Окислительно-восстановительное взаимодействие гидрогеназ фототрофных бактерий с металлами

Задворный, Олег Александрович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Окислительно-восстановительное взаимодействие гидрогеназ фототрофных бактерий с металлами
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Окислительно-восстановительное взаимодействие гидрогеназ фототрофных бактерий с металлами"

На правах рукописи

ЗАДВОРНЫЙ ОЛЕГ АЛЕКСАНДРОВИЧ

ОКИСЛИТЕЛЬНО-ВОССТАНОВИТЕЛЬНОЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ГИДРОГЕНАЗ ФОТОТРОФНЫХ БАКТЕРИЙ С МЕТАЛЛАМИ

03.00.04 - Биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Пущино - 2004

Работа выполнена в лаборатории биохимии и биотехнологии фототрофных микроорганизмов Института фундаментальных проблем биологии Российской академии наук (ИФПБ РАН).

Научные руководители: доктор биологических наук, профессор

Гоготов Иван Николаевич,

кандидат биологических наук Зорин Николай Алексеевич

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Троценко Юрий Александрович,

кандидат биологических наук Бекасова Ольга Демьяновна

Ведущее учреждение: Институт микробиологии РАН

Защита состоится "21" июня 2004 года в_часов

на заседании диссертационного совета Д 002.066.01 при Институте фундаментальных проблем биологии РАН

по адресу: 142290, Московская область, г. Пущино, ул. Институтская, д. 2, ИФПБ РАН.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института фундаментальных проблем биологии РАН.

Автореферат разослан "_"_2004 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук

Г.Н. Назарова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. Гидрогеназа является ключевым ферментом метаболизма водорода и катализирует реакцию обратимого окисления молекулы водорода. Интерес к гидрогеназам в значительной степени обусловлен стремлением познать их структуру и механизм действия, а также возможностью практического применения этих металлоферментов в водородных топливных элементах и биокаталитических системах получения молекулярного водорода с использованием солнечной энергии. По содержанию металлов в активном центре различают два типа гидрогеназ: NiFe- и Fe- гидрогеназы. Недавно выделен еще один тип гидрогеназ, не содержащих никеля и железосерных кластеров. Все типы гидрогеназ различаются по каталитическим свойствам и специфичности к разным донорам/акцепторам электронов [Vignais, Colbeau, 2004].

Металлы, с одной стороны, необходимы для биосинтеза и каталитического действия ферментов, включая гидрогеназу. С другой стороны, ионы металлов в повышенных концентрациях оказывают токсическое действие на живые клетки и ингибирующее влияние на ферменты. В связи с этим необходимо исследовать влияние ионов металлов в широком диапазоне концентраций на активность и механизм каталитического действия гидрогеназ.

Кроме того, многие металлы могут быть донорами электронов для гидрогеназы и окисляться до ионной формы [Bryant, Laishley, 1990]. Данный процесс моделирует анаэробную биокоррозию металлов в присутствии микроорганизмов, содержащих гидрогеназу.

Важной задачей охраны окружающей среды является поиск технологий очистки сточных вод промышленных предприятий от тяжелых металлов. Комплексное использование химических и биологических методов позволит значительно снизить загрязнение окружающей среды тяжелыми металлами. Многие микроорганизмы способны аккумулировать в биомассе большое количество тяжелых металлов, а также трансформировать высокотоксичные ионы металлов в малорастворимые комплексы или осадки свободных металлов. Однако механизм редокс-трансформации металлов остается неясным. Показано, что некоторые микроорганизмы, содержащие гидрогеназу, способны восстанавливать ионы ряда металлов до металлического состояния в присутствии водорода [Lloyd, 2003]. В связи с этим необходим поиск новых продуцентов гидрогеназ, способных к окислению металлов и восстановлению их ионов в атмосфере водорода. Перспективными продуцентами активных и стабильных гидрогеназ являются фототрофные микроорганизмы.

Цель и задачи исследования. Целью данной работы являлось выяснение механизма окислительно-восстановительного взаимодействия гидрогеназ с металлами в модельных системах, У Thio-

БИБЛИОТЕКА

СПтрв г t/a в О» иг ¡<J\

capsa roseopersicina, штамм BBS, и вновь выделенную гидрогеназу Lamprobacter modestohalophilus, штамм Syvash, и исследование свойств гидро-геназы ранее не изученной пурпурной серобактерии L modestohalophilus. В связи с этим были поставлены следующие задачи:

1) получить гомогенные препараты и охарактеризовать свойства гидрогена-зы пурпурной серной бактерии L modestohalophilus,

2) изучить влияние ионов металлов на активность и активацию очищенных гидрогеназ Т. roseopersicina и L modestohalophilus,

3) выяснить возможность восстановления ионов металлов клетками фото-трофных бактерий Т. roseopersicina и L. modestohalophilus в атмосфере водорода,

4) изучить восстановление ионов металлов в атмосфере водорода и окисление металлов очищенными гидрогеназами Т. roseopersicina и L. modestohalophilus.

Научная новизна работы. Впервые показано, что ионы никеля, платины и палладия могут выступать в качестве акцепторов, а металлический порошок кадмия или цинка - доноров электронов для гидрогеназ, выделенных из фото-трофных бактерий.

Установлена способность клеток фототрофных бактерий к восстановлению ионов никеля, платины, палладия и рутения в атмосфере водорода. Добавление метилвиологена в качестве переносчика электронов приводило к ускорению этого процесса.

Изучено ингибирующее действие ионов Ni2+, CdJ+, Mg2+, Cuz+, Hg2+, Pt4+, Pd2+ и Ru1+ на активность и процесс активации гидрогеназ Т. roseopersicina и L. modestohalophilus. Впервые выяснены различные механизмы ингибирующего действия ионов металлов на гидрогеназы микроорганизмов. Установлено, что ионы никеля, кадмия и рутения являются обратимыми ингибиторами гидроге-наз по отношению к окисленному метилвиологену и не влияют на процесс их активации. Ионы меди и ртути необратимо подавляют как активность, так и активацию гидрогеназ.

Впервые получены гомогенные препараты и изучены свойства гидрогена-зы пурпурной серной бактерии L modestohalophilus. Показано, что гидрогеназа этой бактерии устойчива к действию СО, высокой температуры и проявляет высокую стабильность при хранении.

L. modestohalophilus, проявляющая высокую устойчивость к действию О2, СО и температуры, может быть использована при разработке новых видов водородных топливных элементов. На основе клеток фототрофных микроорганизмов возможно создание фотобиореакторов, способных в атмосфере водорода восстанавливать ионы металлов из сточных вод промышленных предприятий.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены на 6-ой Международной конференции «Гидрогеназа 2000» (Германия, Потсдам, 2000), школе-конференции «Горизонты физико-химической биологии» (Пущино, 2000), международной конференции «Биокатализ 2000, основы и практическое использование» (Москва, 2000), 4-ой, 5-ой и 7-ой Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 1999,2001,2003).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 11 работ.

Структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследования, изложения экспериментальных данных, их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы. Текст диссертации занимает 105 страниц, содержит 32 рисунка и 7 таблиц.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Исследования проводились с пурпурными серными бактериями: Thiocapsa roseopersicina, штамм BBS, из коллекции ИФПБ РАН и Lamprobacter modestohalophilus, штамм Syvash, полученной от В. М. Горленко (ИНМИ РАН, г. Москва). Культуры выращивали в фотогетеротрофных условиях на модифицированной среде Пфеннига [Богоров, 1974].

Выделение гидрогеназ L modestohalophilus и Т. roseopersicina проводили обработкой клеток ацетоном с последующим их разрушением ультразвуком. Экстракт клеток фракционировали сульфатом аммония. Дальнейшую очистку проводили с использованием хроматографии на колонках с фенилсефарозой CL-4B («Pharmacia», Швеция) и ДЭАЭ-целлюлозой DE52 («Whatman», Англия), как описано ранее [Шерман и др., 1987]. Гомогенные препараты гидрогеназ получали препаративным электрофорезом в 7%-ном полиакриламидном геле (ПААГ) согласно методу, описанному ранее [Зорин и др., 1995].

Субъединичный состав гидрогеназы определяли электрофорезом в 12,5 % ПААГ в присутствии 0,1 % Ds-Na по методу Лэммли [Laemmli, 1970].

Активность гидрогеназы определяли двумя методами: а) по восстановлению метилвиологена (бензилвиологена) водородом спектрофотометрическим методом в кювете Тунберга [Zorin et al., 1996], - реакционная смесь (2 мл) содержала 5-10 мкг белка гидрогеназы, 50 мМ Tris-HCl-буфер, рН 7,0 (9,0) и 4 (1) мМ раствор метилвиологена (бензилвиологена); б) по выделению водорода из восстановленного дитионитом метилвиологена методом газовой хроматографии [Zorin et al., 1996], - реакционная смесь (2 мл) включала 5-10 мкг белка

препарата, 50 мМ 1ш-ИС1-буфер (рН 7,0), 4 мМ метилвиологспа и 20 мМ ди-тионита натрия. Ферментативную активность выражали в мкмоль Нг/ мин на 1 мг белка. Измерения активности фермента проводили при температуре 30°. Содержание белка определяли двумя методами - по Лоури [Методы общей бактериологии, 1989] и Брэдфорд [БгеёЮгё, 1976].

Восстановление ионов металлов клетками бактерий и препаратами гидрогеназ изучали в долговременных и кратковременных экспериментах. Для проведения долговременных экспериментов клетки бактерий собирали в конце логарифмической фазы роста, промывали три раза 20 мМ 1ш-ИС1 буфером рН 7,0 и ресуспендировали в том же буфере до плотности биомассы ~9,0 мг клеток (сухой вес)/мл. Клеточную суспензию или препараты гидрогеназ активировали в течение ночи в атмосфере водорода. Реакционную смесь (4 мл), состоящую из суспензии клеток (0,4 мл) или препарата гидрогеназ (5-10 мкг белка), 50 мМ 1ш-ИС1 буфера рН 9,0, 4 мМ метилвиологена и 0,04 мМ МС12, РсЮЬ, ЛиСЬ, или [ТЧСУСЫНОг помещали в сосуды (10 мл), заполняли водородом, закрывали резиновыми пробками с зажимами и инкубировали 26-30 дней при температуре 24°С. Скорость восстановления ионов никеля определяли по уменьшению концентрации в среде реакции спектрофотометрическим методом с

использованием диметилглиоксима [Дорохова, Прохорова, 1991].

В кратковременных экспериментах восстановление ионов металлов измеряли по поглощению водорода при помощи электрода Б'Ш 'О2/Н2 Иаша1есЬ (Англия). Реакцию проводили в кювете (1 мл) с магнитной мешалкой, при 30°С. Реакционная смесь состояла из препарата гидрогеназы (5-10 мкг белка), 50 мМ Тпх-ПО буфера рН 9,0,2 мМ метилвиологена (1 мМ К3Ре(СМ)6), 0,01 мМ №С12 (РсЮЪ, ШдОз, рчсадсывд и 0,1 мл дистиллированной воды, насыщенной водородом. Скорость поглощения водорода вычисляли, используя стандартное количество водорода (в 100 мкл дистиллированной воды, насыщенной водородом при 30°С, содержится 77,4 нмоль ). В контроле, не содержащем ионы металла, поглощения водорода не наблюдалось.

Скорость окисления металлов определяли по выделению водорода, измеряемому на газовом хроматографе или электроде Б'Ш О2/Н2 Иаша1есЬ. Реакционная среда обшим объемом 2 (1) мл содержала 10 (5) мг порошка металла, 50 мМ МБ8-№ОИ рН (4.0 - 7.0), 4 (2) мМ метилвиологена, 5-10 (1-5) мкг белка. В контроле, в отсутствии металла выделение водорода не наблюдалось.

Электронно-микроскопические исследования проводились совместно с сотрудниками Лаборатории структурно-функциональной адаптации микроорганизмов ИБФМ РАН, к.б.н. Н. Е. Сузиной и асп. Т. Н. Абашиной. Тотальные препараты готовили из клеток бактерий после долговременных экспериментов. Клетки трижды отмывали бидистиллированной водой и ресуспендировали в

ней до плотности биомассы ~9,0 мг клеток (сухой вес)/мл. Приготовленную таким образом суспензию клеток наносили на поверхность медной сетки покрытые формваровой пленкой-подложкой и высушивали. Ультратонкие срезы получали на микротоме LKB-800A Ultrotome (Швеция), монтировали на опорные сеточки с формваровой подложкой. Срезы контрастировали окрашиванием 3%-ным раствором уранилацетата в 70%-ном этиловом спирте [Sabatini et al., 1964]. Полученные тотальные препараты и ультратонкие срезы анализировали на электронном микроскопе JEM - 100В (JEOL, Япония) при ускоряющем напряжении 80 кВ.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ Характеристика гидрогеназы L, modestohalophilus. Гидрогеназа, выделенная из L. modestohalophilus, штамм Syvash, как и гидрогеназы других фото-трофных бактерий [Кондратьева, Гоготов, 1981], катализирует реакцию образования и окисления водорода, восстанавливая широкий спектр искусственных переносчиков электронов. Наибольшие скорости этой реакции наблюдались в присутствии бензил- и метилвиологенов (таб. 1). Таблица 1.

Свойства гидрогеназ фототрофных бактерий

Свойства Thiocapsa Lamprobacter

roseopersicina modestohalophilus

Субьединичный состав, кДа:

Большая субъединица 64 64

Малая субъединица 34 30

Р1 4,2 4,5

Температурный оптимум, °С 80 85

рН оптимум:

выделение Нг 4,0 4,0-4,5

поглощение Нг 9,0 8,5-9,5

Активность, ед*/мг белка:

выделение Нг (рН 4,0) 63 68

поглощение Нг (рН 9,0) 53 57

Ктн2,мМ 0,012 0,010

Кт{МВ2+),мМ 0,32 0,38

Кт(БВг+), мМ 0,18 0,24

Ингибиторы:

М (СО), мк М 3,5 7.0

ЛЗОЯСУ.мМ:

рН 9,0 0,22 0,16

рН 7,0 3.8 1,33

К\ (сасу, мМ:

рН 9,0 0,24 0,13

рН7,0 0,95 0,94

*- ед = мк моль lb/мин, измерено с метилвиологеном

Рис. 1. Электрофорез гидрогеназ в 12,5%-ном ПААГ с 0,1 % Ds-Na: 1 -L. modestohalophilus, 2-Т. roseopersicina, 3 - маркеры молекулярной массы.

Рис. 2. Влияние состава газовой фазы и температуры на стабильность гид-рогеназы X modestohalophilus при хранении в атмосфере: 1 - аргона, 2 - водорода, 3 - на воздухе при температурах 20°С (о) и 4°С (б).

Удельная активность гидрогеназы L modestohalophihis была близкой к активности фермента Т. roseopersicina штамм BBS [Zorin et al., 1996] и составляла приблизительно 50-70 мкмоль Hj/мин на 1 мг белка. Большая часть гидрогеназной активности (~80%) при разрушении клеток L. modestohalophilus оставалась в растворимой фракции. Подобные данные были получены и при определении локализации гидрогеназ в клетках Т. roseopersicina, Rhodospirillum nibrum [Зорин, Гоготов, 1975] и Clorobium limicola [Серебрякова, 1987].

Спектр поглощения гомогенного препарата гидрогеназы L modestohalophilus был

похожим на таковой гидрогеназы Т. roseop-ersicina, поскольку имел максимум поглощения в области 400-410 нм, характерный для белков, содержащих негемовое железо [Гоготов и др., 1976]. Электрофоретическая подвижность в нативном ПААГ и изоэлек-трическая точка гидрогеназы L. modestohalophilus (pI 4,5) были близки к аналогичным данным фермента Т. roseopersicina [Gogotov et al., 1978], что указывает на сходство структур этих ферментов.

При электрофорезе гомогенных препаратов гидрогеназы L modestohalophilus в ПААГ с Ds-Na проявлялись две белковые зоны, соответствующие 30 и 64 кДа (рис. 1). Таким образом, выделенный нами фермент L. modestohalophilus представляет собой ге-теродимер.

Стабильность гидрогеназы при хранении. Как и гидрогеназа Т. roseopersicina [Зорин, Гоготов, 1982], фермент L modesto-halophilus проявлял высокую стабильность при хранении. Из (рис. 2) видно, что

температура оказывает более существенное влияние на стабильность фермента, чем состав газовой фазы. Так, период полуинактивации гид-рогеназы при хранении на воздухе при 4°С был почти в 5 раз, а под аргоном и водородом - в 2 раза выше, чем при 20°С.

При хранении под аргоном стабильность препаратов гидрогеназ была примерно в 1,5 раза выше, чем под воздухом и водородом. Хранение препаратов гидрогеназы из Ь. тойея^НаЪрНИт при -70°С не снижало активности этого фермента

в течение шести месяцев. Рис 3. Термостабильность (а) и температурный оптимум (б) гидрогеназы из ^рмета&итгостъ гадроге-

Ь modestohalophilus в реакции окисления во- назы. Гидрогеназа Ь. modestohalo-дорода. рЫ1ив проявляет высокую устойчи-

вость к нагреванию. Значительная инактивация фермента в течение 10 мин инкубации наблюдалась при температуре выше 80°С (рис 3, а). Температурный оптимум реакции восстановления метилвиологена составил 85°С (рис. 3, б). Активность гидрогеназы возрастала более чем в 10 раз при увеличении температуры от 30°до 80°С, достигая 530 мкмоль Нг/мин на 1 мг белка. Высокая активность и термостабильность делают данный фермент перспективным для практического использования в качестве водород активирующего биокатализатора.

Влияние рН на активность фермента. Протоны среды и восстановленный метилвиологен являются субстратами фермента в реакции образования Нг или продуктами реакции окисления водорода. Следовательно, активность гидрогеназы в реакции образования водорода должна быть максимальной при низких, а в реакции окисления водорода - при высоких значениях рН среды. Действительно, оптимум рН в реакции образования водорода составил 4,0, а в реакции окисления Щ находился в диапазоне 8,5-9,5 (табл. 1). Такие же оптимальные значения рН характерны для гидрогеназ других фототрофных и хемо-торофных бактерий [Серебрякова и др., 1987].

Влияние СО на активность гидрогеназы. Известно, что окись углерода является ингибитором гидрогеназ ряда фототрофных бактерий [Серебрякова, Гоготов, 1991]. Зависимость начальной скорости поглощения Нг гидрогеназой

L. modestohalophilus от концентрации CO при различном содержании окисленного метилвиологена описывается параллельными прямыми в координатах 1/v от [1]о (рис. 4). Следовательно, СО является бесконкурентным по отношению к окисленному метилвиологену ингибитором. 1М Зависимости скоростей катализи-[со1шм руемой гидрогеназой реакции окис-

Рис 4. Зависимость обратной величины скоро- ления Нг метилвиолотеном от кон-сти (1/v) катализируемой щцрогеназой центрации со При различном фик-L modestohalophilus реакции окисления Нг от

концентрации СО при различном фиксирован- сированном содержании Н2 в коор-ном содержании метилвиологена (MB). динатах [S]/v от [1]„ представляют

собой параллельные прямые, что свидетельствует о том, что СО является конкурентным по отношению к Нг ингибитором. Для определения константы ин-гибирования эти же результаты представлены в координатах 1/v от [1]0 (рис. 5). Полученное для гидрогеназы L. modestohalophilus значение К, (7,0 мкМ) было в 2 раза выше, чем для гидрогеназы Т. roseopersicina (3,5 мкМ) [Зорин, 1986], что свидетельствует о большей устойчивости первой к СО.

Таким образом, полученные данные позволяют сделать вывод, что гидрогеназа фототрофной серной бактерии L. modestohalophilus очень близка по свойствам к аналогичному ферменту из Т. roseopersicina, однако является более устойчивой к воздействию высокой температуры и окиси углерода. Поэтому она весьма интересна с точки зрения практического применения при разработке новых видов водородных топливных элементов [Морозов и др., 2002].

Рис. 5. Зависимость обратной величины скорости (I/v) катализируемой гидрогеназой L modestohalophilus реакции окисления Нг от концентрации СО при различном фиксированном содержанииНг(М): / -4 • 10"5, 2- 8 • Ю-5,5-1,6 • 10"*. (Я", =7,0мкМ).

Влияние ионов металлов на активность гидрогеназ. Ингиби-

рующее действие ионов Ni

/-.> тт„2+ n»4+ r>j2+

Cd'

|2+

Mg2+, Cuz+, Hg2+, Pt,+, Pd¿+ и Ru3+

на гидрогеназы Т. roseopersicina и

Ь. modestohalophilus проявляется в большей степени в реакции поглощения водорода.

Ингибирование фермента из Т. roseopersicina ионами никеля, кадмия и рутения было обратимо и в значительной степени снижалось при увеличении концентрации субстрата -окисленного метилвиологена. Ионы являются конкурентным ингибитором по отношению к окисленному метилвиологену (рис. 6). Подобные данные были получены и для ионов никеля (табл. 1). Константа ингиби-

рования Яи3* составила 0,48 мМ при Рис. 6. Зависимость обратной величины скорости (1/у) катализируемого щдрогеназой рн 9,а Ингибирование ЩДрогеназы Т. roseopersicina окисления Нг от концентра- Ь. modestohalophilus ионами никеля,

ции ОО при фиксированн^^ кадмия и магния, как и в случае с

ях окисленного метилвиологена 1 (/) и 4 мМ

(2)прирН9,0*; = 0,24мМ. гидрогеназой Т. roseopersicina, было

обратимым. Ионы N1** (рис. 7) также являются конкурентным ингибитором по отношению к окисленному метилвиологену. Константа ингибирования этой гидрогеназы ионами как кадмия, так и никеля уменьшалась в ~8 раз при

возрастании рН с 7,0 до 9,0 (табл. 1). Значительное увеличение сродства и

СсР к изученным ферментам фототрофных бактерий при возрастании рН до 9,0 может быть связано с изменением степени гидроксили-1 рования ионов металлов. Однако, константы гидролиза для и равны 9,3 и 10,2 соответственно [На-заренко и др.; 1979], что не объясняет наблюдаемого изменения в

Рис. 7. Зависимость скорости катализируемой

гидрогеназой I тосЫоИаЬркНиз реакции Диапазоне рН 7,0 - 9,0. Другим объ-окисления Н2 от концентрации метилвиологе- яснением может быть увеличение

на (МВ) (в двойных обратных координатах)

степени ионизации молекул фермен-

при различном фиксированном содержании №С12: / - в отсутствии№С12, 2-0,5мМ№С12, та. Действительно, отрицательный 5 -1, ОмМ N¡012, 4-1,5мМ№С12

суммарный заряд гидрогеназы

возрастает с увеличением рН от 7,0 до 9,0, так как pI ферментов из L modestohalophilns и

Т. roseopersicina составляет 4,5 и 4,2, соответственно. Таким образом, обратимый и конкурентный по метил-виологену характер ингибирования, а также резко выраженное увеличение сродства фермента к и Ni2+ при увеличении рН позволяют сделать вывод о том, что катионы металлов электростатически взаимодействуют с отрицательно заряженным акцептор связывающим центром гидрогеназы.

Си2+ и Hg2+ необратимо инги-бировали гидрогеназы

Т. roseopersicina и L. modestohalophi-lus в реакциях поглощения и выделения Н2. Зависимость начальной скорости поглощения от концентрации при различном содержании окисленного метилвиологена линеаризуется в виде параллельных прямых в координатах 1/v от [1]о (рис. 8). Зависимость скорости поглощения от концентрации ионов имела

аналогичный вид.

Влияние ионов Cui+ и Hgî+ на процесс активации гидрогеназы. Ионы Niî+ и

Cd2+

практически не оказывали влияния на активную форму и процесс активации окисленной формы гидрогеназ Т. roseopersicina и L. modestohalophi-lus (рис. 9, а). В отличие от Ni2+ и

С<1 , ионы Си полностью, а в значительной мере ингибировали переход неактивной формы

Рис. 8. Зависимость обратной величины скорости (1/v) катализируемого гидрогеназой T. roseopersicina окисления Нг от концентрации СиСЬ при фиксированных концентрациях окисленного метилвиологена при рН 7,0.

Рис 9. Активация гидрогеназы Т. roseopersicina в 50 мМ Тт-ИС1-буфере, рН 7,0 в атмосфере водорода: 1 - контроль, 2 - в присутствии ионов двухвалентных металлов в концентрации 100 мкМ (№ (а), Си (б), Н^* (в)), 3 - влияние ионов металлов (100 мкМ) на активированную гидрогеназу. Активность фермента измеряли в присутствии 4 мМ метилвиологена.

гидрогеназы в активную. Добавление Си~+ и Н§2+ к предварительно активированной гидрогеназе приводило к инактивации фермента (рис. 9, б и в).

Влияние ионов металлов на спектр поглощения гидрогеназы. Добавление №2+ или Сс12+ практически не изменяло спектр поглощения гидрогеназ в видимой области. Ионы и в меньшей степени Си2+ снижали поглощение гидрогеназы в области 400 нм, что свидетельствует о разрушении FeS-кластеров. Поскольку один из трех железосерных кластеров в составе гидроге-назы находится близко к поверхности фермента, ионы тяжелых металлов могут разрушать его, замещая атомы железа. Показана способность тяжелых металлов к замещению железа в составе ряда FeS-белков [Malkin, 1973]. Поэтому вполне возможно, что ионы меди и ртути вытесняют железо из FeS-кластера гидрогеназ Т. roseopersicina и Ь modestohalophilus и, таким образом, необратимо инак-тивируют фермент.

Проведенные нами исследования свидетельствуют о двух возможных механизмах ингибирования гидрогеназ ионами металлов. обратимо и конкурентно по отношению к метилвиологену ингибируют гидрогеназу,

в то время как необратимо

модифицируют фермент, инактивируя его. Такая модификация препятствует восстановительной активации гидроге-назы, что указывает на значительные изменения в структуре фермента.

Восстановление ионов металлов клетками микроорганизмов. Клетки фототрофных бактерий Т. roseopersicina и Ь. modestohalophilus в долгосрочных экспериментах способны в атмосфере

водорода аккумулировать ионы V»* „ о„3+

и из реакционной среды, образуя черный осадок и металлическое зеркало на поверхности сосуда. В атмосфере аргона образования осадка и металлического зеркала не наблюдалось. Добавление метилвиологена в реакционную систему приводило к небольшому ускорению этого процесса. Скорость восстановления ионов никеля клетками бактерий в присутствии метилвиологена

Рис 10. Электронно-микроскопические фотографии тотальных препаратов клеток Т. roseopersicina (а, б) и ультратонких срезов клеток Ь modestohalophilus (в, г) после инкубации с N¡012 в атмосфере аргона (а, в) и атмосфере водорода (б, г) в течение 15 суток.

Длина масштабной метки 0,5 ЦМ

была максимальной в течение первых 24 часов и достигала 1,7 нмоль и 1,0 нмоль №СЬ на мг биомассы (сухой вес)/час для Т. roseopersicina и L. modesto-halophilus, соответственно. После 25 дней инкубации приблизительно 80% (для клеток Т. roseopersicina) и более чем 60% (для L. modestohalophilus) было восстановлено из 0,04 мМ раствора №С1г и в реакционной среде наблюдалось образование металлического зеркала и черного осадка.

Участие бактерий в восстановлении ионов никеля в клетках микроорганизмов исследовали с применением электронно-микроскопических методов. На тотальных препаратах клеток бактерий видно, что черные гранулы накапливаются на их поверхности (рис. 10, а, б). Электронно-плотные гранулы находятся также внутри клеток (рис. 10, в, г),

Рис 11. Образование металлического зер-

и их расположение совпадает с локали-

кала на поверхности сосуда и черного г

осадка никеля после восстановления №С12 ЗаЦИеЙ ГИДрОГенаЗЫ В КЛеТКЭХ МИКрООр-

в длительных экспериментах гидрогеназой ганизмов [г0ПП, 1лпс1Ь1ас1, 1993]. Т. roseopersicina. 1. Флакон содержит препарат гидрогеназы (10 мкг), 0,04мМ №С12, Восстановление ионов металлов

0,05 М Тт-НО буфер (рН 9,0), и 4 мМ ме- препаратами гидрогеназ из фото-тилвиологена в атмосфере Аг. 2. То же, что

и 1, без метилвиологена в атмосфере Н2. 3. трофных бактерий. Ранее было покаТо же, что и 1, в атмосфере

зано, что некоторые гидрогеназы сульфатредуцирующих бактерий принимают непосредственное участие в процессе восстановления ионов металлов [Chardin et al., 2003]. Нами была исследована возможность восстановления ионов металлов очищенными препаратами гид-рогеназ фототрофных бактерий. Из широкого ряда изученных ионов металлов, в время.дни долговременных экспериментах восста-рис I2. Восстановление никеля 1-идроге- новление Ni2f, Pd2\ Pt4+ и Ru3+ приводило

назой Т. roseopersicina в длительных экспериментах: 1) №С12 в атмосфере Н2, к образованию черного осадка и метал-

2) NiClî и 10 мкг препарата гидрогеназы лического зеркала на поверхности сосуда в атмосфере Аг, 3) То же, что и 2, в amo- посде 5_у даей инкубации (рис щ д0_ сфере гц, 4) То же, что и 2, в присутствии

бавление метилвиологена в реакционную

4 мМ метилвиологена в атмосфере Н2. 100%-0,04мМ NiClj

среду увеличивало скорость восстановления ионов металлов препаратами

гидрогеназы (рис. 12). Это связано с активацией фермента и с увеличением скорости переноса электронов с активного центра фермента на ионы металлов в процессе их восстановления. Кроме того, водород-зависимое восстановление ионов металлов было продемонстрировано в кратковременных экспериментах с использованием Нг-электрода. С высокой эффективностью гидрогеназа катализировала восстановление ионов металлов группы платины. Скорость реакции уменьшалась в ряду 11и!+>1Ч4,>Рс12+ (табл. 2).

При восстановлении ионов палладия (рис. 13) начальная скорость окисления водорода в присутствии в реакционной среде без гидрогеназы была Таблица 2.

Скорость окисления водорода гидрогеназой Т. гохеоретс'та _в присутствии акцепторов электронов_

Акцептор электронов мкмоль Н2/мин мг белка %

Бензилвиологен 42,0 100,0

К3Ре(СЫ)6 13,4 32,3

ЯиСЬ 7,2 18,2

№2Р1С16 3,9 9,2

раа2 3,2 7,6

незначительной (0,2 мкмоль/мин). Добавление фермента увеличивало скорость окисления Н2 до 3,2 мкмоль/мин на 1мг белка, что указывает на прямой перенос электронов от гидрогеназы к Р(12* Однако, необходимо отметить, что скорость восстановления ионов металлов гидрогеназой составляла 7-20% от максимальной активности фермента что может быть связано с частичным ингибированием гидрогеназы ионами металлов. Таким образом, нами показано, что клетки и препараты гидрогена-зы Г. roseopersicina и Ь. modestohalophilus способны восстанавливать ионы металлов с использованием водорода как донора электронов. Изучение участия фототрофных бактерий и их ферментных препаратов в процессе восстановления ионов металлов

позволит использовать их при разработке Рис. 13. Окисление Н2 гидрогеназой из

т • • ™ биореакторов для детоксикации сточных

1. roseoperslClna в присутствии Ра , ^ ^ « « ^

измеренное Н2-элекгродом. Добавляли В°Д промышленных предприятий. 1 мМ Рс1С11 и 10 мкг гидрогеназы (Гд).

Окисление металлов гидрогеназами фототрофных бактерий. Гидрогеназы, выделенные из Т. roseopersicina и L.modestohalophilus, способны окислять металлы Бе, /п, Сё или N1 до ионной формы с одновременным выделением водорода. В присутствие метилвиологена и гидрогеназы Т. roseopersicina образование Н^ снижается в ряду /п>Ре>Сё>№ (Табл. 3). Таблица. 3.

Металлы - доноры электронов в реакции образовапия водорода гидрогеназой Т. гояеореЫста

Металл Редокс потенциал, Е'о, В мкмоль Н2/мин

Ъп -0,763 1,43

Ре -0,440 0,96

С<1 -0,403 0,82

№ -0,250 - 0,002*

* при рН 5,0

Как было показано ранее [Гоготов и др., 1995], образование Нг системами, содержащими порошок металлического железа и гидрогеназу Т. roseopersicina, происходило с высокой скоростью только в присутствии переносчика электронов. Близкую активность в реакции образования водорода при анаэробном окислении Бе в присутствии метилвиологена проявляла гидро-геназа L. modestohalophilus. Без добавления переносчика электронов образования водорода в такой системе практически не наблюдалось.

Выделение водорода в присутствии 5 мг /п (рис. 14, а) и Сё (рис. 14, б) в контроле без гидрогеназы было незначительным. Добавление гидрогеназы (5 мкг) приводило к увеличению скорости образования Н2 почти в 5-8 раз, что указывает на прямой перенос электронов от металла к активному центру фермента. Добавление метилвиологена в реакци-ошгую смесь приводило к дальнейшему, приблизительно десятикратному, увеличению скорости образования водорода, которая соответствовала максимальной активности препаратов гидрогена-зы. Это свидетельствует об увеличении эффективности окисления металлов

или саизмеренное Нг-электродом. Добав- щцрогеназами в присутствии перенос-ляли 5 мкг гидрогеназы (Гд) и 1мМ ме-

чика электронов. Скорость окисления 16

Рис 14. Выделение водорода гидрогеназой Т. roseopersicina в присутствии (5 мг) /п

тилвиологена (МВ).

металлов зависела от рН среды. Так, зависимое от метилвиологена образование водорода в присутствии Cd и гидрогеназы было в 4 раза выше при рН 4,0, чем при рН 7,0. Показано так же образование Н2 в модельных системах, содержащих изучаемые гидрогеназы и металлический алюминий.

Ранее было показано, что окисление металлов гидрогеназами зависит от размеров частиц металла и скорости его перемешивания, рН среды и стабильности гидрогеназы [Гоготов и др., 1995]. Недавно были продемонстрирована возможность окисления стали под действием НАД-зависимой гидрогеназы из ЯаШота вЫгорка [Da Silva et э1., 2002] и прямой перенос электронов между металлическим кадмием, расположенным на частицах CdS, и гидрогеназой Т. гозворвтета [Nedoluzhko й э1. 2000]. В наших экспериментах выявлена способность гидрогеназы в значительной мере ускорять анаэробное окисление не только железа, но и таких устойчивых к коррозии металлов, как цинк, кадмий и алюминий. Данный процесс моделирует анаэробную коррозию металлов в присутствии микроорганизмов, содержащих гидрогеназу.

На основании полученных данных можно предположить два возможных механизма процесса трансформации металлов с участием гидрогеназ фото-трофных бактерий (рис. 15.):

Рис. 15. Схема возможного взаимодействия гидрогеназы с металлами. (I - прямой. II - непрямой перенос электронов между ферментом и металлом).

1) прямой перенос электронов на ионы металлов, посредством электростатического взаимодействия ионов металлов с ферментом, или с поверхности металлов к активному центру гидрогеназы;

2) опосредованное взаимодействие гидрогеназы с металлами с участием искусственных или естественных переносчиков электронов.

Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о том, что металлы могут выступать в качестве субстрата для гидрогеназ фототрофных бактерий. Проявление этой способности гидрогеназ позволяет отнести их к ферментам «металлоксидоредуктазам», что важно как в теоретическом, так и в практическом плане.

выводы

1. Получены гомогенные препараты гидрогеназы из раннее не изученной фототрофной серобактерии Lamprobacter modestohalophilus, штамм Syvash. Гидрогеназа этой бактерии стабильна при хранении и проявляет высокую устойчивость к действию СО и высокой температуры.

2. Впервые показано, что ионы никеля, кадмия и рутения являются обратимыми и конкурентными ингибиторами гидрогеназ Т. roseopersicina и L modestohalophilus по отношению к окисленному метилвиологену в реакции окисления водорода и не оказывают влияния на их активацию. Ионы ртути и меди необратимо подавляют активность и активацию этих ферментов.

3. Впервые установлена способность клеток Т. roseopersicina и L modesto-halophilus к восстановлению ионов никеля, платины, палладия и рутения в атмосфере водорода с образованием металлов.

4. Показана способность гомогенных гидрогеназ Т. roseopersicina и L. mode-stohalophilus к окислению металлического кадмия и цинка с выделением водорода и восстановлению ионов никеля, платины, палладия и рутения в атмосфере водорода в модельных системах. Следовательно, ионы никеля, платины и палладия могут выступать в качестве акцепторов, а металлический порошок кадмия или цинка в качестве доноров электронов в реакции обратимого окисления водорода этими ферментами.

5. Установлено, что восстановление и окисление металлов гидрогеназами фототрофных бактерий может происходить как путем прямого переноса электронов от металла к ферменту, так и опосредованно через переносчик электронов, добавление которого ускоряет протекание этих процессов.

Список работ по теме дпесертации:

1. Гоготов И.Н., Зорин НА, Задворный ОА Аккумуляция металлов фото-трофными микроорганизмами и их извлечение. Экология и почвы. Избранные лекции VIII - IX Всероссийских школ. М.: Политекс, 1999, с. 238-251.

2. Задворный ОА, Зорин Н.А., Гоготов И.Н. Влияние ионов металлов на гидрогеназу пурпурной серобактерии Thiocapsa roseopersicina. Биохимия, 2000,65(11): 1525-1529.

3. Задворный ОА, Зорин НА, Гоготов И.Н., Горленко В.М. Свойства стабильной гидрогеназы пурпурной серной бактерии Lamprobacter modestohalophilus. Биохимия, 2004,69(2):204 - 210.

4. Гоготов. И.Н., Зорин НА, Задворный О.А Использование фототрофных микроорганизмов для детоксикации тяжелых металлов. Проблемы меди-

10.

11.

цинской и экологической биотехнологии. Сборник тезисов докладов юбилейной научной конференции (14-15 декабря). Оболенск: ГНЦ ПМ, 1999, с. 164.

Задворный О.А., Зорин Н.А., Гоготов И.Н. Окисление и восстановление металлов гидрогеназой фототрофной бактерии Thiocapsa roseopersicina. Горизонты физико-химической биологии, Тезисы стендовых сообщений школы-конференции (28 мая-2 июня) Пущино: ОНТИ ПНЦ РАН, 2000, том 1, с. 198.

Zadvomy O.A., Zorin N.A., Gogotov I.N. Redox transformation of metals by hydrogenase from Thiocapsa roseopersicina. Abstr. 6th International Conference on the Molecular Biology of Hydrogenases, Dorint Hotel Potsdam, Germany, 2000, p pT 7.

Zadvorny O.A., Zorin N.A., Gogotov I.N. Transformation of metals in the environment. Abstr. International Conference Biocatalysis - 2000: fundamentals and applications, 2000, Department of Chemical Enzymology, The M.V. Lo-monosov Moscow State University, p. 179.

Zorin N.A., Zadvorny OA, Serebryakova L.T. Interaction of phototrophic bacteria hydrogenase with metals. Proceedings book of 3rd INTAS interdisciplinary Symposium on General Biochemistry, biotechnology and environment (Grant Monitoring Conference, 14-17 December). M: MAX Press, 2000, p. 31. Задворный О.А., Зорин НА, Гоготов И.Н. Ферментативное окисление металлов гидрогеназой Thiocapsa roseopersicina. Биология - наука 21 века. 5-ая Пущинская конференция молодых ученых, Пущино, 2001, с. 21. Зорин Н.А., Задворный О.А., Гоготов И.Н. Преобразование энергии модельными системами на основе гидрогеназы. Биотехнология на рубеже двух тысячелетий. Материалы международной научной конференции (1215 сентября). Саранск: Изд-во Мордов. ун-та, 2001, с. 21. Задворный О.А., Зорин НА, Гоготов И.Н. Стабильность и некоторые физико-химические свойства гидрогеназы пурпурной серобактерии Lampro-bacter modestohalophilus. Биология - наука XXI века: 7-ая Пущинская школа-конференция молодых ученых (14-18 апреля): Сборник тезисов. Пущино, 2003, с. 331.

0 7 О 2

Принято к исполнению 17/05/2004 Заказ № 209

Исполнено 18/05/2004 Тираж: 100 экз.

ООО «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 Москва, Балаклавский пр-т, 20-2-93 (095)318-40-68 www autoreferat ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Задворный, Олег Александрович

Список сокращений.

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Глава I. Метаболизм водорода у фототрофных бактерий.

Глава II. Общая характеристика гидрогеназ.

2.1. Распространение и классификация гидрогеназ.

2.2. Физиологические функции [NiFej-гидрогеназ.

2.3. Строение активного центра NiFe-гидрогеназ.

2.4. Механизм каталитического действия и активация NiFe-гидрогеназ.

2.5. Факторы, влияющие на активность и стабильность гидрогеназ.

2.6. Организация генов, синтез [NiFe]-гидрогеназ и его регуляция.

2.7. Возможности практического применения гидрогеназ.

Глава III. Взаимодействие гидрогеназ с металлами.

3.1. Трансформация ионов металлов микроорганизмами, содержащими гидрогеназу.

3.2. Окисление металлов микроорганизмами, содержащими гидрогеназу.

3.3. Ингибирование гидрогеназ ионами металлов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

Глава IV. Объекты и методы исследования.

4.1 Микроорганизмы и условия их культивирования.

4.2 Получение экстрактов клеток и очистка гидрогеназы.

4.3. Определение гидрогеназной активности.

4.4. Восстановление ионов металлов клетками бактерий и препаратами гидрогеназ.

4.5. Окисление металлов препаратами гидрогеназ.

4.6. Аналитические методы.

4.7. Электронно-микроскопические методы.

4.8. Обработка данных и воспроизводимость измерений.

РЕЗУЛЬТАТЫ.

Глава V. Общая характеристика гидрогеназы пурпурной серной бактерии L. modestohalophilus.

5.1 Физико-химические свойства гидрогеназы.

5.2. Стабильность гидрогеназы при хранении.

5.3. Термостабильность гидрогеназы.

5.4. Влияние рН на активность фермента.

5.5. Влияние СО на активность гидрогеназы.

Глава VI. Влияние ионов металлов на активность и процесс активации гидрогеназ фототрофных бактерий.

6.1. Влияние ионов металлов на активность гидрогеназ.

У I Л I П I Л I

6.2. Влияние ионов Ni , Cd , Си и Hg на активацию гидрогеназы.

6.3. Влияние ионов металлов на спектр поглощения гидрогеназы.

Глава VII. Окислительно-восстановительное взаимодействие клеток и препаратов гидрогеназ из фототрофных бактерий с металлами.

7.1. Восстановление ионов металлов клетками микроорганизмов.

7.2. Восстановление ионов металлов гидрогеназами.

7.3. Окисление металлов гидрогеназами.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Окислительно-восстановительное взаимодействие гидрогеназ фототрофных бактерий с металлами"

Актуальность работы. Гидрогеназа является ключевым ферментом метаболизма водорода и катализирует обратимую активацию молекулярного водорода. Способность к образованию и потреблению водорода проявляют представители разных систа-матических групп микроорганизмов [Кондратьева, Гоготов, 1981]

Интерес к гидрогеназам в значительной степени обусловлен стремлением познать их структуру и механизм действия, а также возможностью практического применения этих многоядерных металлоферментов в водородных топливных элементах и биокаталитических системах получения молекулярного водорода с использованием солнечной энергии. По содержанию металлов в активном центре различают два типа гидрогеназ: NiFe-и Fe- гидрогеназы. В последнее время выделяют еще один тип гидро-V геназ - ферменты, не содержащие никель и железосернь^кластеров. Все типы гидрогеназ различаются по каталитическим свойствам и специфичности к разным донорам/акцепторам электронов [Vignais, Colbeau, 2004].

Кроме того, многие металлы моут быть донорами электронов в катализируемой гидрогеназой реакции образования водорода и окисляться до растворимой ионной формы [Bryant, Laishley, 1990]. Данный процесс моделирует анаэробную биокоррозию металлов в присутствии микроорганизмов, содержащих гидрогеназу.

Важной задачей охраны окружающей среды является поиск технологий очистки сточных вод промышленных предприятий от тяжелых металлов. Комплексное использование химических и биологических методов позволит значительно снизить загрязнение окружающей среды тяжелыми металлами. Многие микроорганизмы способны аккумулировать в биомассе большое количество тяжелых металлов, а также трансформировать высокотоксичные ионы металлов в малорастворимые комплексы или осадок свободного металла. Однако механизм редокс-трансформации металлов остается неясным. Показано, что микроорганизмы, содержащие гидрогеназу, способны восстанавливать ионы ряда металлов до металлического состояния в присутствии водорода [Lloyd, 2003].

В связи с этим необходим поиск новых продуцентов стабильных и активных гидрогеназ, способных к окислению металлов и восстановлению их ионов в атмосфере водорода. Перспективными продуцентами активных и стабильных гидрогеназ являются фототрофные микроорганизмы.

Цель и задачи исследования. Целью данной работы являлось выяснение возможности и механизма окислительно-восстановительного взаимодействия гидрогеназ с металлами в модельных системах, используя ранее описанную гидрогеназу Thiocapsa roseopersicina, штамм BBS, и вновь выделенную гидрогеназу Lamprobacter modestohalophilus, штамм Syvash, и исследование свойств гидрогеназы ранее не изученной пурпурной серобактерии L. modestohalophilus.

В связи с этим были поставлены следующие задачи:

1) получить гомогенные препараты и охарактеризовать свойства гидрогеназы пурпурной серной бактерии L. modestohalophilus,

2) изучить влияние ионов металлов на активность и активацию очищенных гидрогеназ Т. roseopersicina и L. modestohalophilus,

3) выяснить возможность восстановления ионов металлов клетками фототрофных бактерий Т. roseopersicina и L. modestohalophilus в атмосфере водорода,

4) изучить восстановление ионов металлов в атмосфере водорода и окисление металлов очищенными гидрогеназами Т. roseopersicina и L. modestohalophilus. Научная новизна работы. Впервые показано, что ионы никеля, платины и палладия могут выступать в качестве акцепторов, а металлический порошок кадмия или

V цинка)йоноров электронов для гидрогеназ, выделенных из фототрофных бактерий.

Установлена способность клеток фототрофных бактерий к восстановлению ионов никеля, платины, палладия и рутения в атмосфере водорода. Добавление метилвио-логена в качестве переносчика электронов приводило к ускорению этого процесса.

Л| ^ j Л г л | Л Г л |

Изучено ингибирующее действие ионов Ni , Cd , Mg , Си , Hg , Pt , Pd и Ru3+ на активность и процесс активации гидрогеназ Т. roseopersicina и L. modestohalophilus. Впервые выяснены различные механизмы ингибирующего действия ионов металлов на гидрогеназы микроорганизмов. Установлено, что ионы никеля, кадмия и рутения являются обратимыми ингибиторами гидрогеназ по отношению к окисленному метилвиологену и не влияют на процесс их активации. Ионы меди и ртути необратимо подавляют как активность, так и активацию гидрогеназ.

Впервые получены гомогенные препараты и изучены свойства гидрогеназы пурпурной серной бактерии L. modestohalophilus. Показано, что гидрогеназа этой бактерии устойчива к действию СО, высокой температуры и проявляет высокую стабильность при хранении.

Научная и практическая значимость работы. Полученные данные расширяют имеющиеся представления о свойствах фототрофных бактерий и выделенных из них гидрогеназ. Показано, что металлический порошок кадмия или цинка в анаэробных условиях может быть донором электронов для этих ферментов, что важно для выяснения природы коррозии металлов. Выделенная гидрогеназа из L. modestohalophilus, проявляющая высокую устойчивость к действию Ог, СО и температуры, может быть использована при разработке новых видов водородных топливных элементов. На основе клеток фототрофных микроорганизмов возможно создание фотобиореакторов, способных в атмосфере водорода восстанавливать ионы металлов из сточных вод промышленных предприятий.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 11 работ.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Задворный, Олег Александрович

выводы

1. Получены гомогенные препараты гидрогеназы из ранее не изученной фото-трофной серобактерии Lamprobacter modestohalophilus штамм Syvash. Гидрогеназа этой бактерии стабильна при хранении и проявляет устойчивость к действию СО и высокой температуры.

2. Впервые показано, что ионы никеля, кадмия и рутения являются обратимыми и конкурентными ингибиторами гидрогеназ Т. roseopersicina и L. modestohalophilus по отношению к окисленному метилвиологену в реакции окисления водорода и не оказывают влияние на активацию. Ионы ртути и меди необратимо подавляют активность и активацию этих ферментов.

3. Впервые установлена способность клеток Т. roseopersicina и L. modestohalophilus к восстановлению ионов никеля, платины, палладия и рутения в атмосфере водорода с образованием металлов.

4. Показана способность гомогенных гидрогеназ Т. roseopersicina и L. modestohalophilus к окислению металлического кадмия и цинка с выделением водорода и восстановлению ионов никеля, платины, палладия и рутения в атмосфере водорода в модельных системах. Следовательно, ионы никеля, платины и палладия могут выступать в качестве акцепторов, а металлический порошок кадмия или цинка в качестве доноров электронов в реакции обратимого окисления водорода этими ферментами.

В заключение мне очень приятно назвать имена тех людей, которые оказывали помощь и поддержку в процессе выполнения и оформления этой работы.

Сердечно благодарю моего научного руководителя доктора биологических наук Ивана Николаевича Гоготова за внимание к работе и бесценную научную школу.

Выражаю глубочайшую благодарность моему научному руководителю кандидату биологических наук Николаю Алексеевичу Зорину за большое внимание и всестороннюю помощь в работе, который не только организовывал и направлял мою работу, но и ободрял меня в моменты неудач и сомнений.

Искренне благодарю сотрудников лаборатории биохимии и биотехнологии фо-тотрофных микроорганизмов кандидата биологическюс наук Ларису Тимофеевну Серебрякову, кандидата биологических наук Марину Евгеньевну Шереметьеву, асп. Григория Ивановича Котова и Валентину Андреевну Морозову за помощь в работе и при обсуждении результатов.

Глубоко признателен заведующему лаборатории физиологии и биотехнологии фототрофных организмов доктору биологических наук Анатолию Анатолиевичу Цыганкову и кандидату биологических наук Татьяне Викториновне Лауринавичене за поддержку и содействие в работе и всем сотрудникам этой лаборатории.

Выражаю благодарность кандидату биологическюс наук Наталье Егоровне Су-зиной и асп. Татьяне Николаевне Абашиной (ИБФМ РАН) за помощь в проведении электронно-микроскопических экспериментов.

От всей души признателен моим близким Валентине Ивановне Задворной, Юлии Александровне Червонной и Екатерине Юрьевне Гавриш, и друзьям в Пущино, Туле, Москве и Санкт-Петербурге за понимание и поддержку на всём протяжении работы.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Задворный, Олег Александрович, Пущино

1. Бекасова О.Д., Орлеанский В.К., Никандров В.В. Аккумуляция кадмия, титана и алюминия цианобактерей Nostoc muscorum. Микробиология, 1999, 68(6):851-859.

2. Богоров Л.А. О свойствах Thiocapsa roseopersicina штамм BBS, выделенного из эстуария белого моря. Микробиология, 1974,43:326-333.

3. Гильманов М.К., Кожанов Т.К., Клышев Л.К. В кн.: Труды Всесоюзного семинара 14-18 декабря 1971 (под ред. В. Л. Кретовича), 1971, Москва, ВДНХ, с. 110-115.

4. Гоготов И.Н., Зорин Н.А., Кондратьева Е.Н. Очистка и свойства гидрогеназы Thiocapsa roseopersicina. Биохимия, 1976, 41:836-842.

5. Гоготов И.Н. Hydrogenase of purple bacteria: properties and regulation of synthesis. Arch. Microbiol, 1984,140(2):86-90.

6. Гоготов И.Н. Биотехнологичекие основы получения водорода за счет фототрофных микроорганизмов. Биотехнология, 1989, 5:1.

7. Гоготов И.Н., К.К. Рао, Холл Д.О. Образование системами, содержавшими металлическое железо и препараты гидрогеназ. Прикладная биохимия и микробиология, 1995,31(4): 387-392.

8. Гоготов И.Н., Зорин Н.А., Задворный О.А. Аккумуляция металлов фототрофными микроорганизмами и их извлечение. Экология и почвы. Избранные лекции VIII IX Всероссийских школ. Москва: Политекс, 1999, с. 238-251.

9. Добош Д. Электрохимические константы. Справочник для электрохимиков. М.: Мир, 1980, 365 с.

10. Дорохова Е.Н., Прохорова Г.В. Аналитическая химия, М.: Высшая школа, 1991, с. 233-234.

11. Заварзин Г.А., Колотилова Н.Н. Введение в природоведческую микробиологию: Учеб. пособие. М.: Книжный дом «Университет», 2001. - 256 с.

12. Зорин Н.А. Redox properties and active center of phototrophic bacteria hydrogenases. Biochemie, 1986a, 68(1):97-101.

13. Зорин Н.А. Ингибирование гидрогеназы Thiocapsa roseopersicina различными соединениями. Биохимия, 19866, 51:770-774.

14. Зорин Н.А. рН-Индуцируемые конформационные изменения гидрогеназы Thiocapsa roseopersicina. Биохимия, 1992, 57(2):1171-1176.

15. Зорин Н.А., Карякин А.А., Гоготов И.Н., Варфоломеев С.Д. Механизм действия гидрогеназы Thiocapsa roseopersicina. Биохимия, 1988, 53(5):728-734.

16. Зорин Н.А., Пашкова О.Н., Гоготов И.Н. Выделение и характеристика двух форм гидрогеназы Thiocapsa roseopersicina. Биохимия, 1995, 60(4):515-521.

17. Зорин Н.А., Серебрякова JI.T., Гоготов И.Н. Влияние окислительно-восстановительного потенциала на активность гидрогеназ пурпурных бактерий. Биохимия, 1984,49(8): 1316-1319.

18. Зорин Н. А., Гоготов И.Н. Гидрогеназная активность Thiocapsa roseopersicina по реакции обмена D2 Н20. Биохимия, 1975, 40(2):192-195.

19. Зорин Н. А., Гоготов И.Н. Стабильность гидрогеназы из пурпурной серобактерии Thiocapsa roseopersicina. Биохимия, 1982, 47(5):827-833.

20. Каравайко Г.И. Биогеотехнология металлов В кн. Промышленная микробиология. Под ред., Н.С. Егорова. М.:Высш. шк., 1989, с. 634-660.

21. Карякин А.А., Варфоломеев С.Д. Каталитические свойства гидрогеназ. Успехи химии, 1986 55(9): 1524-1549.

22. Кеше Г. Коррозия металлов. Физико-химические принципы и актуальные проблемы. М.: Металлургия, 1984,400 с.

23. Кондратьева Е.Н., Гоготов И.Н. Молекулярный водород в метаболизме микроорганизмов. 1981, М.: Наука. 344 с.

24. Кондратьева Е.Н. Автотрофные прокариоты: Учеб. пособие. М: Изд-во МГУ, 1996. 312 с.

25. Крупянко В. И. Распределение ингибирующей активности среди катионов двухвалентных металлов. Биохимия, 1988, 53(6):905-911.

26. Методы общей бактериологии. Под ред. Ф. Герхардта и др. 1989. М.: Мир, 2:356.

27. Морозов С.В. Водородный топливный электрод на основе ферментов. Диссертация на соискание ученой степени кандидата химических наук, МГУ, Москва, 2003.

28. Морозов С.В., Карякина Е.Е., Задворный О.А., Зорин Н.А., Варфоломеев С.Д., Карякин А.А. Биоэлектрокатализ гидрогеназой Th. roseopersicina, иммобилизованной на различных углеродных материалах. Электрохимия, 2002, 38:113-119.

29. Назаренко В.А., Антонович В.П., Невская Е.М. Гидролиз ионов металлов в разбавленных растворах. М.: Атомиздат, 1979.

30. Никандров В.В. Неорганические полупроводники в биологических и биохимических системах: биосинтез, свойства и фотохимическая активность. Успехи биологической химии, 2000, 40:357-396.

31. Персанов В.М., Гоготов И.Н. Выделение молекулярного водорода клетками зеленой водоросли Chlorella vulgaris. Физиология растений, 1979, 26:560.

32. Пименова М.Н. Повреждение микроорганизмами материалов и способы их защиты.

33. В кн. Промышленная микробиология. Под ред., Н.С. Егорова. -М.:Высш. шк., 1989, с. 660-677.

34. Пиневич А.В., Аверина, С.Г. Оксигенная фототрофия: Руководство по эволюционной клеточной биологии. СПб: Изд-во С.-Петерб. ун-та, 2002. - 236 с.

35. Серебрякова J1.T. Гидрогеназы пурпурных и зеленых бактерий. Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук, ИПиФ АН СССР, Пущино, 1990.

36. Серебрякова JI.T., Гоготов И.Н. Ингибирование гидрогеназ зеленых бактерий газообразными соединениями. Биохимия, 1991,56(2):289-294.

37. Серебрякова Л.Т., Зорин Н.А., Гоготов И.Н. Гидрогеназа зеленой серобактерии СЫогоЫит limicola forma thiosulfatophilum. Биохимия, 1987, 52(6):908-914

38. Серебрякова Л.Т., Зорин Н.А., Карпилова И.Ф., Гоготов И.Н. Влияние температуры на анаэробное окисление металлов при участии бактериальных гидрогеназ. Прикладная микробиология и биохимия, 1997, 33(3):317-320.

39. Физическая энциклопедия. Гл. ред. Прохоров А.М. М.: Большая Российская энциклопедия, 1992,3:356.

40. Чернавина И.А. Физиология и биохимия микроэлементов. М.: Высшая школа, 1970.

41. Шерман М.Б., Орлова Е.В., Смирнова Е.А., Зорин Н.А., Тагунова И.В., Куранова И.П., Гоготов И.Н. Структура микрокристаллов гидрогеназы из Thiocapsa roseopersicina. Биофизика, 1987. 295(2):509-512.

42. Юркова Н.А., Савельева Н.Д., Ляликова Н.Н. Окисление молекулярного водорода и окиси углерода факультативно-хемолитотрофными ванадатвосстанавли-вающими бактериями. Микробиология, 1993, 62(4):597-603.

43. Adams M.W.W. The Structure and Mechanism of Iron-Hydrogenases. Biochim. Biophys. Acta, 1990,1020(2):115-145.

44. Adams M.W.W., Hall D.O. Properties of the solubilized membrane-bound hydrogenase from the photosynthetic bacterium Rhodospirillum rubrum. Arch. Biochem. and Biophys., 1979,195(2):288-295.

45. Adams M.W.W., Mortenson, L.E., Chen, J.S. Hydrogenase. Biochem. Biophys Acta, 1981, 594(2-3): 105-176.

46. Albracht S.P.J., van der Zwaan J.W., Fontijn R.D. Direct evidence for spin-spin interaction between Ni(III) and iron-sulfur cluster. Biochem. Biophys. Acta, 1984, 766:245-258.

47. Albracht S.P.J. Nickel hydrogenases: in search of the active site. Biochim. Biophys. Acta, 1994,1188:167-204.

48. Alexeeva S., Hellingwerf, K.J., and Teixeira de Mattos, M.J. Requirement of ArcA for redox regulation in Escherichia coli under microaerobic but not anaerobic or aerobic conditions. J. Bacteriol. 2003.185:204-209.

49. Alvarez H.M., Krawiec, M., Donovan-Merkert, B.T., Fouzi, M., and Rabinovich, D.

50. Modeling nickel hydrogenases: synthesis and structure of a distorted octahedral complex with an unprecedented NiS(4)H(2). core. Inorg. Chem., 2001. 40:5736-5737.

51. Aono S. Biochemical and biophysical properties of the СО-sensing transcriptional activator CooA. Acc. Chem. Res., 2003,36:825-831.

52. Appel J., and Schulz, R. Hydrogen metabolism in organisms with oxygenic photosynthesis: Hydrogenases as important regulatory devices for a proper redox poising. J. Photochem. Photobiol., 1998, 47:1-11.

53. Asada Y., and Miyake, J. Photobiological hydrogen production J. Biosci. Bioeng., 1999, 88:1-6.

54. Badar U., Ahmed N., Beswick A.J., Pattanapiptpaisal P., and Macaskie L.E. Reduction of chromate by microorganisms isolated from metal contaminated sites of Karachi, Pakistan. Biotechnol. Letters, 2000, 22:829-836.

55. Bagyinka C., J.P. Whitehead, M.J. Maroney. An X-Ray-absorption spectroscopic study of nickel redox chemistry in hydrogenase. J. Am. Chem. Soc., 1993, 115(9):3576-3585.

56. Bertrand M., Friedrich, В., and Siddiqui, R.A. Ralstonia eutropha TF93 is blocked in Tat-mediated protein export. J. Bacteriol., 2000, 182:581-588.

57. Binder U., Maier, T. and Bock, A. Nickel incorporation into hydrogenase 3 from Escherichia coli requires the precursor form of the large subunit. Arch. Microbiol., 1996,165:69-72.

58. Blokesch M., Magalon, A., and Bock, A. Interplay between the specific chaperone-like proteins HybG and HypC in maturation of hydrogenases 1,2, and 3 from Escherichia coli. J. Bacteriol., 2001,183:2817-2822.

59. Blokesch M. and Bock, A. Maturation of NiFe.-hydrogenases in Escherichia coli: the HypC cycle. J. Mol. Biol., 2002, 324:287-296.

60. Boichenko A.V. and Hoffmann, P. Photosynthetic hydrogen-production in prokaryotes and eukaryotes: Occurrence, mechanism, and functions. Photosynthetica 1994, 30:527-552.

61. Bontidean I., Lloyd, J,R., Hobman, J.L., Wilson, J.R., Csoregi, E., Mattiasson, B, and Brown, N.L. Bacterial metal-resistance proteins and their use in biosensors for the detection of bioavailable heavy metals. J Inorg. Biochem., 2000, 79:225229.

62. Bredford M. A rapid and sensitive method for quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle protein-dye binding. Analyt. Biochem., 1976, 72(1-2):248-254.

63. Brewin N.J., DeJong, T.M., Phillips D.A., and Johnston A.W.B. Co-transfer of determinants for hydrogenase activity and nodulation ability in Rhizobium legumino-sarum. Nature, 1980,288:77-79.

64. Bruschi M., Fantucci, P., and De Gioia, L. DFT investigation of structural, electronic, and catalytic properties of diiron complexes related to the 2Fe.n subcluster of Fe-only hydrogenases. Inorg. Chem., 2002, 41:1421-1429.

65. Bryant R. D., and Laishley, E. J. The role of hydrogenase in anaerobic biocorrosion. Can. J.Microbiol., 1990,36:259-264.

66. Bryant R., and Laishley, E. The effect of inorganic phosphate and hydrogenase on the corrosion of mild steel. Appl. Microbiol. Biotechnol., 1993,38:824-827.

67. Cammack R. in Cammack, R., Frey, M., and Robson, R. (eds). 2001. Hydrogen as a Fuel.1.arning from Nature (Taylor and Francis Inc., London and New York, USA, 2001), pp. 71-92.

68. Cammack R., Patil, D. S., Hatchikian, E.C., and Fernandez, V.M. Nickel and iron-sulphur centers in Desulfovibrio gigas hydrogenase: ESR spectra, redox properties and interactions. Biochim. Biophys. Acta, 1987, 912:98-109.

69. Casalot L., and Rousset, M. Maturation of the NiFe. hydrogenase. Trends Microbiol., 2001,9:228-236.

70. Chardin В., Giudici-Orticoni M.-T., De Luca, G., Guigliarelli, В., and Bruschi, M. Hydrogenase in sulfate-reducing bacteria function as chromium reductase. Appl. Microbiol. Biotechnol., 2003, 63:315-321.

71. Chirwa ES, Wang Y-T: Simultaneous chromium(VI) reduction and phenol degradation in an anaerobic consortium of bacteria. Wat. Res., 2000,34:2376-2384.

72. Colbeau A., Chabert J., and Vignais, P.M. Purification, molecular properties and localization in the membrane of the hydrogenase of Rhodopseudomonas capsulata. Biochim. Biophys. Acta, 1983, 748:116-127.

73. Cord-Ruwish R., and Widdel, F. Corroding iron as a hydrogen source for sulphate-reduction in growing cultures of sulphate-reducing bacteria. Appl. Microbiol. Biotechnol, 1986,25(3): 169-174.

74. Da Silva S., Basseguy, R., and Bergel, A. The role of hydrogenase in the anaerobic mi-crobiologically influence corrosion of steels. Bioelectrochemistry, 2002, 56:7779.

75. Darensbourg M.Y., Lyon, E.J., Zhao, X., and Georgakaki, I.P. The organometallic active site of Fe.hydrogenase: models and entatic states. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 2003,100:3683-3688.

76. De Lacey A.L., Hatchikian, E.C., Volbeda, A., Frey, M., Fontecilla-Camps, J.C. and Fernandez, V.M. Infrared-spectrochemical characterization of the NiFe. hydrogenase of Desulfovibrio gigas. J. Am. Chem. Soc, 1997,119:7181-7189.

77. De Luca G., de Philip, P., Dermoun, Z., Rousset, M., and Vermeglio, A. Reduction of technetium(VII) by Desulfovibrio fructosovorans is mediated by the nickel-iron hydrogenase. Appl. Environ. Microbiol., 2001, 67:4583-4587.

78. Dey S., Patke, D.S. Mercury biotransformation and its potential for remediation of mercury contaminated water. J Environ Biol., 2000, 21:47-54.

79. Dzierzewicz Z., Cwalina, В., Chodurek, E., and Wilczok, T. The relationship between microbial metabolic activity and biocorrosion of carbon steel. Res. Microbiol., 1997,148:785-793.

80. Eberz G., Hogrefe, C., Kortlucke, C., Kamenski, A., and Friedrich, B. Molecular cloning of structural and regulatory hydrogenase (hox) genes of Alcaligenes eutrophus HI6. J. Bacteriol, 1986,168:636-641.

81. Ehrenreich A., and Widdel, F. Anaerobic oxidation of ferrous iron by purple bacteria, a new type of phototrophic metabolism. Appl. Environ. Microbiol., 1994, 60(12):4517-4526.

82. Evans D.J., and Pickett, C.J. Chemistry and the hydrogenases. Chem. Soc. Rev., 2003, 32:268-275.

83. Fagan Т., and Mayhew, S. G. Effects of mercurial on hydrogenase from Desulfovibrio vulgaris (Hildenbrough). Biochem. Soc. Trans., 1988,16:178-179.

84. Fan H.J., and Hall, M.B. Recent theoretical predictions of the active site for the observed forms in the catalytic cycle of Ni-Fe hydrogenase. J. Biol. Inorg. Chem., 2001, 6: 467-473.

85. Fernandez V.M., Rua, M.L., Reyes, P., Cammack, R., and Hatchikian, E. C. Inhibition of Desulfovibrio gigas hydrogenase with copper salts and other metal ions. Eur. J. Biochem., 1989,185:449-454.

86. Flickinger M. C., and Drew, S. W Encyclopedia of Bioprocess Technology Fermentation, Biocatalysis and Bio separation. 1999,1-5, John Wiley & Sons.

87. Foerster S., Stein, M., Brecht, M., Ogata, H., Higuehi, Y., and Lubitz, W. Single crystal EPR studies of the reduced active site of NiFe. hydrogenase from Desulfovibrio vulgaris Miyazaki F. J. Am. Chem. Soc., 2003, 125:83-93.

88. Fontecilla-Camps J.C., Frey, M., Garein, E., Hatchikian, C., Montet, Y., Piras, C., Vernede, X., and Volbeda, A. Hydrogenase: a hydrogen-metabolizing enzyme.

89. What do the crystal structures tell us about its mode of action? Biochimie, 1997,79:661-666.

90. Gadd G.M. Accumulation of metals by microorganisms and algae. (Ed. R. H.-J. Wein-heim et al.: VCH, 1988,6b:401-433.

91. Garcin E., Vernede, X., Hatchikian, E.C., Volbeda, A., Frey, M., and Fontecilla-Camps, J.C. The crystal structure of a reduced NiFeSe. hydrogenase provides an image of the activated catalytic center. Structure Fold Des., 1999, 7: 557-566.

92. Georgakaki LP., Miller, M. L., and Darensbourg, M. Y. Requirements for functional models of the iron hydrogenase active site: D2/H2O exchange activity in ((р,-SMe)(^-pdt)Fe(CO)2(PMe3).2+)[BF4"]. Inorg. Chem., 2003, 42:2489-2494.

93. Graf E.G. and Thauer, R.K. Hydrogenase From Methanobacterium-Thermoautotrophicum a nickel-containing enzyme. FEBSLett., 1981,136(1):165-169.

94. Gogotov I.N., Zorin, N.A., Serebriakova, L.T., and Kondratieva, E.N. The properties of hydrogenase from Thiocapsa roseopersicina. Biochim. Biophys. Acta, 1978, 523:335-343.

95. Happe T, Hemschemeier, A., Winkler, M., and Kaminski, A. Hydrogenases in green algae: do they save the algae's life and solve our energy problems? Trends Plant Sci., 2002, 7:246-250.

96. Happe R.P., Roseboom, W., and Albracht, S.P.J. Pre-steady-state kinetics of the reactions of the NiFe.-hydrogenase from Chromatium vino sum with H2 and CO. Eur. J. Biochem., 1999,259:602-608.

97. Happe R.P., Roseboom, W., Pierik, A.J., Albracht, S.P.J., and Bagley, K.A. Biological activation of hydrogen. Nature 1997,385:126.

98. Happe Т., and Kaminski, A. Differential regulation of the Fe-hydrogenase during anaerobic adaptation in the green alga Chlamydomonas reinhardtii. Eur. J. Biochem., 2002,269:1022-1032.

99. Harder E.C. Iron depositing bacteria and their geologic relations. Governmental Printing Office, Washington, D.C., 1919.

100. Higuchi Y., Ogata, H., Miki, K., Yasuoka, N., and Yagi, T. Removal of the bridging ligand atom at the Ni-Fe active site of NiFe. hydrogenase upon reduction with

101. Нг, as revealed by X-ray structure analysis at 1.4 A resolution. Structure, 1999, 7: 549-556.

102. Higuchi Y., Toujou, F., Tsukamoto, K., and Yagi, T. The presence of a SO molecule in NiFe.-hydrogenase from Desulfovibrio vulgaris Miyazaki as detected by mass spectrometry. J. Inorg. Biochem., 2000, 80: 205-211.

103. Higuchi Y., Yagi, Т., and Yasuoka, N. Unusual ligand structure in Ni-Fe active center and an additional Mg site in hydrogenase revealed by high resolution X-ray structure analysis. Structure, 1997, 5:1671-1680.

104. Hobman J.L., Wilson, J.W., and Brown, N.L: Microbial mercury reduction. In Environmental Microbe-Metal Interactions. Edited by Lovley DR. ASM Press, 2000, pp. 177-197.

105. Hopper S., Babst, M., Schlensog, V., Fischer, H.M., Hennecke, H., and Bock, A. Regulated expression in vitro of genes coding for formate hydrogenlyase components of Escherichia coli. J. Biol. Chem., 1994,269:19597-19604.

106. Horikoshi Т., Akajama A., and Sakaguchi, T. Uptakeof uranium from seawater by Synechococcus elongatus. J.Ferment. Technol., 1979,57:191.

107. Houchins J.P., and Burris R.H. Physiological reactions of the reversible hydrogenase from Anabaena 7120. Plant Physiol., 1981, 68:717-721.

108. Kamachi Т., Uno, S., Hiraishi, Т., and Okura, I. Purification and properties of intact hydrogenase from Desulfovibrio vulgaris (Miyazaki) J. Mol. Catalysis A: Chemical, 1995,95:93-98.

109. Kashefi К., Tor, J. M., Nevin, K. P., and Lovley, D. R. Reductive precipitation of gold by dissimilatory Fe(III)-reducing Bacteria and Archaea. Appl. Environ. Microbiol, 2001,67:3275-3279.

110. Kayall A., and Rauchfuss, T.B. Protonation studies of the new iron carbonyl cyanide trans-Fe(CO)3(CN)2.2": implications with respect to hydrogenases. Inorg. Chem., 2003, 42: 5046-5048.

111. Khatipov E., Miyake, M., Miyake, J., and Asada, Y. Polyhydroxybutirate accumulation and hydrogen evolution by Rhodobacter sphaeroides as a function of nitrogen availability. In Biohydrogen, ed. Zaborsky O.R. 1998. Plenum Press, New York. P. 157-161.

112. Kobayashi M., and Kurata, S.I. The mass culture and cell utilization of photosynthetic bacteria. Proc. Biochem., 1978,13:27-30.

113. Kosourov S., Seibert, M., and Ghirardi, M.L. Effect of extracellular pH on the metabolic pathways in sulfur-deprived H2-producing Chlamydomonas reinhardii cultures. Plant Cell Physiol, 2003, 44(2):146-155.

114. Madigan M.T., Martinko, J.M., and Parker, J. Prokaryotic diversity: Bacteria. In: Brock biology of microorganisms, 8th ed. Ed M.T. Madigan, 1997, Prentice-Hall, Inc., New Jersey. P. 636-740.

115. Magalon A., and Bock, A. Dissection of the maturation reactions of the NiFe.-hydrogenase 3 from Escherichia coli taking place after nickel incorporation. FEBSLett., 2000, 473:254-258.

116. Malkin R. Iron-Sulfur Proteins, (Lovenberg, W., ed.). Academic Press, N. Y., 1973, 2:118.

117. Maroney M.J., and Bryngelson, P.A. Speectroscopic and model studies of the Ni-Fe hydrogenase reaction mechanism. J. Biol. Inorg. Chem., 2001, 6:453-459.

118. Maroti G., Fodor, B.D., Rakhely, G., Kovacs, A.T., Arvani, S., and Kovacs, K.L. Accessory proteins functioning selectively and pleiotropically in the biosynthesis of NiFe.-hydrogenases in Thiocapsa roseopersicina. Eur. J. Biochem., 2003, 270:2218-2227.

119. Massanz C., Fernandez, V.M., and Friedrich, B. C-terminal extension of the ^-activating subunit, HoxH, directs maturation of the NAD-reducing hydrogenase in Alca-ligenes eutrophus. Eur. J. Biochem., 1997, 245: 441-448.

120. Mc Tavish H., Sayavedra-Soto, L.A., and Arp, D J. Comparison of isotope exchange, H2 evolution, and H2 oxidation activities of Azotobacter vinelandii hydrogenase. Biochim. Biophys. Acta, 1996,1294:183-190.

121. Melis A., and Happe, T. Hydrogen production. Green algae as a source of energy. Plant physiol, 2001,127:740-748.

122. Meyer V., Kelley, B.C., and Vignais, P.M. Nitrogen fixation and hydrogen metabolism in photosynthetic bacteria. Biochimie, 1978, 60:245.

123. Michel C., Brugna, M., Aubert, C., Bernadac, A., and Bruschi, M. Enzymatic reduction of chromate: comparative studies using sulfate-reducing bacteria. Appl. Microbiol. Biotechnol., 2001,55:95-100.

124. Miyake J. The science of biohydrogen. In Biohydrogen, ed. Zaborsky O.R. 1998. Plenum Press, New York. P. 7-18.

125. Moore M. D., and Kaplan, S. Members of the family Rhodospirillaceae reduce heavy-metal oxyanions to maintain redox poise during photosynthetic growth. ASM News, 1994, 60(l):17-23.

126. Muller A., Tscherny, I., Kappl, R., Hatchikian, E.C., Huttermann, J., and Cammack, R.

127. Hydrogenases in the "active" state: determination of g-matrix axes and electron spin distribution in the active site by .H ENDOR spectroscopy. J. Biol. Inorg. Chem., 2002,7:177-194.

128. Nehring J.L., and Heinekey, D.M. Dinuclear iron isonitrile complexes: models for the iron hydrogenase active site. Inorg. Chem., 2003, 42:4288-4292.

129. Nedoluzhko A.I., Shumilin, I.A., Mazhorova, L.E., Popov, V.O., and Nikandrov, V.V.

130. Enzymatic oxidation of cadmium and lead metals photodeposited on cadmium sulfide. Bioelectrochemistry, 2000, 53:61-71.

131. Nicholas D.J.D., Fisher, D.J., Redmond, W.J., Wright, M.A. Some aspects of hydrogenase activity and nitrogen fixation in Azotobacter-Spp and in Clostridium-Pasteurianum. J. Gen. Microbiol., 1960,22(1): 191-205.

132. Nicolet Y., Piras, C., Legrand, P., Hatchikian, C.E., and Fontecilla-Camps, J.C. Desulfovibrio desulfuricans iron hydrogenase: the structure shows unusual coordination to an active site Fe binuclear center. Structure FoldDes., 1999, 7:13-23.

133. Noda K., Zorin, N.A., Nakamura, C., Miyake, M., Gogotov, I.N., Asada, Y., Akutsu, H., and Miyaki, J. Langmuir-Blodgett film of hydrogenase for electrochemical hydrogen production. Thin Solid Films, 1998, 327-329:639-642.

134. Odermatt A, and Solioz, M. Two trans-acting metalloregulatory proteins controlling expression of the copper-ATPases of Enterococcus hirae. J. Biol. Chem., 1995, 270:4349-4354.

135. Olson J.W., and Maier, R.J. Dual roles of Bradyrhizobium japonicum nickelin protein in nickel storage and GTP-dependent Ni mobilization. J. Bacteriol., 2000, 182:1702-1705.

136. Pankhania I. Hydrogen metabolism in sulphate-reducing bacteria and role in anaerobic corrosion. Biofouling, 1988,1:27-47.

137. Park C.H., Keyhan, M., Wielinga, В., Fendorf, S, and Matin, A. Purification to homogeneity and characterization of a novel Pseudomonas putida chromate reductase. Appl. Environ. Microbiol., 2000, 66:1788-1795.

138. Payne R. В., Darren, M., Gentry, В., Rapp-Giles, J., Casalot, L., and Wall, J.D. Uranium reduction by Desulfovibrio desulfuricans strain G20 and a cytochrome C3 mutant. Appl. Environ. Microbiol, 2002, 68:3129-3132.

139. Perego P., and Fabiano, B. Corrosion, microbial. Encyclopedia of Bioprocess Technology Fermentation, Biocatalysis, and Bioseparation (Ed. Flickinger, M.C., and Drew, S.W.). 1999. John Wiley & Sons, 1-5:717-729.

140. Peters J.W., Lanzilotta, W.N., Lemon, B.J., and Seefeldt, L.C. X-ray crystal structure of the Fe-only hydrogenase (Cpl) from Clostridium pasteurianum to 1.8 angstrom resolution. Science, 1998,282: 1853-1858.

141. Piimpel Т., L. E. Macaskie, J. A. Finlay, L. Diels, and M. Tsezos. Nickel removal from nickel-plating wastewater using a biologically active moving-bed sand filter. BioMetals, 2003,16:567-581.

142. Rakhely G., Colbeau, A., Garin, J., Vignais, P.M., and Kovacs, K.L. Unusual organization of the genes coding for HydSL, the stable NiFe. hydrogenase in the pho-tosynthetic bacterium Thiocapsa roseopersicina BBS. J. Bacteriol., 1998, 180:1460-1465.

143. Rasmussen L.D., Sorenson, S.J., Turner, R.R., and Barkay, T. Application of a mer-lux biosensor for estimating bioavailable mercury in soil. Soil Biol. Biochem., 2000,32:639-646.

144. Reissman S., Hochleitner, E., Wang, H., Paschos, A., Lottspeich, F., Glass, R.S., and Bock, A. Taming of a poison: biosynthesis of the NiFe-hydrogenase cyanide ligands. Science, 2003,299:1067-1070.

145. Richard D.J., Sawers, G., Sargent, F., McWalter, L., and Boxer, D.H. Transcriptional regulation in response to oxygen and nitrate of the operons encoding the NiFe. hydrogenases 1 and 2 of Escherichia coli. Microbiology, 1999,145: 2903-12.

146. Robson R. The assembly line. In Hydrogen as a fuel: learning from Nature. London and New York: Taylor and Francis, 2001, pp. 57-72.

147. Roessler P. and Lien, S. Anionic modulation of the catalytic activity of hydrogenase from Chlamydomonas reinhardtii. Arch. Biochem. Biophys., 1982,213:31-44.

148. Sabatini D.D., Miller, F., Barrnet, RJ. Aldehyde fixation for morphological end enzyme histochemical studies with the electro microscope. J. Histochem. Cytochem., 1964,12:57-71.

149. Salyi S., Kritikos, M., Akermark, В., and Sun, L. Synthesis of an amino-functionalized model of the Fe-only hydrogenase active site. Chemistry, 2003, 9:557-60.

150. Sapra R., Bagramyan, K., and Adams, M.W. A simple energy-conserving system: proton reduction coupled to proton translocation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2003, 100:7545-7550.

151. Sasaki K. Hydrogen and 5-aminolevulinic acid production by photosynthetic bacteria. In Biohydrogen, ed. Zaborsky O.R. 1998. Plenum Press, New York. P. 133-142.

152. Schmiechen H., Wittig H., and Martin S.Entfernung von Schwermetallen aus abwassern mittels Sorption an biopolimer aus Microorganismus Ectothiorodospira shaposhnikovii. Umveltbiotechnologie, 1991,1:38-41.

153. Sciotti M.A., Chanfon, A., Hennecke, H., and Fischer, H.M. Disparate oxygen responsiveness of two regulatory cascades that control expression of symbiotic genes in Bradyrhizobium japonicum. J. Bacteriol., 2003,185:5639-5642.

154. Sellman D., Geipel, F., Heinemann, F.W. (NEt(4))(2)Fe(CN)(2)(CO)('S(3)').: an iron thiolate complex modeling the [Fe(CN)(2)(CO)(S-Cys)(2)] site of [NiFe] hydrogenase centers. Chemistry, 2002, 8:958-966.

155. Sherman M.B., Orlova, E.V., Smirnova, E.A., Hovmoller, S., and Zorin, N.A. Three-dimensional structure of the nickel-containing hydrogenase from Thiocapsa roseopersicina. J. Bacteriol., 1991,173(8):2576-2580.

156. Shumate S.E., Stranberg G.W. Comprehensive biotechnology. Eds. Moo-Young M., Robinson C.N., Howell J.A. N.Y.: Pergamon Press. 1985. P.235-247.

157. Sieghbahn P.E.M., Blomberg, M.R.A., Wirstam nee Pavlov, M., and Crabtree, R.H. The mechanism of the Ni-Fe-hydrogenases: a quantum chemical perspective. J. Biol Inorg. Chem., 2001, 6:460-466.

158. Silver S., and Phung Le T. Bacterial heavy metal resistance: New surprises, Annu. Rev. Microbiol, 1996, 50:753-789.

159. Silver S., and Walderhaug, M. Gene regulation of plasmid- and chromosomal determined inorganic ion transport in bacteria. Microbiol Rev., 1992, 56:195-228.

160. Smith W.L., and Gadd, G.M. Reduction and precipitation of chromate by mixed culture sulphate-reducing bacterial biofilms. J. Appl. Microbiol, 2000, 88:983-991.

161. Stephenson M., and Stickland, L.H. Hydrogenase. A Bacterial enzyme activating molecular hydrogen. Biochem. J., 1931, 25:205-214.

162. Straub K.L., Benz, M, Schink, В., and Widdel, F. Anaerobic, nitrate-dependent microbial oxidations of ferrous iron. Appl Environ Microbiol, 1996, 62:1458-1460.

163. Thauer R.K., Klein, A.R., and Hartmann, G.C. Reactions with molecular hydrogen in microorganisms: evidence for a purely organic hydrogenation catalyst. Chem. Rev., 1996,96: 3031-3042.

164. Tibelius K.N., and Knowles, R. Hydrogenase activity in Azospirillum brasilense is inhibited by nitrite, nitric oxide, carbon monoxide and acetylene. J. Bacteriol., 1984, 160(1):103-106.

165. Tsygankov A.A., Hirata, Y., Miyake, M., Asada, Y., and Miyake, J. Photobioreactor with photosynthetic bacteria immobilized on porous glass for hydrogen photopro-duction. J. Ferment Bioeng., 1994, 77:575-578.

166. Turner J.S. and Robinson N.J. Cyanobacterial metallothioneins: biochemistry and molecular genetics. J. Industr. Microbiol, 1995,14:259-264.

167. Vignais P.M. and Colbeau, A. Molecular biology of microbial hydrogenases. Cur. Issues Mol. Biol, 2004, 6:159-188.

168. Vignais P.M., Henry, M.F., Berlier, Y., and Lespinat, P.A. Effect of pH on H2-3H2exchange, H2 production and H2 uptake, catalysed by the membrane-boundhydrogenase of Paracoccus denitrificans. Bichem. Biophys. Acta, 1982, 681:519-529.

169. VignaisP.M., Billoud, В., and Meyer, J. Classification and phylogeny of hydrogenases. FEMS Microbiol. Rev., 2001, 25:455-501.

170. Vignais P.M., Cournac, L., Hatchikian, E.C., Elsen, S., Serebryakova, L., Zorin, N., and Dimon, B. Continuous monitoring of the activation and activity of NiFe.-hydrogenases by membrane-inlet mass spectrometry. Int. J. Hydrogen En., 2002,27:1441-1448.

171. Vignais P.M., Toussaint В., Colbeau A. Regulation of hydrogenase gene expression. В Blankenship, R.E. Madigan, M.T., Bauer C.E. (eds): Anoxugenic Photosyn-thetic bacteria, Netherlands, 1995, Chapter 55, pp. 1175-1190

172. Vignais P.M., Toussaint, B. and Colbeau, A. Regulation of hydrogenase gene expression In Blankenship, R.E., Madigan, M.T., Bauer, C.E. (eds): Anoxygenic Photo-synthetic Bacteria, 1995, Chapter 55, pp 1175-1190

173. Vignais P.M., Willison, J.C., and Colbeau, A. H2 respiration In D. Zannoni (ed.), Respiration in Archaea and Bacteria. Vol. 2. Diversity of Prokaryotic systems. Ch. IX. (Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, The Netherlands). 2003.

174. Volbeda A., Charon, M.H., Piras, C., Hatchikian, E.C., Frey, M., and Fontecilla-Camps, J.C. Crystal structure of the nickel-iron hydrogenase from Desulfovibrio gigas. Nature, 1995,373: 580-587.

175. Volbeda A., Montet, Y., Vernede, X., Hatchikian, E. C., and Fontecilla-Camps, J. C.

176. High-resolution crystallographic analysis of Desulfovibrio fructosovorans NiFe. hydrogenase. Intern. J. Hydrogen Energy, 2002, 27: 1449-1461.

177. Von Kiihr W., and Van der Vlugt. Graphication of cast iron as an electrochemical in anaerobic soils. Water (The Hague), 1934,18:147-165.

178. Voncken F.G.J., Boxma, В., van Hoek, A.H., Akhmanova, A.S., Vogels, G.D., Huynen, M., Veenhuis, M., and Hackstein, J.H. A hydrogenosomal Fe.- hydrogenase from the anaerobic chytrid Neocallimastix sp. L2. Gene, 2002,284:103-112.

179. Vrati S. Single cell protein production by photosynthetic bacteria grown on the clarified effluents of biogas plant. Appl. Microbiol. Bioechnol., 1984,19:199-202.

180. Warthman R., Pfennig, N., and Cypionka, H. The quantшn requirement for H2 production by anoxygenic phototrophic bacteria. Appl. Microbiol. Biotechnol., 1993, 39:358-362.

181. Woolfolk C. A., and Whiteley, H. R. Reduction of inorganic compounds with molecular hydrogen by Micrococcus lactilyticus. J. Bacteriol., 1962, 84:647-658.

182. Wu L.F., and Mandrand, M.A. Microbial hydrogenases: primary structure, classification, signatures and phylogeny. FEMS Microbiol. Rev., 1993,10:243-269.

183. Wykoff D.D., Davies J.P., Melis A., Grossman A.R. The regulation of photosynthetic electron transport during nutrient deprivation on Chlamydomonas reinhardtii. Plant Physiol, 1998,117:129-139.

184. Zhao X., Georgakaki, I.P., Miller, M.L, Mejia-Rodrigue, R., Chiang, C.Y., and Darens-bourg, M.Y. Catalysis of H2/D2 scrambling and other H/D exchange processes by Fe.-hydrogenase model complexes. Inorg. Chem., 2002, 41:3917-3928.

185. Zhao X., Georgakaki, I.P., Miller, M.L., Yarbrough, J.C., and Darensbourg, M.Y. H/D exchange reactions in dinuclear iron thiolates as activity assay models of Fe-H2ase. J. Am. Chem. Soc., 2001,123:9710-9711.

186. Zorin N. A. Application of hydrogenase from Thiocapsa roseopersicina for renewable energy model systems. In Biohydrogen III, 2004 (in press).

187. Zorin N.A., Dimon, В., Gagnon, J., Gallard, J., Carrier, P., and Vignais, P. M. Inhibition by iodoacetamide and acetylene of the H-D-exchange reaction catalyzed by Thiocapsa roseopersicina hydrogenase. Eur. J. Biochem., 1996,241:675-681.

188. Zorin N.A., Lindblad, P. Localization of hydrogenase in the purpule sulphur bacterium Thiocapsa roseopersicina. Arch Microbiol., 1993,160:1-5.

Информация о работе

Задворный, Олег Александрович
кандидата биологических наук
Пущино, 2004
ВАК 03.00.04

Диссертация

Окислительно-восстановительное взаимодействие гидрогеназ фототрофных бактерий с металлами - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы