли. Показан резонансный ха рактер действия, установлен эффект комбинированного облучения.

4. Изучено стимулирующее действие КВЧ-излучения на уровен фотосинтетических процессов и накопление пигментов в клетке ник роводоросли.

5. Выявлена циркадная (суточная, часовая) ритмика изменени реакционной способности экзометаболитов микроводоросли P.viridi и показано влияние на нее КВЧ-излучения.

6. Показано, что реакционную способность экзометаболито можно рассматривать как физиологический критерий стимулирующег действия КВЧ-излучения на микроводоросли.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Тамбиев А.X., Лапшин О.М. Ритмика изменений реакционно способности экзометаболитов морской зеленой водоросли/ Тез. докл I Всес. симпоз. "Теоретические основы аквакультуры", М. 1983.-С.188-189.

2. Тамбиев А.Х., Лапшин О.М., Панъков С.Л. Связь между реак ционной способностью экзометаболитов и физиологическими парамет рами культуры морской промышленно важной микроводорослЕ Platymonas viridis/ Тез.докл. Всес. конф. "Промышленное культиви рование микроводорослей", М., 1985. -С.110-112.

3. Тамбиев А.Х., Лапшин О.М., Паньков С.Л. Корреляция объек с наступлением деления клеток промышленно важной микроводорос; Platymonas viridis/ Тез. докл. конф. "МГУ - Главмикробиопром" М., 1986. -С.50.

4. Тамбиев А.Х., Лапшин О.М.Суточные колебания реакционной способности экзометаболитов агароносной водоросли Phyllophora nervosa/ Тез. докл. конф. "МГУ - Главмикробиопром", М., 1986. -С.51-52.

5. Тамбиев А.Х., Кирикова H.H., Лапшин О.М. Изменение реакционной способности экзометаболитов сине-зеленой водоросли Spirulina platensis при действии электромагнитного излучения мм диапазона низкой интенсивности/ Тез. докл. VI Всес. семин. "Применение мм излучения низкой интенсивности в биологии и медицине", М., 1986. -С.45.

6. Тамбиев А.Х., Кирикова H.Н., Лапшин О.М. Реакционная способность и биологическая активность экзометаболитов морских одноклеточных водорослей/ Тез. докл. I Всес. конф. "Ar—, альные проблемы современной альгологии", Киев, 1987. -С.144.

7. Тамбиев А.Х., Лапшин О.М. Временные ритмы изменений реакционной способности среды морских водорослей/ В сб.: "Применение научных разработок ученых-биологов в рыбном хозяйстве", М., 1987. -С.131-136.

8. Тамбиев А.Х., Кирикова H.H., Лапшин О.М., Яковлева М.Н., Мантрова Г.М. Изменение реакционной способности экзометаболитов сине-зеленой водоросли спирулина под действием мм излучения/ В сб.: "Медико-биологические аспекты миллиметрового излучения низкой интенсивности", М., 1987. -С.121-125.

9. Tambiev А.Н., Kirikova N.N., LapshinO.M., Gusev M.V. Physiological criterion of cyanobacrerium growth stimulation/ ibstr. 8 Intern. Biotechnol. sympos., Paris, 1988. -P.259.

10.Tambiev A.H., Lapshin 0.M. Rhythms of excretion of arganic substances by microalgae/ Abstr. 8 Intern. Biotechnol. sympos., Paris, 1988. -P.128.

11. Тамбиев А.Х., Кирикова H.H., Лапшин О.М., Бецкий O.B., Яовскова Т.А., Нечаев В.М., Петров И.Ю. Влияние комбинированного воздействия миллиметрового и сантиметрового электромагнитного излучения на продуктивность микроводорослей/ В сб. : "Миллиметровые золны в медицине и биологии", М., 1989. -С.183-188.

12. Тамбиев А.Х., Кирикова H.H., Лапшин О.М. Влияние ЭМИ мм [щапазона на фотосинтетическую активность "микроводорослей/ Тез. 10кл. УП Всес. семин. "Применение КВЧ- излучения низкой интенсивности в биологии и медицине", М., 1989. -С. 83.

13.Тамбиев А.Х., Кирилова H.H., Лапшин О.М., Бецкий О.В., Яковлева М.Н., Мантрова Г.М., Гусев М.В., Некоторые закономерности взаимодействия ЭМИ мм диапазона с микроводорослями/ Тез. докл. УП Всес. семин. "Применение КВЧ-излучения низкой интенсивности в биологии и медицине", М., 1989. -С.84.

14. Гусев М.В., Тамбиев А.Х., Кирикова H.H., Лапшин О.М., Бецкий О.В., Гуляев Ю.В. Способ подготовки посевного материа-ла-инокулята микроводорослей/1990. Авт. свидетельство N 1552641.

15. Tambiev А.Н., Kirikova N.N., Lapshin О.М. Reactionary ability of native exometabolites in algae-bacterium association/ Abstr. 5 Intern, sympos. on microbial ecology (ISME-5), Kyoto, 1989. -P.166.

16. Тамбиев А.Х., Кирикова H.H., Лапшин О.М., Смирнов ,Н.А., Гусев М.В. Стимулирующее действие электромагнитного излучения миллиметрового диапазона низкой интенсивности на рост микроводорослей/ Вестн. Моск. ун-та, сер. 16. Биология.-1990.-N

1.-С.32-36.

17. Тамбиев А.Х., Кирикова H.H., Лапшин О.М., Гусев М.В. Изменение ростовых характеристик при воздействии на микроводоросли электромагнитного излучения миллиметрового диапазона низкой интенсивности/ Вестн. Моск. ун-та, сер. 16. Биология.-1990.-N

2. -С. 42-47.

18. Тамбиев А.Х., Кирикова H.H., Лапшин О.М., Бецкий О.В., Новскова Т.А., Нечаев В.М., Гуляев Ю.В., Гусев М.В. Способ получения посевного материала микроводорослей/1992. Авт. свидетельство N 1741417.

19. Тамбиев А.Х., Кирикова H.H., Лапшин О.М., КВЧ-излучение и интенсивность фотосинтеза у микроводорослей/ Тез. докл. Междун. конф. "Фотосинтез и фотобиотехнология", Пущино, 1991. - С.111.

20. Тамбиев А.Х., Лапшин О.М., Влияние КВЧ-излучения на ритмику фотосинтетических процессов морской микроводоросли/Тез. докл. Междун. конф. "Фотосинтез и фотобиотехнология", Пущино, 1991. -С. 112.

21. Тамбиев А.Х., Лапшин О.М., Кирикова H.H. Изменение цир-кадных процессов у микроводорослей под действием КВЧ-излучения/В сб.: "Миллиметровые волны в медицине", М., 1991. - С.308-311.

22. Тамбиев А.Х., Кирикова H.H., Лапшин О.М. Изменение фотосинтетической активности микроводорослей под влиянием электромагнитного излучения/Физиология растений.-1992.-N 5.-С.1004-1010.