Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Безмедиаторное сопряжение NAD-зависимой гидрогеназы и неорганического полупроводника CdS при фотокаталитическом восстановлении NAD

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Безмедиаторное сопряжение NAD-зависимой гидрогеназы и неорганического полупроводника CdS при фотокаталитическом восстановлении NAD"

РГ6 од

1 9 ДПР-1303

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ОРДЕНА ЛЕНИНА ИНСТИТУТ БИОХИМИИ ии. А.К.БАХА РАН

На права! рукописи

ШУМИЛИН ИГОРЬ АЛЕКСЕЕВИЧ

УДК 577.152

БЕЗМЕДИАТОРНОЕ СОПРЯЖЕНИЕ NAD-ЗАВИСКМОИ ГНДРОГЕЙАЗЫ И НЕОРГАНИЧЕСКОГО ПОЛУПРОВОДНИКА CdS ПРИ ФОТОКАТАЛИТ1ЯЕСКОМ ВОССТАНОВЛЕНИИ MAD.

03.00.04. - биологическая химия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации иа соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Ыосква - 1993

Работа выполнена в лаборатории инзенерной энзиыологии биохимии им. Л.Н.Баха РАН.

Института

Научные руководители

Официальные оппоненты

- д.х.н. В.О.Попов

к.б.н. В.В.Никандров

( 1

- д.б.н. И.Н.Гоготов д.х.н. А.И.Ярополов

Ведущая организация

Кафедра энзиыологии Химического факультета МГУ им. М.В.Ломоносова

м

Защита состоится " " ' " ЛлО^ 1ЭЗЗ г на заседании Специализированного Совета (К 902.96.01) по присуждению ученой Ътепени кандидата биологических наук в Институте биохимии им. А.Н.Баха РАН (Мосхва, Ленинский проспект, 33, корп.2).

С диссертацией ыохно ознакомиться в библиотеке биологической литературы РАН (Москва, Ленинский проспект, 33, корп.1).

Автореферат разослан

л- 04.

1993 г.

Ученый секретарь Специализированного Совета, доктор биологических наук

.Молчанов

общая характеристика работы.

Актуальность проблемы. Создание фотохимических систем на основе неорганических полупроводников является одним из перспективных подходов к преобразованию энергии света. Световое возбуждение полупроводника создает условия для протекания окислительно-восстановительных реакций с участием фотогене-рированных электронов зоны проводимости и дырок. Эти реакции включают стадию межфазного переноса электрона и часто протекают с низкими скоростями. Сопряжение ферментов и полупроводников, или осуществление ферментативных реакций при использовании генерированных полупроводником окислительно-восстановительных эквивалентов, позволяет достичь высокой скорости и :елективности фотохимических реакция. Сопряжение полупроводника и $ермента достигается либо при помощи редокс-недиатора, либо за зчет прямого переноса электрона полупроводник-фермент.

Осуществление ферментативной реакции при пряном переносе электронов от неорганического полупроводника к ферменту представляет особый интерес, так как его реализация является предпосылкой для создания нового типа фотобиокатализаторов, 5иосенсорных или биоэлектронных устройств. Изучение прямого переноса электронов от твердого тела - полупроводника на ■юлекулу фермента позволяет также получить сведения о структуре фермента, свойствах его окислительно-восстановительных центров и tx взаимодействии с электродами.

Единственным реализованным до сих пор безмедиаторным [ютокаталитическим процессом при сопряженом действии неорганических полупроводников и ферментов является ¡ютообразование водорода.

Применение NAD-зазисимых ферментов в фотохимических ;истемах позволяет осуществить вксокоселективный процесс генерации NADH с использованием световой энергии. Все подобные ;истемы, реализованные до сих пор, требуют обязательного 1рисутствия медиаторов, прямой перенос электрона от юлупроводника к NAD-зависимому ферменту не осуществлен. Нами 5ыло предположено, что фотовосстановление NAD при пряном переносе >'ле>гт ронов от неорганического полупроводиш.-а ксжет бктъ >суиествлено при использовании nad-гавнсимой гидрогеназы, >бладаюшей электрон-транспортной цепью с большим количеством

реакшгонноспособных редокс-центров.

Ир л т. и' палачи. Целью данной работы является реализация безмедиаторного сопряжения неорганического полупроводника -фотосенсибилизатора и фермента - NAD-зависимой гидрогеназы, исследование условий и механизма прямого переноса электрона полупроводник - фермент. В связи с этим были поставлены следующие задачи:

1. Создание безмедиаторной фотокаталитической системы восстановления NAD, основанной на сопряженном действии NAD-завИСИМОЙ гидрогеназы Alcaligenes eutrophus Н16 И неорганического полупроводника.

2. Оптимизация условий фотокаталитического ферментативного восстановления nad.

3. Определение механизма сопряженного действия NAD-зависимой гидрогеназы и неорганического полупроводника. Идентификация субстрата гидрогеназы в фотокаталитической реакции и локализация редокс-центра гидрогеназы, обеспечивающего поступление электронов от полупроводника в электрон-транспортную цепь фермента.

Научная новизна. Впервые реализовано безмедиаторное сопряжение NAD-зависимого „ фермента и неорганического полупроводника.

Впервые показана возможность использования ферментом -NAD-зависимой гидрогеназой нового типа субстрата - металла Cd°.

Сформулирован новый механизм фотоокисления формиата полупроводником Cds.

Впервые осуществлено разделение тетрамерной молекулы NAD-зависимой гидрогеназы A.eutrophus Н16 на гетеродимеры. Предложенный метод позволяет получить в чистом виде каталитически активный диафоразный и гидрогеназный гетеродимеры фермента.

Установлено, что редокс-центр гидрогеназы, обеспечивающий поступление электронов от полупроводника в электрон-транспортную иепь фермента, расположен на диафоразном гетеродимере.

Практическая ценность паботн. Реализованная в данной работе безмедиаторная фотокаталитическая система восстановления NAD до NADH, основанная на сопряженном действии NAD-зависимой гидрогеназы и неорганического полупроводника Cds, может использоваться в биотехнологических процессах для регенерации кофермента. Осуществление переноса электронов от металлического

кадмия в электрон-транспортную цепь NAD-зависииоП гидрогеназы открывает новып подход для сопряжения ферментов с полупроводниками и электродами.

дгтпобаиня пабптн. Основные результаты работы представлены на международной конференции по Фотохимии (Киев,1992), на конференции "Структурно-функциональная организация фотосинтетических мембран и их моделеП" (Пувино,1993).

Структура и объчм работ». Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, излохения результатов и их обсуждения, выводов г. списка цитируемой литературы. Работа изложена на (ЗОстраницах и иллюстрирована32рисунками. Список цитируемой литературы включает ÏS"-f работн.

Публикации. Основные материалы диссертационной работы отражены в 4 публикациях, приведенных в конце автореферата.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

Сорбция NAD-зависикой гидрогеназы сульфидом кадмия.

Ранее было показано, что сорбция фермента является

необходимым условием для осуществления прямого переноса электрона от полупроводника. Эффективность связывания NAD-зависимой гидрогеназы частицами Cds ?ависит от состава среду. При насыщении сорбции в фосфатном и в MES-трис буфере при рН 5.5-6.5 количество связавшегося с Cds фермента почти одинаково. Увеличение рН приводит к ухудшению связывания белка, при этом сорбция в MES-трне буфере происходит более эффективно, чем в фосфатном (изменение рН от 6.0 до 8.0 в MES-трис снижает связывание гидрогеназы лишь на ю%, а в фосфате сорбция уменьшается в несколько раз). Добавление фосфата к препарату, сорбированному в MES-трио, приводит к десорбции гидрогеназы до уровня, достигаемого в фосфатном буфере. Добавление формиата почти не влияет на связывание гидрогеназы в MES и трис, а также в КФБ рН 5.5-6.5. При более высоких рН в фосфатном буфере сорбция фермента значительно увеличивается в присутствии 1-2 M фсрмиата.

Иммобилизованная на частицах cds гидрогеназа сохраняет ферментативную активность в реакциях с природными субстратами (восстановление NAD водородом и обратная, реакция с NADH) и в реакции выделения н2 из восстановленного метилвиологена.

Видимо, связывание гидрогеназы частицами cds обеспечивается не кулоновскшш, а водородными связями. На это указывает сохранение степени связывания фермента при значительном повышении ионной силы {вплоть до 2 M концентрации соли -формиата натрия). На сорбцию гидрогенази не влияет и добавление солей кадмия, хотя,' как показано, связывание катионов cd2+ придает частицам cds положительный заряд, а молекула гидрогеназы заряжена отрицательно (pi 4.S5). Многозарядные анионы типа фосфата, по-видимому, связываются поверхностью Cds. Электростатическое отталкивание препятствует эффективной сорбции фермента в таких условиях, особенно при повышении рН, когда увеличивается содержание двухзарядного аниона нро42- и трехзаряднсго PO,j3~. Использование буферов, не содержащих многозарядных анионов (mes, трис) позволяет исключить фактор электростатического отталкивания и достичь высокой степени связывания белка с полупроводником даже при высоких рН.

Разделение NAO-зависимой гидрогенази Alcaligenes eutrophus Н16 на двафоразный и гидрогеназный гетеродиыерн.

Тетрамерная молекула NAD-зависимой гидрогенази наряду с центрами активации NAD и н2, содержит другие каталитические редокс-центры. Одним из подходов к исследованию гидрогеназы является изучение ее фрагментов, содержащих отдельные участки электрон-транспортной цепи фермента. Известно, что гидрсгеназа Xocacdia opaca ib при недостатке Ni2* обратимо диссоциирует на два гетеродимера, один из которых проявляет гидрогеназную, а другой - диафоразную активность с искусственными акцепторами. Гидрогеназа a.eutrophus не диссоциирует в таких условиях, достичь разделения составлявших ее гетеродимеров до сих пор не удавалось.

NAD-завискыая гидрогеназа A.eutrophus Н16 связывается с фенил-сефарозой в солевом буфере и при уменьшении ионной силы десорбируется одним пиком без потери активности. При обработке связанной с фенил-сефарозой гидрогеназы буфером с высоким рН (>11), с колонки сходит пик белка, окрашенного в коричневый цвет. Последующее промывание колонки низкомолярним буфером приводит к десорбции второго белкового пика. При повышении рН щелочного буфера количество белка в первом пике увеличивается, а во втором уменьшается до тех пор, пока они не достигают постоянного примерно эквиаолярного соотношения. Спектры поглощения выделенных

фрагментов соответствуют спектрам гетеродпмеров. выделенных и:> гпдрогеназы к.opaca.

Белок, составлявший первый пик, представляет собой диафоразный гстеродимер фермента. Он абсолютно не проявляет гидрогеназной активности, но эффективно катализирует окисление KADH искусственными акцепторами. При разделениг в оптимальных условиях удельная активност;, диафоразного фрагмента в реакшш окисления NADH феррицианидом в 2.5 раза превышает удельную активность нативной гпдрогеназы.

Белок, образующий второй пик, является гидрогеназннм гетеродиаерон фермента. Гидрогеназный фрагмент инактизируется в процессе разделения и содержит лишь остаточные гидрогеназную и диафоразную активности из-за примеси недиссоциировавшего фермента.

Реассоциации разделенных гетеродимеров достичь не удалось. Возможно, диссоциация гпдрогеназы при высоких pH приводит к нарушению структуры гидрогенаэного фрагмента, теряющего ферментативную активность.

Связывание нативной молекулы фермента фенил-сефарозой происходит, видимо, благодаря гидрогеназному фрагменту. После удаления диафоразного гетеродимерэ, не связывающегося с фенил-сефарозоп в условиях эксперимента, связи между носителем и гидрогеназной частью молекулы сохраняются и условия десорбции гидрогеназного гетеродимерг остаются такими же как у нативной молекулы фермента.

&отокаталит»ческое восстановление nad до nack е результате

безмэдиаторного сопряжения КАС-ззвиеиной гидрогенази и неорганического полупроводника CdS.

При освэшокии видимым светом суспензии CdS, содержащей формиат в качестве донора электронов, NAD-эависимую гидрогеназу и nad, происходит образование соединения, имеющего характерный для nadh спектр поглощения (рис.1). Образующееся вещество полностью окисляется при катализируемом L-глутаматдегидрогеназой восстановительном амкнирсвании 2-!сетогл5'тара?з. Это означает, чте фотохимическая система формиат-сеЗЗ-гидрогеназа спеиифическ:: восстанавливает nao до nadh. Продукт неспецифического одно.1лектронкого ¡установления ( nad>2 не образуется. Фотсобразование nadh не наблюдается, если в систсме отсутствует

g

гидрогеназа, донор электронов или полупроводник.

При использовании других, нежели формиат, эффективных доноров электронов (цистеина, дитиотреитола, mes) фотовосстановление NAD сорбированной на Cds гидрогеназой не происходит» Более того, при добавлении SH-содержащих доноров, NADH/не образуется даже в присутствии формиата. В отличие от этого, добавление mes (до 1U) в содержащую формиат систему почти не влияет'на скорость фотовосстановления NAD.

Образование NADH системой формиат-саБ-гидрогеназа начинается сразу после освещения без индукционного периода и имеет постоянную скорость на протяжении 30-40 мин действия света, затем скорость реакции снижается (рис.1). Падение скорости фотореакции связано с постепенным фотоокислением гидрогеназы полупроводником.

Зависимость скорости фотообразования nadh от концентрации nad имеет обычный для ферментативных реакций характер, значение константы Михаэлиса гидрогеназы по nad в фотореакции составляет 2.2*ю"4 м и близко к kmnad в реакции восстановления nad водородом, катализируемой ферментом в растворе (5.6*10"4М).

Скорость фотообразования NADH линейно возрастает при увеличении концентрации донора электронов формиата вплоть до 2 M (рис.2). Ускорение реакции не связано с ростом ионной силы раствора, так как при поддержании постоянной ионной силы добавлением NaCl, скорость фотопроцесса уменьшается, а ее зависимость от концентрации формиата сохраняет аналогичный характер. Скорость фотовосстановления NAD прямо пропорциональна интенсивности света в интервале до 2.5*10° эрг*см **с , при дальнейшем усилении светового потока скорость не изменяется. Увеличение содержания полупроводника от 2 до 30 мг вызывает лишь незначительное ускорение фотореакции.

Максимального значения скорость фотообразования nadh достигает, в интервале pH 6.0-7.0 (рис.3). При pH выше 9 восстановление nad практически прекращается (в этих условиях не происходит и фотоокисления формиата полупроводником). Фотообразование nadh протекает с наибольшей скоростью при использовании буферов, в составе которых отсутствуют многозарядные анионы (трис, mes, epps, mops и т.п.). Присутствие 0.1 M фосфата уменьшает скорость реакции почти в 2 раза, а в присутствии такой же концентрации бората или цитрата nadh не

Рве. l. Образование hash при деЕстван света на систему форииат-саз-гадрогеназа-НАВ. На вставке - спектр поглощения образупчегсся наш.

5 кг cas tl m 0.05 Ы KES рН 6.5 с 2 U «оракатоы; 25 икг гсдрогеназн; 1.5«10-» Ы HAD; 10-2 н edeb : интенсивность света 5*10* эр^сн-'гс-1.

Рте. 2. Загпедаость скорости Сютосбрэзовския HADH скстеиоК Cop-"-iaT-CàS-r!!jrooreaa3a-iiAD от коплен î^oït форцната. А - ионная сила определяется концентрацией йюрмиата; в - зонная сила постоянна за счет добавления Neci. s кг cas в 1 ил в 0.1 У mes рН 6.5; 25 икг гидрогеназа: i.5«io-J U had: ю-г м edelz: знтенсквяость света 5*10е эрг»с1гг «с-1.

Рис.з. рН-завкскэюсть скорости фотохгталитичесхого образования kadh системой $opmaT-Cds-rwn>oreHa3a-NAD. 5 иг Cds в 1 ил 0.1 Ы буфере (А - HES; В - тряс) с 2 Ы форииатон: 25 мкг гидрогеназы; 7.5*Ю-4 U NAD; пггенсаввос7Ь света 5*10« эрг*см-,»с->.

к

Об рое количество гпдрогепази, иг

Рнс.4. Зависимость скорости фотообраэованяя NADH систеыоЯ Оорниат-СМЗ-гидрогеназа-НАО (А) я количества сорбирэсанного (фермента (в) от обсего содержания гвдрогепаза.

S мг CdS в 1 ил 0.05 У KES рН Ь.5 с 2 H форматом; Î.SSIC-3 U NA.0: интенсивность света при фото реакции 5»105 aprscsr3 «с-1.

образуется, при этом также прекращается фотоокисление формиата. Вероятно, отрицательный заряд поверхности cdS, образовавшиПся п результате связывания многозаряднш анионов катионам» Cd^, препятствует взаимодействию полупроводника и формиата. Добавление сульфата, хлорида, ацетата почти не влияет на фотовосстановление NAD (как и на фотоокисление донора). Не оказнвает влияния и присутствие катионов К+, Na+, Zn2+ ( 0.01 M), но при добавлении таких же концентраций Cd2+, Mn2+, Ni2+ скорость фотовосстановления NAD уменьшается примерно на 10«.

Увеличение количества гидрогеназы до 0.012-0.015 мг/мг CdS ведет к прямо пропорциональному увеличении фотообразования nadh. Однако, при нагрузке фермецтсчвише 0.05 мг/иг CdS дальнейшее добавление гидрогеназы не B.iîikoT ма скорость процесса (рис.-!). Скорость фотообразования nadh линейно коррелирует с сорбцией гидрогеназы на поверхности частиц CdS, причем связанный фермент не десорбируется с полупроводника в течение фотореакции. Находящаяся в растворе гидрогеназа, вияиыо, не принимает участия в фотореакции.

Активность гидрогеназы при фотовосстановлении NAD в оптимальных условиях, достигает 50% активности иммобилизованного на CdS фермента и 1G~ активности растворенной гидрогеназы в реакции восстановления NAD водородом в темноте.

Полученные результаты позволяют заключить, что необходимым условием для безыедиаторного фотовосстанов.ченкя nad сорбированной на CdS гидрогеназой является 'использование в качестве донора электронов формиата. Для формулировки механизма

фотокаталчтяческой реакции потребовалось изучение

неферментативных фотохимических процессов в системе.

Фотохимические процессы в системе формиат-полупроводи m; cdS.

Ранее било показано, что при фотоокислении формиатэ образуется сильный восстановитель - анион-радикал со2'~ (Ео=-2.ov): нсоо~= + со2'~+ н+1 I- электрон зоны проводимости). Предполагалось, что анион-радикал» со2'" восстанавливают катионы Cd2+ решетки CdS по реакции cd2 + + 2CQ2'~ = cd° + 2С02, а фотогенерированние электроны расходуется на образование водорода, катализируемое cd°: е » = 1/2В2- Проведенные ь

представленное, работе исследования позволили существенно уточнит), и дополнить механизм Фоторазложения Формиата сульфидом кадмия.

Действие света на систему формиат-CdS приводит к образованию трех газообразных продуктов - со2> н2, а также со, генерация которого не была зарегестрирована ранее. Скорость фотообразованыя углекислого газа максимальна в начале освещения, затем выделение С02 резко снижается. В отличие от со2, окись углерода в начале фотохимической реакции образуется лишь в малых количествах, а Н2 вообще не выделятся, он появляется спустя некоторое вреия действия света. Далее скорости фотообразования н2 и СО постепенно возрастают и достигают стабильного максимального уровня. Увеличение скорости фотообразования Н2 и СО совпадает с уменьшением выделения С02. Прекращение освещения приводит к прекращению образования всех трех газов.

Изначально желтые частицы CdS под действием света приобретают серо-зеленый цвет, а при длительном освещении становятся черными. Потемнение полупроводника вызвано образованием атомов кадмия в результате фотовосстановления катионов cd2+ поверхности cds. Восстановление поверхности полупроводника протекает с большей скоростью при низких рН. В щелочной среде потемнения частиц cds к образования Cd° не наблюдается.

При освеиекии CdS в присутствии других, нежели формиат, эффективных доноров электронов ( дитиотреитола, иистеина, меркаптоэтанола, MES), образования cd° на поверхности полупроводника не происходит (частицы сохраняют ярко-желтый цвет), не наблюдается также фотовыделения Н2. Однако, если эти доноры присутствуют в системе одновременно с форыиатом, по влиянию на фотопроцессы они могут быть разделены на две группы. Присутствие MES не влияет на фотоокисление формиата cds и образование Cd°. Принципиально другое действие оказывают SH-соединения. Если эти доноры добавлены к системе формиат-CdS перед началом облучения, при действии света не выделяются С02, со, Н2 и не восстанавливается поверхность полупроводника. После добавления таких доноров к освещаемой системе формиат-cds, содержащей С d° и образующей водород, образование продуктов фоторазложения формиата (со2 и со) прекращается, а фотовыделение н2 увеличивается более чем в 2 раза.

Таким образом, необходимым условием для образования cd° на поверхности cas является фотоокисление формиата. Присутствие mes

п

не влияет на фоторазлозсение формиата, так как в этом случае полупроводник эффективнее окисляет формиат. В присутствии более легкоокиеляемых доноров (Бн-соединений), фотоокчсление формиата подавляется и образования са° не происходит. Следовательно, в восстановлении катионов са2+ решетки участвуют анион-радикала С02"~. как и предполагалось ранее. Прекращение фотоокисления Формиата при щелочных рН, видимо, также объясняется сменой донора. Из-за ионизации БН-групп в щелочных условиях возрастает эффективность фотоокисления полупроводником анионов Э2", входящих в состав саэ, а окисление формиата подавляется. При этом происходит образование коллоидных частиц серы.

Находящийся на восстановленной поверхности полупроводника с<3° служит катализатором фотообразования водорода, без катализатора Н2 не выделяется. В присутствии С(2° добавление Бн-доноров приводит к увеличению фотообразования Н2 за счет их более интенсивного окисления. Следовательно, фотообразование Н2 обеспечивается электронами зоны проводимости саБ, что соответствует ранее предложенному механизму.

В отличие от фотообразования со2 и п2, реакция превращения формиата в со не является редокс процессом, она протекает без изменения степени окисления реагентов. Образование со - это альтернативный путь превращения анион-радикалов со2-~, который достигает максимальной скорости посла исчерпывания окислителей -поверхностных катионов С <32* (возможная схема:

С02'~+ е + Н+ = со + он"). Фотообразование со не происходит в отсутствие анион-радикалов С02'~. Считывая склонность анион-радикалов С02'~ к димеризашт можно также предположить образование в фотосистеме оксалатг (соо~)2.

с6°, образованный при восстановлении поверхности саэ, после прекращения освещения стабилен в анаэробных условиях, его окисление кислородом в отсутствие катализаторов происходит с низкой скоростью. Реакция кадмия с 02 катализируется метилэилогеном, эффективно восстанавливающимся за счет ей0, и протекает по суммарному уравнению 2Сс10 + о2 = 2с<32+ + 202". После полного окисления са° поверхность сеЗЭ принимает прежний желтый ивет. Количество С02, выделившегося в процессе фотообразования Сс1°, в 2 раза превышает количество о2 , требуемого для последующего окисления кадмия. Это означает, что соотношение

фотоокислившегося формиата и образованного Cd° составляет 1:1. Следовательно, один из восстановительных эквивалентов, необходимых катиону решетки для превращения в Cd° обеспечивается анион-радикалом С02'~, а второй - фотогенерированным электроном, и восстановление происходит в результате реакции cd2++ е + со2'~= cd° + со2 (в отличие от предполагавшейся схемы).

При добавлении в фотохимическую систему формиат-cds акцепторов электронов (MV2+, FMN, феназинметосульфатг) происходит их восстановление за счет фотоокисления формиата, образование Н2 и со подавляется. После полного восстановления MV2+, протекающего до MV0, фотовыделение Н2 достигает прежней скорости, а образование СО не возобновляется. Возможно, после полного восстановления метилвиологена анион-радикалы С02'~, расходуются в реакции с двойными связями mv°, тогда как для образования н2 достаточно электронов зоны проводимости и Cd°.

Система формиат-CdS при освещении восстанавливает также катионы cd2+, добавленные в виде растворимых солей. Количество выделяющегося при этом С02 равно количеству добавленных катионов Cd2+, что подтверждает эквиколярное соотношение фотоокисляюаегося формиата и образующегося cd°. Фотовыделение Н2 и СО прекращается после добавления Cd2+ и возобновляется после восстановления катионов.

Вещества, не способные участвовать в редокс реакциях (например, дикумарол) не влияют на поведение фотохимической системы. Присутствие nad также не оказывает влияния на фотореакции (как отмечено выше, неферментативного восстановления nad фотосистемой формиат-cds не происходит).

Ранее з экспериментах по импульсному радиолизу было показано, что редокс потенциал пары Cd2+/Cd+ в растворе составляет примерно -1.9 v и анион-радикалы С02"~ обеспечивают восстановление находящихся в растворе катионов Cd2+ до cd+. Однако, известно, что катион Cd+ в присутствии Cds, окисляется до Cd2+, а электрон при этом переносится на частицу полупроводника. Поглощенный частицей cds электрон находится в некоторой локальной ловувке. Предполагается, что восстановление катиона кадмия решетки cdz до Cd° происходит без промежуточного образования Cd+, по схеме:

е" + Cd2 + = ICd2+e"i, e~ + (Cd2 + e~> = Cd°, где пара lcd2+e~) образована находящимся ь ловушке электроном и катионом репетк;:.

Суммируя полученные в работе и литературные данные, механизм фотовосстановления ионов кадмия, входящих в состав cds, до cd° можно представить следующим образом:

1! Под действием света происходит разделение зарядов на полупроводнике - генерируются дырки и электроны зоны проводимости;

2) В результате окисления формиата фотогенерированной дыркой образуется анион-радикал С02'~;

3) Электрон зоны проводимости локализуется на ловушке и образует пару (cd2+e~);

4) При взаимодействии пары (cd2+e~) с анион-радикалом со2'~ образуется атом Cd°;

5) После восстановления доступных ионов кадмия, фоторазложение донора полупроводником продолжается, а генерированные электроны зоны проводимости и анион-радикалы со2'_ участвуют в других реакциях (образование н2 и со, восстановление акцепторов).

За счет фотоокисления формиата может быть превращено в cd° по крайней мере 20% ионов кадмия решетки Cds. Редокс потенциал атомов Cd°, образовавшихся из катионов поверхности Cds, вероятно, имеет значение между -1.175 V (реакция cds + 2е = Cd° + S2") и -0.403 v (реакция в растворе cd2++ 2е = cd°).

Механизм прямого сопряжения NAD-эазисимой гидрогенаэн и полупроводника cds при восстановлении NAD.

При освещении системы формиат-cds образуются 4 типа восстановителей, . которые могут участвовать в восстановлении N'AD гидрогеназой. Это электроны зоны проводимости полупроводника, анион-радикалы со2'~, водород и cd°. Восстановление NAD до NADH представляет собой двухэлсктронннй процесс и может происходить как при участии одного двухэлектронного восстановителя, так и за счет двух ояноэлектронных (одинаковых или различных).

Опытные данные позволят- сделать однозначный завод - о том, что реализованное фотовоостамовлснне NAI) происходи"- бег участчя водорода. Фотообразование н2 начинается после индукционного

1-4

периода, который может составлять десятки минут. Фотовосстановление nap начинается сразу после начала освещения, то есть происходит в условия!, когда л2 отсутствует. Добавление соли кадмия, приводящее к полному прекращению фотовыделения н2, вызывает лишь незначительное снижение скорости образования NADH. Линейная корреляция скорсати фотовосстановления . NAD с сорбцией гидрогеназы (рис.4) указывает, что в реакции участвует только фермент, связанный с Cds, тогда как при восстановлении NAD водородом, скорость реакции зависила бы от общего содержания гидрогеназы.

Способность гидрогеназы восстанавливать NAD при участии другого, чем водород, восстановителя подтверждают эксперименты с" диафоразным гетеродимером фермента. Диафоразный фрагмент катализирует реакции никотинамидных коферментов, но не содержит Н2-активирующего центра и не способен использовать в качестве субстрата водород (см гл.2). Тем не менее, скорость восстановления NAD системой формиат-саз-гидрогеназа практически не изменяется при замене гидрогеназы на диафоразный гетеродимер (если суммарная диафоразная активность в системе сохраняется).

Очевидно, что в определенных условиях может быть реализовано также восстановление NAD гидрогеназой при использовании фотогенерируемого водорода.

Установить природу взаимодействующего с гидрогеназой восстановителя удалось после разделения реакции

фотовосстановления nad на световую и темновую стадии. Прекращение освещения приводит к полной остановке фотохимических реакций. Тем не менее, добавление гидрогеназы и nad в предварительно освещенную систему формиат-cds приводит к образованию nadh в темноте. Восстановление nad происходит с постоянной скоростью без заметного лаг-периодэ (рис.5). Скорость реакции прямо пропорциональна количеству гидрогеназы, сорбированной полупроводником, но не общему содержанию фермента в системе. Скорость восстановления nad увеличивается при увеличении времени предварительного освещения системы формиат-cds и прямо пропорциональна количеству фотоокислившегося донора (рис.6). Максимальная достигнутая скорость восстановления nad (после 2 часов освещения), в з раза превышает скорость восстановления nad водородом, катализируемого иммобилизованной на cds гидрогеназой,

■НУ

Рис.S. Тенновое образование КАШ гидрогеаазоа, добавленной в предварительно освечекну» систему Çopaaar-cdS.

После S мал освещения s иг cas в 1 ил о.OS H HES pH 6.5 с 2 H еорииатоы • пря интенсивности света 5*10« эрг*сы-*»с-* в теаноте добавлено l.5*io-' Ы had н 25 intr гадрогенаэа .

Рис.6. Зависимость скорости теннового образования НАШ гидрогевазой, добазлевяоЯ в предварительно освеаеннув систену Формяат-cds, от яола^гстга вндеяавэегося щш освевеняп соз. После прекрацсняя осзевдная 5 иг cds s l ал о.05 H mes pH s.5 с 2 Il форккатоа пра ннтевсхваостп света Б«1С5 spr^cir 2=с-; добавлено 1.5*10"3 И NAD И 25 5вГ-гиикзгенази .

i! близка к скорости реакции, катализируемой растворенным ферментом.

Продолжительность периода между прекращением освещения системы формиат-cds и добавлением гидрсгеназы и NAD практически не влияет на скорость образования NADH. Более того, присутствие кислорода в течение 10 мин после прекращения освещения так.ге не изменяет скорость восстановления NAD.

Таким образом, образование nadh после добавления гидрогеназы и nad к предварительно освещенной системе формиат-cds происходит за счет восстановителя, который стабилен долгое время как в анаэробных, так и в аэробных условиях и накапливается в процессе фотоокисления формиата полупроводником.

Анион-радикалы С02"~ чрезвычайно быстро окисляются кислородом и димеризуются в отсутствие окислителей. Таким образом, со2-* должны исчезнуть в течение короткого времени после прекращения освещения системы формиат-cds как в аэробных, так и в анаэробных условиях. Следовательно, восстановление NAD гидрогеназой, добазленной к предосвещенноГ: системе формиат-cds не может происходить за счет анион-радикалов со2'~.

Несмотря на достаточный редокс потенциал, электроны зоны проводимости CdS также не участвуют в ферментативном восстановлении NAD. В присутствии cd° фотогенерированные электроны эффективно вступают в реакцию образования Н2 и быстро исчезают после прекращения освещения. Кроме того, фотовосстановление NAD не протекает в присутствии других, нежели формиат, доноров электронов, несмотря на эффективную Фотогенерацию электронов зоны проводимости в CdS.

Металлический кадмий образуется при восстановлении катионов Cd2+ решетки CdS в результате совместного действия электронов зоны проводимости и аниок-радикалов сог"~. Количество образовавшегося Cd° практически равно количеству фотоокксленного полупроводником формиата. Cd° способен накапливаться в значительных количествах и стабилен в анаэробных условиях. Его окисление кислородом в отсутствие катализаторов (например, мотилвиологена) происходит с низкой скоростью.

Описанные результаты позволяют заключить, что субстратом ферментативной реакции при темновом восстановлении NAD системой фopмиaт-CdS-rидpoгeнsзa являются атомы кадмия Cd°. Тот факт,

что активность иммобилизованной на CdS гидрогенаэы при восстановлении nad за счет Cd° достигает активности растворенного фермента при восстановлении nad водородом указывает на эффективность переноса электрона от Cd° на реакционный иентр фермента. Переносу электрона на гидрогеназу способствует прочная сорбция белка на восстановленной поверхности CdS, имеющей, по-видимому, не чисто металлический характер. Очевидно, ориентация сорбированной молекулы фермента благоприятна для взаимодействия с находящимся ка твердой поверхности реагентом. В реакции восстановления nad гидрогеназой сорбированной на восстановленных частицах CdS может расходоваться большее количество атомов Cd°, чей содержится на поверхности, покрываемой молекулой фермента. Вероятно, гкдрогеяаза реагирует лишь с небольшим числом атомов cd°, расположенных вблизи реакционного редоке центра фермента и постоянно регенерируемых за счет сопряженного окисления удаленных атомов кадмия. Однако, нельзя исключить возможности перемещения молекулы фермента по поверхности полупроводника в течение реакции.

Способность диафоразного гетеродимера NAD-ззвисиыоП гидрогеназы восстановливать nad позволяет заключить, что окисление cd° ферментом происходит при участии редокс центра, расположенного на^- или у-сУ<5'ьединицзх' = составлявших диафоразныд фрагмент. Таким образом, перенос электронов от Cd° может происходить на железо-серные кластеры [4Fe-4S], находящиеся на •^-субьединице, а также [2Fe-2SJ и FMN, расположенные на d-субъединице.

Ранее показано, что при электрокаталитическом восстановлении nad термостабильность NAD-зависимой гидрогеназы значительно увеличивается по сравнению с восстановлением nad водородом. Известно, что диафоразный фрагмент гораздо более термостабилен, чем тетрамерная молекула фермента, катализирующая восстановление nad водородом. Можно предположить, что сопряжение гидрогеназы с платиновым электродом также как и с восстановленной поверхностью CdS, происходит за счет редокс центра, находящегося на диафоразном гетеродимера. Предполагаемое сходство процессов восстановления NAD фото- и электрокаталитической системами может означать существование универсального пути персноси электронов на гидрогеназу с поверхности твердого тела.

ВЫВОДЫ.

1. Получена фотокаталитическая система, осуществляющая специфическое фотовосстановление Nad до nadh при безмедиаторном сопряженном действии неорганического полупроводника cds и NAD-зависимой гидрогеназы Alcaligenes eutrophus Hi 6, адсорбционно связанной с полупроводником. Активность гидрогеназы в фотокаталитической реакции достигает 50% активности иммобилизованного на Cds фермента в реакции восстановления NAD водородом.

2. Показано, что необходимым условием фотокаталитического восстановления nad до nadh сорбированной на CdS гидрогеназой является использование доноров электронов, обеспечивающих фотовосстановление поверхности полупроводника. Фотокаталитическая реакция может быть разделена на два процесса - фотовосстановление катионов cd2+ поверхности cds до cd° и последующее темновое восстановление nad до nadh гидрогеназой.

3. Установлено, что субстратом гидрогеназы в реакции восстановления nad до nadh являются атомы металла Cd°, образовавшиеся при фотовосстановлеиии поверхности Cds. Взаимодействие гидрогеназы с Cd° происходит за счет прямого переноса электрона от полупроводника на редокс центр фермента.

4. Предложен новый механизм фоторааложения формиата сульфидом кадмия в анаэробных условиях, включающий образование Cd° при взаимодействии пары (Cd2+e~), состоящей из катиона решетки и электрона зоны проводимости cds, с анион-радикалом со2'~, генерируемым при фотоокислении формиата. При накоплении cd° формиат разлагается с образованием со и Н20, а также н2 и со2.

5. Разработан способ разделения диафоразного и гидрогеназного гетеродимеров, составляющих молекулу NAD-завксимой гидрогеназы. Показано, что инактивация гидрогеназы в щелочной среде происходит в результате диссоциации тетрамерной молекулы фермента на гетеродимеры.

6. Показано, что диафоразный гетеродиыер гидрогенаэг: катализирует фотовосстановление NAD до NADH при сопряженном действии с cds аналогично тетрамерной молекуле фермента. Установлено, что окислительно-восстановительный центр гидрогеназы, реагирующий с атомом Cd°, расположен на диафоразном фрагменте.

СПИСОК РАБОТ. ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1. Shurailin I.A., Nikandrov V.V., Popov V.O., Krasnovsliy A.A. Photogeneration of nadh under coupled action of CdS semiconductor and hydrogenase from Alcaligenes eutrophus without exogenous mediators// FEES Letters, 1092, v.306, p.125-128.

2. Shumilin i.a., Nikandrov V.V. , Popov v.o., Krasnovsky a.a. New type of substrate of nad-dependent hydrogenase - metal cadraium// FEBS Letters, 1993, in print.

3. Шумилин И.А., Никандров В,8., Попов В.О. , Красновский А.А. Фоговосстановление nad при сопряженной действии полупроводника cds и гидрогеназы Alcaligenes eutrophus без искусственных переносчиков электронов// Международная конференция по фотохимии, Киев, 1992, Сб.тез.докл., с.37.

4. Шумилин И.А., Никандров В.В., Попов В.О. Механизм фотовосстановления NAD системой неорганический полупроводник Cds-гидрогеназа Alcaligenes eutrophus// Конференция "Структурно-функциональная организация фотосинтетических мембран и их моделей", Пущино, 1993, принято к публикации.