Изучение роли алкилоксибензолов в стрессовом ответе микроорганизмов

Степаненко, Ирина Юрьевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Изучение роли алкилоксибензолов в стрессовом ответе микроорганизмов
ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Изучение роли алкилоксибензолов в стрессовом ответе микроорганизмов"

На правах рукописи

СТЕПАНЕНКО Ирина Юрьевна

ИЗУЧЕНИЕ РОЛИ АЛКИЛОКСИБЕНЗОЛОВ В СТРЕССОВОМ ОТВЕТЕ МИКРООРГАНИЗМОВ

03.00.07. - Микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 2005

Работа выполнена в Институте микробиологии им С.Н. Виноградского РАН

Научный руководитель

доктор биологических наук, профессор Г.И. Эль-Регистан

Официальные оппоненты

доктор биологических наук, профессор В.К. Плакунов

доктор биологических наук, профессор Р.А. Звягильская

Ведущая организация

Московский Государственный Университет им. М.В. Ломоносова, факультет почвоведения, кафедра биологии почв

Защита диссертации сос I ои 1 ся 30 мая 2005 года в 14.00 часов на заседании диссертационного совета Д 002 224 01 в Институте микробиоло! ии им. С Н Виноградского РАН по адресу:

117312. г Москва, Проспект 60-летия Оюября, д 7, корп 2.

С диссертацией можно ознакомился в библиотеке Инаитута микробиоло1 ии им С Н Виноградского РАН

Автореферат разослан « гг » 2005 I

Ученый секретарь диссер!ационного совета,

кандидат биологических наук

Л.Е. Никитин

ЗЖНо

Актуальность проблемы. Проблема адаптации микроорганизмов к стрессу является одной из наиболее актуальных проблем микробиочогии Накапливается все больше данных о i ом. что действие различных стрессовых факторов сопровождается возрастанием в клетках концентрации активных форм кислорода (АФК), вызывающих окислительный стресс Так, повреждающие эффекты АФК наблюдаются при воздействии на микроорганизмы как высоких [Davidson et al, 19%. Sugiyamaetal, 2000; Рихванов с соавт ,2001;2003],такинизких температур [Park. 2000]. высоких концентраций солей [Гейдебрсхт, 2003]. радиации [Эйдус, 1962]

Молеку чярно-биологические исследования внутриклеточных механизмов адаптации микроорганизмов к стрессу позволили получить обширную информацию о событиях, происходящих на уровне реализации генетических программ клеточного ответа системах репарации ДНК [Rusting. 1992, Романовская с соавт., 2002; 2003]. ферментах антиоксидангной защиты [Terzenbach. Blaut. 1998: Смирнова с соавт , 2001; Брюханов с соавт . 2002; Подкопаева с соавт , 2003]. особенностях транскрипции арессовых белков [Hidalgo, Demple, 1996; De Маю. 1999; Zheng, Stor7. 2000]. в том числе белков тепловою шока, имеющих функции мотекулярных шаперонов и участвующих в структурной стабилизации и фолдинге белков [Van der Vies. Georgopoulos. 1996, Shukla, Singh, 1999. Hossain, Nakamoto. 2003] Вместе с тем, в последние годы в области исследований устойчивости микроорганизмов к стрессовым воздействиям обозначился очевидный интерес к изучению внеклеточных а уторегуляторов. обеспечивающих межклеточную коммуникацию при формировании стрессового ответа клеток Описан ряд физиологических процессов, ассоциированных со с!ационарной фазой культур микроорганизмов в ответ на стресс голодания (starvation stress) и достижение критической плотности кпеток (quorum sensing) в которых принимают участие ауторегуля горы [Хохлов, 1988 Эчь-Регистан. 1988; Dworkin, 1996; Shapiro. Dworkin. 1997; Parsek, Greenberg, 2000] Однако, роль межклеточных взаимодействий и участие экзометаболигов в системе гибкой защиты клеток проли-ферирующих микробных культур от воздействия стрессоров изучены явно недостаточно

В обсуждаемом аспекте проблемы нас интсресовачи функции ауторегуляторов в развитии защитных реакций клетки, контроле процессов динамичной структурной реорганизации и стабилизации субклеточных структур Претендентами на эту роль \ioiy г быть внеклеточные метаболи ты, описанные по адаптогенному действию культуральных жидкостей [Воробьева с соавт , 1993; Никотаев. 1996; 2000] вещества, содержащиеся в лиза1ах кчеток [Кокоева. Плакунов, 1993]. адагпогены белковой природы [Rowbury, Goodson, 2001, Воробьева с соавт . 2003], а также микробные аутоиндукторы анабиоза факторы d, (фс!,), представленные у ряда бактерий и дрожжей алкилоксибензолами(АОБ) [Осипов с соав! , 1985: Батраков с соавт . 1993, Мулюкин с соавт . 1996] По достижении определенного концентрационного уровня АОБ (фс1!) контролируют переход микробной культуры к с!анионарной фазе развитие в клетках гипометаболического, а затем анабиотического состояний, сопряженных с повышением устойчивое [и стационарных клеток и покоящ1||ф£4ШЩй0Й)^ЛШ<пР«5*гным и повРеж"

.'ПАЦИипДЛиМ * *

БИБЛИОТЕКА

дающим воздействиям [Светличный с соавт., 1986; Эль-Регистан, 1988; Демкина с соавт., 2000; Лойко с соавт , 2003] Описанные свойства АОБ предполагают их участие в природных механизмах адаптации клеток микроорганизмов к стрессу Выяснение функций АОБ в процессах повышения устойчивости клеток и стабилизации субклеточных структур представляется важным для теории стресса и решения практических задач защиты организмов от неблагоприятных воздействий.

Цель работы — изучить роль микробных алкилоксибензолов ауторегуляторных факторов d , в адаптации микроорганизмов к сублетальным воздействиям стрессоров различной природы.

Задачи исследований: 1) изучить динамику накопления вне- и внутриклеточных АОБ в к\ пьтурс Мю ococcus lutem, подвергнутой температурному шоку и выявить их возможную роль как адаптогенов; 2) оценить протекторные функции АОБ в сохранении жизнеспособности клеток пролиферирующих культур бактерий М luteus и дрожжей Satiharomyces cerevisiae в условиях теплового шока и окислительного стресса разчичной природы; 3) изучить механизмы действия химических аналогов фс1, бактерий (С7-АОБ и С|2-АОБ) и дрожжей (тирозола) в регуляции активности и стабильности ферментных белков, 4) исследовать участие АОБ в антиоксидантной защите клеток при окислительном стрессе; 5) определить на молекулярном уровне функционирование АОБ как ангиоксидантов. а также изучить качественный состав и функциональную активность продуктов, образующихся при окислении АОБ

Научная новизна. (1) Установлены основные закономерности саморегуляции формирования арессового огвега микроорганизмов с участием внеклеточных фс1г представленных у ряда бак герий и дрожжей алкилоксибензолами Выявлена роль АОБ как адаптогенов протекторного типа, защищающих клетки пролиферирующих культур бактерий и дрожжей от стрессовых воздействий разной природы - теплового шока, у-облучения и фоюокисления Обнаружено, что формирование стрессового ответа бактерий М lutein сопряжено с повышением биосинтеза АОБ, внектеточпый пул которых служит для их перераспредетения между клетками попутяции Установтено, что защитный эффект АОБ при возрастании их концентрации в культуре, подвергаемой стрессовому воздействию, выражается в повышении устойчивости клеток и сохранении их способности к пролиферации. (2) Установлено, что механизм про1екторното дейавия АОБ включает их функционирование как химических шаперонов и эффективных перехватчиков АФК Впервые показана антиоксидантная активность феноть-ных соединений в защите клеток от синглетного кислорода (3) В опытах т пи о впервые показана способность химических аналогов фс!1 (С?-АОБ, С12-АОБ и тирозола) направтенно модифицировать структуру ферментных белков, что приводит к повышению их с1абичьносги и изменению каталитической активности в сторону как активации, так и иш ибирования Установлена зависимость изменения вектора каталитической активное! и модифицированных АОБ ферментных белков от структуры и концентрации АОБ как лиганда Обнаружена

корреляция между повышением каталитической активности и снижением гидрофобное™ образующихся комплексов «фермент-АОБ» (4) Впервые проведен анализ продуктов окисления С7-АОБ и С|2-АОБ. полученных в результате их функционирования как ловушек АФК. образующихся в различных условиях (у-облучение. фото- и химическое окисление) Показано многостадийное окисление АОБ с образованием большого числа окисленных мономеров продуктов их конденсации и полимеров, более полярных, чем нативные АОБ (5) Впервые установлено, что продукты окисления АОБ, также как нативные АОБ, обладают свойствами структурных модификаторов ферментов и обуславливают изменение их каталитической активности сопряженно со стабилизацией макромолекул Показано, что продукты окисления С,-АОБ и С|2-АОБ более активны как химические шапероны. чем нативные АОБ

Практическая ценность работы. (1) Полученные в работе результаты могут быть использованы' для разработки эффективных способов антиоксидантной защиты про- и эука-риошческих организмов; дтя совершенствования методов борьбы с микробной контаминацией и биообрастанием; для направленной регуляции роста промышленных штаммов

(2) Разработан способ стабилизации и направленной модуляции катали i ической активности ферменюв на основе использования в качестве структурных модификаюров белков химических анало! ов фс^ На разработанный способ подготовлена и заявлена патент ная документация

(3) Разрабо1ан способ высокоэффективного солодорашепия, основанный на применении химических аналогов фс), в качестве регуляторов ферментативной активное! и прорастающего зерна и одновременно для дсконтаминации ячменя от фитопатогенной микрофлоры На разработанный способ получен патент РФ

Апробация работы. Результаты работы были представлены на 1-ой Всероссийской конференции «Прикладные аспекты химии высоких энергий» (Москва, 2001); 3-ей Международной конференции по стабилизации белка "Biocatalyst stability" (Тулуза, Франция, 2002); V Симпозиуме «Химия протеолитических ферментов» (Москва. 2002); 1-ом Международном KOI irpecce «Био 1ехнология — состояние и перепек гивы развития» (Москва, 2002); Всероссийской научно-технической конференции-выставке «Высокоэффективные пищевые технологии, методы и средс1ва для их реализации» (Москва, 2003), 35lh COSPAR Scientific Assembly (Парил, Франция, 2004).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 14 работ, из них 6 с i a i ей и 8 тезисов Также подюювлены и заявлены 2 патеша, получено 1 положительное решение (патент РФ № 2002124631/13 (026166)).

Структура диссертации. Диссертация изложена на 178 страницах и состой i из введения, обзора литературы, экспериментальной час1и, заключения, выводов и списка литературы, включающего 297 работ отечественных и зарубежных авторов Диссертация иллюстрирована 7 тблицами и 67 рисунками

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объекты исследования. Бактерии Mia ос ne eus lutein-, штамм 13267 NCIMB культивировали на мясопептонном бульоне (МПБ) и синтетической питательной среде с лактатом лития [Мулюкин с соавт , 1996] Дрожжи Saccharomу ces ceievisiae, m гамм 380 ВКМ выращивали на ячменном сусле (3,5° Баллинга) Инокулят, культуру фазы линейного роста, вносили в количестве, дающем начальную оптическую плотность клеточной суспензии 0.2 (Specord) Кулыивированис проводили в колбах на 250 мл (50 мл среды) или 750 мл (250 мл среды) на качалке (140 об/мин) при температуре 28°С.

Микробиологические методы. Оптическую плотность (ОП) клеточной суспензии измеряли нефелометрически на спектрофоюмефе "Specord М-400, Jena" (ФРГ) (?. = 650 нм, 1 = 10 мм). Массу сухих клеток (МСК) определяли после их высушивания до посюянного веса в течение 24 часов при температуре 105°С. Жизнеспособность клеток определяли по количеству колониеобразующих единиц (КОЕ) при высеве клеточных суспензий из ряда разведений на агаризованные среды Термоусгойчивость клеток определяли после npoipeea клеточных суспензий в ультра1ермос1а1е "UV-10" при температурах 45°, 60°, 70°С в течение 10-15 мин с последующим определением ОП клеточной суспензии и числа КОЕ. Радиоустойчивость клеток определяли по сохранению ими жизнеспособности (КОЕ) через 30 мин и 2 часа после у-облучения ишенсивностью 194 рад/с (установка ГУРХ 100000. у-а'Со). Устойчивость дрожжей к сишлешому кислороду СО,) определяли в клетках, фогосенсибилизированных хлорином е6, при их облучении монохроматическим лазером 662 нм (20 мВт/см?) [Peng et al., 1997] с последующим определением числа КОЕ Микроскопические наблюдения проводили в микроскопе "Amplival" (Германия) с фазово-контрастным усфойством.

Биохимические и физико-химические методы анализа. Выделение микробных алкилоксибензолов проводили, как описано ранее [Светличный с соавт , 1986] Концентрацию АОБ в образцах определяли с помощью колориметрической реакции с диазониевым производным 3,3'-диметоксибензидина (реактивом Fast Blue В Salt diazoti7ed— FBB, Sigma) [Tluscik et al , 1981] Количество белка определяли по методу Лоури [Lowry et al., 1951]; с помощью колориметрической реакции с Кумаси синим (Fluka) [Bradford, 1976]. Количество редуцирующих веществ определяли с помощью колориметрической реакции с 3,5-динитросалиниловой кислотой (Fluka) [Miller. 1959] В качестве химических аналогов факторов d, использовали алкилрезорцины С7-АОБ и С,,-АОБ, а также 2-(4-парагидроксифенил)-этан-1-ол (тирозол), синтезированные в МИТХТ им M В. Ломоносова со степенью чистоты 99,9% Эти соединения вносили в реакционные среды в виде раствора в этаноле так. чтобы конечная концентрация спирта в реакционной среде составляла 0,05% (об/об), или в виде водорастворимых К-солей Активность трипсина (Sigma) определяли модифицированным методом Ансона [Грачева с соавт , 1982], где мерой активности являлась скорость накопления продуктов гидролиза казеина,

не осаждаемых трихлоруксусной кислотой (ТХУ); по скорости гидролиза этилового эфира 1чГ-бензоил-Ь-аргинина (ВАЕЕ) (Sigma) Значения Кт и Утач трипсина были определены из зависимостей Лайнуивера-Бэрка Активность а- и ß-амилаз (Fluka) определяли по количеству образующихся при !идролизе крахмала редуцирующих веществ [Грачева с соавт., 1982]. Вязкость растворов белков определяли вискозиметрическим методом [Алейникова, Рубцова, 1988] Степень набухания белка определяли по модифицированной методике [Зимон, Лещенко, 2001]. Гель-фильтрацию pací воров белков проводили на колонке (35.0x2,5 см), заполненной сефадексом G-75 (Chemapol) Показатель гидрофобное! и белка (ПГ) определяли по модифицированной методике [Серебрякова с соавт . 2002], i де в качестве гидрофобной фазы использовали хлороформ. Спектры поглощения растворов АОБ регистрировали на спектрофотометре "Hitachi 550" (Япония). Исследование окисленных растворов АОБ проводили методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) на жидкостном хроматографе "Star" (Varían, США) Исследование продуктов окисления АОБ методом хромато-масс-спектрометрии (ХМС) проводили на спектрометре модели 597^ с газовым хроматографом модели 6890 (Hewlett Packard, США) Идентификацию разделенных веществ проводили с использованием масс-спектральных библиотек NIST98 и Wiley275.

Статистический анализ проводили стандартными магматическими методами (t-тесг Стыодеита) в программе Microsoft Excel-2000 Критерий вероятности Р<0,05 принимачи достаточным для достоверной разницы между опытной и контрольной группами данных

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Глава 1. Реакция бактериальной культуры Micrococcus luteus на стрессовые воздействия 7. 1. Влияние теплового шока па рост и жизнеспособность М. luteus

Температура сущес i венно влияет на скорость роста и размножения микроорганизмов Резкие колебания (шоковое воздействие) температуры оказывают гораздо более нсбла1 оприят-ное действие на клегки. чем ее постепенное изменение или постоянное действие пониженных или повышенных температур В наших экспериментах были подобраны такие условия термообработки (температура и время экспозиции), которые не вызывали летального эффекта в отношении исследуемой ку муры, но ингибировали се рос i В качестве объекта исследования испо 1ь-зовали бак!ерии М luteus так как фс^ у них представлен АОБ класса алкилрезорцинов, которые можно определять количественно в высокоспецифичпой реакции с реактивом FBB [Мулюкин с соавт.. 1996]. Об эффективности стрессового воздействия судили по изменению ОП культуры и числа КОЕ После термообработки при 45°С кулыуры фазы линейного роста, выращенной на син iei и ческой среде, доля оставшихся жизнеспособными клеток составила 40,8% (2.4x10* КОЕ/мл) от контроля, не подвергавшегося тепловой обработке (7,8x108 КОЕ/мл), тогда как действие более высоких 1емператур приводило к практически полной гибели культуры Поэтому для дальнейших экспериментов был выбран режим термообработки при 45°С, 15 мин

Поведение культур М luteum в ответ на тепловой шок зависело как от их возраста, так и от среды роста После воздействия на культуру, экспоненциально растущую на синтетической питательной среде, отмечено снижение ОП от 2,4 до 1,8 ед. с дальнейшим возобновлением роста, тогда как в тех же условиях в культуре, растущей на богатой среде (МПБ), наблюдалась только временная остановка деления клеток, после чего рост возобновлялся на короткий период и культура переходила в стационарную фазу на 2 часа раньше, чем контрольная (рис 1а). Зависимость терморезистентности клеток от среды их роста объясняется тем, что богатая среда МПБ содержит низкомолекулярные вещества (аминокислоты, полиолы), которые могут обладать функциями естественных химических шаперонов [Welch. Brown, 1996] и проявляв, вследствие этого, свойства стрессопроГекторов.

При сравнительном анализе терморезистентности бактерий М lutein (выращенных на синтетической питательной среде) различного физиологического возраста выявлено, что меньшей устойчивостью (термообработка 45°С, 15 мин) обладали клетки кучьтуры фазы линейного роста, для которых наблюдалось более выраженное, чем для клеток фазы замедленного роста снижение величины ОП клеточной суспензии (соответственно, на 25% и 7%) Аналогичным образом, растущие на богатой органической среде клетки культуры фазы линейного роста были более чувствительны к термошоку, чем клетки фазы замедленного рост а Это выражалось в сокращении периода задержки роста культуры по мере ее старения при одной и той же дозе воздействия Повышенную устойчивость к термошоку клеток М Intens более поздних фаз роста можно объяснить тем, что в процессе развития бактериальной культуры в ней происходит накопление низкомолекулярных метаболитов с возможными адаптогенными функциями, в том числе АОБ [Светличный с соавт , 1986; Мулюкин с соавт , 1996]

1.2. Влияние теплового шока на динамику накопления алкилоксибензолов в культуре М. intens

Исходя из того, что прекращение деления у микроорганизмов — это генетически детерминированный механизм зашиты от небтагоприятных факторов окружающей среды [Lange. Hengge-Aronis, 1991: Morris, 1993; Фсофилова. 2003]. а эндогенной причиной прекращения роста микробной культуры и перехода к стационарной фазе является накопление фс!, (АОБ) доопределенного порогового уровня [Светличный с соавт , 1986]. можно было ожидать, что при воздействии на растущую культуру стрессора (повышенной температуры) динамика АОБ в культуре микрококка будет меняться Учитывая результаты предыдущей серии экспериментов, температурному шоку (45°С, 15 мин) подвергали бактериальную культуру фазы линейною роста, развивающуюся на МПБ (рис 1а). Как видно из полученных данных (рис. 16), в контрольных вариантах наблюдалось возрастание валового (на единицу объема) уровня АОБ как в клетках, так и в культуральной жидкости развивающейся культуры, что подтверждает закономерности динамики биосинтеза этих ауторегуляторов, выявленные ранее [Эль-Регистан, 1988] В опытных культурах во время остановки роста после воздействия температуры количество внеклеточных АОБ продолжало нарастать, так же, как и в контроле, но с большей скоростью, тогда как в клетках их концентрация не менялась Выход культуры из стресса

оп

1 1,2

8 [_

0,8

7 О

2 0,4

1,2

0,8

и 0,4

■ (б) уу ""М-кж(о)

5-кл(кУ" Г 6-кл(о)

. (в) 4-кж(оЬз 6-кл(о)

З-кж(к) у* 5-кл(к)

10 12 Время, ч

Рис 1. Влияние 1еплово1 о шока на изменение ОП (а) и динамики накоппения АОБ в кулыуре М \uteus, в расчете на единицу объема культуры, мг/л (б) и единицу массы клеток, мг/гМСК (в): 1 — конIроль; 2 — про! ревание при 45°С в течение 15 мин: 3 - содержание внекле1 очных АОБ в контрольном варианте. 4 содержание внеклеточных АОБ после термообработки: 5 — содержание вну фиклеточных АОБ в контрольном варианте; 6 — содержание внутриклеточных АОБ после термообработки; 7 — стабилизация клеток С,-АОБ 8 мМ за 30 мин до шока; 8 — стабилизация клеток С7-АОБ 12 мМ за 30 мин до шока.

сопровождался резкими изменениями концентрации АОБ, динамика которых в культуральной

жидкости и клетках имела противоположный характер' уровень АОБ в клетках возрастал

при снижении их содержания в культуральной жидкости При пересчете количества АОБ

на единицу массы кчеток. что отражает как продуктивность ауторегуляторов в стрессовой

ситуации, так и величину их аккумуляции в клетках, выход культуры из шока сопровождался

заметным перераспределением АОБ' в культуральной жидкости их количество падало, а в

клетках возрастало и было достоверно больше, чем в контроле (рис 1 в) Полученные данные

позволили заключить, что во время формирования стрессового ответа пул внеклеточных

АОБ служит для их перераспределения между клетками популяции

Важно отметить, что в культуре, подвергнутой шоку, удельное количество суммарных

(внутри- и внеклеточных) АОБ увеличилось на 35% по сравнению с контролем, что отражает

возросшую продуктивность клеток микрококка как их реакцию на стрессовое воздействие

(табл 1). Эта разница в уровне суммарных АОБ и, подчеркнем, их концентраций в клетках

опытной и контрольной культур (рис. 1в) объясняет более ранний переход опытной культуры

к стационарной фазе (рис. 1а).

Таблица 1. Суммарное содержание (вне- и внутриклеточных) АОБ на единицу массы (мт /г МСК)

Время отбора пробы, ч роста Количество АОБ, мг/м МСК (%)

контроль опыт

до термообработки, 5 ч 0,95 ±0,05 (100) 0,95 ±0,05 (100)

после термошока, 6 ч 1,06 ±0,05 (100) 1,43 ±0,07(135)

выход на стационар, 11 ч 1,24 ±0,06 (100) 1,53 ± 0,07 (123)

Анализ приведенных результатов позволил предположить, что повышение концентрации АОБ в культуре за счет дополнительного внесения химического аналога фс^ будет способствовать защите клеток от последующих стрессовых воздействий Адапто1 енные функции алкилоксибензолов исследовали в опытах с прединкубацией культуры М lutein фазы линейно! о роста с химическим аналогом фс!1 этих бактерий С7-АОБ Аналог вносили за 30 мин до 1емпературного воздействия (45°С, 15 мин) в концентрациях 4-12 мМ, которые в предварит ельных опытах не оказывали существенного влияния на рост культуры При исследовании динамики рос i а опытных культур было показано, что протекторное действие С?-АОБ имело концентрационную зависимость (рис 1а) Его внесение в количестве 4-8 мМ не оказывало действснно1 о защит ного эффекта, тогда как в более высоких дозах — 12 мМ С7-АОБ имел выраженное протекторное действие развитие культур после термообработки проходило без задержки роста (наблюдавшейся в контрольной культуре, подверг нугой тепловому шоку), хотя и с более низкой скоростью.

Таким образом, полученные результаты позволили сделать вывод об индуцированной стрессором стимуляции синтеза микробных АОБ, участвующих в формировании о гвет а кчеток пролиферирующей культуры на «незапланированные» стрессы Возрастание концентраций АОБ в культуре, подвергаемой стрессовому воздействию, имеет защитный эффект, который выражается в повышении устойчивости клеток, сохранении их метаболической активности и способности к пролиферации Следует отметить, что защитный эффект АОБ помимо их собственно ст абилизирующего действия связан с ускоренным переходом культуры в стационарную фазу, характеризующуюся повышением общей устойчивости клеток за счет индукции rpoS-регулона, который включае! систему генов ответа на стрессы [Lange. Hengge-Aronis, 1991: Loewen, Hengge-Aronis, 1994]

Глава 2. Защита дрожжей Saccharomyces cerevisiac алкилоксибензолами от окислительного стресса

Температурный шок у микроорганизмов сопровождается избыточным накоплением АФК, коюрые индуцируют окистительпый стресс [Benov, Fridovich, 1995; Davidson et al . 1996, Sugiyama et al , 2000; Смирнова с соавт., 2001; Рихванов с соавт., 2003]. Результаты исследований. показавшие участие АОБ в повышении устойчивости бактерий М lutein к повреждающему действию темпера i уры, обусловили целесообразность изучения их возможных протекторных функций в защше микробных клеток от прямого окислительного стресса.

В качестве объекта исследования были взяты эукариотические микроорганизмы — дрожжи S ceievniae, так как, во-первых, для них была установлена способность синтезировать аутоиндукторы анабиоза производные оксибензолов [Батраков с соавт . 1993], во-вторых, ранее было показано видонеспецифическое участие АОБ (на примере гекситрезорцина) в защите клеток эукариот(фибробластов) от действия биологических и химических токсиканюв

[Ильинская с соавт . 2000]. Окислительный стресс в клетках дрожжей индуцировали: (1) •/-облучением, которое помимо прямого повреждающего биологические структуры действия вызывало образование множественных форм АФК в результате радиолиза воды; (2) фоюокислением сенсибилизированных хлорином ей клеток дрожжей

2.1. Защита 5. сегегтае от радиационного поражения

В опытах по изучению радиопротек горных функций АОБ в отношении клеток 5 се-/е\'шае использовали С7-АОБ в концентрациях 0,8-12,9 мМ, выбрав время его внесения в культуру за 30 мин до стрессового воздействия. Пробы, отобранные из экспоненциально растущей кулы^ры. прединкубированные с С7-АОБ, 1акже как и контрольные (без АОБ), подвергали у-облучению дозой 50 крад и затем инкубировали при комнатной температуре без принудительной аэрации Через 30 мин и 2 часа после дейсгвия радиации определяли титр жизнеспособных клеюк дрожжей (КОЕ).

Было применено несколько алгоритмов расчета, учитывающих как влияние С?-АОБ на рост дрожжевых культур, так и их абсолю I ный протекторный эффект (табл 2). Было обнаружено, что С,-АОБ в концентрациях, стимулировавших рост дрожжей (0,8-8,0 мМ) (табл 2, столбец 2), не защищал клетки от облучения и даже ускорял их гибель (табл 2, сюлбцы 3,4 — число КОЕ на 11 -24% меньше, чем в контроле), ч I о подтверждает наблюдения об обрат ной зависимости стрессоустойчивости и скорости роста микробных клеток Выраженный про I ект орный эффект АОБ (число КОЕ через 30 мин после облучения на 17-34° о больше, чем в кон фоле) наблюдался при концентрациях, больших 8,0 мМ, не влиявших на рост культур (табл.2, сюлбен 4)

Таблица 2. Число жизнеспособных клеток 5 сегегтае, предварительно стабилизированных АОБ, через 30 мин и 2 часа после воздействия у-радиации (50 крад)

Концентрация АОБ, мМ До облучения Через 30 мин после облучения Через 2 часа после облучения

КОЕ/млхЮ7 (%) КОЕ/млхЮ7 (%) Доля выживших. % КОЕ/млхЮ7 (%) Доля выживших, % Отн. прирост клеюк, % Абс. протекторный эффект, %

№ столбца 2 3 4 5 6 7 8

0 5,7010,25(100) 1,6510,11(28,9) 100 1,8610,13(32,6) 100 112,7 100

0.8 5,44+0,37(100) 1,5810,09(24.5) 84.6 2,3310,08 (36,2) 110,9 147,5 125,3

4,0 7,0510,45(100) 1,8310,07(26,0) 89,8 2,5510,12(36,2) 110,9 139,3 137,1

8,0 8,9510,57(100) 1,9810.12(22.1) 76,3 2,70+0,14(30,2) 92,5 136,4 145,3

9.7 5,9310,46(100) 2,0310,14(34,2) 118,1 2,2610,11 (38,1) 116,8 111,3 121,5

11,3 5.0510,34(100) 2,0610,15(34,0) 117.5 2,1310,09(35,2) 107,9 103,4 114,5

12,9 4.6710.17(100) 1.8210.11 (39.0) 134.7 1,93+0.10 (41,3)1 126,5 106,0 103,8

Примечание' показатели в столбце 2 приничакмея за 100% при вычислении значений в столбцах 3 и 5, в столбцах 4 и 6 за 100% принимается первое значение (%) столбцов 3 и 5. соответственно; при вычислении значений в сюлбце 7 используются показатели в столбце 5 и за 100% принимаются соо1ве!ствующие показатели в столбце 3; значения в столбце 8 рассчитываются из данных столбца 5, принимая за 100% первое

Другим важным показателем защитного эффекта АОБ от повреждающего действия радиации было их влияние на сохранение способности клеток к размножению, о чем судили по учету числа КОЕ через 2 часа после облучения, когда колонии формировались из клеток, оставшихся жизнеспособными, а также из отделившихся почек Титр жизнеспособных клеток в вариантах внесения С7-АОБ в концентрациях 0,8-8,0 мМ был существенно выше (табл 2, столбцы 5,6) по сравнению с соответствующими показателями, полученными через 30 мин после облучения (табл.2, столбцы 3,4). При этом протекторный эффект С7-АОБ наблюдали во всем диапазоне испытанных концентраций — 0,8-12,9 мМ, хотя он был больше (число КОЕ на 16-26% больше, чем в контроле) в вариантах с 9,7-12,9 мМ АОБ, так же, как и при учете КОЕ через 30 мин При расчетах относительного прироста клеток, защищенных АОБ. за период 30 мин-2 ч после облучения (табл 2, столбец 7), а также абсолютного протекторного эффекта АОБ, 1де за 100% брали чисто КОЕ в варианте без внесения АОБ (табл 2, столбец 8), лучшиерезулыаты (на 21-45% больше, чем в контроле) были получены в опьнах с использованием АОБ в концентрациях 0,8-9.7 мМ Таким образом, при определении адаптогенных функций АОБ был зафиксирован как непосредственный протекторный эффект, так и защитное действие АОБ на сохранение способности дрожжей к размножению

2.2. Защита S. cerevisiae от фотодинамического повреждения В другой серии экспериментов в качестве повреждающего агента был применен синглетный кислород СО,), который генерировался в фотосенсибилизированных дрожжевых клетках, обработанных хлорином е6, при их облучении лазером (662 нм)* В культуры дрожжей 5 cei evisiae фапл линейного роста контрольных и опытных вариантов вносили фотосенсибилизатор (ФС) хлорин е в концентрации 10 мкг/л. в опытные варианты, кроме того, вносили С7-АОБ в диапазоне концентраций от 1,6 до 16 мМ Контрольные и опытные культуры прединкубировали в течение 30 мин, после чего клетки облучали монохроматическим лазерным светом с) - 662 нм Защитный эффект в этом случае, также как и радиопротек горный, зависел от концентрации С;-АОБ оптимальной была концентрация 8.0 мМ. при которой один и тот же процент погибших ктеюк дрожжей (76%) вызывала доза обтучения в 3,5 раза большая (12 Дж/см2), чем в суспензии незащищенных клеток (3,5 Дж/см2) (рис. 2)

Рис. 2. Дозовые кривые выживаемости клеюк дрожжей S cerevisiae, обработанных за 30 мин до облучения (/. = 662 нм). I — только ФС хлорином е ; 2 — ФС и С7-АОБ(8 мМ); 3 — 76% noi ибших клеток в контрольной культуре.

* Работа проводитась совместно с сотрудниками кафедры биофизики МГУ им М В Ломоносова кбн М Г Стаховской и к б н НС Беленикиной. за что автор выражает им большую благодарность.

Таким образом, АОБ являются эффективными перехватчиками АФК разной природы, образующихся как радиационно-химически, так и фотохимически Отметим, что протекторный эффект феиольных соединений против действия синглетного кислорода показан впервые Известны два основных природных механизма формирования стрессового ответа — повышение стабильности клеточных компонентов к повреждающим воздействиям и антиоксидантная защита В качестве стабилизаторов могу г выступать молекулярные шапероны, представляющие собой белки, в том числе шоковые, комплементарные по структуре защищаемым протеинам [Van der Vies. Georgopoulos. 1996], а также низкомолекулярные химические шапероны, коюрые за счет слабых физико-химических взаимодействий могут образовывать лабильные комплексы с макромолекулами, стабилизируя их структуру и способствуя рассеянию энергии повреждения [Welch. Brown, 1996]. Другой защитный механизм включает перехват АФК антиоксидантными ферментами или легко окисляющимися веществами В частности, ранее была показана способное i ь некоторых фенольных соединений служить ловушками активных форм азота и кислорода [Эммануэль, 1968; Van der Meulen et al, 1997: Peng et al, 1997: Зенков ссоавт ,2001]. Продемонстрированное протекторное действие АОБ при тепловом и окислительном шоке, индуцированном действием у-радиации или синглетного кислорода, можно объяснить этими свойствами АОБ Поэтому в следующей части работы более подробно рассмотрены функции АОБ как химических шаперонов и ангиоксидантов.

Глава 3. Функционирование алкилоксибензолов в качестве структурных модификаторов и стабилизаторов белков

При выяснении механизмов действия АОБ. которые контролируют переход микробных культур в стационарную фазу и образование покоящихся форм, было обнаружено, что на молекулярном уровне эти ауторегуляторы (на примере гсксилрезорцина) участвуют в посттрансляционной модификации сфуктуры ферментов с образованием тсрмостабильных и малоактивных комплексов, что позволило отнести АОБ к химическим шаперонам [Беспалов с соавг., 2000; Ко таков с соавт , 2000] В наших исследованиях бьп расширен спектр гомологов АОБ как лигапдов, были апробированы индивидуальные С|:-АОБ, С?-АОБ и 2-(4-ларагидрокси-фенил)-этан-1-ол (тирозол). различающиеся числом и положением заместителей (гидроксиль-ных групп) в арома i ическом кольце и длиной алкильного радикала, что определяет степень гидрофобности их молекул и влияе! на характер взаимодействия с молекулами биополимеров В качестве моделей белков были использованы коммерческие препараты ферментов высокой степени очисч ки различного происхождения, бактериального — а-амилаза (КФ 3.2 1 1) (Fluka), растительною— р-амилаза(КФЗ 2.1 2) (Fluka) и животного трипсин (КФ 3 4.21 4) (Sigma) Учитывая, что для «созревания» новых конформеров белков в их комплексах с АОБ требуется неко горое время, смесь растворов ферментов и АОБ предвари i ельно инкубировали в течение разных временных интервалов при комнатной температуре, а затем вносили в реакционные смеси В работе использовали более «хнвегствующие физиологическим условиям, чем ранее применявшиеся спиртовые растворы, формы внесения АОБ — водорастворимые К-соли

3.1. Модификация ферментов С, ¿-АОБ

В экспериментах с гидрофобным гомологом С12-АОБ было установлено, что его ком-плексообразование с трипсином и ß-амилазой приводит к модификации структуры ферментов, о чем судили по изменению их каталитической активности [Shinto, Hiraki, 1994; Hage et al , 2001] Действие АОБ имело концентрационную зависимость в диапазоне низких концентраций (0,01-0,2 мМ) этот гомолог незначительно повышал каталитическую активность (на 10-30% от контроля) в зависимости от времени прединкубапии и структуры фермен га, а при высоких концентрациях имел ингибирующий эффект (рис 3). Сопряженно с изменением каталитической активиости ферментов модификация их структуры обуславливала развитие устойчивости белков к денатурирующим воздействиям (pH- и тепловой денатурации, у-радиации) В случае прединкубапии трипсина с С|2-АОБ (40 мин) до тепловой обработки (60°С) наблюдался гермопротекторный эффект в области концентраций как повышающих, так и понижающих активность фермен та вне зависимости от длительности прогревания (рис 4). а предварительная обработ ка ß-амилазы С, ,-АОБ в концентрациях 0,05-0,3 мМ повышала ее радиостабильность (рис. 5)

Таким образом, С|2-АОБ в широком диапазоне концентраций стабилизировал структуру ферментных белков, повышая их термо- и радиостабильность, и сопряженно с этим влиял на каталитическую активность Отметим, что вектор изменения фермен га т ивной активности (стимуляция ингибирование) при комплексообразовании белков с С12-АОБ зависел от времени их взаимодействия и концентрации АОБ как лиганда и преимущественно имел ингибирующий характер

При объяснении полученных результа гов следует принимать во внимание, что ком-плексообразование белка с низкомолекупярными химическими шаперонами, в том числе с АОБ, может иметь несколько следствий Это — изменения пространственной ориентации функционапьных i рупп и организации белковых цепей в области активного центра: изменения поверхностного заряда белковой глобулы: а также изменения сольватиой оболочки белка Известно, что сахара или полиолы. а также осморегуляторы. относящиеся к группе химических шаперонов и взаимодействующие с белками посредством водородных связей, в основном, способствуют образованию вокруг молекулы белка сольватной оболочки которая отличается по своим свойствам от объемной водной фазы [Schein 1990] В нашем случае, в низких концентрациях С|2-АОБ. образующий комплексы с белками за счет водородных связей при участии гидроксильных групп ароматического ядра, также может способствовать изменениям соль-ватной оболочки фермента и. кроме того реорганизации бечковых цепей по типу «скрепок», вследствие чего повышается стабильность белка без существенного изменения каталитической активности Однако, при повышении концентраций С12-АОБ сто комплексообразование с белком в большей степени будет осуществляться за счет гидрофобных взаимодействий при участии алкильных радикалов Это может привести к большим конформационным перестрой-

Активность, % 120 100

60 40 20 0

Рис. 3. Концентрационная зависимость действия С12-АОБ на изменение протеолити-ческой активности трипсина*, время пред-инкубации. 1 — 10 мин; 2-40 мин.

* Действие С]2-АОБ на активность р-амилазы имело аналогичный характер.

•С*.

0,5

Активность, (ед акт/мг бетка^Ю3 0,8

1,5 2

С|2-АОБ,ММ □ - 1, Активность, 0-2

0,6 0,4 0,2 0

_ а a

Л. \

1-3

(ед акт/мг белка)х 10 1,5

1 ii ■

0,025

0,05 0,25 0,5 С12-АОБ, мМ

облучения

0,2 0,3 Cn-АОБ, чМ

Рис 4 Термостабильность трипсина в ком- Рис 5 Радиостабильность р-амитазы в комплексе с С|2-АОБ, время прединкубации 40 плексесС|2-АОБ,дозау-облучения5.82крад мин, длительность прогревания при 60°С: 1 Время прединкубации белка с АОБ: 1 — без

— без прогревания (контроль); 2 10 мин; 3 добавления АОБ (контроль); 2 — 10 мин; 3

— 20 мин. —60 мин.

кам в макромолекуле, ее «разворачиванию», снижению критического числа молекул воды в гидратной оболочке белковой глобулы, что совокупно обуславливает повышение ее гидрофобное™ и. как следствие, резкую потерю активности [Белова с соавт . 1991, Пожарский. Зснченко, 1998; Zheng. Ornstein, 1996; Klibanov, 1997] Но. в то же время, предотвращение локальных конформационных изменений в денатурирующих условиях за счет «ужесточения» структуры фермента в комплексах с С |2-АОБ будет приводить к усилению стабилизирующих эффектов [Baskakov. Bolen. 1998' Qu et al . 1998; Варфоломеев, Гуревич. 1999] 3.2. Модификация ферментов С-АОБ Показанное сопряжение возрастания стабильности модифицированных АОБ ферментных белков с ингибированием их каталитической активности отмечается в подавляющем большинстве работ и патентов, хотя теоретически не является обязательным Напомним что в экспериментах по стрессоустойчивости микроорганизмов, описанных в главе 2. было обнаружено рост-стимулирующее (в определенном концентрационном интервале) действие на дрожжи другого химического аналога фс!( С7-АОБ В этом случае может иметь место механизм стабилизации белковых структур без снижения их функциональной активности Подобные эффекты сопряженное повышение стабильности и каталитической активности ферментов (трипсина, а- и Р-амилаз) in vitro, были выявлены нами в серии экспериментов.

где испотьзовали С7-АОБ, отличающийся от гомолога С|2-АОБ меньшим размером алкилыюго радикала и, вследствие этого, меньшей гидрофобностью При стабилизации исследуемых ферментов С,-АОБ как в случае с С12-АОБ, наблюдалась нелинейная зависимость изменения их активности в широком диапазоне концентраций лиганда (рис 6) Концентрации С -АОБ, повышающие ферментативные активности на 50"о, различались для разных ферментов и составляли для трипсина — 8,0 мМ, а-амилазы 0,8 мМ. ß-амилазы -1.6мМ(табл 3) Изменения активное! и модифицированного фермента зависели также от продолжительности взаимодейс i вия с С7-АОБ. требуемого для «созревания» hoboi о конформера (рис 6). Осцилла-юрный характер концентрационной зависимое! и действия ДОБ. достоверно подтвержденный в опытах с «малым шагом» изменения концентраций, по-видимому, отражает образование нескольких конформеров фермента

Сопряженно со стимуляцией активности у модифицированных С,-АОБ ферментов наблюдалось повышение термо- и радиостабильнос ги Так, значения протеолитической активности стабилизированного С7-АОБ трипсина после его термообработки были значительно выше, чем в контрольных вариантах (рис. 7). Диапазон эффективных концентраций С,-АОБ составил 6,4-12,9 мМ, что сопоставимо с данными, полученными в экспериментах по защите ■S ceievisiae oi окислительного стресса (8-13 мМ) и в опьиах по термопротекции М Intens, i де С7-АОБ защищал бактериальные клетки в концентрации 12 мМ. В условиях у-облучения активность трипсина в комплексах с С7-АОБ не только не снижалась, вследствие действия радиации, но даже превышала активность в контроле (рис 8). Полученные результаты объяс-

Таблица 3 Влияние С;-АОБ и продуктов его окисления (доза у-облучения 0.2 Мрад) на изменение каталитической активности трипсина, а- и р-амилаз (время прединкубации ферментов с АОБ 10 мин)

Концентрация С,-АОБ, мМ Активность, % к контролю

трипсин амилазы

прединкубация с нативным АОБ прединкубация с окисленным АОБ прединкубация с нативным АОБ прединкубация с окисленным АОБ

а-амилаза ß-амнлаза ß-ачилаза

0(контроль) 100 100 100 100 100

0,08 - - 112 119 -

0,16 - 122 121

0,32 - И1 129 -

0.64 - — 137 136 -

0,80 119 124 150 141 -

1,60 114 119 162 148 96

3,20 126 134 - 160 153

4.80 124 139 - 162 168

6,40 134 147 - 164 164

8,00 168 201 - 167 177

9,60 174 182 170 182

11.20 161 194 172 170

12.90 152 191 - 173 196

О 2 4 6 8 10 12

Су-АОБ, ММ

Рис 6 Влияние продолжительности прединкубации трипсина с С7-АОБ на его протеолити-ческую активность: 1 - 10 мин; 2-20 мин; 3-40 мин.

няготся тем, что при радиолизе растворов Сг-АОБ он окисляется, проявляя свои свойства антиоксиданта, с образованием продуктов, которые также обладают функциями химических шаперонов, что более подробно будет рассмотрено ниже Стабилизация структуры модифицированных ферментов при их комплексообразовании с С?-АОБ обуславливала существенное расширение температурного и рН диапазонов катализа, что продемонстрировали опыты, в которых ферментный катализ проводили при различных значениях температур и рН (табл 4) Обратим внимание, что рН оптимум (равно как и температурный оптимум) катализа не изменялся при стабилизации ферментов С;-АОБ (рис. 9) Это предполагает, что конформа-ционные изменения при взаимодействии белков с АОБ не затрагивают ионногенные группы активных центров ферментов [Березин. 1985: Варфоломеев. Гуревич, 1999]

Таким образом, в отличие от гидрофобного Ср-АОБ, более гидрофильный аналог фё! - С7-АОБ, в широком диапазоне концентраций обуславливал такие изменения структуры ферментных белков, в результате которых существенно стимулировалась их каталитическая активность при одновременном повышении устойчивости к денатурирующим воздействиям температуры, рН и у-радиации В литературе имеются сведения об изменениях конформации ферментов, связанных с их «суперактивностыо». но не в водных, а органических средах. Так. активность пероксидазы хрена, солюбилизованиой обращенными мицеллами диизооктил-сульфосукцината натрия в октане, превосходила в несколько раз активность фермента в воде при прочих равных условиях [Березин, 1985] В этом случае значительную роль отводят реакционной способности воды в микроокружении модифицированных ферментов за счет ее высокой подвижности или изменения кислотно-основных характеристик [Варфоломеев, Гуревич, 1999] В наших экспериментах молекулы С?-АОБ при взаимодействии с ферментами в водных растворах могут способствовать как реорганизации белковых цепей, так и изменениям сольватных оболочек белков и вследствие этого их стабилизации аналогично действию некоторых полиолов [Уо1кт, КНЬапоу, 1989] Вследствие этих взаимодействий будут меняться функциональные свойства воды, находящейся в микроокружении ферментов, тем самым способствуя повышению их каталитической активности Рипашою е! а1, 1978, 1980]

Активность,

(ед акт/мг белка)х103

1,2 0,8 0,4 0

и 1 ■-3

"L , 1, 1 1

Активность, (ед.акт/мг белка)х 10: 1,6

контрочь до оот\чения "контроль посте о,6л>чёния,

3,2

6,4

9,6 13 Ст-АОБ, мМ

Рис 7 Термостабильность трипсина в комплексе с С7-АОБ, время прединкубации 60 мин, длительность про1ревания при 60°С. 1 - без прогревания (контроль): 2 — 10 мин; 3 — 20 мин

Таблица 4 Влияние С7-АОБ на изменение температурного и рН диапазона катализа трипсина, а-и (5-амилаз (время прединкубации ферментов с АОБ 30 мин)

4,8

6,4

8 9,6

Ст-АОБ, чМ Рис 8 Радиостабильность трипсина в комплексе с С;-АОБ, время прединкубации 40 мин, доза у-облучения 12,7 крад 1 -активность необлученного трипсина: 2 активность облученного трипсина.

Фермент Концентрация С7-АОБ, мМ Диапазон температур*, °С " Диапазон pH*

трипсин 0 (контроль) 45 7,8

0,80 40-55 7,0-10,5

4,80 25-65

а-амилаза 0 (контроль) 55 6,9

0,64 44-55 5,2-7,4

1.60 23-65 5,0-7,5

3-амилаза 0 (контроль) 40 4,8

0,64 17-54 4,3-6,7

5.60 13-57 4.0-7.1

Активность, (сд акт/чг белка)х 10 2,5

* В указанных диапазонах акт ивности стабилизи- Рис 9. Действие С?-АОБ (время предин-рованных АОБ ферментов были равны ичи превы- кубации 30 мин) на изменение фермен-шячи значения их максимальной активности в тативной активности ß-амилазы при контроле (при оптимальных значениях температу- различных pH' 1 — контроль (без АОБ); рыирН) 2- 0,64 мМ; 3 — 5,6 мМ.

.?..?. Модификация трипсина тиром/лом

Ауюриуляторный ф<1! дрожжей S ceiensiae — 2-(4-гидроксифснил)этан-1-ол (гироадл) [Eai раков с соавт . 1993]. относится к производным оксибензолов, но в оижчие от АОБ — ф<11 бактерий, не имеет гидрофобного алкильного радикала и поз i ому более полярен [Schultz, 1987] Вследствие этого тирозол неспособен встраиваться в липидный бислой. но благодаря мачым размерам и тоской конфигурации кольца способен проникать в клетку через мембрану Было высказано предположение, что регуляторное действие тирозола на дыхание митохондрии. скорее Bcei о. обусловлено его непосредственным взаимодействием с дыхательными фермен [ами [Ненашев с соавт 1994] Прямые доказательства модификационных эффектов тирозола были получены нами на модельном ферменте (трипсине) в опытах т мио

Как и в экспериментах с АОБ действие тирозола зависело от концентрации, времени прединкубации с белком и имело нелинейный характер Тирозол повышал активность трипсина в наибольшей степени при концентрациях 6-10 мМ и времени прединкубации 10 мин (на 40-50% от 100% в контроле) При увеличении концентрации (11,6 мМ) и времени контакта (60 мин) наблюдалось ингибирование фермента (до 80% от 100% в контроле), что коррелирует с данными по его влиянию in vivo на дыхание клеток дрожжей [Батраков с соавт , 1993] Модификация трипсина тирозолом приводила к повышению термостабильности как в условиях проведения протеолиза при различных значениях температуры, так и при тепловой денатурации белка до гидролиза При этом не выявлено прямой корреляции между повышением стабильности и активности модифицированного тирозолом трипсина' высокие концентрации тирозола (8,7-11,6 мМ), которые не стимулировали активность (100-83% от 100% в контроле), в большой степени повышали ei о стабильность к тепловой денатурации (60°С)- в опытном варианте сохранялось 55-80% активности, тогда как в контроле — только 6-20%.

Выявление способности тирозола к структурной модификации и стабилизации ферментных белков, аналогичной эффектам С--АОБ, свидетельствует о схожести механизмов шаперонного действия двух структур фс^ бактерий и дрожжей Подчеркнем, что определяющее значение структуры стабилизирующего лиганда на изменение активности фермента обязательно корректируется его концентрацией Этим можно обьяснить различия в стрессовом ответе клеток культур разного физиологического возраста (см главу 1.1).

3.4. Изменение кинетических характеристик трипсина при комплексообразовании с А ОБ Различия в изменениях каталитической активности (стимуляция-ингибирование) стабилизированных АОБ/тирозолом ферментных белков, зависящие от гидрофобное™ и полярности используемою лиганда, предполагали соответствующие изменения физико-химических свойств образующихся комплексов «белок-АОБ» и поэтому их кинетических характеристик Эксперименты с модифицированным трипсином показали, что основные кинетические параметры (Кт и V ). позволяющие интерпретировать взаимодействия фермента с лигандом [Фёршт. 1980: Плакунов, 2001], изменялись различным образом при исполь-

Таблица 5 Влияние АОБ на изменение кинетических параметров трипсина (время прединкубации фермента с АОБ 40 мин)

Концентрация АОБ, мМ Km, (М) х 10"3 \'тач, (мкМ/минхмг) х 103

0 (контроль) 0,100±0,010 2,09±0,02

с12-аоб

0.005 0,100±0,002 1,82±0,03

0,25 0,099±0,003 1,40+0,02

С,-АОБ

0,32 0,100±0,004 2,42±0,11

3,20 0,098±0,006 3,73±0,08

зовании С,-АОБ или С12-АОБ как шаперонов (табл 5). При комплексообразовании белка как с С|2-АОБ, так и с С,-АОБ константа Кл| практически не изменялась и была равна Кт контро чьного варианта. Это свидетельствует о том, что при взаимодействии трипсина с АОБ не меняется конформапия активного центра биокатализатора и сохраняется сродство фермента к субстрат у Однако, скорое I и кат ализа модифицированных АОБ ферментов изменялись При использовании С12-АОБ значения Утлч снижались по сравнению с контролем, что позволило отнести взаимодействия 1рипсина с С|2-АОБ к типу неконкурентного ингибирования. Напротив. при использовании в качестве ли! анда С7-АОБ значения V существенно возрастали. Учитывая, что при этом Кт не менялась, можно полагать, что возрастание скорости ферментативной реакции (активация) происходит вследствие конформационных изменений в доменах, близких к активному центру, но не самого активного центра.

Таким образом, в комплексах с различными по степени гидрофобное!и АОБ образуются разные конформеры фермента, изменение каталитической активност и ко I орых имеет противоположные векторы — в сторону стимуляции или ингибирования. Такой механизм регуляции метаболических активностей клетки важен для гибкого физиотогическо1 о ответа пролиферирующей культуры в условиях стрессовых воздействии в сублстальном диапазоне

Глава 4. Физико-химические свойства белков, модифицированных алкилоксибензолами

Изменения кинетических параметров ферментов в их комплексах с различными по гидрофобное™ АОБ коррелировали с изменениями таких физико-химических характеристик биополимеров, как вязкое! ь, способность к набуханию в водных растворах и степень гидрофоб-ности, что бы то показано в модельных экспериментах Степень гидрофильности/гидрофобност и модельных белков, модифицированных АОБ, определяли методом их перераспределения в бифазной системе «вода-ор1 анический растворитель (хлороформ)», предварительно установив, что хлороформ не оказывав! иш ибирующего действия на ферментативные активности белков (трипсина). Показатети гидрофобности (ПГ) у всех нативпых исследуемых белков — казеина, альбумина, трипсина, были равны 20-30%, что определялось как количество (%) белка, перешедшего из водного раствора в 1идрофобную фазу. При взаимодеиствии как ферментных, так и неферментных белков с С;-АОБ происходило снижение ПГ белков При этом повышение каталитическои активное! и модифицированных С7-АОБ ферментов (трипсина) было сопряжено с увеличением гидрофильное!и белковых макромолекул в широком интервале концентраций лшанда (рис. 10) В вариан!ах модификации белков С]2-АОБ наблюдалась обратная картина повышение с i епени i идрофобнос ги трипсина сопровождалось ингибированием каталитической активносш (рис. 11) Обнаруженная корреляция между изменением степени гидрофобности ферменшых белков и модуляцией их активности делает возможной направленную регуляцию эффекшвности функционирования белков

о 2s? о 2 5?

X 1?1,2 •зС ■С 40 2 X _ U 0,8 ж ^ ■ с 40

ff J 0,9 ■ 30 ' Lh» - -f J 0,6 ■ 30

II 0,6 s £ • 20 ' §|о,4 5 * - 20

£ ч0,3 < а ■ 10 1 5 5 0,2 ■ 10

0 - ' ' ' ' ' Ip^*— 0 -й-

О 0,2 0,4 0,60,8 1 4 6 8 10 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1

С7-ЛОБ,мМ С12-АОБ, ММ

Рис 10 Концентрационная зависимость Рис 11. Концентрационная зависимость действия С7-АОБ на изменения- 1 — пока- действия С,,-АОБ на изменения- 1 - показателя гидрофобности трипсина; 2 — акти- зателя гидрофобное™ трипсина: 2 — активности трипсина Время прединкубации вности 1рипсина Время прединкубации белка с АОБ 10 мин белка с АОБ 60 мин.

Таким образом, различающиеся гидрофобпостью АОБ (фс!,), участвующие в регуляции стрессового ответа клеток микроорганизмов, по-разному влияют на характер изменений физико-химических свойств и функциональной активности ферментных белков Полученные результаты позволяют предположить, что в зависимости от своей структуры АОБ изменяют сольватные оболочки белков и свойства воды в них и, таким образом, влияки на стабильность и каталитическую активность ферментов, что не противоречит показанной ранее способности химических шаперонов изменять гидратацию молекул белка [Schein, 1990, Plaza del Pino. Sanchez-Ruiz, 1995].

Глава 5. Продукты окисления алкилоксибензолов и их функциональная активность 5.7. Анализ продуктов окисления АОБ

Учит ывая важную роль в механизмах стрессоустойчивости микроорханизмов системы неферментативной защиты клеточных структур от повреждающего действия АФК, образующихся при стрессовых воздействиях различной природы, в заключительной главе работы рассмотрены молекулярные механизмы протекторного действия АОБ как антиоксидангов

Антиоксидантное действие АОБ как ловушек АФК обусловлено их способностью к многостадийному окислению в присутствии кислорода воздуха, что визуально дстекшруется как развитие розовой и затем бурой окраски их растворов. Для инициации окислитепьных реакций в растворах АОБ были использованы методы стационарно) о радиолиза (у-облучение). фотоокисления (УФ свет) и химического окисления (Н,0,0,3% или О, воздуха в присутствии КОН)*. При облучении различными дозами -/-радиации аэрируемых растворов С;-АОБ (1 мМ) наблюдалось изменение структуры и ин генсивности спектра поглощения во всем диапазоне длин волн, появление новых полос поглощения (285-290 и 450-600 нм), что свидетельствовало

* Работа проводилась совместно с сотрудниками Института электрохимии им А Н Фрумкина РАН д х н А А Ревиной, к х.м Т К Л>цик и с сотрудниками Института физической химии РАН дхн О Г Ларионовым, к х н MB Кочетовой, за что автор выражает им большую благодарность

А, отн ед 0,3

0,2 0,1

3 2,

200 300 400

А, огн ед 2

500 (а)

600 700 л. нм

А,отн ед 2

(б)

А,отн ед 2

Рис. 12 Спектры оптического поглощения растворов С7-АОБ (1 мМ) до (1) и после облучения дозами: 0,5 Мрад (2): 0.8 Мрад (3).

(в)

ж.

61, мин

61, чин

6t, мин

Рис 13. Хроматограчмы (ВЭЖХ) растворов С7-АОБ (1 мМ) до (а) и после облучения дозами 0,5 Мрад (б) и 3 Мрад (в). Детекция при длине волны- 1 — 240 нм. 2 — 272 нм, 3 — 290 нм

об образовании различных продуктов радиолиза исходного соединения в том числе имеющих хромофор (рис 12) Исследования методом аналитической ВЭЖХ состава продуктов окисления С7-АОБ показали динамичные превращения нативных АОБ с образованием более «легких» и «тяжетых» фракций, последние представляли собой конденсированные продукты окисления, вплот ь до появления высокомотекулярных темноокрашенных нерастворимых полимерных соединений, более полярных, чем нативный С?-АОБ (рис. 13) Аналогичные превращения имели место при фою- и химическом окислении растворов С?-АОБ Количественный и качественный состав продуктов окисления варьировал в зависимости от усповий образования АФК Так. неокисленный С,-АОБ выходил на 9.5 мин. при окислении УФ светом спектр продуктов включал вещества с временем удерживания 5.2, 6,0, 6,5. 7,4, 8,0. 10,1 мин. перекисью водорода — 5,2 и 6.0 мин; в присутствии щелочи — 6.0; 7,3: 8.6 и 10,1 мин Методом ХМС среди продуктов окисления С7-АОБ обнаружены изомеры три- и тетрагидроксиалкилбеизолов. соответствующие хипопы. а также вещества полифенолытого ряда, представляющие собой продукты ди- и тримерной конденсации окисленных и исходных молекут С,-АОБ с отрывом двух или четырех атомов водорода (более высокополимерные продукты меюдом ХМС не могли быть идентифицированы)

При окислении (у-радиация, фото- и химическое окисление) водных растворов С|г-АОБ (К-соль) в присутствии кислорода воздуха концентрация продуктов окисления была ниже чем при аналогичном окислении С;-АОБ При хрома тографировании (ВЭЖХ) неокисленный С)2-АОБ выходил на 10.57 мин, а основной продукт окисления на 8,20 мин Идентификация продуктов окисления Ср-АОБ проводится в настоящее время

Таким образом, АОБ, накапливающиеся в клетках микроорганизмов в условиях окислительного стресса, могут участвовать в сложных окислительно-восстановительных реакциях. Вектор превращений АОБ направлен в сторону их окисления, что является результатом функционирования АОБ как ловушек АФК и обеспечивает защиту клеточных структур от повреждающего действия последних Окисление АОБ проходит в несколько этапов через образование полиолов и хинонов до полимерных продуктов окисления В процессе этих превращений образующиеся окисленные формы АОБ сохраняют свою функциональную активность антиоксидантов и структурных модификаторов клеточных биополимеров 5.2. Модификация ферментов продуктами окисления АОБ

Продукты окисления С7-АОБ и С|ГАОБ получали в реакции радиолиза (у-облучение, доза 0,2 Мрад, интенсивность 194 рад/с) и проверяли их функциональную активность как химических шаперонов, используя стандартные методы определения стабильности и каталитической активности трипсина и р-амилазы.

Продукты окисления С,-АОБ, также как нативный АОБ, повышали активность модельных ферментов, при этом эффективные концентрации окисленного С7-АОБ были меньше, чем неокисленного, и составили для трипсина 8,0-12,9 мМ и для Р-амилазы 9,6-12,9 мМ (180-200% к контролю) (табл. 3). Это свидетельствует о большей эффективности окисленных форм С7-АОБ в модификации структуры белков вследствие увеличения числа гидроксильных (и кето-) групп в ароматическом кольце АОБ. Соответственно, продукты радиолиза С7-АОБ повышали термостабильность ферментных белков (трипсина и Р-амилазы), равно как и их устойчивость ку-облучепию, при более низких концентрациях, чем нативный С7-АОБ. Повышение стабильности ферментов к денатурирующим воздействиям регистрировалось также как значительное расширение температурного и рН диапазонов ферментативного ка гализа Аналогичным образом продук1ы окисления С|2-АОБ обладали большей модифицирующей способностью по сравнению с нативным АОБ, стабилизируя, но при этом ингибируя активность р-амилазы во всем диапазоне применяемых концентраций.

Таким образом, продукты окисления С;-АОБ и С,,-АОБ сохраняют свои свойства структурных модификаторов белков, модулируя активность ферментов с сохранением вектора изменений (стимуляция-ингибирование), а также повышая их стабильность к повреждающему действию у-радиации, температуры и рН. При этом стабилизирующие эффекты продуктов окисления АОБ проявляются при меньших концентрациях, чем нативных АОБ Отсюда следует, что продукты окисления АОБ, как и нативные молекулы, могут принимать участие в клеточном ответе микроорганизмов на стрессовые воздействия.

Глава 6. Прикладные аспекты исследований

Алкилоксибензолы, обладающие в определенных концентрациях микробостатическим и микробоцидным эффектами в отношении широкого круга микроорганизмов, а также функциями химических шаперонов, были испытаны в качестве деконтаминантов и регуляторов

ферментативных активностей в производстве пивоваренного солода Совместно с кафедрой процессов ферментации и промышпенного биокатализа МГУГТП и кафедрой микробиологии КГУ был разработан способ эффективного солодоращения, при котором повышается выход и качество солода за счет модификации и стабилизации гидролаз зерна, снижения потерь гидролизованных Сахаров на дыхание, сокращения сроков сотодоращения, а гакже снижения контаминации зерна фитопатогенной микрофлорой

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Резучьта! ы исследования роли микробных ауторегуляторов анабиоза, относящихся к алкилоксибензолам (АОБ), в клеточном отвеге микроорганизмов на стрессовые воздействия демоне фируют их участие, по меньшей мере в двух механизмах обеспечивающих адаптацию микробных клеток к повреждающему действию стрессоров разтичной природы Во-первых, алкилоксибензолы функционируют в качестве химических шаперонов. модифицирующих и стабилизирующих структуру и модулирующих активность ферментных белков, а также способствующих диссипации энергии повреждения Во-вторых. АОБ являются эффективными перехватчиками активных форм кислорода, что приводит к их окислению с образованием продуктов, обладающих бочее выраженными протекторными свойствами антиоксидантов и структурных модификаторов, чем нативные АОБ Таким образом. АОБ выполняют важные функции в системе физико-химической защит ы микроорганизмов от окислительного стресса В устовиях стрессовых воздействий наблюдается значительное увеличение синтеза алкилокси-бензолов, внеклеточный пул которых служит для их перераспределения между клетками популяции Защитный эффект АОБ выражается в повышении устойчивости микробных клеток к действию стрессоров различной природы (теплового шока, у-радиации. фотоокисления) и сохранении их пролиферативной способности

ВЫВОДЫ

1 Микробные ауторегуляторы анабиоза, представленные у ряда бактерий и дрожжей алкилоксибензолами (АОБ), участвуют в формировании стрессового о I вета клеток пролифе-рирующих культур микроорганизмов. Стрессовый ответ Мю оеоеси\ киеи^ на тепловой шок сопровождается увеличением син геза алкилоксибензолов, внеклеточный пул которых служит для их перераспределения между клетками популяции

2. Увеличение концентрации АОБ в культурах бактерий Мкююит 1и!еи5 или дрожжей Яасс/ииотусе^ сегегтае защищает клетки от стрессовых воздействий (теплово1 о шока, у-радиации, фотоокисления), что выражается в повышении их устойчивости и сохранении способности к размножению.

3 Протекторное действие АОБ основано на их функционировании в качестве антиоксидантов и химических шаперонов, стабилизирующих структуру и модифицирующих активность ферментных белков.

4 Химические аналоги микробных ауторегуляторов — С,-АОБ, С|2-АОБитирозол, способны изменять конформацию ферментов, обуславливая сопряженные изменения каталитической активности и стабилизацию белков, что выражается в повышении их термо- и радиоустойчивости и расширении температурного и pH диапазонов катализа

5 Установлена корреляция между изменениями физико-химических свойств белков, модифицированных АОБ (степень набухания, вязкость растворов, гидрофобность) и структурой АОБ Изменения каталитической активности стабилизированных ферментов (стимуляция -ингибирование) зависят от концентраций АОБ и гидрофобности образующихся комплексов «белок-АОБ».

6 В условиях стресса АОБ функционируют как товушки активных форм кислорода Среди продуктов окисления С?-АОБ идентифицированы полигидроксиалкилбензолы хиноны. а также вещества полифенольного ряда (продукты конденсации) Окисленные формы АОБ, образующиеся при радио- фото- и химическом окислении, обладают более выраженными свойствами стабилизаторов и модуляторов ферментных белков, чем нативные АОБ

Список работ, опубликованных по материалам диссертации

1 Карпекина Т А . Степаненко И Ю Модификация ферментов естественными химическими шаперонами микроорганизмов//В кн • «Пищевые продукты XXI века», М Издательский комплекс МГУПП. 2001 Т 1 С. 74-76.

2 Карпекина Т А., Степаненко И Ю , Крылова Е.И . Козлова А Н , Грачева И М . Эль-Регистан Г.И Участие микробных алкилоксибснзолов в регуляции автолитической деструкции дрожжевых клеток//Микробиология 2002 Т 71 №5 С 611-618

3 Ст епаненко И Ю , Смирнова Е А . Шаненко Е.Ф . Эль-Регистан Г И Влияние алкилокси-бензолов на процессы солодоращсния//Прикладная биохимия и микробиология 2004 Т 40. № 1.С. 83-88

4 Степаненко И Ю . Страховская М Г , Беленикина Н С . Николаев Ю А . Мулюкин A JI, Козлова А Н . Ревина А А . Эль-Регистан Г И Защита Scucharomyies cerevisiae алкилокси-бензолами от окислительного и радиационного поражения // Микробиология 2004 Т 73 №2. С. 204-210

5 Степаненко И Ю . Мулюкин A J1.. Козлова А Н , Николаев Ю А., Эль-Регистан Г И Роль алкилоксибензолов в адаптации Micrococcus luteusK температурному шоку // Микробиология 2005. Т. 74 № 1 С 26-33.

6 El-Registan G I . Mulyukin A L . Nikolaev Yu А . Stepanenko 1 Yu . Kozlova A N . Martirosova E I . Shancnko E F . Strakhovskaya M G , Revina A A The role of microbial low-molecular-wcight autoregulatorv factors (alkylhydroxybenzenes) in resistance of microorganisms to radiation and heat shock // Adv Space Res 2005 (accepted)

7 Степаненко И Ю , Чиков Н А . Пичугина Т В , Ревина А А , Эль-Регистап Г.И Радиопротекция трипсина алкилоксибензолами //1 Всероссийская конференция (с приглашением специалистов стран СНГ) «Прикладные аспекты химии высоких энер! ий» Москва 2001 С 67-68

8 KarpekinaT A ,StepanenkoI Yu , KrylovaE I MulyukinA L ,KrylovT A , RevinaA A.. BoudrantJ , El-Rcgistan G I Stabilization of enzymes by alkylhydroxyben/enes// 3rd International conference on protein stabilisation "Biocatalyst stability" Toulouse 2002 P 67

9 Revina A A . Stepanenko I Yu , Kochetova M V . Larionov О G , Lutsik T К . Karpekina T.A . Boudrant J , El-Registan G.I Radioprotection of trypsin by alkylhydroxybenzenes // 3rd International conference on protein stabilisation "Biocatalyst stability" Toulouse 2002 P 68

10 Карпекина T A . Степаненко И Ю . Шаненко Е Ф . Эль-Регистан Г И Стабитизация ферменюв химическими шапероначи микробного происхождения // Тезисы докладов V Симпозиума «Химия протеолитических ферменюв» Москва 2002 С 114

11 Степаненко И Ю , Карпекина Т А , Шаненко Е Ф . Попов М П , Эль-Регистан Г И Влияние алкитоксибензолов на протеолитичсские ферменты солода // Тезисы докладов V Симпозиума «Химия протеолитических ферментов» Москва 2002 С 116

12 Эль-Рсгиаан Г И . КарпекинаТ А .Степаненко И Ю , Крылова Е И . Шаненко Е Ф . Крылов И А , Красноппанова А А . БауринаМ М .БудранЖ Оабилизация индивидуальных ферментов и фермен шых систем алкилоксибснзолами // 1-ый Международный конгресс «Биотехнология - состяние и перспективы развития» Москва 2002 С 195-196

13 Степаненко И Ю . Шишкина М Л . Мартиросова Е И , Шаненко Е Ф , Витол И С . Николаев Ю А . Эль-Pei истан Г И Механизм действия алкитоксибензолов на физико-химические свойства белков // В сб докладов всероссийской научно-технической конференции-выставки «Высокоэффективные пищевые техночогии. методы и средства для их реализации» Москва 2003 С 195-200

14 EI-Registan G I . Mulyukin A L . Nikolaev Yu А . Stepanenko I.Yu , Shanenko E F Strakhovskaya M G , Rcvma A A The role of microbial low-molecular-weight autoregulatory factors (alkylhydroxybenzenes) m resistance of micioorganisms to radiation // Abstract 35,h COSPAR Scientific Assembly Paris. France 2004 httpV/www cosis net/abstracts/COSPAR04/ 00353/COSPAR()4-A-00353-1 pdf.

15 Эль-Регистан Г И , Ермолаева Г А , Шаненко Е Ф., Крылов И А , Ревина А А , Оепаненко И Ю , Смирнова Е А , Еюров С Ю . Покровский А В , Будран Ж. Способ производства солода // Патент РФ № 2002124631/13 (026166) от 17 09 2002

16 Эль-Регистан Г И . Шаненко Е Ф . Крылов И А . Воейкова Т А , Карпекина Т А , Степаненко И Ю Крылова Е И , Табаков В Ю Способ стабилизации ферментов в водных растворах // Заявка на получение патента РФ на изобретение № 2003106799 от 13 03 2003

£-9012

РНБ Русский фонд

2006-4 4492

Издатель Слеианенко Лицензия ЛР № 04694 от 28 04.2001 г Подписано к печати 25 04 2005 г. Форма! 60x90/16 Усо.печ л. 1.75 Тираж 100 зкз. Заказ 27.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Степаненко, Ирина Юрьевна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Глава 1. Окислительный стресс у микроорганизмов.

1.1. Активные формы кислорода и причины их возникновения.

1.2. Токсическое действие АФК на клетки микроорганизмов.

1.3. Механизмы устойчивости микроорганизмов к окислительному стрессу.

1.3.1. Ферменты антиоксидантной защиты.

1.3.2. Другие компоненты антиоксидантной защиты.

1.4. Регуляция клеточного ответа на окислительный стресс.

Глава 2. Температурные стрессы у микроорганизмов.

2.1. Клеточный ответ на тепловой шок.

2.2. Белки теплового шока.

2.3. Клеточный ответ на холодовый шок.

2.4. Участие углеводов в клеточном ответе на температурные стрессы.

Глава 3. Регуляция стрессового ответа.

3.1. Роль RpoS-регулона в защите клеток от множественных стрессов.

3.2. Другие регуляторные системы клеточного ответа на стрессы.

3.3. Система регуляции клеток микроорганизмов гуанозинтетрафосфатом.

Глава 4. Участие внеклеточных ауторегуляторов в адаптационном ответе микроорганизмов.

4.1. Внеклеточные факторы адаптации.

4.2. Аутоиндукторы анабиоза (факторы d,).

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

Глава 1. Объекты и методы исследования.

1.1. Объекты исследования.

1.2. Микробиологические методы.

1.3. Биохимические и физико-химические методы анализа.

1.4. Статистическая обработка экспериментальных данных.

Глава 2. Реакция бактериальной культуры Micrococcus luteus на стрессовые воздействия.

2.1. Влияние теплового шока на рост и жизнеспособность М. luteus.

2.2. Влияние теплового шока на динамику накопления алкилокси-бензолов в культуре М. luteus.

2.3. Защита клеток М. luteus от теплового шока.

Глава 3. Защита дрожжей Saccharomyces cerevisiae алкилоксибензолами от окислительного стресса.

3.1. Защита S. cerevisiae от радиационного поражения.

3.2. Защита S. cerevisiae от фотодинамического повреждения.

Глава 4. Функционирование алкилоксибензолов в качестве структурных модификаторов и стабилизаторов белков.

4.1. Модификация ферментов С12-АОБ.

4.1.1. Модификация трипсина С12-АОБ.

4.1.2. Модификация р-амилазы С12-АОБ.

4.2. Модификация ферментов С7-АОБ.

4.2.1. Модификация трипсина С7-АОБ.

4.2.2. Модификация р-амилазы С7-АОБ.

4.2.3. Модификация а-амилазы С7-АОБ.

4.3. Модификация трипсинатирозолом.

4.4. Модификация р-амилазы D-валином.

4.5. Изменение кинетических параметров трипсина при комплексообразованиис АОБ.

Глава 5. Физико-химические свойства белков, модифицированных алкилоксибензолами.

Глава 6. Продукты окисления алкилоксибензолов и их функциональная активность.

6.1. Анализ продуктов окисления АОБ.

6.2. Модификация ферментов продуктами окисления АОБ.

6.2.1. Модификация трипсина продуктами окисления С7-АОБ.

6.2.2. Модификация р-амилазы продуктами окисления С7-АОБ.

6.2.3. Модификация р-амилазы продуктами окисления С12-АОБ.

Глава 7. Прикладные аспекты исследований.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Изучение роли алкилоксибензолов в стрессовом ответе микроорганизмов"

Актуальность проблемы. Проблема адаптации микроорганизмов к стрессу является одной из наиболее актуальных проблем микробиологии. Накапливается все больше данных о том, что действие различных стрессовых факторов сопровождается возрастанием в клетках концентрации активных форм кислорода (АФК), вызывающих окислительный стресс. Так, повреждающие эффекты АФК наблюдаются при воздействии на микроорганизмы как высоких [Davidson et al., 1996; Sugiyama et al., 2000; Рихванов с соавт., 2001; 2003], так и низких температур [Park, 2000], высоких концентраций солей [Гейдебрехт, 2003], под действием радиации [Эйдус, 1962].

Молекулярно-биологические исследования внутриклеточных механизмов адаптации микроорганизмов к стрессу позволили получить обширную информацию о событиях, происходящих на уровне реализации генетических программ клеточного ответа: системах репарации ДНК [Rusting, 1992; Романовская с соавт., 2002; 2003], ферментах антиоксидантной защиты [Terzenbach, Blaut, 1998; Смирнова с соавт., 2001; Брюханов с соавт., 2002; Подкопаева с соавт., 2003], особенностях транскрипции стрессовых белков [Hidalgo, Demple, 1996; De Maio, 1999; Zheng, Storz, 2000], в том числе белков теплового шока, имеющих функции молекулярных шаперонов и участвующих в структурной стабилизации и фолдинге белков [Van der Vies, Georgopoulos, 1996;Shukla, Singh, 1999; Hossain, Nakamoto, 2003]. Вместе стем, в последние годы в области исследований устойчивости микроорганизмов к стрессовым воздействиям обозначился очевидный интерес к изучению внеклеточных ауторегуляторов, обеспечивающих межклеточную коммуникацию при формировании стрессового ответа клеток. Описан ряд физиологических процессов, ассоциированных со стационарной фазой культур микроорганизмов в ответ на стресс голодания (starvation stress) и достижение критической плотности клеток (quorum sensing), в которых принимают участие ауторегуляторы [Хохлов, 1988; Эль-Регистан, 1988; Dworkin, 1996; Shapiro, Dworkin, 1997; Parsek, Green berg, 2000]. Однако, роль межклеточных взаимодействий и участие экзометаболитов в системе гибкой защиты клеток пролиферирующих микробных культур от воздействия стрессоров изучены явно недостаточно.

В обсуждаемом аспекте проблемы нас интересовали функции ауторегуля-торов в развитии защитных реакций клетки, контроле процессов динамичной структурной реорганизации и стабилизации субклеточных структур. Претендентами на эту роль могут быть внеклеточные метаболиты, описанные по адаптогенному действию культуральных жидкостей [Воробьева с соавт., 1993; Николаев, 1996; 2000], вещества, содержащиеся в лизатах клеток [Кокоева, Плакунов, 1993], адаптогены белковой природы [Rowbury, Goodson, 2001; Воробьева с соавт., 2003], а также микробные аутоиндукторы анабиоза — факторы d, (фс!,), представленные у ряда бактерий и дрожжей алкилоксибензо-лами (АОБ) [Осипов с соавт., 1985; Батраков с соавт., 1993; Мулюкин с соавт., 1996]. По достижении определенного концентрационного уровня АОБ ^d,) контролируют переход микробной культуры к стационарной фазе, развитие в клетках гипометаболического, а затем анабиотического состояний, сопряженных с повышением устойчивости стационарных клеток и покоящихся форм к неблагоприятным и повреждающим воздействиям [Светличный с соавт., 1986; Эль-Регистан, 1988; Демкина с соавт., 2000; Лойко с соавт., 2003]. Описанные свойства АОБ предполагают их участие в природных механизмах адаптации клеток микроорганизмов к стрессу. Выяснение функций АОБ в процессах повышения устойчивости клеток и стабилизации субклеточных структур представляется важным для теории стресса и решения практических задач защиты организмов от неблагоприятных воздействий.

Цель работы — изучить роль микробных алкилоксибензолов — ауторегуляторных факторов d,, в адаптации микроорганизмов к сублетальным воздействиям стрессоров различной природы.

Задачи исследований: 1) изучить динамику накопления вне- и внутриклеточных АОБ в культуре Micrococcus luteus, подвергнутой температурному шоку, и выявить их возможную роль как адаптогенов; 2) оценить протекторные функции АОБ в сохранении жизнеспособности клеток пролиферирующих культур бактерий М. luteus и дрожжей Saccharomyces cerevisiae в условиях теплового шока и окислительного стресса различной природы; 3) изучить механизмы действия химических аналогов фd1 бактерий (С?-АОБ и С|2-АОБ) и дрожжей (тирозола) в регуляции активности и стабильности ферментных белков; 4) исследовать участие АОБ в антиоксидантной защите клеток при окислительном стрессе; 5) определить на молекулярном уровне функционирование АОБ как антиоксидантов, а также изучить качественный состав и функциональную активность продуктов, образующихся при окислении АОБ.

Научная новизна. (1) Установлены основные закономерности саморегуляции формирования стрессового ответа микроорганизмов с участием внеклеточных фс!,, представленных у ряда бактерий и дрожжей алкилоксибен-золами. Выявлена роль АОБ как адаптогенов протекторного типа, защищающих клетки пролиферирующих культур бактерий и дрожжей от стрессовых воздействий разной природы — теплового шока, у-облучения и фотоокисления. Обнаружено, что формирование стрессового ответа бактерий М. luteus сопряжено с повышением биосинтеза АОБ, внеклеточный пул которых служит для их перераспределения между клетками популяции. Установлено, что защитный эффект АОБ при возрастании их концентрации в культуре, подвергаемой стрессовому воздействию, выражается в повышении устойчивости клеток и сохранении их способности к пролиферации. (2) Установлено, что механизм протекторного действия АОБ включает их функционирование как химических шаперонов и эффективных перехватчиков АФК. Впервые показана антиокси-дантная активность фенольных соединений в защите клеток от синглетного кислорода. (3) В опытах in vitro впервые показана способность химических аналогов фс1, (С7-АОБ, С12-АОБ и тирозола) направленно модифицировать структуру ферментных белков, что приводит к повышению их стабильности и изменению каталитической активности в сторону как активации, так и ингибирования. Установлена зависимость изменения вектора каталитической активности модифицированных АОБ ферментных белков от структуры и концентрации АОБ как лиганда. Обнаружена корреляция между повышением каталитической активности и снижением гидрофобности образующихся комплексов «фермент-АОБ». (4) Впервые проведен анализ продуктов окисления С7-АОБ и С|2-АОБ, полученных в результате их функционирования как ловушек АФК, образующихся в различных условиях (у-облучение, фото- и химическое окисление). Показано многостадийное окисление АОБ с образованием большого числа окисленных мономеров, продуктов их конденсации и полимеров, более полярных, чем нативные АОБ. (5) Впервые установлено, что продукты окисления АОБ, также как нативные АОБ, обладают свойствами структурных модификаторов ферментов и обуславливают изменение их каталитической активности сопряженно со стабилизацией макромолекул. Показано, что продукты окисления С7-АОБ и С|2-АОБ более активны как химические шапероны, чем нативные АОБ.

Практическая ценность работы. (1) Полученные в работе результаты могут быть использованы: для разработки эффективных способов антиокси-дантной защиты про- и эукариотических организмов; для совершенствования методов борьбы с микробной контаминацией и биообрастанием; для направленной регуляции роста промышленных штаммов. (2) Разработан способ стабилизации и направленной модуляции каталитической активности ферментов на основе использования в качестве структурных модификаторов белков химических аналогов фс!,. На разработанный способ подготовлена и заявлена патентная документация. (3) Разработан способ высокоэффективного солодо-ращения, основанный на применении химических аналогов фс1, в качестве регуляторов ферментативной активности прорастающего зерна и одновременно для деконтаминации ячменя от фитопатогенной микрофлоры. На разработанный способ получен патент РФ.

Апробация работы. Результаты работы были представлены на 1-ой Всероссийской конференции «Прикладные аспекты химии высоких энергий» (Москва, 2001); 3-ей Международной конференции по стабилизации белка "Biocatalyst stability" (Тулуза, Франция, 2002); V Симпозиуме «Химия протео-литических ферментов» (Москва, 2002); 1-ом Международном конгрессе «Биотехнология — состояние и перспективы развития» (Москва, 2002); Всероссийской научно-технической конференции-выставке «Высокоэффективные пищевые технологии, методы и средства для их реализации» (Москва, 2003); 35th COSPAR Scientific Assembly (Париж, Франция, 2004).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 14 работ, из них 6 статей и 8 тезисов. Также подготовлены и заявлены 2 патента, получено 1 положительное решение (патент РФ № 2002124631/13 (026166)).

Структура диссертации. Диссертация изложена на 178 страницах и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, заключения, выводов и списка литературы, включающего 297 работ отечественных и зарубежных авторов. Диссертация иллюстрирована 7 таблицами и 67 рисунками.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Степаненко, Ирина Юрьевна

выводы

1. Микробные ауторегуляторы анабиоза, представленные у ряда бактерий и дрожжей алкилоксибензолами (АОБ), участвуют в формировании стрессового ответа клеток пролиферирующих культур микроорганизмов. Стрессовый ответ Micrococcus luteus на тепловой шок сопровождается увеличением синтеза алкилоксибензолов, внеклеточный пул которых служит для их перераспределения между клетками популяции.

2. Увеличение концентрации АОБ в культурах бактерий Micrococcus luteus или дрожжей Saccharomyces cerevisiae защищает клетки от стрессовых воздействий (теплового шока, у-радиации, фотоокисления), что выражается в повышении их устойчивости и сохранении способности к размножению.

3. Протекторное действие АОБ основано на их функционировании в качестве антиоксидантов и химических шаперонов, стабилизирующих структуру и модифицирующих активность ферментных белков. 4. Химические аналоги микробных ауторегуляторов — С7-АОБ, С)2-АОБ и тирозол, способны изменять конформацию ферментов, обуславливая сопряженные изменения каталитической активности и стабилизацию белков, что выражается в повышении их термо- и радиоустойчивости и расширении температурного и рН диапазонов катализа.

5. Установлена корреляция между изменениями физико-химических свойств белков, модифицированных АОБ (степень набухания, вязкость растворов, гидрофобность) и структурой АОБ. Изменения каталитической активности стабилизированных ферментов (стимуляция-ингибирование) зависят от концентраций АОБ и гидрофобности образующихся комплексов «белок-АОБ».

6. В условиях стресса АОБ функционируют как ловушки активных форм кислорода. Среди продуктов окисления С7-АОБ идентифицированы поли-гидроксиал кил бензолы, хиноны, а также вещества полифенольного ряда (продукты конденсации). Окисленные формы АОБ, образующиеся при радио-, фото- и химическом окислении, обладают более выраженными свойствами стабилизаторов и модуляторов ферментных белков, чем нативные АОБ.

заключение

В естественной среде обитания все микроорганизмы имеют свои пределы экологической адаптации, в границах которой они нормально растут и развиваются. Но из-за постоянно изменяющихся условий внешнего окружения микробные культуры могут находиться в состоянии, не оптимальном для их роста. В связи с этим у микроорганизмов различной таксономической принадлежности, в том числе у экстремофильных бактерий, выработаны различные механизмы адаптации к отклонениям такого рода [Sorokin et al., 2000; Zvyagilskaya et al., 2001; Бонч-Осмоловская, 2004].

В последнее время большое внимание уделяется изучению низкомолекулярных веществ, обеспечивающих адаптацию и устойчивое существование вида в пределах зоны его толерантности и способствующих выживанию клеток при экстремальных внешних воздействиях. Так, для галоалкалофильных бактерий родов Thioalkalivibrio и Thioalkalimikrobium, являющихся обитателями содовых озер с высоким содержанием солей и щелочности среды, низкомолекулярным компонентом цитоплазмы, обеспечивающим осмотическую адаптацию клетки, является глицин-бетаин [Сорокин, 2000]. Вместе с тем у них было показано наличие системы ауторегуляции роста и развития микробных культур, осуществляющейся с участием внеклеточных аутоиндукторов анабиоза — факторов dj, относящихся по химической природе к алкилоксибензолам (АОБ), и предназначенной для развития адаптации культур к лимиту источников питания, контроля перехода в стационарную фазу и индукции образования цистоподобных покоящихся клеток [Лойко с соавт., 2002; 2003]. На фоне постоянно присутствующей у галоалкалофильных бактерий осмопротекторной системы с участием глицин-бетаина, накопление факторов d, обеспечивает дополнительную защиту клеток в периоды стресса.

В наше работе было начато изучение защитного действия этих ауторегу-ляторов для повышения устойчивости вегетативных размножающихся клеток микроорганизмов и механизмов стабилизации субклеточных структур в условиях стрессовых воздействий. Одним из объектов исследований были неспоро-образующие бактерии Micrococcus luteus. Интерес к этим объектам неслучаен, так как ранее было обнаружено, что внеклеточные аутоиндукторы анабиоза (факторы d,) этих бактерий относятся алкилоксибензолам класса алкилрезорцинов, и изучена динамика их накопления в культурах микрококка [Мулюкин с соавт., 1996а]. В качестве другой модели были взяты эукариотические микроорганизмы — дрожжи Saccharomyces cerevisiae, факторы d, которых представлены другим производным оксибензолов—тирозолом [Батраков с соавт., 1993].

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Степаненко, Ирина Юрьевна, Москва

1. Алейникова Т.Л., Рубцова Г.В. Руководство к практическим занятиям по биологической химии / Под. ред. Николаева А.Я. М.: Высшая школа, 1988.239 с.

2. Аминова Л.Р., Троценко Ю.А. Особенности метаболизма метанола и ксилозы у каталозонегативного мутанта дрожжей Hansenula polymorpha при росте на смешанных субстратах // Микробиология. 1998. Т. 67. № 4. С. 452-457.

3. Андреищева Е.Н., Звягильская Р.А. Адаптация дрожжей к солевому стрессу // Прикл. биохимия и микробиология. 1999. Т. 35. № 3. С. 243-256.

4. Бабусенко Е.С., Гаязов P.P., Эль-Регистан Г.И., Градова Н.Б. Динамика ауторегуляторных факторов d, и d2 в периодической культуре Methylococcus capsulatus II Биотехнология. 1991. № 5. С. 26-28.

5. Баснакьян И.А. Стресс у бактерий. М.: Медицина, 2003. 136 с.

6. Батраков С.Г., Эль-Регистан Г.И., Придачина Н.Н., Ненашева В.А., Козлова А.Н., Грязнова М.Н., Золотарева И.Н. Тирозол — ауторегуляторный фактор d, Saccharomyces cerevisiae II Микробиология. 1993. Т. 62. №. 4. С. 633-638.

7. Березин И.В. Действие ферментов в обращенных мицеллах. 39-е Баховское чтение. М.: Наука, 1985. 40 с.

8. Билай В.И., Курбатская 3. Определитель токсинобразующих микромице-тов. Киев: Наукова думка, 1990. 150 с.

9. Битков В.В., Ненашев В.А., Придачина Н.Н. Проневич Л.А., Хашаев З.Х.-М., Батраков С.Г. Бактериальные алкилрезорцины — регуляторы структуры биологических мембран // Известия АН СССР. Сер. Биол. 1991. № 2. С. 182-193.

10. Бонч-Осмоловская Е.А. Изучение термофильных микроорганизмов в Институте микробиологии РАН // Микробиология. 2004. Т. 73. № 5. С. 644-658.

11. Брюханов A.JI., Тауэр Р.К., Нетрусов А.И. Каталаза и супероксиддисму-таза в клетках строго анаэробных микроорганизмов// Микробиология. 2002. Т. 71. № 3. С. 330-335.

12. Бурлакова Е.Б., Наджарян T.JI. Биологические проблемы старения и замедление старения антиоксидантами. Сб. Итоги науки и техники. Сер. Общие проблемы биологии. Т. 5. М.: ВИНИТИ, 1986. С. 1-240.

13. Варфоломеев С.Д., Гуревич К.Г. Биокинетика. М.: Гранд: Фаир-Пресс, 1999. 720 с.

14. Владимиров Ю.А. Свободные радикалы в биологических системах // Соросовский образовательный журнал. 2000. Т. 6. № 12. С. 13-19.

15. Воробьева Л.И., Алтухова Е.А., Наумова Е.С., Абилев С.К. Десмутаген-ное действие культуральной жидкости, полученной в результате пропионово-кислого брожения // Микробиология. 1993. Т. 62. №. 6. С. 1093-1100.

16. Воробьева J1.И., Ходжаев У.Ю., Пономарева Г.М. Внеклеточный белок Luteococcus japonicus subsp. casei реактивирует клетки, инактивированные ультрафиолетовым облучением и нагреванием //Микробиология. 2003. Т. 72. №. 4. С. 482-487.

17. Воробьева Л.И., Чердынцева Т.А., Абилев С.К. Антимутагенное действие бактерий против мутагенеза, индуцируемого 4-нитрохинолон-1 -оксидом у Salmonella typhimurium II Микробиология. 1995. Т.64. №. 2. С. 228 233.

18. Гаенко Г.П., Решетникова И.В., Дуда В.И. Супероксиддисмутаза в спорах Clostridium butyricum II Микробиология. 1985. Т. 54. № 2. С. 322-324.

19. Гейдебрехт О.В. Механизмы галоадаптации микроорганизмов в условиях гипоксии. Дисс. на соиск. уч. ст. к.б.н. Москва, 2003.

20. Гейдебрехт О.В., Арзуманян В.Г., Плакунов В.К., Беляев С.С. Влияние степени аэрации среды на галотолерантность дрожжей родов Candida, Rhodo-torula и Malassezia II Микробиология. 2003. Т. 72. № 3. С. 312-319.

21. Головлев Е.Л. Реакция бактериальных клеток на холодовый шок на уровне динамики хромосомы, транскрипции и трансляции // Микробиология. 2003. Т. 72. № 1.С. 5-13.

22. Гордеев К.Ю., Битков В.В., Придачина Н.Н., Ненашев В.А., Батраков С.Г. Бактериальные 5-н-алкил-(С|9-С21)резорцины — неконкурентные ингибиторы фосфолипазы А2//Биоорганическая химия. 1991. Т. 17. № 10. С. 1357-1364.

23. Грачева И.М., Грачев Ю.П., Мосичев М.С., Борисенко Е.Г., Богатков С.В., Гернет М.В. Лабораторный практикум по технологии ферментных препаратов. М.: Легкая и пищевая промышленность, 1982. С. 36-57, 186-198.

24. Грачева И.М., Кривова А.Ю. Технология ферментных препаратов. М.: Элевар, 2000. 512 с.

25. Демкина Е.В., Соина B.C., Эль-Регистан Г.И. Образование покоящихся форм Arthrobacter globiformis в автолизирующихся суспензиях // Микробиология.2000. Т. 69. № 3. С. 383-388.

26. Дорошенко Е.В., Лойко Н.Г., Ильинская О.Н., Колпаков А.И., Горнова И.Б., КлимановаУ.В., Эль-Регистан Г.И. Характеристика диссоциантов Bacillus cereus II Микробиология. 2001. Т.70. №6. С. 811-819.

27. Запрометов М.Н. Фенольные соединения: распространение, метаболизм и функции в растениях. М.: Наука, 1993. 122 с.

28. Звягинцев Д.Г. Экологическая роль микробных метаболитов. М.: Изд-во МГУ, 1986. 240 с.

29. Зенков Н.К., Ланкин В.З., Меньшикова Е.Б. Окислительный стресс: биохимический и патофизиологический аспекты. М.: МАИК Наука/Интерпериодика,2001. 343 с.

30. Зимон А.Д., Лещенко Н.Ф. Коллоидная химия. М.: АГАР, 2001. 320 с.

31. Ильинская О.Н., Колпаков А.И., Зеленихин П.В., Круглова З.Ф., Чойдаш Б., Дорошенко Е.В., Мулюкин А.Л., Эль-Регистан Г.И. Влияние ауто-индукторов анабиоза бактерий на геном микробной клетки // Микробиология. 2002а. Т. 71. №2. С. 194-199.

32. Ильинская О.Н., Колпаков А.И., Шмидт М.А., Дорошенко Е.В., Мулюкин А.Л., Эль-Регистан Г.И. Роль бактериальных ауторегуляторов роста группы алкилоксибензолов в ответе стафилококков на стрессовые воздействия // Микробиология. 2002b. Т. 71. № 1. С. 23-29.

33. Капрельянц А.С., Скрыпин В.И., Эль-Регистан Г.И., Козлова А.Н., Островский Д.Н. Дуда В.И. Изменение структурного состояния мембраны

34. M. lysodeikticus под влиянием препаратов ауторегуляторных бактериальных факторов d, // Прикладная биохимия и микробиология. 1985. Т. 21. № 3. С. 378-381.

35. Козлова О.В., Куприянова-Ашина Ф.Г., Егоров С.Ю., Эль-Регистан Г.И. Влияние химического аналога микробных аутоиндукторов анабиоза на Са2+-ответ мицелиальных грибов // Микробиология. 2004. Т. 73. № 6. С. 741-750.

36. Кокоева М.В., Плакунов В.К. Возможность модификации осмочув-ствительности экстремально галофильных архебактерий // Микробиология. 1993. Т.62. № 5. С. 825-834.

37. Комарова Т.Н., Поршнева О.В., КоронеллиТ.В. Образование трегалозы клетками R- и S-вариантов Rhodococcus erythropolis И Микробиология. 1998. Т. 67. №3. С. 428-431.

38. Коновалова Е.Ю., Эль-Регистан Г.И., Бабьева И.П. Динамика и накопление ауторегуляторных факторов d, и d2 дрожжами Rhodosporidium toruloides I/ Биотехнология. 1985. №3. С. 71-74.

39. Ленинджер А. Основы биохимии. Пер. с англ. Т. 1. М., 1985. С. 176-179.

40. Лойко Н.Г., Козлова А.Н., Осипов Г.А., Эль-Регистан Г.И. Низкомолекулярные ауторегуляторы развития бактерий Thioalkalivibrio versutus и Thioalkalimikrobium aerophilum II Микробиология. 2002. Т. 71. № 3. С. 308-315.

41. Лойко Н.Г., Соина B.C., Сорокин Д.Ю., Митюшина Л.Л. Образование покоящихся форм у грамотрицательных хемолитоавтотрофных бактерий Thioalkalivibrio versutus и Thioalkalimikrobium aerophilum II Микробиология. 2003. Т. 72. № 3. С. 328-337.

42. Лущак В.И. Окислительный стресс и механизмы защиты от него у бактерий // Биохимия. 2001. Т. 55. № 5. С. 592-609.

43. Марголин A.JI., Шерсткж С.Ф., Изумрудов В.А., Швядас В.Ю., Зезин А.Б., Кабанов В.А. Фазовые превращения в растворах полиэлектролитовых комплексов как модель спорообразования //Докл. АН СССР. 1983. Т. 272. № 1.С. 230-233.

44. Меденцев А.Г., Аринбасарова А.Ю., Акименко В.К. Адаптация фитопа-тогенного гриба Fusarium decemcellulare к окислительному стрессу // Микробиология. 2001. Т. 70. № 1. С. 34-38.

45. Мейсель М.Н. О биологическом действии ионизирующих излучений на микроорганизмы. Действие облучения на организм. Докл. сов. делегации на Междунар. конф. по мирн. использов. атомн. энергии. Изд-во АН СССР, 1958. С. 78-111.

46. Мейсель М.Н., Кондратьева Т.М. О ранних изменениях в клетках культур тканей под влиянием рентгеновских лучей // Вопросы радиобиологии. 1956. С. 314-324.

47. Меньшикова Е.Б., Зенков Н.К. Окислительный стресс при воспалении // Успехи современной биологии. 1997. Т. 117. №2. С. 155-171.

48. Мерзляк М.Н. Активированный кислород и жизнедеятельность растений // Соросовский образовательный журнал. 1999. № 9. С. 20-26.

49. Мирчинк Т.Г. Почвенная микробиология. М.: Изд-во МГУ, 1988. 220 с.

50. Мулюкин А.Л. Образование покоящихся форм у неспорообразующих микроорганизмов// Дисс. на соиск. уч. ст. к.б.н. М: ИНМИ РАН, 1998. 150 с.

51. Мулюкин А.Л., Козлова А.Н., Капрельянц А.С., Эль-Регистан Г.И. Обнаружение и изучение динамики накопления ауторегуляторного фактора d, в культуральной жидкости и клетках Micrococcus luteus II Микробиология. 1996а. Т. 65. № 1.С. 20-25.

52. Мулюкин А.Л., Луста К.А., Грязнова М.Н., Козлова А.Н., Дужа М.В., Дуда В.И., Эль-Регистан Г.И. Образование покоящихся форм Bacillus cereus и Micrococcus luteus II Микробиология. 1996b. Т. 65. № 6. С. 782-789.

53. Ненашев Е.А., Придачина Н.Н., Эль-Регистан Г.И., Золотарева И.Н., Батраков С.Г., Действие ауторегуляторов анабиоза некоторых микроорганизмов на дыхание митохондрий печени крыс//Биохимия. 1994. Т. 59. № 1. С. 1511-1515.

54. Николаев Ю.А. Внеклеточные факторы адаптации бактерий к неблагоприятным условиям среды // Прикладная биохимия и микробиология. 2004. Т. 40. №4. С. 387-397.

55. Николаев Ю.А. Защитное влияние тетрациклинчувствительного штамма Escherichia coli на рост тетрациклинустойчивого штамма в присутствии тетрациклина при совместном культивировании // Микробиология. 1996а. Т. 65. № 6. С. 745-748.

56. Николаев Ю.А. Множественный защитный эффект экзаметаболита (экзаметаболитов), выделяемого Escherichia coli при обработке тетрациклином // Микробиология. 1996b. Т.65. №.6. С. 748-753.

57. Николаев Ю.А. Обнаружение двух новых внеклеточных адаптогеннных факторов у Escherichia coli К-12// Микробиология. 1997а. Т. 66. №. 6. С. 785-789.

58. Николаев Ю.А. Сравнительное изучение свойств двух внеклеточных протекторов, выделяемых Escherichia coli при повышенной температуре // Микробиология. 1997b. Т. 66. № 6. С. 790-795.

59. Николаев Ю.А. Участие экзометаболитов в адаптации Escherichia coli к стрессам// Микробиология. 1997с. Т. 66. №. 1. С. 38-41.

60. Николаев Ю.А., Воронина Н.А. Перекрестное действие внеклеточных факторов адаптации к стрессу у микроорганизмов // Микробиология. 1999. Т. 68. № 1.С. 45-50.

61. Николаев Ю.А., Паников Н.С. Внеклеточная протеаза как регулятор обратимой адгезии Pseudomonas fluorescens И Микробиология. 2002. Т. 71. № 5. С. 629-634.

62. Николаев Ю.А., Паников Н.С., Лукин С.М., Осипов Г.А. Насыщенные С,2-С33 углеводороды — ауторегуляторы адгезии Pseudomonas fluorescens на стекле // Микробиология. 2001. Т. 70. № 2. С. 174-181.

63. Николаев Ю.А., Проссер Дж.И., Паников Н.С. Внеклеточные факторы адаптации к неблагоприятным условиям среды в периодической культуре Pseudomonas fluorescens И Микробиология. 2000. Т. 69. № 5. С. 629-635.

64. Нонхибел Д., Уолтон Дж. Химия свободных радикалов. М.: Мир, 1977. С. 606.

65. Носкин Л.А., Бреслер С.Е., Смирнова И.С., Суслов А.В. Исследование индукции и репарации повреждений ДНК в гепатоцитах крыс, возникающих под действием рентгеновского излучения // Радиобиология. 1982. Т. 22. № 1. С. 44-50.

66. Осипов А.Н., Азизова О.А., Владимиров Ю.В. Активныеформы кислорода и их роль в организме // Успехи биологической химии. 1990. Т. 31. С. 180-208.

67. Осипов Г.А., Эль-Регистан Г.И., Светличный В.А., Козлова А.Н., Дуда

68. B.И., Капрельянц А.С., Помазанов В.В. О химической природе ауторегуля-торного фактора d, Pseudomonas carboxydoflava 11 Микробиология. 1985. Т. 54. №2. С. 184-190.

69. Островский Д.Н. Новые участники окислительного стресса у бактерий // Успехи биологической химии. 1997а. Т. 37. С. 147-169.

70. Островский Д.Н. Окислительный стресс у бактерий. 53-е Баховское чтение. Москва, 1997b. 23 с.

71. Плакунов В.К. Основы энзимологии. М.: Логос, 2001. 128 с.

72. Подкопаева Д.А., Грабович М.Ю., Дубинина Д.А. Окислительный стресс и системы антиоксидантной защиты клеток у микроаэрофильной бактерии Spirillum winogradskii II Микробиология. 2003. Т. 72. № 5. С. 600-608.

73. Пожарский Э.В., Зенченко Т.А. // Молекулярная биофизика. 1998. Т. 43.1. C. 31-34.

74. Рапопорт А.И., Пузыревская О.М., Саубенова М.Г. Полиолы и устойчивость дрожжей к обезвоживанию // Микробиология. 1988. Т. 52. № 2. С. 329-331.

75. Рихванов Е.Г., Варакина Н.Н., РусалеваТ.М., Раченко Е.И., Войников В.К. Действие ингибиторов цитохроксидазного комплекса на термоустойчивость дрожжей // Микробиология. 2003. Т. 72. № 2. С. 174-179.

76. Рихванов Е.Г., Варакина Н.Н., Русалева Т.М., Раченко Е.И., Киселева В.А., Войников В.К. Влияние азида натрия на устойчивость к тепловому шоку Saccharomyces cerevisiae и Debaryomyces vanriji II Микробиология. 2001а. Т. 70. № 3. С. 300-304.

77. Рихванов Е.Г., Варакина Н.Н., Русалева Т.М., Раченко Е.И., Киселева В.А., Войииков В.К. Изменение дыхания при действии теплового шока на дрожжи Saccharomyces cerevisiae II Микробиология. 2001b. Т. 70. №4. С. 531-535.

78. Родионова Т. А., Николаев Ю.А. Защитное действие обратимой адгезии термофильной бактерии Bacillus licheniformis 603 от N-этилмалеимида // Микробиология. 2004. Т. 73. № 1. С. 133-134.

79. Родионова Т.А., Шеховцова Н.В., Паников Н.С., Николаев Ю.А. Рост и адгезия Bacillus licheniformis в зависимости от условий культивирования // Микробиология. 2003. Т. 72. № 4. С. 521-527.

80. Романовская В.А.,Рокитко П.В., Малашенко Ю.Р., КриштабТ.П., Черная Н.А. Чувствительность к стрессорным факторам почвенных бактерий, изолированных из зоны отчуждения Чернобыльской АЭС // Микробиология. 2003. Т. 72. №2. С. 174-179.

81. Романовская В.А., Рокитко П.В., Михеев А.Н., Гуща Н.И., Малашенко Ю.Р., Черная Н.А. Влияние у-излучения и дегидратации на выживаемость бактерий, изолированных из зоны отчуждения Чернобыльской АЭС // Микробиология. 2002. Т. 71. №5. С. 705-712.

82. Романовская В.А., Соколов И.Г., Малашенко Ю.Р., Рокитко П.В. Мута-бельность эпифитных и почвенных бактерий рода Methylobacterium и их резистентность к ультрафиолетовому ионизирующему излучению// Микробиология. 1998. Т. 67. № 1.С. 106-115.

83. Светличный В.А., Романова А.К., Эль-Регистан Г.И. Изучение количественного содержания мембраноактивных ауторегуляторов при литоавтотрофном росте Pseudomonas carboxydoflava // Микробиология. 1986. Т. 55. № 1. С. 55-59.

84. Серебрякова Е.В., Дармов И.В., Медведев Н.П., Алексеев С.А., Рыбак С.И. Оценка гидрофобных свойств бактериальных клеток по адсорбции на поверхности капель хлороформа//Микробиология. 2002. Т. 71. №2. С. 237-239.

85. Смирнова Г.В., Закирова О.Н., Октябрьский О.Н. Роль антиоксидантных систем в отклике бактерий Escherichia coli на тепловой шок // Микробиология. 2001. Т. 70. №5. С. 595-601.

86. Сорокин Д.Ю. Биология морских гетеротрофных и алкалофильных серо-окисляющих бактерий // Автореф. дисс. на соиск. уч. ст. д.б.н. Москва, 2000.

87. Степанова В.П., Захаров И.А. Радиочувствительность ядра и митохон-дриона дрожжевой клетки: изучение методом цитодукции // Генетика. 1983. Т. 19. №6. С. 912-920.

88. Страховская М.Г., Шумарина А.О., Иванова Э.В., Фрайкин Г.Ф. Инактивация дрожжей Candidaguilliermondii видимым светом при индуцированном синтезе эндогенных порфиринов // Микробиология. 1998. Т. 67. № 3. С. 360-363.

89. Ткаченко А.Г., Салахетдинова О.Я., Пшеничнов М.Р. Обмен путресцина и калия между клеткой и средой как фактор адаптации Escherichia coli к гиперосмотическому шоку // Микробиология. 1997. Т. 66. № 3. С. 329-334.

90. Ткаченко А.Г., Салахетдинова О.Я., Пшеничнов М.Р. Роль транспорта путресцина и калия в адаптации Escherichia coli к голоданию по аммонию // Микробиология. 1996. Т. 65. № 6. С. 740-744.

91. Феофилова Е.П. Изменения в углеводном и липидном составе мицелия Cunninghamella japonica во время длительного высокотемпературного стресса // Микробиология. 1993. Т. 62. № 1. С. 62-69.

92. Феофилова Е.П. Торможение жизненной активности как универсальный биохимический механизм адаптации микроорганизмов к стрессовым воздействиям // Прикладная биохимия и микробиология. 2003. Т. 39. № 1. С. 5-24.

93. Феофилова Е.П. Трегалоза, стресс и анабиоз // Микробиология. 1992. Т. 61. №5. С. 741-755.

94. Феофилова Е.П., Кузнецова Л.С. Влияние антиоксидантов на рост и состав липидов Cunninghamella japonica в норме и под действием стрессора // Микробиология. 1996. Т. 65. № 4. С. 467-473.

95. Феофилова Е.П., Терешина В.М., Хохлова Н.С., Меморская А.С. О различных механизмах биохимической адаптации мицелиальных грибов к температурному стрессу: изменение в составе углеводов цитозоля // Микробиология. 2000. Т. 69. № 5. С. 606-611.

96. Фёршт Э. Структура и механизм действия ферментов. Пер. с англ. М.: Мир, 1980. 432 с.

97. Филимонова М.Н., Губская В.П., Нуретдинова И.А., Бенедик М.Дж., Богомольная Л.М., Андреева М.А., Лещинская И.Б. Изоформы нуклеазы Ser-ratia marcescens. Роль ионов Mg2+ в механизме гидролиза // Биохимия. 1997. Т. 62. №9. С. 1148-1154.

98. Хохлов А.С. Низкомолекулярные микробные ауторегуляторы. М.: Наука, 1988. 271 с.

99. Черников М.П. Протеолиз и биологическая ценность белков (Казенны как собственно пищевые белки). М., 1975. 125 с.

100. Эйдус Л .X. Биологическое действие излучений. Физический энциклопедический словарь. Т. 2. М.: Советская энциклопедия, 1962. С. 124-129.

101. Эль-Регистан Г.И. Роль мембраннотропных ауторегуляторных факторов в процессах роста и развития микроорганизмов. Дисс. на соиск. уч. ст. д.б.н. М. 1988.

102. Эль-Регистан Г.И., Гальченко В.Ф., Ильинская О.Н., Колпаков А.И., Мулюкин А.Л., Крылов И.А. Функции химических шаперонов в развитии анабиоза и устойчивости микроорганизмов. Ферменты микроорганизмов. Казань, XII юбилейная конференция, 2001. С. 50-53.

103. Эмануэль Н.М. Физико-химические основы применения фенольных соединений в химии и биологии. Фенольные соединения и их биологические функции. М.: Наука, 1968. С. 311-331.

104. Altuvia S., Almiron М., Huisman G., Kolter R., Storz G. The dps promoter is activated by OxyR during growth and by IHF and sigma S in stationary phase // Mol. Microbiol. 1994. V. 13. P. 265-272.

105. Antelmann H., Engelmann S., Scmid R., Hecker M. General oxidative stress response in Bacillus subtilis: cloning, expression and mutation of the alkylhydroperoxide reductase operon//J. Bacteriol. 1996. V. 178. P. 6571-6578.

106. Apte S.K., Fernandes Т., Badran H., Ballal A. Expression and possible role of stress-responsive proteins in Anabaenal! J. Biosciences (Bangalore). 1998. V. 23. № 4. P. 399-406.

107. Armstrong-Buisseret L., Cole M.B., Stewart G.S. A homologue to the Escherichia coli alkylhydroperoxide reductase AhpC is induced by osmotic upshock in Staphylococcus aureus II Microbiol. 1995. V. 141. P. 1655-1661.

108. Atlung Т., Hansen F.G. Low-temperature-induced DnaA protein synthesis does not change initiation mass in Escherichia coli K-12 // J. Bacteriol. 1999. V. 181. №18. P.5557-5562.

109. Azevedo D. The Saccharomyces cerevisiae Yapl yeast oxidative stress sensor is activated by menadione, cadmium, diamide and H202 through different mechanisms // Euro. J. Biochem. 2001. V. 268. № si. P. 43-189.

110. Basaga H.S. Biochemical aspect of free radicals// Biochem. Cell. Biol. 1990. V. 68. P. 989-998.

111. Baskakov I., Bolen D.W. Forcing thermodynamically unfolded proteins to fold //J. Biol. Chem. 1998. V. 273. P. 4831-4834.

112. Benov L., Fridovich I. Superoxide dismutase protects against aerobic heat shock in Escherichia coli Hi. Bacteriol. 1995. V. 177. № 11. P. 3344-3346.

113. Benson A.K., Haldenwang W.G. The aB-dependent promoter of the Bacillus subtilis sigB operon is induced by heat shock//J. Bacteriol. 1993. V. 175. P. 1929-1935.

114. Bloomfield V.A. DNA condensation //Curr. Opin. Struct. Biol. 1996. V. 6. P. 334-341.

115. Boucher S., Klauck E., Fischer D., Lucassen M., Jung K., Hengge-Aronis R. Regulation of RssB-dependent proteolysis in Escherichia coli: a role for acetyl phosphate in a response regulator-controlled process // Mol. Microbiol. 1998. V. 27. P. 787-795.

116. Boylan S.A., Redfield A.R., Brody M.S., Price C.W. Stress-induced activation of the oB transcription factor of Bacillus subtilis 11 J. Bacteriol. 1993. V. 175. P. 7931-7937.

117. Bradford M.M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein — due binding // Analyt. Biochem. 1976. V. 72. P. 248-254.

118. Bradley T.M., Hidalgo E., Leautaud V., Ding H., Demple B. Cysteine-to-alanine replacements in the Escherichia coli SoxR protein and the role of the 2Fe-2S. centers in transcriptional activation // Nucleic. Acids Rev. 1997. V. 25. P. 1469-1475.

119. Brandi A., Pietroni P., Gualerzi C.O., Pon C.L. Post-transcriptional regulation of CspA expression in Escherichia coli 11 Mol. Microbiol. 1996. V. 19. № 2. P. 231-240.

120. Brandi A., Pon C.L., Gualerzi C.O. Interaction of the main cold shock protein CS7.4 (CspA) of Escherichia coli with the promoter region of HNS // Biochimie. 1994. V. 76. № Ю-11. P. 1090-1098.

121. Brettar I., Hoefle M.G. Nitrous oxide producing heterotrophic bacteria from the water column of the central Baltic: abundance and molecular identification // Mar. Ecol. Prog. Ser. 1993. V. 94. P. 253-265.

122. Brioukhanov A., Netrusov A., Sordel M., Thauer R.K., Shima S. Protection of Methanosarcina barkeri against oxidative stress: identification and characterization of an iron superoxide dismutase// Arch. Microbiol. 2000. V. 174. № 3. P. 213-216.

123. BsatN., Herbig A., Casillas-Martinez L., Setlow P., Helmann J.H. Bacillus subtilis contains multiple Fur homologues: identification of the iron uptake (Fur) and peroxide regulon (PerR) repressors//Mol. Microbiol. 1998. V. 29. P. 189-198.

124. Carmel-Harel O., Stearman R., Gasch A.P., Botstein D., Brown P.O., Storz G. Role of thioredoxin reductase in theYaplp-dependent response to oxidative stress in Saccharomyces cerevisiae 11 Mol. Microbiol. 2001. V. 39. № 3. P. 595-605.

125. Cashel M., Rudd K.F. The stringent response // Escherichia coliand Salmonella typhimurium / Eds. Neidhardt F.C. et al. Washington DC: ASM Press, 1987. P. 1410-1438.

126. Chen L., Keramati L., Helmann J.D. Coordinate regulation of Bacillus subtilis peroxide stress genes by hydrogen peroxide and metal ions // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1995. V. 92. P. 8190-8194.

127. Cirilo R. The response of Saccharomyces cerevisiae to oxidative stress conditions involves the gene GTT2 // Euro. J. Biochem. 2001. V. 268. № si. P. 43-189.

128. Claiborne A. Catalase activity // Handbook of Methods for Oxygen Radical Research. Boca Raton: CRC Press. 1986. P. 283-284.

129. Conter A., Menchon C., Gutierrez C. Role of DNA supercoiling and RpoS sigma factor in the osmotic and growth phase-dependent induction of the gene osmE of Escherichia coli K-12 // J. Mol. Biol. 1997. V. 273. P. 61-74.

130. Davidson J.F., Whyte В., Bissinger P.H., Schiestl R.H. Oxidative stress is involved in heat-induced cell death in Saccharomyces cerevisiae // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1996. V. 93. № 10. P. 5116-5121.

131. Davies K.J.A. Protein damage and degradation by oxygen radicals // J. Biol. Chem. 1987. V. 262. P. 9902-9907.

132. De Maio A. Heat shock proteins: facts, thoughts and dreams // Shock. 1999. V. 11. №1. P. 1-12.

133. Deryabina Yu., Bazhenova E., Saris N.-E., Zvyagilskaya R. Ca2+ efflux from mitochondria of the teast Endomyces magnusii I/ J. Biol. Chem. 2001. V. 276. P. 47901-47906.

134. Dillon J.G., Tatsumi C.M., Tandingan P.G., Castenholz R.W. Effect of environmental factors on the synthesis of scytonemic, a UV-screening pigment, in a cyanobacterium {Chroococcidiopsis sp.)//Arch. Microbiol. 2002. V. 177. P. 322-331.

135. Ding H., Demple B. In vivo kinetics of a redox-regulated transcriptional switch // Proc. Natl. Acad. USA. 1997. V. 94. P. 8445-8449.

136. Dworkin M. Recent advances in the social and developmental biology of the Myxobacteria 11 Microbiol. Rev. 1996. V. 60. № 1. P. 70-84.

137. Ellis S.W., Grindle M., Lewis D.H. // Mycol. Res. 1991. V. 95. P. 457-464.

138. Esposito D., Del Vecchio P., Barone G. Interaction with natural polyamines and thermal stability о DNA. A DSC study and a theoretical reconsideration //J. Am. Chem. Soc. 1997. V. 119. P. 2606-2613.

139. Farewell A., Kvint K., Nystrom T. Negative regulation by RpoS: a case of a sigma factor competition // Mol. Microbiol. 1998. V. 29. P. 1039-1051.

140. Farr S.B., Kogoma T. Oxidative stress responses in Escherichia coli and Salmonella typhimurium II Microbiol. Rev. 1991. V. 55. P. 561-585.

141. Folch J., Less M., Sloane-Stanley C.A. A simple method for the isolation and purification of total lipids from animal tissues // J. Biol. Chem. 1957. V. 226. № 1. P. 497-509.

142. Fridovich I. Superoxide dismutases // Ann. Rev. Biochem. 1975. V. 44. № 1. P. 147-159.

143. Fridovich I. Superoxide dismutases: adaptation to paramagnetic gas // J. Biol. Chem. 1989. V. 264. P. 7761-7770.

144. Fridovich I. The biology of oxygen radicals // Science. 1978. V. 201. P. 875-880.

145. Fuqua W.C., Winans S.C., Greenberg E.P. Quorum sensing in bacteria: the LuxR-LuxI family of cell density-responsive transcriptional regulators// J. Bacteriol. 1994. V. 176. № 2. P. 269-275.

146. Gardner P.R., Fridovich I. Superoxide sensitivity of Escherichia coli aconitase //J. Biol. Chem. 1991. V. 266. P. 19328-19333.

147. Gaudu P., Weiss B. SoxR, a 2Fe-2S. transcription factor, is active only in its oxidized form //Proc. Natl. Acad. USA. 1996. V. 93. P. 10094-10096.

148. Goldstein J., Pollit N.S., Inouye M. Major cold shock protein of Escherichia coli I/ Proc. Natl. Acad. USA. 1990. V. 87. № 1. P. 283-287.

149. Graf E., Empson K., Eaton J. Phytic acid — a natural antioxidant //J. Biol. Chem. 1987. V. 262. P. 11647-11650.

150. Graumann P., Marahiel M.A. Some like it cold: response of microorganisms to cold shock // Arch. Microbiol. 1996. V. 166. P. 293-300.

151. Graumann P., Schroder K., Schmid R. Cold shock stress-induced protein in Bacillus subtilis 111. Bacteriol. 1996. V. 178. P. 4611-4619.

152. На H.C., Sirisoma N.S., Kuppusamy P. The natural polyamine spermine functions directly as a free radical scavenger // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1998a. V. 95. P. 11140-11145.

153. На H.C., Yager J.D., Woster P.M., Casero R.A. Structural specificity of polyamine analogues in the protection of DNA from strand breaks induced by reactive oxygen species// Biochem. Biophys. Res. Commun. 1998b. V. 244. P. 298-303.

154. Hage R., Hora J., Swarthoff Т., Twisker R. Method for enhancing the activity of enzymes // US 6225275, 2001.

155. Hecker M., Volker U. General stress proteins in Bacillus subtilis II FEMS Microbiol. Ecol. 1990. V. 74. P. 197-214.

156. Hecker M., Volker U. Non-specific, general and multiple stress resistance of growth-restricted Bacillus subtilis cells by the expression of the oB regulon // Mol. Microbiol. 1998. V. 29. P.l 129-1136.

157. Hengge-Aronis R. Back to log phase: crs as a global regulator in the osmotic control of gene expression // Mol. Microbiol. 1996. V. 21. P. 887-893.

158. Hengge-Aronis R. Survival of hunger and stress: the role of rpoS in early stationary phase gene regulation in Escherichia coli II Cell. 1993. V. 72. P. 165-168.

159. Hidalgo E., Bollinger J., Bradley T.M., Walsh C.T.4, ^Demple B. Binuclear 2Fe-2S. clusters in the Escherichia coli SoxR protein and role of the metal centers in transcription //J. Biol. Chem. 1995. V. 270. P. 20908-20914.

160. Hidalgo E., Demple B. Adaptive responses to oxidative stress: the SoxRS and OxyR regulon. In: Regulator of gene expression in Escherichia coli / Ed. Lin E., Linch A. Austin: R.G. Landes Company, 1996. P. 435-452.

161. Hladyszowski J., Zubik L., Kozubek A. Quantum mechanical and experimental oxidation studies of pentadecylresorcinol, olivetol, orcinol and resorcinol // Free Radic. Res. 1998. V. 28. № 4. P. 359-368.

162. Honda K., Kataoka M., Sakuradani E., Shimizu S. Role of Acinetobacter calcoaceticus 3,4-dihydrocoumarin hydrolase in oxidative stress defence against peroxoacids // Euro. J. Biochem. 2003. V. 270. № 3. P. 486-494.

163. Hossain M.M., Nakamoto H. Role for the cyanobacterial HtpG in protection from oxidative stress // Current Microbiol. 2003. V. 46. № I. P. 70-76.

164. Huisman G.W., Kolter R. Sensing starvation: a homoserine lactone — dependent signaling pathway in Escherichia coli II Science. 1994. V. 265. P. 537-539.

165. Hussain N.H., Goodson M., Rowbury R J. // Science Progress. 1998. V. 81. № 1. P. 69-80.

166. Ichise N., Morita N., Hoshino Т., Kawasaki K., Yumoto I., Okuyama H. A mechanism of resistance to hydrogen peroxide in Vibrio rumoiensis S-l // Appl. Environ. Microbiol. 1999. V. 65. № 1. P. 73-79.

167. Imlay J.A., Fridovich I. Assay of metabolic superoxide production in Escherichia coli/П. Biol. Chem. 1991a. V. 266. P. 6957-6965.

168. Imlay J.A., Fridovich I. Superoxide production by respiring membranes of Escherichia coli II Free Radic. Res. Comms. 1991b. V. 12-13. P. 59-66.

169. Ishihama A. Adaptation of gene expression in stationary phase bacteria // Curr. Opin. Genet. Develop. 1997. V. 7. P. 582-588.

170. Jamieson D.J. Oxidative stress responses of Saccharomyces cerevisiae II Redox. Rep. 1995. V. 1. № 1. P. 89-95.

171. Jamieson D.J., Storz G. Transcriptional regulators of oxidative stress response. In: Oxidative stress the molecular biology of antioxidant defenses / Ed. Scandalios J.G. Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor, 1997. P. 91-115.

172. Jiang W., Hou Y., Inouye M. CspA, the major cold-shock protein of Escherichia coli, is an RNA chaperone//J. Biol. Chem. 1997. V. 272. № 1. P. 196-202.

173. Jones P.G., Cashel U., Glaser G., Neidhardt F.C. Function of a relaxed-like state following temperature downshifts in Escherichia coli 11 J. Bacteriol. 1992a. V. 174. P.3903-3914.

174. Jones P.G., Inouye M. RbfA, 30S ribosomal binding factor, is a cold-shock protein whose absence triggers the cold-shock response // Mol. Microbiol. 1996. V. 21. №6. P. 1207-1218.

175. Jones P.G., Inouye M. The cold-shock response — a hot topic // Mol. Microbiol. 1994. V. 11. № 5. P. 811 -818.

176. Jones P.G., Krah R., Tafuri S.R., Wollfe A.P. DNA gyrase, CS7.4, and the cold shock response in Escherichia coli И J. Bacteriol. 1992b. V. 174. № 18. P. 5798-5802.

177. Jones P.G., Mitta M., Kim W.J., Inouye M. Cold shock inducts a major ribosomal-associated protein that unwinds double-standed RNA in Escherichia coli 11 Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1996. V. 93. P. 76-80.

178. Jones P.G., VanBogelen R.A., Neidhardt F.C. Induction of proteins in response to low temperature in Escherichia coli Hi. Bacteriol. 1987. V. 169. № 5. P. 2092-2095.

179. Kaiser D., Losick R. How and why bacteria talk to each other // Cell. 1993. V. 79. P. 873-885.

180. Kandror O., Goldberg A.L. Trigger factor is induced upon cold shock and enhances viability of Escherichia coli at low temperature // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1997. V. 94. P. 4978-4981.

181. Kell D., Kaprelyants A.S., Grafen A. Pheromones, social behavior and functions of secondary metabolism in bacteria // Trend in Ecology and Evolution. 1995. V. 10. P. 126-129.

182. Keyer K., Gort A.S., Imlay J. A. Superoxide and the production of oxidative DNA damage//J. Bacteriol. 1995. V. 177. P.6782-6790.

183. Keyer K., Imlay J.A. Superoxide accelerates DNA damage by elevating free-iron levels // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1996. V. 93. P. 13635-13640.

184. Khan A.U.//Science. 1970. V. 168. P.476-482.

185. Kilstrup M., Jacobsen S., Hammer K., Vogensen F.K. Induction of heat shock proteins DnaK, GroEL and GroES by salt stress in Lactococcus lactic И Appl. Environ. Microbiol. 1997. V. 179. № 17. P. 5471-5481.

186. Klibanov A.M.//Trends in Biochem. Tech. 1997. V. 15. P. 97-101.

187. Kogoma T. Stable DNA replication: Interplay between DNA replication, homology recombination, and transcription // Microbiol. Mol. Biol. Rev. 1997. V. 61. P. 212-238.

188. Kozubek A., Tyman J.H.P. Resorcinolic lipids, the natural non-isoprenoid phenolic amphiphiles and their biological activity // Chem. Rev. 1999. V. 99. № 1. P. 1-31.

189. Kruger E., Volker U., Hecker M. Stress induction of clpC in Bacillus subtilis and its involvement in stress tolerance//J. Bacteriol. 1994. V. 176. № 11. P. 3360-3367.

190. Lange R., Hengge-Aronis R. Identification of a central regulator of stationary-phase gene expression in Escherichia coli II Mol. Microbiol. 1991. V. 5. P. 49-59.

191. Lange R., Hengge-Aronis R. The cellular concentration of the ss subunit of RNA-polimerase in Escherichia coli is controlled at the levels of transcription, translation and protein stability//Genes Dev. 1994. V. 8. P. 1600-1612.

192. Laport M.S., da Silva M.R., Silva C.C., de Freire Bastos M.C., Giambiagi-deMarval M. Heat-resistance and heat-shock response in the nosocomial pathogen Enterococcus faecium И Current Microbiol. 2003. V. 46. P. 313-317.

193. Lausova A., Ferianc P., Polec B. The effect of different oxidative challenge on growth and stress protein induction in Escherichia coli И Biologia (Bratislava). 1999. P. 649-660.

194. Leblanc L., Leboeuf C., Leroi F., Hartke A., Auffray Y. Comparison between NaCl tolerance response and acclimation to cold temperature in Shewanella putrefaciens 11 Current Microbiol. 2003. V. 46. P. 157-162.

195. Leblanc L., Leroi F., Hartke A., Auffray Y. Do stresses encountered during the smoked salmon process influence the survival of the spoiling bacterium Shewanella putrefaciensl II Lett. Appl. Microbiol. 2000. V. 30. P. 427-442.

196. Lee P.C., Bochner B.R., Ames B.N. AppA, heat shock stress and cell oxidation // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1983. V. 80. P. 7596-7600.

197. Lelivelt M.J., Kawula Т.Н. Hsc66, an Hsp70 homolog in Escherichia coli, is induced by cold shock but not by heat shock// J. Bacteriol. 1995. V. 177. № 17. P. 4900-4907.

198. Lemos J.A.C., Burne R.A., Castro A.C.D. Molecular cloning, purification and immunological response of recombinant GroEL and DnaK from Streptococcus pyogenes И FEMS Immunol. Med. Microbiol. 2000. V. 28. P. 121-128.

199. Lemos J.A.C., Giambiagi-deMarval M., Castro A.C.D. Expression of heat shock proteins in Streptococcus pyogenes and their immunoreactivity with sera from patients with streptococcal diseases // Med. Microbiol. 1998. V. 47. P. 711-715.

200. Lenders J.P., Crichton R.R. Thermal stabilization of amylolytic enzymes by covalent coupling to soluble polysaccharides // Biotechnol. Bioeng. 1984. V. 26. P. 1343-1351.

201. Liochev S.I., Hausladen A., Beyer W.F., Fridovich I. NADPH-ferredoxin oxidoreductase acts as a paraquat diaphorase and is a member of the soxRS regulon //Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1994. V. 91. P. 1328-1331.

202. Loewen P.C., Hengge-Aronis R. The role of the sigma factor gs (KatF) in bacterial global regulation // Annu. Rev. Microbiol. 1994. V. 48. P. 53-80.

203. Loosdrecht van M. Bacterial adhesion / Wageningen: Agricaltural Univer., 1990. P. 200.

204. Lowry O.H., Rosebrough N.J., Farr A.L., Randall R.J. Protein measurement with the Folin phenol reagent//J. Biol. Chem. 1951. V. 193. P. 265-275.

205. Marshall K.C. Adhesion as a strategy for access to nutrients // Bacterial adhesion. Molecular and ecological diversity. New York: Wiley-Liss, 1996. P. 59-88.

206. Martinez A., Kolter R. Protection of DNA during oxidative stress by the nonspecific DNA-binding protein Dps//J. Bacteriol. 1997. V. 179. P. 5188-5194.

207. Messner K.R., Imlay J. A. The identification of primary sites of superoxide and hydrogen peroxide formation in the aerobic respiratory chain and sulfite reductase complex of Escherichia coli И J. Biol. Chem. 1999. V. 274. P. 1011910128.

208. Michel V., Lehoux I., Depret G. The cold shock response of the phychotrophic bacterium Pseudomonas fragi involves four low-molecular-mass nucleic acid-binding proteins//J. Bacteriol. 1997. V. 179. P. 7991-7942.

209. Miller G.L. // Anal. Chem. 1959. V. 31. № 5. P. 426.

210. Mongkolsuk S., Vattanaviboon P., Praituan W. Induced adaptive and cross-protection responses against oxidative stress killing in a bacterial phytopathogen, Xanthomonas oryzae pv oryzae И FEMS Microbiol. Lett. 1997. V. 146. № 2. P. 217-222.

211. Moreau P.L., Gerard F., Lutz N.W., Cozzone P. Non-growing Escherichia coli cells starved for glucose or phosphate use different mechanisms to survive oxidative stress // Mol. Microbiol. 2001. V. 39. № 4. P. 1048-1060.

212. Morris J.G. Bacterial shock responses // Endeavour, New Series. 1993. V. 17. № 1. P. 2-6.

213. Mosbach K. Immobilized enzymes and cells: Parts В, С // Methods Enzymol. V. 135 and 136. Academic Press, New York, 1987. P. 120.

214. Muffler A., Fischer D., Alluvia S., Storz G., Hengge-Aronis R. The response regulator RssB controls stability of the crs subunit of RNA polymerase in Escherichia c0////EMBOJ. 1996. V. 15. P. 1333-1339.

215. Murray K.D., Bremer H. Control of the spoT-dependent ppGpp synthesis and degradation in Escherichia coli Hi. Mol. Biol. 1996. V. 259. P. 41-57.

216. Musso H. Phenol oxidation reactions //Ange. Chem. Internat. Edit. 1963. V. 2. №12. P. 723-735.

217. Nathan C.F. Secretory products of macrophages // J. Clin. Invest. 1987. V. 79. P. 319-326.

218. Neves M.J., Jorge J.A., Francois J.M., Terenzi H. Effects of heat shock on the level of trehalose and glycogen, and on the induction of thermotolerance in Neurospora crassa 11 FEBS Lett. 1991. V. 283. № 1. P. 19-22.

219. Nunoshiba Т., Hidalgo E., Cuevas C.F.A., Demple B. 2-Stage control of an oxidative stress regulon — the Escherichia coli soxR protein triggers redox-inducible expression of the soxS regulatory gene // J. Bacteriol. 1992. V. 174. P. 6054-6060.

220. Nystrom Т., Neidhardt F.C. Cloning, mapping and nucleotide sequencing of a gene encoding a universal stress protein in Escherichia coli II Mol. Microbiol. 1992. V. 6. P. 3187-3198.

221. Pannekoek Y., van Putten J.P., Dankert J. Identification and molecular analysis of 63-kilodalton stress protein from Neisseria gonorrhoeae II J. Bacteriol.1992. V. 174. № 21. P. 6928-6937.

222. Panoff J.-M., Thammavongs В., Gueguen M. Cold stress responses in mesophilic bacteria CY 972069 //J. Cryobiol. 1998. V. 36. P. 75-83.

223. Park J.J. Cellular responses to freeze-thawstress// Ph. D Thesis. University of New South Wales (Australia). 2000.

224. Parsek M.R., Greenberg E.P. Acyl-homoserine lactone quorum sensing in Gram-negative bacteria: A signaling mechanism involved in associations with higher organisms // PNAS. 2000. V. 97. № 16. P. 8789-8793.

225. Parsell D.A., Lindquist S. The function of heat-shock proteins in stress tolerance: degradation and reactivation of damaged proteins//Annu. Rev. Genet.1993. V. 27. P. 437-496.

226. Peng Q., Berg K., Moan J., Kongshaug M., Nesland J.M. 5-Aminolevulinic acid-based photodynamic therapy: principles and experimental research //Photochem. Photobiol. 1997. V. 65. P. 235-251.

227. Pinheiro R., Belo I., Mota M. Oxidative stress response of Kluyveromyces marxianus to hydrogen peroxide, paraquat and pressure // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2002. V. 58. № 6. P. 842-847.

228. Piper P.W. Molecular events associated with acquisition of heat tolerance by the yeast Saccharomyces cerevisiae // FEMS Microbiol. Rev. 1993. V. 11. № 4. P. 339-355.

229. Plaza del Pino I.M., Sanchez-Ruiz J.M. An osmolyte effect on the heat capacity change for protein folding// Biochemistry. 1995.V. 34. P. 8621-8634.

230. Qu Y., Bolen C.L., Bolen D.W. Osmolyte-driven contraction of a random coil protein // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1998. V. 95. P. 9268-9273.

231. Rao N., Kornberg A. Inorganic polyphosphate supports resistance and survival of stationary phase Escherichia colill J. Bacteriol. 1996. V. 178. P. 1394-1400.

232. Rowbury R.J. Life sciences up-date. Do we need to rethink our ideas on the mechanisms of inducible processes in bacteria?// Science Progress. 1998. V. 81. №3. P. 193-204.

233. Rowbury R.J., Goodson M. An extracellular acid-stress-sensing protein needed for acid tolerance induction in Escherichia coli II FEMS Microbiol. Lett. 1999a. V. 174. № 1. P. 49-55.

234. Rowbury R.J., Goodson M. An extracellular stress-sensing protein is activated by heat and UV irradiation as well as by mild acid ity, the activation producing an acid tolerance-including protein // Lett. Appl. Microbiol. 1999b. V. 29. № 1. P. 10-14.

235. Rowbury R.J., Goodson M. Extracellular sensing and signaling pheromones switch-on thermotolerance and other stress responses in Escherichia coli II Science Progress. 2001. V. 84. P. 205-233.

236. Rowbury R.J., Humphrey T.J., Goodson M. Properties of an L-glutamate-induced tolerance response which involves the functioning of extracellular induction components //J. Appl. Microbiol. 1999. V. 86. P. 325-330.

237. Rowbury R.J., Hussain N.H. // Lett. Appl. Microbiol. 1998. №27. P. 193-197.

238. Rusting R.L. Why do we age // Sci. Amer. 1992. V. 267. P. 86-95.

239. Salmond G., Bycroft B.W., Stewart C., Williams P. The bacterial "enigma": cracking the code of cell-cell communication // Mol. Microbiol. 1995. V. 16. № 4. P. 615-624.

240. Sanders J.W., Venema G. Kok J. Environmental stress responses in Lactococcus lactis II FEMS Microbiol. Rev. 1999. V. 23. № 3. P. 483-501.

241. Schein C.H. Solubility as a function of protein structure and solvent components // Biotechnology. 1990. V. 8. P. 308-317.

242. Schultz T.W. Relative toxicity of para-substituted phenols: log KOW and pKa-dependent structure-activity relationships // Bull Environ. Contam. and Toxicol. 1987. V. 38. № 6. P. 994-1002.

243. Seaver L.C., Imlay J. Alkylhydroperoxide reductase is the primary scavenger of endogenous hydrogen peroxide in Escherichia coli I/ J. Bacteriol. 2001. V. 183. P. 7173-7181.

244. Shapiro D.A., Dworkin M. (Eds.). Bacteria as multicellular organisms / N-Y.: Oxford Univ. Press, 1997. 456 p.

245. Shinto Т., Hiraki C. Enzyme reaction stabilizers and enzyme preservatives // EP0599652. 1994.

246. ShuklaH.D., Singh B.R. Identification ofDnaJ-likechaperonein Clostridium botulinum type A // J. Protein Chem. 1999. V. 18. № 6. P. 695-700.

247. Skorko-Glonek J., Zurawa D., Kuczwara E., Wozniak M., Wypych Z., Lipinska B. The Escherichia coli heat shock protease HtrA participates in defense against oxidative stress // Mol. Gen. Genet. 1999. V. 262. № 2. P. 342-350.

248. Sorokin D.Yu., Robertson L.A., Kuenen J.G. Isolatoin and characterization of alkaliphilic, chemolithoautotrophic, sulphur-oxidizing bacteria // Antonie van Leeuwenhoek. 2000. V. 77. P. 251-260.

249. Storz G., Imlay J.A. Oxidative stress // Curr. Opin. Microbiol. 1999. V. 2. №2. P. 188-194.

250. Storz G., Tartaglia L.A., Ames B.N. Transcription regulator of oxidative stress-inducible genes: direct activation by oxidation // Science. 1990. V. 248. P. 189-194.

251. Storz G., Toledano M. Regulation of bacterial gene expression in response to oxidative stress // Methods in Enzymology. 1994. V. 236. Part B. P. 196-207.

252. Stranjord A.J.G., Barbara P.F. Proton-transfer kinetics of 3-hydroxyflavone: solvent effects. //J. Phys. Chem. 1985. V. 89. P. 2355.

253. Sugiyama K., Izawa S. Inoue Y. The Yaplp-dependent induction of glutathione synthesis in heat shock response of Saccharomyces cerevisiae II J. Biol. Chem. 2000. V. 275. №20. P. 15535-15540.

254. Sunamoto J., Hamada Т., Seto Т., Yamamoto S. // Bull. Chem. Soc. Jap. 1980. V. 53. P. 583-589.

255. Sunamoto J., Kondo H., Akimaru K. // Chem. Lett. 1978. V. 8. P. 821-824.

256. Svensater G., Sjogreen В., Hamilton I.R. Multiple stress responses in Streptococcus mutans and induction of general and stress-specific proteins // Microbiol. UK. 2000. V. 146. №1. P. 107-117.

257. Tartaglia L.A., Storz G., Brodsky M.N. Alkylhydroperoxide reductase from Salmonella typhimurium: sequence and homology to thioredoxin reductase and other flavoprotein disulfide oxidoreductases//J. Biol. Chem. 1990. V. 265. P. 10525-10540.

258. Tatzelt J., Prusiner S.B., Welch W.J. Chemical chaperones interfere with the formation of scrapie prion protein // Moll. Cell. Biol. 1996. V. 15. № 23. P. 6363-6373.

259. Terzenbach D.P., Blaut M. Purification and characterization of a catalase from the nonsulfur phototrophic bacterium Rhodobacter sphaeroides ATH 2.4.1 and its role in the oxidative stress response // Arch. Microbiol. 1998. V. 169. № 6. P. 503-508.

260. Timasheff S.N., Arakawa T. Protein structure. A practical approach / IRL Press, Oxford, 1990. 331 p.

261. Tkachenko A., Nesterova L., Pshenichnov M. The role of the natural polyamine putrescine in defense against oxidative stress in Escherichia colill Arch. Microbiol. 2001. V. 176. № 1/2. P. 155-157.

262. Tluscik F., Kozubek A., Mejbaum-Katzenellenbogen W. Alkylresorcinols in rye (Secale cereale L.) grains // Act. Soc. Bot. Pol. 1981. V. 54. № 7. P. 645-651.

263. Tonami H., Uyama H., Kobayashi S., Fujita Т., Taguchi Y., Osada K. Chemoselective oxidative polymerization of m-ethynylphenol by peroxidase catalyst to a new reactive polyphenol // Biomacromolecules. 2000. V. 2. № 1. P. 149-151.

264. Tran L.T., Inoue Y., Kimura A. Oxidative stress response in yeast: purification and some properties of a membrane-bound glutathione peroxidase from Hansenula mrakii /I Biochem. Biophys. Acta. 1993. V. 1164. P. 166-172.

265. Van der Meulen F.W., Ibrahim K., Sterenborg H.J., Alphen L.V., Maikoe A., Dankert J. Photodynamic destruction of Haemophilus parainfluenzae by endogenously produced porphyrins //J. Photochem. Photobiol. B. Biol. 1997. V. 40. P. 204-208.

266. Van der Vies S.M., Georgopoulos C. Regulation of chaperonin gene expression // Chaperonins (Series: Cell Biology, A Series of Monographs). 1996. P. 137-166.

267. Viner R. Hans Selye and the making of stress theory // Social studies of science. L. 1999. V. 29. № 3. P. 391-410.

268. Volker U., Engelmann S., Maul В., Riethdorf S., Volker A., Schmid R., Mach H., Hecker M. Analysis of the induction of general stress proteins of Bacillus subtilis II Microbiol. 1994. V. 140. P. 741-752.

269. Volkin D.B., Klibanov A.M. A practical approach. In: Protein function / Ed. Creighton Т.Е. IRL Press, Oxford, UK, 1989. P. 1-24.

270. Vorobjeva L.I., Khodjaev E.Yu., Cherdinceva T.A. The study of induced antimutagenesis of propionic acid bacteria//J. Microbiol. Meth. 1996. V. 24. № 3. P. 249-258.

271. Vorobjeva L.I., Khodjaev E.Yu., Ponomareva G.M., Varjuhina S.Yu. // Proc. 3rd Int. Conf. on Predictive Modeling in Foods. Leuven. Belgium. 2000. P. 182-184.

272. Votyakova T.V., Bazhenova E.N., Zvyagilskaya R.A. Regulation of the yeast mitochondrial Ca2+ uptake by polyamines and Mg2+ // J. Bioenerg. Biomembr. 1993. V. 25. P. 569-574.

273. Wang J.Y., Syvanen M. DNA twist as a transcriptional sensor for environmental changes // Mol. Microbiol. 1992. V. 614. P. 1861-1866.

274. Welch W.J., Brown C.R. Influence of molecular and chemical chaperones on protein folding//Cell Stress and Chaperones. 1996. V. l.№2. P. 109-115.

275. Welsh D.T. Ecological significance of compatible solute accumulation by microorganisms: from single cells to global climate // FEMS Microbiol. Rev. 2000. V. 24. № 3. P. 263-290.

276. Winkler K., Kienle I., Burger M., Wagner L.C., Holzier H. Metabolic regulation of the trehalose content of vegetative yeast // FEBS Lett. 1991. V. 291. № 2. P. 269-272.

277. Woods M.L., Bonfiglioli R., MsGee L.A. Georgopoulos C. Synthesis of select group of proteins by Neisseria gonorrhoeable in response to thermal stress // Infect, and Immun. 1990. V. 58. № 3. P. 719-725.

278. Wu J., Dunkan W., Wiess B. Overproduction and physical characterization of SoxR 2Fe-2S. protein that governs an oxidative response regulon in Escherichia coli IIУ Biol. Chem. 1995. V. 270. № 17. P. 10323-10327.

279. Yumoto I., Yamazaki K., Kawasaki K., Ichise N., Morita N., Hoshino Т., Okuyama H. Isolation of Vibrio sp. S-l exhibiting extraordinarily high catalase activity//J. Ferment. Bioeng. 1998. V. 85. P. 113-116.

280. Zgurskaya H.I., Keyhan M., Matin A. The as level in starving Escherichia coli cells increases solely as a result of its increased stability, despite decreased synthesis // Mol. Microbiol. 1997. V. 24. P. 643-651.

281. Zheng M., Aslund F., Storz G. Activation of the OxyR transcription factor by reversible disulfide bond formation // Science. 1998. V. 279. P. 1718-1721.

282. Zheng M., Storz G. Redox sensing by prokaryotic transcription factors // Biochem. Pharmacol. 2000. V. 59. № 1. P. 1-6.

283. Zheng Y.-J., Ornstein R.L. // Biopolymers. 1996. V. 38. P. 791-799.

284. Zvyagilskaya R., Andreishcheva E., Soares I.M.I., Khozin I., Berhe A., Persson B.L. Isolation and characterization of a novel leaf-inhabiting osmo-, salt and alkali-tolerant Yarrowia lipolytica strain // J. Basic Microbiol. 2001. V. 41. P. 283-303.

285. Zvyagilskaya R., Bazhenova E., Deryabina Yu. The Ca2+ transport system of yeast mitochondria as affected by physiolodical effectors // Yeast. 1995. V. 11. P. 469.

286. Также благодарю свою любимую семью за постоянную моральную и материальную поддержку.

Информация о работе

Степаненко, Ирина Юрьевна
кандидата биологических наук
Москва, 2005
ВАК 03.00.07

Диссертация

Изучение роли алкилоксибензолов в стрессовом ответе микроорганизмов - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы