Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Атомно-силовая микроскопия аффинных взаимодействий в микробиологии
ВАК РФ 03.02.03, Микробиология
Автореферат диссертации по теме "Атомно-силовая микроскопия аффинных взаимодействий в микробиологии"
На правах рукописи
Краевский Сергей Владимирович
АТОМНО-СИЛОВАЯ МИКРОСКОПИЯ АФФИННЫХ ВЗАИМОДЕЙСТВИЙ В МИКРОБИОЛОГИИИ
03.02.03 - микробиология 03.01.06 - биотехнология (в том числе бионанотехнологии)
АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Оболенск 2011
1 6 ИЮН 2011
4850578
Работа выполнена в ФГУП «Государственном научном центре Российской Федерации - Институте теоретической и экспериментальной физики».
Научные руководители: кандидат биологических наук
Игнатюк Т. Е.
кандидат биологических наук Игнатов С. Г.
Официальные оппоненты: доктор биологических наук
Жариков Г. А.
доктор биологических наук Герасимов В. Н.
Ведущая организация: Московский государственный университет
им. М.В. Ломоносова, Биологический факультет
Защита диссертации состоится «30» июня 2011 года 13-00 часов на заседании диссертационного совета Д 350.002.01 при ФГУН «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» по адресу: 142279, Оболенск Серпуховского района Московской области.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУН «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии»
Автореферат разослан a^Q^JL 2011г.
Отзывы в двух экземплярах, заверенные печатью, просим отправлять по адресу:
142279, Оболенск Серпуховского района Московской области, ФГУН ГНЦ прикладной микробиологии и биотехнологии, ученому секретарю совета
Н.К. Фурсовой. Факс 8(4967) 36-00-10, e-mail: fursova@obolensk.org
Ученый секретарь
диссертационного совета кандидат биологических наук
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы
Свойство аффинности определяет способность молекул к химическому взаимодействию между собой и играет большую роль в микробиологии при изучении взаимодействий антиген-антитело или фаг-бактерия. Методы сканирующей зондовой микроскопии (СЗМ), в том числе атомно-силовой микроскопии (АСМ), появившиеся в 1980-х годах, уже прочно вошли в арсенал физических методов, использующихся при изучении различных микробиологических объектов. Создание биочипов, разработка новых способов секвенирования ДНК, создание биологических контейнеров для доставки лекарств в организм - вот далеко не полный перечень актуальных на сегодняшний день вопросов, для решения которых можно использовать АСМ. Изучение поведения биополимеров и биополимерных комплексов, в том числе антиген-антитело, на поверхности подложки и особенностей их адсорбции востребовано для создания биосенсоров, для развития молекулярной электроники, для дизайна молекулярных архитектур.
Актуальность исследования такого взаимодействия как «фаг-клетка» сложно переоценить. Бактериофаги традиционно используются для передачи генетической информации в генетической инженерии, кроме того, всё более распространяющаяся резистентность бактерий к антибиотикам делает задачу развития фаготерапии более чем актуальной.
Широкий спектр возможностей, предоставляемый зондовой микроскопией для изучения бактерий и фагов - от получения трехмерных изображений с атомным разрешением до исследования локальных свойств объекта -обуславливает большое количество работ по этой тематике, публикуемых ежегодно в ведущих научных журналах.
Целью диссертационной работы является применение атомно-силовой микроскопии для исследования аффинных взаимодействий фаг-бактерия и антиген-антитело в микробиологии.
Задачи исследования:
1. Разработать метод визуализации и исследования взаимодействия «фаг-клетка» с помощью атомно-силовой микроскопии;
2. Исследовать различные стадии процесса инфицирования фагом бактериальной клетки с помощью АСМ;
3. Исследовать различные комбинации высокомолекулярных неспецифических модификаторов для улучшения сорбционных свойств поверхности по отношению к бактериальным клеткам для дальнейшего атомно-силового сканирования;
4. Разработать методику создания поверхности из активных антител, оптимизировать параметры такой методики с помощью атомно-силовой микроскопии, количественно и качественно исследовать сорбционные свойства полученной поверхности.
Научная новизна работы:
Разработана новая методика создания аффинной поверхности из активных антител для специфической визуализации бактерий. Проведены количественные и качественные АСМ исследования сорбционных свойств высокоспецифичной поверхности по отношению к фрагментам бактериальных клеток. Впервые разработан подход для изучения специфического взаимодействия фаг-клетка с помощью АСМ и проанализированы различные стадии заражения бактериальной клетки фагом для трех различных видов бактерий. С помощью АСМ изучались другие модификаторы поверхности, которые увеличивают адсорбцию определённых клеток.
Научная и практическая значимость
Разработан метод специального приготовления образцов бактериальных культур для исследования с помощью АСМ, что позволяет использовать данный метод для изучения аффинных взаимодействий в микробиологии. Разработанным метод исследования взаимодействия фаг-бактерия позволяет в физиологических условиях проследить различные этапы данного процесса, а также описать свойства бактериофага, важные для характеристики препаратов бактериофагов, предлагаемых для фаготерапии. Разработанные в процессе работы аффинные подложки на основе антител позволяют идентифицировать не только клетки бактерий, но и нанофрагменты бактериальных клеток. Основные результаты диссертационной работы использованы в процессе выполнения работ лабораторией атомио-масштабных исследований конденсированных сред ФГУП «Институт теоретической и экспериментальной физики» по гранту МНТЦ №3245 «Бионанотехнологический анализ аффинных поверхностей».
Положения, выносимые на защиту
1. Разработанный подход для изучения специфического взаимодействия бактериофаг-бактерия с помощью АСМ позволяет анализировать различные стадии заражения бактериальной клетки фагом.
2. Модификаторы поверхности подложек (ЦТАБ-лектин, БСА-глутаровый альдегид, крахмал, агароза) значительно увеличивающих адсорбцию бактериальных клеток.
3. Аффинные поверхности на основе антител обеспечивают специфическую визуализацию бактерий и их фрагментов с помощью АСМ.
4. Математическая обработка параметров взаимодействия антиген-антитело, заложенная в методе АСМ-детектирования, позволяет дать количественные и качественные характеристики процесса визуализации.
Личный вклад соискателя
Все экспериментальные измерения с помощью зондовой микроскопии выполнены автором лично. Кроме того, автор принимал участие в приготовлении образцов бактериальных клеток, бактериофагов, белков и их комплексов - совместно с сотрудниками ФГУН «ГНЦ прикладной микробиологии и биотехнологии» (Оболенск) и физического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова. Анализ и интерпретация экспериментальных данных проведены автором лично.
Апробация работы
Основные результаты диссертационной работы были доложены на следующих научных конференциях и школах: 8ft International EMBL Symposium, Heidelberg, Germany, November 2006; Межгосударственная научно-практическая конференция государств-участников СНГ "Чрезвычайные ситуации международного значения в общественном здравоохранении и санитарная охрана территорий государств-участников содружества независимых государств». Протвино, 2006; Первая Всероссийская Школа-семинар Современные достижения бионаноскопии. Москва, 2007; ESF-EMBO Symposium on Probing Interactions between Nanoparticles/Biomaterials and Biological Systems, Sant Feliu de Guixols, Spain, 2007; The XV International Conference and discussion scientific club "New Information Technology in Medicine, Pharmacology, Biology and Ecology". Yalta-Gurzuf, Ukraine, 31 May-9 June 2007; IV International conference on "NanoBio and related new and perspective biotechnologies". Pushchino, 2007; V I Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием «Молекулярная диагностика -2007», Москва, 2007; Вторая международная конференция «Современные достижения бионаноскопии». Москва, 2008; Международный форум по нанотехнологиям. Научно-технологических секция. Москва, 2008; Международная научно-практическая конференции «Нанотехнологии в сельском хозяйстве». Москва, 2008; Первая Международная научная школа "Наноматериалы и нанотехнологии в живых системах". Москва, 2009; Третья международная конференция «Современные достижения бионаноскопии».
Москва, 2009; Восьмая Курчатовская молодежная школа, Москва, 2010; Четвёртая международная конференция «Современные достижения бионаноскопии». Москва, 2010.
Диссертация апробирована на расширенном заседания секции НТС №4 (межлабораторном научном семинаре) ФГУП «Государственный научный центр РФ - Институт Теоретической и Экспериментальной Физики» от 18 марта 2011 г.
Публикации
Материалы диссертации опубликованы в 16 печатных работах, из них 5 статей в рецензируемых журналах перечня ВАК и 11 публикаций в сборниках, трудах и материалах конференций.
Структура и объем диссертации
Диссертационная работа состоит из введения, четырёх глав, заключения, списка литературы, включающего 122 наименования: 4 ссылки на русском языке и 118 на английском. Работа изложена на 101 страницах, содержит 29 рисунков и 2 таблицы.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
В работе использовались штаммы грамотрицательных бактерий Escherichia co/i 057 и Salmonella enteritidis 89 с их фагами, А157 и 39, соответственно, а также грамположительные бактерии Bacillus thuringiensis 393 с фагом Vf, предоставленные Государственным Исследовательским Центром Прикладной Микробиологии и Биотехнологий (Оболенск).
Приготовление образцов для сканирования на воздухе. На подложку наносили 10 - 20 мкл суспензии, или подложку помещали сверху на каплю или полностью погружали в раствор, содержащей исследуемый объект, выдерживали 115 минут для адсорбции, а затем высушивали в струе азота.
В качестве подложек использовали как свежесколотые, так и подвергнутые различным модификациям поверхности слюды, графита, кремния и золота. В качестве модификаторов использовалась методика тлеющего заряда, а также такие соединения, как бычий сывороточный альбумин (БСА), лектин выделенный из Triticum vulgare, лектин выделенный из CanavaHa ensiformis, глутаровый альдегид, Фиколл 400, имунноглобулин G и антитела.
АСМ-измерення проводили на атомно-силовом микроскопе Nanoscope Illa (Digital Instruments, USA) в режимах постоянного и прерывистого контакта. При измерениях в контактном режиме сканирования использовали коммерческие кантилеверы из нитрида кремния (Si3N4) с жёсткостью 0,01, и 0,3 Н/м (в зависимости от объекта). Для измерений в режиме прерывистого контакта на воздухе использовали коммерческие кантилеверы из кремния с номинальной жесткостью 11,5 Н/м. Резонансная частота сканирования лежала в диапазоне 193 -325 кГц.
Для обработки изображений использовали программу ФемтоСкан Онлайн (Центр перспективных технологий, Россия).
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Глава 1 содержит подробный обзор литературы по теме диссертации. Рассматриваются основы методов зондовой микроскопии (разделы 1.1-1.3), в особенности атомно-силовой, их преимущества и недостатки, по сравнению с методами электронной микроскопии, артефакты изображений, а также возможности при исследовании биологических объектов, таких как биополимеры, бактерии и бактериофаги. Описываются различные режимы работы АСМ. Особое внимание уделено рассмотрению сил, действующих между зондом и поверхностью во время сканирования. Разделы 1.4-1.6 содержат краткую справочную информацию по изучаемым биологическим объектам, а также обзор работ по конкретному применению АСМ (в основном) и СТМ для изучения
схожих биологических объектов. Раздел 1.7 посвящен АСМ вирусов, бактериофагов, а также актуальным проблемам фаготерапии. Подчеркнута потребность в прямых in vivo экспериментах по визуализации взаимодействия бактериофага с клеткой. Перечислены как наиболее значимые достижения в этой области, так и те проблемы, которые до настоящего времени решить не удалось.
Глава 2 посвящена исследованию с помощью АСМ взаимодействия фаг -клетка. В разделе «материалы и методы» Главы 2 подробно описывается разработанная методика эксперимента на примере грамотрицательных бактерий Escherichia coli 057 и Salmonella enteritidis 89 с их фагами, А157 и 39, соответственно.
О 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.8 0.7 (jm Высота токшок бастернофцгов, им
Рис. 1 Бактериофаги А157 к Е. Coli: (а) АСМ изображения полученные в тейпинг режиме, (Ь) Трехмерный вид (размеры изображения примерно 600x600x60 нм2); (с) ПЭМ изображение; (d) Профиль сечения вдоль пунктирной линии с АСМ изображения; (е) гистограмма распределения по высотам головок бактериофагов.
Процедура приготовления образцов для нанесения на подложку была следующая: суспензии, содержащие клетки (их концентрация варьировалась от 109 до Ю10 кл./мл) и бактериофаги (10ш-10" шт./мл) смешивали друг с другом, после чего помещали в термостат при температуре 37 °С. Затем пробы отбирали в различное время после инкубации и центрифугировали со скоростью 5000 об/с,
9
чтобы избавиться от посторонних примесей и не связавшихся бактериофагов. Осадок суспензировали в дистиллированной воде. Полученную суспензию наносили на свежий скол слюды для дальнейшего АСМ исследования.
На рис. 1 представлены изображения бактериофага V18/A157 к Escherichia coli, полученные с помощью АСМ (а, б) и ПЭМ (в), сечение, демонстрирующее профиль двух частиц бактериофага (г) и гистограмма распределения высоты головок бактериофага (д). Как видно из АСМ- и ПЭМ-изображений, бактериофаг V18/A157 состоит из головки и отростка.
Другой используемый в нашей работе бактериофаг, бактериофаг 39/s.e. к Salmonella enteritidis, не обнаруживает отростка на АСМ- и ПЭМ-изображениях и имеет более размытое распределение высот головки с максимумами, приходящимися приблизительно на значения 25 и 33 нм. Тот факт, что для обоих бактериофагов значение высоты, полученное из АСМ-изображений, меньше диаметра головки, объясняется как эффектом «высыхания» на подложке, так и воздействием кантилевера на образец. АСМ исследования взаимодействия Escherichia coli с бактериофагами V18/A157 показали, что бактериофаги закрепляются на поверхность клетки, и по прошествии некоторого количества времени клеточная стенка разрушается. Причем бактериофаги обнаруживаются на поверхности клетки уже через 5 минут
Рис.2. АСМ изображения полученные в контактном режиме клеток 51. enteritidis, инкубированных с бактериофагом 39 (а,Ь) в течение 5 мин., (c,d) - в течение 60 мин.
после их совместного термостатирования, затем количество бактериофагов заметно растет. АСМ-изображения клеток Escherichia coli, смешанных с бактериофагами 39/s.e. к Salmonella enteritidis при тех же условиях, не выявили наличия взаимодействия.
Такая же серия экспериментов была проведена нами и для клеток Salmonella enteritidis и бактериофагов к ним (39/s.e.). Соответствующие АСМ-изображения приведены на рисунке 2. Так же, как и в предыдущем случае, обнаружено связывания бактериофагов с клеточной стенкой бактерий и рост количества связанных бактериофагов с течением времени.
Отличительной особенностью было то, что бактериофаги были специфично связаны с кончиками пилей S. enteritidis. Термостатирование смеси клеток Salmonella enteritidis с бактериофагами v 18/А157 к Escherichia coli в течение часа, не выявило наличия связывания.
В следующем эксперименте взаимодействие фаг - клетка рассмотрено на примере грам-положительных бактериальных клеток Bacillus thuringiensis, со
специфичными к ним бактериофагами.
Исследуемые клетки
имеют форму палочек, длина которых (3-8 мкм в зависимости от возраста) в несколько раз больше ширины (около 1 мкм), а высота (или диаметр) клеток на поверхности слюды составляет около 500 нм.
На рисунке 3 представлена гистограмма распределения частиц бактериофага по высотам. Поскольку при нанесении бактериофагов на подложку и их высушивании может происходить их разрушение и даже выход РНК, что мы наблюдали и на других бактеориофагах, то распределение по
20 30 40 50 60 70 80 90 100
Высота бактериофагов, нм
Рисунок 3. Гистограмма распределения высот бактериофага к Bacillus thuringiensis.
высотам получилось довольно широким. Учитывая эффект воздействия кантилевера на частицы бактериофагов во время сканирования, диаметр головки бактериофагов к клеткам Bacillus thuringiensis можно оценивать по верхней границе распределения, т.е. 60 - 70 нм.
Процедура приготовления образцов для нанесения на подложку отличалась от предыдущих тем, что при инкубировании клеток с фагом в термостате мы использовали шейкер для дополнительной аэрации. Как и предполагалось, для аэробной клетки это является критическим условием для наблюдения процесса лизиса клетки.
На рис.4 можно увидеть, что клеточная стенка клеток В. инкубированных с бактериофагом (рис.4 Ь) в течении 120 мин без аэрации не
Рис 4. АСМ изображения клеток В. thuringiensis не смешанные с фагами (а), инкубированные с бактериофагом Vf при температуре 30 °С без аэрации в течении 2 часов (Ь), инкубированные с бактериофагом Vf при температуре 30 СС на шейкере в течении 5 мин (с) и 60 мин (d,e). (f) АСМ профиль вдоль черной линии с картинки (е), иллюстрирует шероховатость инфицированной клетки .
сильно изменилась по сравнению с контролем (рис. 4 а).
При аэрации заключительную литическую стадию с выходом бактериофагов можно уже наблюдать через 60 мин термостатирования (рис. 4. d). Кроме того, можно заметить, что поверхность клетки претерпевает критические изменения: обнаружено, что на ней образуются поры размером порядка 60-80 нм, что сопоставимо с размером бактериофага.
Глава 3 посвящена различным методикам модифицирования поверхностей для улучшения сорбции различных биологических объектов, в частности бактериальных клеток и дальнейшего АСМ исследования. Глава построена традиционно. После краткого введения, следует раздел 3.2 - материалы и методы.
В разделе 3.3.1 описаны исследованные влияние таких модификаторов, как: лектин и ЦТАБ (цетилтриметиламмония бромид).
Лектин выделенный из Phaseolus coccineu и нанесенный из раствора с концентрацией 1 мг/мл на свежесколотую слюду, образует на ее поверхности сплошной слой (рис. 5а). При нанесении на эту поверхность клеток Bacillus
Рис.5. АСМ-изображения (а) - лектина, нанесенного из раствора с концентрацией 1 мг/мл на поверхность слюды, АСМ-изображение клеток Bacillus thuringiensis, нанесенных (б) - на ЦТАБ-модифицированную слюду (контроль), (в) - на модифицированную ЦТАБом и лектином поверхность слюды. Размеры кадров составляют (а) 4,5x4,5 мкм2, (б), (в) 130x130 мкм2.
thuringiensis они практически не обнаруживаются на АСМ-изображениях, что связано, скорее всего, со смыванием белка с поверхности слюды при нанесении
водного раствора клеток. Чтобы закрепить этот белок на поверхности, поверхность слюды предварительно модифицировалась ЦТАБом (цетилтриметиламмония бромидом). На рис. 56 показано АСМ-изображение клеток Bacillus thuringiensis, нанесенных на ЦТАБ-модифицированную слюду (контроль), а на рис. 5в - АСМ-изображение этих же клеток, нанесенных при тех же условиях на модифицированную ЦТАБом и лектином поверхность. Анализ показал, что обработка лектином повышает степень адгезии обоих видов клеток на поверхность в 5 - 10 раз.
Похожие эксперименты были проведены для лектина из Conovalia ensiforimis. Показано, что грамположительные и грамотрицательные бактерии по-разному связываются с поверхностью, обработанной лектином из Conovalia ensiforimis: такая обработка в несколько раз повышает степень адсорбции клеток Bacillus thuringiensis и не влияет на адсорбцию Escherichia coli . Поэтому можно утверждать, что в первом случае речь идет о адсорбции.
НМ
у ¥
О
dx: 1.063
1
dv:-2.17 мкм
мкм
Рис. 6. АСМ-изображение поверхности слюды, модифицированной БСА и глютаровым альдегидом (я) и «царапающие» эксперименты специфической (/>). Размеры кадров составляют 10x10 мкм2 (я) Кроме того> в Этом случае и 3.6x3.6мкм' (Ь). Профиль, проведенный вдоль
пунктирной линии, показан на (с). Толщина клетки Bacillus thuringiensis слоя составляет около 2 им. заметно агрегируют между
собой вдоль длины, образуя длинные агрегаты шириной в одну и длиной в
несколько клеток.
Раздел 3.3.2 посвящен другим модификаторам слюды: бычий сывороточный альбумин (БСА) и глутаровый альдегид. Для обработки поверхности мы наносили 10 - 15 мкл 0,05 % водного раствора БСА на свежесколотую слюду, затем промывали водой и высушивали в потоке азота. Затем эта же процедура повторялась для глутарового альдегида (0,05 %). Для того чтобы выяснить толщину слоя-модификатора, мы провели с помощью АСМ так называемые «царапающие» эксперименты модифицированной поверхности. Для этого мы значительно увеличили контактную силу воздействия кантилевера во время сканирования маленького участка поверхности (около 600x600 нм2), после чего вернули нормальную силу и увеличили размер кадра. АСМ-изображения этих поверхностей до и после «царапающего» эксперимента приведены на рис. 6. Эти рисунки свидетельствуют (см. рис 6Ь, 6с), что толщина слоя составляет примерно 2 нм и материал модификатора сдвинут к краям области, которая сканировалась с высокой силой.
Эксперименты по изучению адгезии бактериальных клеток на слюду, обработанную БСА и глутаровым альдегидом, показали аффинность по сравнению со слюдой. Тем не менее, клетки Bacillus thuringiensis имеют тенденцию к агрегации на модифицированной поверхности. Похожий эффект наблюдался нами с этими же клетками, адсорбированными на слюду, модифицированную цетилтриметиламмонем бромида.
В разделе 3.3.3 описываются исследования агарозы и крахмала в качестве модификаторов подложки. Для Escherichia coli оба вещества значительно увеличили уровень адгезии, тогда как значительного эффекта в случае Bacillus thuringiensis обнаружено не было.
Также в этом разделе приведены исследования такого модификатора поверхности слюды как Фиколл 400 (0,05 % раствор). Однако модифицированная с помощью Фиколл 400 слюда показала слабую адгезию бактериальных клеток.
В главе 4 описаны эксперименты по созданию аффинной поверхности из активных антител и АСМ исследований специфического связывания такой
поверхности с бактериями и их фрагментами. В первой части главы даются общие сведения об антителах и методах закрепления их на поверхности.
Чтобы антитела сохраняли активность на поверхности первая задача которую необходимо было решить - правильная ориентация молекулы антител. Т.е. необходимо было расположить антитела таким образом, чтобы антигенсвязывающий фрагмент был направлен наружу и оставался активным. Для этого мы использовали белок в, который способен специфично связываться с Рс, преимущественно за счет полярных взаимодействий.
Раздел 4.2 посвящен материалам и методам, где описываются различные способы разрушения бактериальных клеток на фрагменты, а также разработанная методика создания аффинной поверхности на основе антител специфичных к Е.соИ. Согласно разработанной методике, этапы приготовления аффинной поверхности из активных антител были следующими: свежесколотая слюда обрабатывается в тлеющем разряде в течение 60 секунд (при силе тока 0,2 - 0,4 мА), после чего экспонируется в каплю (20 мкл) раствора белка й (0.1 - 0,6 мг/мл). После этого слюдяная пластинка промывается в течение 1 минуты в капле (50 мкл) дистиллированной воды и экспонируется в раствор антител (0.1 - 0.2 мг/мл) на 10 минут. Полученная пластинка еще раз промывается в течение 1 минуты в воде и высушивается в потоке сжатого азота. Концентрации белка О и антител подбирались исходя из «царапающих» экспериментов. На АСМ-изображениях образцов приготовленных по данной методике (рис. 7), видно, что количество фрагментов, адсорбированных специфичными антителами, в сотни раз больше, чем неспецифичными.
if'
^.....ц^;:
Рис. 7. АСМ-изображения поверхностей, модифицированных белком G и антителами к Escherichia coli (более подробно см. в тексте), экспонированных в (а, Ъ) буфер, (с, d) суспензию, содержащую фрагменты клеток Bacillus subcilis концентрацией (по целым клеткам) 108 клеток/мл, (е, j) суспензию, содержащую разрушенные фрагменты клеток Escherichia coli концентрацией (по целым клеткам) 108 клеток/мл. Размеры изображений составляют 50 (а, с, е) и 10 мкм (b, d,f).
В разделе 4.3. посвященному результатам и обсуждению, для проведения детального анализа фрагментов бактерий на АСМ-изображениях и эффективного сравнения размеров и плотности адсорбции этих фрагментов описываются специальные математические алгоритмы. Суть их в следующем.
Допустим, мы имеем АСМ-изображение поверхности с некоторыми объектами. Для того, чтобы выделить объект, расположенный на поверхности, высчитывалась пороговая высота по формуле h„op.=min{hcp+2d, (Кр+Нтш)/2}, где hcp, - средний уровень поверхности на всем изображении, d - среднее квадратичное отклонение от среднего уровня, Нт,х - максимальная высота на изображении. Все части поверхности, оказавшиеся выше пороговой высоты hnop, считались объектами. Они выделялись на изображении и для них строились
о со Н
Ф 50
с
о
»и
ю
га
а ■&
о со н
о 0) X
ц
о ы
80
60
40
20
15 20 Высота фрагментов, нм
№ ;
25
«> 90
2 80
0 70
1 60
|50
0 40 ш
Н 30
® 20
1 Ю
5 0
Км
гРЖ
141 11111 Ш»;
»ш; Д.
Ю®)|
1
0 100000 200000 300000
з
Объем фрагментов, нм
В <1
30
40
50
60
70
Высота фрагментов, нм
1000000 2000000 3000000 4000000 5000000 3
ПРткем гЬпягментгт нм
Рис. 8. Гистограммы распределения по вычисленным из АСМ-изображений высотам (а, с) и объемам (Ь, с!) фрагментов Е.соП, на слюде, обработанной белком й (а, Ь) и белком О с антителом (МАТ, с и с1).
распределения по высотам (максимальным и средним), площадям, периметрам и объемам.
На рис. 8 приведены гистограммы распределения по высотам (а, с) и объемам (Ь, с1) фрагментов Е.соЧ, провзаимодействовавших с поверхностью слюды, обработанной белком О (а, Ь) и белком О с антителами (МАТ, с и с1). Анализ этих гистограмм показывает, что фрагменты бактерий, адсорбированных на эти поверхности, сильно отличаются по размерам. Так, если наиболее вероятная высота фрагментов, связавшихся с поверхностью, обработанной только белком О, составляет 11 нм, а объем - 50000 нм3, то для фрагментов, связавшихся с поверхностью, обработанной антителами, эти значения составляют 38 нм и
300000 нм3. Стоит обратить также внимание на то, что характер зависимостей
заметно различается: если в первом случае он напоминает нормальное (гауссово)
распределение (рис. 8 а, Ь), то во втором - экспоненциальный спад (рис. 8 с, d).
Что может указывать на то, что в первом случае с поверхностью связались
преимущественно фрагменты не специфичные к антителам МАТ или примеси из
раствора (в пользу чего свидетельствует гауссов характер распределения размеров
фрагментов), тогда как во второй раз - специфичные к антителам фрагменты
бактериальных клеток E.coli.
Для того, чтобы оперировать количественными критериями изучаемого
взаимодействия, нами была разработана следующая схема статистического
анализа АСМ-изображений.
На гистограммах
распределения по высотам
всех объектов на
контрольном изображении
выбирается такая высота
/г„,;,„ ниже которой лежит
95% объектов. В
дальнейшем анализируются
лишь объекты, высоты
которых превышают hmin.
Рис. 9. Диаграмма значений к для образцов, Такое отбрасывание более
полученных при экспонировании аффинных к низких объектов позволит E.coli поверхностей в суспензии фрагментов
Bacillus subtilis и E.coli концентрациями 108 и 107 избежать анализа примесей,
клеток/мл в сравнении с контрольным образцом. содержащихся в буфере. В
случае гистограмм для рис. 8, hm¡„ =45 нм. После этого для анализируемого изображения (с бактериальными фрагментами) строится распределение изображенных на нем объектов с высотами, большими hmin, по объемам и рассчитывается суммарный объем объектов V на АСМ-изображении. Затем суммарный объем нормируется на площадь АСМ-
-------------------------, !
• 1 :: . J ■ • I
i i
Щ —j—|........i"
I
J —i-—*-1-—-1................1- ------
контроль Bacilluss. Bacilluss. E.coli E.coli _10**8 Ю**7 10**8 10**7
изображения к -V/S. Таким образом, величина к, имеющая смысл количества присоединившегося к поверхности материала на единицу площади, служит критерием для оценки наличия или отсутствия специфического связывания.
Значения величины к для образцов, полученных при экспонировании аффинных к E.coli поверхностей в суспензии Bacillus subtilis и E.coli концентрациями 10s и 107 клеток/мл, в сравнении с контрольным изображением представлены на рис. 9.
Таким образом, приведенные результаты демонстрируют эффективность использования АСМ вместе со специальными алгоритмами обработки изображений для детектирования не только отдельных клеток, но и их фрагментов.
ВЫВОДЫ
1. Разработан подход для изучения специфического взаимодействия бактериофаг-бактерия с помощью АСМ и проанализированы различные стадии заражения бактериальной клетки фагом для трех различных видов бактерий.
2. С помощью АСМ показана эффективность ряда модификаторов поверхности подложек (ЦТАБ-лектин, БСА- глутаровый альдегид, крахмал, агароза), значительно увеличивающих адсорбцию бактериальных клеток.
3. Продемонстрировано, что аффинные поверхности на основе антител повышают сорбцию фрагментов клеток за счет взаимодействия антител со специфичными антигенами бактерий.
4. Математическая обработка параметров взаимодействия антиген-антитело, заложенная в методе АСМ-детектирования, позволяет дать количественные и качественные характеристики процесса.
Список публикаций по теме диссертации
Статьи:
1. Dubrovin Е. V., Voloshin A. G., Kraevsky S. V., Ignatyuk Т. Е., Abramchuk S. S., Yaminsky I. V. , Ignatov S. G. Atomic Force Microscopy Investigation of Phage Infection of Bacteria // Langmuir. - 2008. - V. 24. - № 22. - P. 13068-13074 (9 цитирований).
2. Ignatov S. G., Voloshin A.G.,. Virjasov S. N, Fedjukina G.N., Mochalov V.V., Ganina E.A., Dubrovin E.V., Kraevsky S.V., Ignatyuk Т.Е. Bionano - microbiology// In book: Sensors for Environment, Health and Security. M.-I. Baraton (ed.), © Springer Science + Business Media B.V. - 2009. - P. 333345.
3. Dubrovin E., Ignatov S., Ignatyuk Т., Kraevsky S., Voloshin A., Yaminsky I. Visualization of pathogen-host interaction using AFM// Biophysical Journal. 2007. - Suppl. S. - P. 514A-515A.
4. Dubrovin, Evgeniy V.; Fedyukina, Galina N.; Kraevsky, Sergey V.; Ignatyuk, Tatyana E.; Yaminsky, Igor V.; Ignatov, Sergei G. Development of Affine Surfaces for Specific Binding of Bacterial Fragments from Solutions Using AFM // Biophysical Journal, vol. 98, issue 3, - 2009. pp. 191a
5. C.B. Краевский, Д. А. Рогаткин. Медицинская робототехника: первые шаги медицинских роботов. // Технологии живых систем. -2010. -т.7. -№4. -С. 3-14.
Тезисы докладов:
1. Федюкина Т.Н., Баранова Е.В., Акимова JI.A., Волошин А.Г., Вирясов С.Н., Косарев Н.В., Дубровин Е.В., Краевский С.В., Игнатгок Т.Е., Игнатов С.Г. АСМ визуализация взаимодействия латексных частиц, модифицированных антителами в присутствии антигена // VII Межгосударственная научно-практическая конференция государств-участников СНГ "Чрезвычайные ситуации международного значения в общественном здравоохранении и санитарная охрана территории государств-участников СНГ".Оболенск. - 2006. - С. 250,251.
2. Краевский С. В., Волошин А. Г., Дубровин В.Е., Игнатов С.Г., Игнатгок Т.Е., Яминский И.В. Изучение влияния бактериофагов на бактерии с помощью АСМ // Сборник тезисов «Современные достижения бионаноскопии» Первая Всероссийская Школа-семинар. Москва. - 2007. - С. 29.
3. Игнатов С.Г., Вирясов С.Н., Федюкина Г.Н., Баранова Е.В., Ганина Е.А., Мочалов В.В., Е.В. Дубровин, С.В. Краевский, Т.Е. Игнатгок. Применение АСМ для специфической визуализации микроорганизмов // VI Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием «Молекулярная диагностика -2007» - 2007. - Т. 1. - С. 81-82.
4. Дубровин Е.В., Игнатов С.Г., Игнатюк Т.Е., Краевский С.В., Федюкина Г.Н., Яминский И.В АСМ-исследование биоспецифичных взаимодействий на поверхностях // Сборник тезисов Второй международной конференции «Современные достижения бионаноскопии». Москва. - 2008. - С. 22.
5. Игнатов С.Г., Волошин А.Г., Федюкина Т.Н., Баранова Е.В., Ганина Е.А., Мочалов В.В., Перовская О.Н., Дубровин Е.В., Краевский С.В., Игнатюк Т.Е. Специфическая АСМ визуализация бактериальных нанофрагментов //Международный форум по нанотехнологиям. Сб. тезисов докладов научно-технологических секций, т. 2. Москва. - 2008. - С. 150, 151.
6. Игнатов С.Г., Волошин А.Г., Вирясов С.Н., Федюкина Г.Н., Баранова Е.В., Ганина Е.А., Мочалов В.В., Перовская О.Н., Дубровин Е.В., Краевский С.В., Игнатюк Т.Е. Нано в микробиологии: специфическая визуализация бактериальных нанофрагментов и нанотоксичность // Нанотехнологии в сельском хозяйстве. Доклады Международной научно-практической конференции. Москва. - 2008. - С. 34-36.
7. Игнатов С.Г., Волошин А.Г., Вирясов С.Н., Федюкина Г.Н., Ганина Е.А., Мочалов В.В., Перовская О.Н., Е.В. Дубровин, С.В. Краевский, Т.Е. Игнатюк. АСМ анализ взаимодействия фаг-бактерия.// Материалы 1-ой Международной научной школы "Наноматериалы и нанотехнологии в живых системах". - 2009. - С. 32
8. Dubrovin Е., Fedyukina G., Ignatov S., Ignatyuk Т., Kraevsky S., Voloshin A., Yaminsky I. Visualization of pathogen-host interaction using AFM // 8th International EMBL PhD Student Symposium. Heidelberg, Germany. -2006.-P. 46.
9. Ignatov S. G., Virjasov S. N., Fedjukina G.N., Baranova E.V., Ganina E. A., Mochalov V.V., Dubrovin E.V., Kraevsky S.V., Ignatyuk Т.Е. Specific AFM visualization of bacteria and bactericidal activity of nano-objects // IV International conference on "NanoBio and related new and perspective biotechnologies". Pushchino. - 2007. - P. 193-195.
10. Ignatov S. G., Voloshin A.G., Virjasov S. N., Fedjukina G.N., Mochalov V.V., Dubrovin E.V., Kraevsky S.V., Ignatyuk Т.Е.// International expert meeting drug design and development. Moscow. - 2007. - P. 14,15.
11. С. В. Краевский, Е.В. Дубровин, С.Г. Игнатов, Т.Е. Игнатюк, С.В. Федюкина, И.В. Яминский И. В. Методика модификации подложки антителами для повышения специфичности к бактериальным фрагментам для дальнейшего атомно-силового сканирования // Сборник тезисов Четвёртой международной конференции «Современные достижения бионаноскопии». Москва 2010, с. 36
Подписано в печать:
25.05.2011
Заказ № 5617 Тираж -100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru
Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Краевский, Сергей Владимирович
Список Сокращений
Список иллюстраций
Список таблиц
Введение
Обзор литературы
Глава 1 Основные принципы сканирующей зондовой 13 микроскопии
1.2 Атомно-силовая микроскопия
1.3 Артефакты зондовой микроскопии и способы их учёта
1.4 Применение АСМ для исследования биологических 24 объектов
1.5 Белки и нуклеиново-белковые комплексы
1.6 АСМ и бактериальные клетки
1.6.1 Нанесение бактериальных клеток на подложку для 34 АСМ
1.6.2 АСМ бактерий
1.7 АСМ и вирусные частицы
1.7.1 Нанесение вирусных частиц на подложку для АСМ
1.7.2 АСМ вирусов
Экспериментальная часть
Глава 2 Изучение специфического взаимодействия бактериофагов и бактерий с помощью атомно-силовой микроскопии
2.2 Материалы и методы
2.2.1 Приготовление бактериальных клеток и 47 бактериофагов
2.2.2 Приготовление образцов для АСМ и ПЭМ 49 исследований
2.2.3 ACM и ПЭМ
2.3 Результаты и Обсуждение
2.3.1 Результаты сканирования фагов
2.3.2 Исследование процесса инфицирования 53 бактериофагом бактерии с помощью АСМ
3.4 Контрольные эксперименты 59 Выводы
Глава 3 Изучение различных модификаторов поверхности 62 призванных увеличить адсорбционные свойства подложек по отношению к бактериальным клеткам для дальнейших АСМ исследований
3.2 Материалы и методы
3.2.1 Модифицирование поверхности подложки с помощью 62 ЦТАБа и лектина
3.2.2 Модифицирование поверхности подложки с помощью 63 сывороточного альбумина (БСА) и глютарового альдегида
3.2.3 Модифицирование поверхности подложки с помощью 63 БСА, крахмала и агарозы
3.2.4 Нанесение бактериальных клеток на 63 модифицированную поверхность
3.2.5 АСМ эксперименты
3.3 Результаты и обсуждение
3.3.1 Лектины
3.3.2 Модификаторы подложек на основе бычьего 67 сывороточного альбумина (БСА) и глютарового альдегида
3.3.3 Модификаторы подложек на основе крахмала и 69 агарозы
Выводы
Глава 4 Разработка аффинных поверхностей на основе 72 антител для распознавания нанофрагментов бактерий в растворах с помощью атомно-силовой микроскопии
4.1.1 Антитела
4.1.2 Методы нанесения антител на поверхность
4.2 Материалы и методы
4.2.1 Получение бактериальных фрагментов
4.2.2 Приготовление биофункциональной поверхности
4.2.3 Выдержка биофункциональной поверхности в 80 растворе аналита
4.2.4 АСМ эксперименты
4.3 Результаты и обсуждение 81 Выводы
Введение Диссертация по биологии, на тему "Атомно-силовая микроскопия аффинных взаимодействий в микробиологии"
Атомно-силовая микроскопия (АСМ) входит в относительно новую группу сканирующих зондовых микроскопий (СЗМ) - методов исследований-различных свойств объектов с крайне высоким пространственным, разрешением. СЗМ отсчитывает свою историю- с 1981 г., когда группой' ученых, был разработан сканирующий туннельный микроскоп (СТМ) [Binning and Rohrer, 1983]. Его создатели - швейцарские ученые Хайнрих Рорер и Герхард Бинниг - были отмечены Нобелевской премией по физике в 1986 году. В том же году был создан атомно-силовой микроскоп [Binning and Quate, 1986], использующий в своей основе детектирование обменного взаимодействия атомов, что значительно расширило применение зондовой микроскопии в различных областях, особенно в биологии, так как на изучаемые образцы перестало. накладываться условие их электрической проводимости. Ряд ключевых преимуществ по сравнению с традиционными методами электронной микроскопии обусловил резкий рост популярности методики АСМ в микробиологии. К этим преимуществам относятся: относительная простота приготовления образцов (например, не требуется контрастирования атомами тяжёлых металлов), отсутствие необходимости создания вакуума во время сканирования, возможность проводить исследование объектов в жидкости, в частности, изучать биологические объекты in vivo и др. При этом не наноситься серьёзный ущерб пространственному разрешению изображений: АСМ позволяет строить трехмерные изображения поверхностей с разрешением вплоть до атомного. Всё это делает методику АСМ крайне актуальной для современных задач микробиологии и бионанотехнологии.
Стоит отметить, что одним только получением изображений поверхности АСМ не ограничивается. Так, например, с её помощью можно изучать взаимодействие двух объектов: измерять силы трения, упругости, адгезии, а также перемещать отдельные молекулы и атомы [Severin et al;,
2004; Eigler et al., 1990], осаждать: и удалять их с какой-либо поверхности, измерять толщины биологических пленок на поверхности.
Бионанотехнология - современная« биологическая? наука, оперирующая наноразмерными: объектами; Возможности получения, нанообъектов и способность, анализировать их качественно изменяют уже существующие подходы в исследованиях. Применение АСМ в бионатехнологии открывают новые перспективы для значительного увеличения чувствительности анализа и идентификации микроорганизмов;,
В данной работе представлены результаты исследования аффинного (от англ. affinity — сродство) т.е. высокоспецифического взаимодействия-бактерий с антителами и бактериофагами с помощью АСМ. Обнаружение аффинного взаимодействия решает одну из ключевых задач микробиологии -идентификацию^ бактерий; В1 случае с исследованием взаимодействия; бактериофагов с клеткой-хозяина, АСМ позволяет также увидеть.различные стадии процесса инфицирования-во времени in vivo: от места первичного крепления бактериофага, до изменения, структуры поверхности клетки и полного лизиса с выходом новых частиц бактериофагов. Данное исследование является крайне актуальным, т.к. позволяя изучить биологию и литические свойства фагов, оно напрямую разрешает многие вопросы в фаготерапии [Мирошников и др., 2006], а фаготерапия в свою очередь нацелена на решение- такой серьёзной задачи как борьба? с мультирезистентными инфекциями, в том числе и внутрибольничными, рост числа которых наблюдается в последние годы [Towner, 2009].
Возможности АСМ были ярко продемонстрированы в работах с аффинными поверхностями на основе активных антител, позволив визуализировать высоко специфично сорбированные нанофрагменты бактерий. При этом использовалась возможность АСМ измерять толщину и шероховатость поверхностных биопленок, что позволило подобрать оптимальные концентрации исходных растворов и условия для создания монослоя из активных антител.
Результаты работы очень важны для микробиологии и бионанотехнологий, поскольку существенно расширяют и дополняют представления о методах идентификации прокариот и* вносят существенный вклад в понимание процессов анализа бактериального мира.
Цель и задачи исследования
Целью работы является применение атомно-силовой микроскопии для исследования аффинных взаимодействий фаг-бактерия и антиген-антитело в микробиологии.
В соответствии с целью в работе решаются следующие задачи исследования;
- Разработать метод визуализации и исследования взаимодействия «фаг-клетка» с помощью атомно-силовой микроскопии;
- Исследовать различные стадии процесса инфицирования фагом бактериальной клетки с помощью АСМ;
- Исследовать различные комбинации высокомолекулярных неспецифических модификаторов для улучшения сорбционных свойств поверхности по отношению к бактериальным клеткам для дальнейшего атомно-силового сканирования;
- Разработать методику создания поверхности из активных антител, оптимизировать параметры такой методики с помощью атомно-силовой микроскопии, количественно и качественно исследовать сорбционные свойства полученной поверхности.
Научная новизна работы:
Разработана новая методика создания аффинной поверхности« из активных антител для специфической визуализации бактерий. Проведены количественные и качественные АСМ исследования сорбционных свойств высокоспецифичной поверхности по отношению к фрагментам бактериальных клеток. Впервые разработан подход для изучения специфического взаимодействия фаг-клетка с помощью АСМ и проанализированы различные стадии заражения бактериальной клетки фагом для трех различных видов бактерий. С помощью АСМ изучались другие модификаторы поверхности, которые увеличивают адсорбцию определённых клеток.
Научная и практическая значимость
Разработан метод специального приготовления- образцов* бактериальных культур для исследования с помощью АСМ, что позволяет использовать данный метод для изучения аффинных взаимодействий в микробиологии. Разработанный метод исследования взаимодействия фаг-бактерия-позволяет в физиологических условиях проследить различные этапы данного процесса, а также описать свойства бактериофага, важные для характеристики препаратов бактериофагов, предлагаемых для фаготерапии. Разработанные в процессе работы аффинные подложки на основе антител позволяют идентифицировать не только клетки бактерий, но и нанофрагменты бактериальных клеток. Основные результаты диссертационной работы использованы в процессе выполнения работ лабораторией атомно-масштабных исследований конденсированных сред ФГУП «Институт теоретической и экспериментальной физики» по гранту МНТЦ №3245 «Бионанотехнологический анализ аффинных поверхностей».
Положения, выносимые на защиту
1. Разработанный подход для изучения специфического взаимодействия бактериофаг-бактерия с помощью АСМ позволяет анализировать различные стадии заражения бактериальной клетки фагом.
2. Модификаторы поверхности подложек (ЦТАБ-лектин, БСА-глутаровый альдегид, крахмал, агароза) значительно увеличивающих адсорбцию бактериальных клеток.
3. Аффинные поверхности на основе антител обеспечивают специфическую визуализацию бактерий и их фрагментов с помощью АСМ.
4. Математическая обработка параметров взаимодействия антиген-антитело, заложенная в методе АСМ-детектирования, позволяет дать количественные и качественные характеристики процесса визуализации.
Апробация работы
Основные результаты диссертационной работы были доложены на следующих научных конференциях и школах:
• Межгосударственная научно-практическая конференция государствучастников СНГ "Чрезвычайные ситуации международного значения в общественном здравоохранении и санитарная охрана территорий государств-участников содружества независимых государств».
Протвино, -2006. th
• 8 International EMBL Symposium. Germany, Heidelberg, -2006.
• Первая Всероссийской Школы-семинара Современные достижения бионаноскопии. Москва, -2007.
• ESF-EMBO Symposium on Probing Interactions between Nanoparticles/Biomaterials and Biological Systems, Sant Feliu de Guixols, Spain, -2007.
• The XV International Conference and discussion scientific club "New Information Technology in Medicine, Pharmacology, Biology and Ecology". Yalta-Gurzuf, Ukraine, 31 May-9 June -2007.
• IV International conference on "NanoBio and related new and perspective biotechnologies". Pushchino, - 2007.
• V I Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием «Молекулярная диагностика -2007» - 2007
• Вторая международная конференция «Современные достижения бионаноскопии». Москва, - 2008
• Международный форум по нанотехнологиям. Научно-технологических секция. Москва, - 2008.
• Международная научно-практическая конференции «Нанотехнологии в сельском хозяйстве». Москва, - 2008.
• 1-ая Международная научная школа "Наноматериалы и нанотехнологии в живых системах". Москва, - 2009.
• Третья международная конференция «Современные достижения бионаноскопии». Москва, -2009.
• 8-ая Курчатовская молодежная школа, Москва, -2010.
• Четвёртая международная конференция «Современные достижения бионаноскопии». Москва, -2010.
Личный вклад автора
Все экспериментальные измерения зондовой микроскопии выполнены автором лично.
Автор принимал участие в приготовлении образцов бактериальных клеток, вирусов, нуклеиновых кислот, белков и их комплексов совместно с сотрудниками и ФГУН «ГНЦ прикладной микробиологии и биотехнологии» г. Оболенска и сотрудниками физического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова. Анализ и интерпретация экспериментальных данных проведены автором лично.
Публикации
Материалы диссертации опубликованы в 16 печатных работах, из них 5 статей в рецензируемых журналах перечня ВАК и 11 публикаций в сборниках, трудах и материалах конференций.
Обзор литературы
Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Краевский, Сергей Владимирович
ВЫВОДЫ:
1. Продемонстрирована возможность применения атомно-силовой микроскопии для визуализации аффинных взаимодействий в микробиологии.
2. Разработан подход для изучения специфического взаимодействия бактериофаг-бактерия с помощью АСМ и проанализированы различные стадии заражения бактериальной клетки фагом для трех различных видов бактерий.
3. С помощью АСМ показана эффективность ряда модификаторов поверхности подложек (ЦТАБ-лектин, БСА- глутаровый альдегид, крахмал, агароза), увеличивающих адсорбцию бактериальных клеток в несколько раз.
4. Продемонстрировано, что аффинные поверхности на основе антител повышают сорбцию фрагментов клеток за счет взаимодействия антител со специфичными антигенами бактерий.
5. Математическая обработка параметров взаимодействия антиген-антитело, заложенная в методе АСМ-детектирования, позволяет количественно оценить общий объем адсорбировавшихся бактериальных фрагментов на поверхности из активных антител.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Бионанотехнологические методы в микробиологии и биофизике -современный тренд в исследовательских направлениях, позволяющий детализировать процессы в живых системах на нано-уровне. В данной работе представлены результаты исследования аффинного т.е. высокоспецифического взаимодействия бактерий с антителами и бактериофагами с помощью АСМ. Обнаружение аффинного взаимодействия решает одну из ключевых задач микробиологии - идентификацию бактерий. В случае с исследованием взаимодействия бактериофагов с клеткой хозяина, АСМ позволяет также увидеть различные стадии процесса инфицирования во времени in vivo: от места первичного креплении бактериофага, до изменения структуры поверхности клетки и полного лизиса с выходом новых частиц бактериофагов, что может помочь разрешить значительную часть вопросов фаготерапии. Кроме того, возможности АСМ были ярко продемонстрированы в работах с аффинными поверхностями на основе антител, позволив высокоспецифично визуализировать нанофрагменты бактерий. При этом, при подборе концентраций модификаторов и условий обработки образов в различных стадиях, использовалась возможность АСМ измерять толщину поверхностных биопленок, что позволило подобрать оптимальные условия для создания монослоя из активных антител. Способность методики АСМ получить истинное трехмерное изображение поверхности позволило также с помощью математических алгоритмов дать не только качественную, но и количественную оценку объема специфически адсорбированного на аффинной поверхности материала. Таким образом, разработанная методика приготовления аффинной поверхности на основе активных антител вместе с АСМ и математической обработкой изображений могут использоваться при создании новых видов биосенсоров.
Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Краевский, Сергей Владимирович, Оболенск
1. Мирошников К.А., Чертков О.В., Назаров П. А., Месянжинов В. В. Пептидогликаннлизирующие ферменты бактериофагов-перспективные противобактериальные агенты //Успехи биологической химии, -2006, -т. 46, -сс. 65-98.
2. Филонов А.С., Яминский И.В. Зондовая микроскопия: построение и обработка изображений. В кн. «Сканирующая зондовая микроскопия биополимеров» под ред. И.В. Яминского. М.: Научный мир, 1997.
3. Amro N.A., Kotra L.P., Wadu-Mesthridge К., Bulychev A., Mobashery S., Liu G. High-resolution Atomic Force Microscopy Studies of the Escherichia coli Outer Membrane: Structural Basis for Permeability // Langmuir, 2000, - v. 16, - pp.27892796.
4. Andersen J.E.T., Moller P., Pedersen M.V. , Ulstrup J. Cytochrome с dynamics at gold and glassy carbon surfaces monitored by in situ scanning tunnel microscopy // Surface Science, 1995, - v.325, -pp. 193-205.
5. Arnoldi M., Kacher C., Bauerlein E., Radmacher M., Fritz M. Elastic Properties of the Cell Wall of Magnetospirillum Gryphiswaldense Investigated by Atomic Force Microscopy//Appl. Phys. A, 1997, - v.66,-pp.S613-S618.
6. Arscott P.G., Lee G., Bloomfield V.A. and Evans D.F. Scanning tunneling microscopy of Z-DNA // Nature, 1989, - v.339, - pp.484-486.
7. Awais, R.; Fukudomi, H.; Miyanaga, K.; Unno, H.; Tanji, Y. A recombinant bacteriophage-based assay for the discriminative detection of culturable and viablebut nonculturable Escherichia coli 0157:H7 // Biotechnol. Prog,. -2006, -v. 22, -pp. 853-859.
8. Barrow, P. A.; Soothill, J. S. Bacteriophage therapy and prophylaxis: rediscovery and renewed assessment of potential // Trends Microbiol. -1997, -v.5, -pp. 268-271.
9. Binning G., Rohrer H. Scanning tunneling microscopy // Surface Science, -1983,-v. 126,-pp. 236-244.
10. Binning G., Quate C. Atomic force microscope // Phys. Rev.Lett., 1986, -v.56, - pp.930-933.
11. Bhaya D., Watanabe N., Ogawa T., Grossman A.R. The role of an alternate sigma factor in motility and pili formation in the cyanobacterium Synechocystis sp. strain PCC 6803 // Proc Natl Acad Sci USA, 1999, - v.96, - pp.3188-93.
12. Bhaya D., Takahashi A., Grossman A.R. Light regulation of type IV pilus-dependent motility by chemosensor-like elements in Synechocystis PCC6803 // Proc Natl Acad Sci USA, 2001, - v.98, - pp.7540-745.
13. Bhaya D., Bianco N.R., Bryant D., Grossman A. Type IV pilus biogenesis and motility in the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC6803 // Mol Microbiol, 2000, -v.37,- №4, -pp.941-51.
14. Bolshakova A.V., Kiselyova O.I., Yaminsky I.V. Microbial Surfaces Investigated Using Atomic Force Microscopy // Biotechnol. progress, 2004, - v. 20, -№ 6, -pp.1615-1622.
15. Bolshakova A.V., Kiselyova O.I., Filonov A.S., Frolova O.Yu., Lyubchenko Yu.L., Yaminsky I.V. Comparative Studies of Bacteria with Atomic Force Microscopy Operating in Different Modes // Ultramicroscopy, 2001, - v.68, -pp.121-128.
16. Bolshakova A.V., Vorobyova E.A., Yaminsky I.V. Indication of Living Bacterial Cells in Native Soil and Permafrost // Phys. Low-Dim. Struct., 2003, -v.3/4, - pp. 105-112.
17. Braga P.C., Ricci D. Atomic Force Microscopy: Application to Investigation of Escherichia coli Morphology before and after Exposure to Cefodizime // Antimicrob. Agents Chemother., 1998, - v.42, - pp. 18-22.
18. Britt D.W., Buijs J., Hlady V. Tobacco mosaic virus adsorption on self-assembled and Langmuir-Blodgett monolayers studied by TIRF and SFM // Thin Solid Films, 1998, - v.327-329, - pp.824-828.
19. Bustamante C., Vesenka J., Tang C.L., Rees W., Guthold M., and Keller R. Circular DNA molecules imaged in air by scanning force microscopy // Biochemistry, 1992, - v.31, - pp.22-26.
20. Camesano T.A., Natan M.J., Logan B.E. Observation of Changes in Bacterial Cell Morphology Using Tapping Mode Atomic Force Microscopy // Langmuir, -2000, v. 16, - pp.4563-4572.
21. Chang H., Bard A.J. Observation and characterization by scanning tunneling microscopy of structures generated by cleaving highly oriented pyrolytic graphite // Langmuir,-1991,-7,-pp.1143-1153.
22. Bin-Wha Chang, Yuh-Ming Hsu, Hsien-Chang Chang. An improving method for determination of Escherichia coli population based on multi-channel series piezoelectric quartz crystal system // Sensors and Actuators B -2000, -v.65, -pp. 105107.
23. Clemmer C.R, Beebe T.P. Graphite: A mimic for DNA and other biomolecules in scanning tunneling microscopes studies // Science, 1991, - v.251, - pp.640-642.
24. Cullen D.C., Lowe C.R. AFM Studies of Protein Adsorption: 1. Time-Resolved Protein Adsorption to Highly Oriented Pyrolytic Graphite // J. Colloid Interface Sci. , 1994, - v. 166, -pp. 102-108.
25. Da Silva Jr A., Teschke O. Effects of the antimicrobial peptide PGLa on live Escherichia coli // Biochimica et Biophysica Acta, 1643, 2003, - v.95, - pp.103.
26. Daugelavieius R., Gaidelyte A., Cvirkaite-Krupovie V., Bamford, D. H. Online monitoring of changes in host cell physiology during the one-step growth cycle of Bacillus phage Bam35 // Microbiol. Methods -2007, -v.69, -pp. 174-179.
27. Day J., Kuznetsov Yu.G., Larson S.B., Greenwood A., and McPherson A. Biophysical Studies on the RNA Cores of Satellite Tobacco Mosaic Virus // Biophys. J. ,-2001,-v.80,-pp.2364-2371.
28. Di'az, C.; Schilardi, P. L.; Salvarezza, R. C.; deMele, M. F. L. Nano/Microscale order affects the early stages of Biofilm formation on metal surfaces // Langmuir -2007, -v.23, -pp. 11206-11210.
29. Droz, E.; Taborelli, M.; Wells, T. N. C.; Descouts, P. Preparation of isolated biomolecules for SFM observations: T4 bacteriophage as a test sample // Biophys. J. -1993,-v.65,-pp.1180-1187.
30. Drygin Yu.F., Bordunova O.A., Gallyamov M.O., Yaminsky I.V. Atomic force microscopy examination of tobacco mosaic virus and virion RNA // FEBS Letters, -1998, v.425, - pp.217-221.
31. Dufre'ne, Y. F. AFM for nanoscale microbe analysis // Analyst -2008, -v. 133, -pp. 297-301.
32. Dufre'ne, Y. F. Application of atomic force microscopy to microbial surfaces: from reconstituted cell surface layers to living cells // Micron -2001, -v. 32, -pp. 153165.
33. Dufre'ne, Y. F. Using nanotechniques to explore microbial surfaces // Nat. ReV. Microbiol. -2004, -v.2, -pp. 451-460.
34. Dufre'ne, Y. F.; Hinterdorfer, P. Recent progress in AFM molecular recognition studies // Physiol. -2008, -v.256, -pp. 237-245.
35. Dufrene Y.F., Boonaert Ch. J.P., Germ P.A., Asther M., Rouxhet P.G. Direct Probing of the Surface Ultrastructure and Molecular Interactions of Dormant and Germinating Spores of Phanerochaete chryosporium // J. Bacteriol., 1999, - v. 181, -pp.5350-5354.
36. Dupres, V.; Menozzi, F. D.; Locht, C.; Clare, В. H.; Abbott, N. L.; Cuenot, S.; Bompard, C.; Raze, D.; Dufre^ne, Y. F. Nanoscale mapping and functional analysis of individual adhesins on living bacteria // Nat. Methods -2005, -v.2, -pp.515-520.
37. Eigler D.M., Schweizer E.K. Positioning single atoms with a scanning tunnelling microscope // Nature, 1990, - v.344, - pp.524-526.
38. Ellis, L. F.; Schlegel, R. A. Electron microscopy of Pseudomonas phi 6 bacteriophage //Virol. -1974, -v.14, -pp. 1547-1551.
39. Epand R.F., Yip C.M., Chernomordik L.V., LeDuc D.L., Shin Y., Epand R.M. Self-assembly of influenza hemagglutinin: studies of ectodomain aggregation by in situ atomic force microscopy // Biochimica et Biophysica Acta, 2001, - v.1513, -pp. 167-175.
40. Fang, J.; Knobler, С. M.; Gingery, M.; Eiserling, F. A. J. Imaging bacteriophage T4 on patterned organosilane monolayers by scanning force microscopy // Phys. Chem. B. -1997, -v. 101, -pp. 8692-8695.
41. Filonov, A. S.; Gavrilko, D. Yu.; Yaminsky, I. V. FemtoScan SPMImage Processing Software Manual // Advanced Tecnologies Center: Moscow, 2001. URL: http://www.nanoscopy.net/manual/en/ (дата обращения 10.05.2011).
42. Fokine, A.; Chipman, P. R.; Leiman, P. G.; Mesyanzhinov, V. V.; Rao, V. В.; Rossmann, M. G. Molecular architecture of the prolate head of bacteriophage T4 // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. -2004, -v. 101, -pp. 6003-6008.
43. Fung Ying-Sing, Si Shi-Hui, Zhu De-Rong. Piezoelectric crystal for sensing bacteria by immobilizing antibodies on divinylsulphone activated poly-m-aminophenol film//Talanta-2000, -v. 51-pp. 151-158.
44. Gailyamov M.O, Yaminskii I.V. Quantitative methods for restoration of true topographical properties of objects using the measured AFM-images. 2. The effect of broadening of the AFM-profile // Surface Investigation, 2001, - v.16, - pp.11351141.
45. Gerritsen J.W., Elemans J.A.A.W., Hulsken B., Travaille A.M., van Kempen H., Rasing Th., and Speller S. STM in a Gel Environment // AIP Conference Proceedings, 2003, - v. 696, - pp.365-368.
46. Guckenberger R., Heim M., Cevc G., Knapp H. F., Wiegrabe W., and Hillebrand A. Scanning tunneling microscopy of insulators and biological specimens based on lateral conductivity of ultrathin water films // Science, 1994, - v. 266, -pp.1538-1540.
47. Guryev O.L., Dubrovsky T., Chernogolov A., Dubrovskaya S., Usanov S., Nicolini C. Orientation of cytochrome P450scc in Langmuir-Blodgett monolayers // Langmuir, 1997, - v. 13, - pp.299-304.
48. Hamaker H.C. Wan-der-Waals attraction Between Spherical Particles //Physica, 1937, - v.4,-p.1058.
49. Hinterdorfer, P.; Dufre'ne, Y. F. Detection and localization of single molecular recognition events using atomic force microscopy // Nat. Methods -2006, -v. 3, -pp. 347-355.
50. Ivanovska, I.; Wuite, G.; Jo'nsson, B.; Evilevitch, A. Internal DNA pressure modifies stability of WT phage // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. -2007, -v. 104, -pp. 9603-9608.
51. Dmitri Ivnitski, Ihab Abdel-Hamid, Plamen Atanasov, Ebtisam Wilkins. Biosensors for detection of pathogenic bacteria // Biosensors & Bioelectronics -1999, -v. 14-pp. 599-624
52. Jandt, K. D. Atomic force microscopy of biomaterials surfaces and interfaces //Surf. Sci. -2001, -v.491, -pp. 303-332.
53. Kasas S., Fellay B., Cargnello R. Observation of Action of Penicillin on Bacillus subtilis using Atomic Force Microscopy: Technique for the Preparation of Bacteria // Surf. Interface Anal, 1994, - v.21, - pp. 400-401.
54. Kay, L. E. J. Conceptual Models and Analytical Tools: The Biology of. Physicist Max Delbriick// Hist. Biol. -1985, -v. 18, -pp. 207-246.
55. Kim D.T., Blanch H.W., and Radke C.J. Direct Imaging of Lysozyme Adsorption onto Mica by Atomic Force Microscopy // Langmuir, 2002, - v. 18, -pp.5 841-5850.
56. Namsoo Kim, In-Seon Park, Dong-Kyung Kim. Characteristics of a label-free piezoelectric immunosensor detecting Pseudomonas aeruginosa // Sensors and Actuators -2004, -v. 100 -pp. 432-438.
57. Dong Chung Kim and Dae Joon Kang. Molecular Recognition and Specific Interactions for Biosensing Applications // Sensors -2008, -v.8, -pp.6605-6641
58. In-Seon Park a, Woo-Yeon Kim b, Namsoo Kim. Operational characteristics of an antibody-immobilized QCM system detecting Salmonella spp. // Biosensors & Bioelectronics -2000-v. 15-pp. 167-172
59. Kiselyova O.I., Nasikan N.S., Yaminsky I.V., Novikov V.K. AFM imaging of PVX particles and PVX RNA 11 Phys. Low-Dimen. Struct., 2001, - v.3/4, - pp. 167.
60. Kiselyova O.I., Yaminsky I.V. Atomic force microscopy of protein complexes. In "Atomic Force Microscopy: Biomedical Methods and Applications" (Methods in Molecular Biology, vol. 242), Ed. by P.C. Braga, D. Ricci. Humana Press, 2004, pp. 217-230.
61. Kiselyova O.I., Yaminsky I.V., Karger E.M., Frolova O.Yu., Dorokhov Yu.L. and Atabekov J.G. Visualization of TMV movement protein-RNA complexes formed in vitro by atomic force microscopy // Journal of general virology, 2001, - v.82, -pp.1503-1508.
62. Kiselyova O.I., Yaminsky I.V. Proteins and membrane-protein complexes // Colloid Journal, 1999, - v.61, - pp. 1-19.
63. Kiselyova O.I., Yaminsky I.V., Karpova O.V., Rodionova N.P., Kozlovsky S.V., Arkhipenko M.V., and Atabekov J.G. AFM Study of Potato Virus X Disassembly Induced by Movement Protein // J. Mol. Biol., 2003, - v.332, -pp.321-325.
64. Kolbe, W. F.; Ogletree, D. F.; Salmeron, M. B. Atomic force microscopy imaging of T4 bacteriophages on silicon substrates // Ultramicroscopy -1992, -v.42-44,-pp. 1113-1117.
65. Kuznetsov Yu.G., Malkin A.J., Lucas R.W., McPherson A. Atomic force microscopy studies of icosahedral virus crystal growth // Colloids and Surfaces B: Biointerfaces, 2000, - v. 19, - pp.333-346.
66. Olivier Lazcka, F. Javier Del Campo, F. Xavier Munoz. Pathogen detection: A perspective of traditional methods and biosensors. Biosensors and Bioelectronics 22 (2007) 1205-1217.
67. Lederberg, Smaller fleas. ad infinitum: Therapeutic bacteriophage redux // J. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. -1996, -v.93, -pp. 3167-3168.
68. Lee I., Wang X., Zhu C.F., Wang C., Bai C. Investigation of polystyrene nanoparticles and DNA-protein complexes by AFM with image reconstruction // Applied Surface Science, 1998, - v. 126, -pp.281-286.
69. Levin, B.; Bull, J. J. Phage Therapy revisd: The population biology of a bacterial infection and its treatment with bacteriophage and antibiotics Am. Nat. -1996, -v. 147,-pp. 881-898.
70. Lyubchenko, Y. L.; Oden, P. I.; Lampner, D.; Lindsay, S. M.; Dunker, K. A. Atomic force microscopy of DNA and bacteriophage in air, water and propanol: the role of adhesion forces // Nucleic Acids Res. -1993, -v.21, -pp. 1117-1123.
71. Lister T.E., Pinhero P.J. In Vivo Atomic Force Microscopy of Surface Proteins on Deinococcus radiodurans // Langmuir, 2001, - v. 17, - pp.2624-2628.
72. Sang-Hun Lee, Desmond D. Stubbs, John Cairney, and William D. Hunt. Rapid Detection of Bacterial Spores Using a Quartz Crystal Microbalance (QCM) Immunoassay // IEEE SENSORS JOURNAL, -2005 -v. 5,
73. Lomonosov A.M., Egorov S.N., Gallyamov M.O., Yaminsky I.V. AFM of Bacterial Cells Subjected to Different Factors // Phys. Low-Dim. Struct., 2003, -v.3/4,-pp. 125-130.
74. Luria, S. E.; Anderson, T. F. The identification and characterization of bacteriophages with the electron microscope // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. -1942, -v. 28, -pp. 127-130.
75. Malkin A.J., Kuznetsov Yu.G., Lucas R.W., and McPherson A. Surface Processes in the Crystallization of Turnip Yellow Mosaic Virus Visualized by Atomic Force Microscopy // Journal of Structural Biology, 1999, - v.127, - pp.35^3.
76. Marks, T.; Sharp, R. J. Bacteriophages and biotechnology: a review // Chem. Technol. Biotechnol. -2000, -v.75, -pp.6-17.
77. Matsko, N.; Klinov, D.; Manykin, A.; Demin, V.; Klimenko, S. J. Atomic force microscopy analysis of bacteriophages KZ and T4 // Electron Microsc. -2001, -v.50, -pp. 417^22.
78. Mazeran P.-E., Loubet J.-L., Martelet C., Theretz A. Under buffer SFM observation of immunospecies adsorbed on a ciano grafted silicon substrate // Ultramicroscopy, 1995, - v.60, - pp.33-40.
79. McMaster T.J., Miles M.J., Shewry P.R., and Tatham A.S. In Situ Surface Adsorption of the Protein C Hordein Using Atomic Force Microscopy // Langmuir, -2000, -v.16,-pp.1463 -1468.
80. Miller, E. S.; Kutter, E.; Mosig, G.; Arisaka, F.; Kunisawa, T.; Ru'ger, W. Bacteriophage T4 genome //Microbiol. Mol. Biol. ReV. -2003, -v.67, -pp. 86-156.
81. Mu"ller, D. J.; Anderson, K. Biomolecular imaging using atomic force microscopy // Trends Biotechnol. -2002, -v.20, -pp. S45-S49.
82. Muller D.J., Baumeister W., Engel A. Conformational Change of the Hexagonally Packed intermediate Layer of Deinococcus radiodurans Monitored by Atomic Force Microscopy // J. Bacteriol., 1996, - v. 178, - pp.3025-3030.
83. Namura, M.; Hijikata, T.; Miyanaga, K.; Tanji, Y. Detection of Escherichia coli with fluorescent labeled phages that have a broad host range to E. coli in sewage water// Biotechnol. Prog. -2008, -v.24, -pp. 481-486.
84. Nettikadan S., Tokumasu F., and Takeyasu K. Quantitative Analysis of the Transcription Factor AP2 Binding to DNA by Atomic Force Microscopy // Biochemical and biophysical research communications, 1996, - v.226, - pp.645649.
85. Padlana E. A., Daviesa D. R., S. Rudikoff S. and Pottera M. Structural basis for the specificity of phosphorylcholine-binding immunoglobulins // Immunochemestry, -v.13, -pp 945-949, -1976.
86. Rikke Louise Meyer, Xingfei Zhou, LoneTang, AyyoobArpanaei, PeterKingshott, Flemming Besenbacher. Immobilisation of living bacteria for AFM imaging under Physiological conditions // Ultramicroscopy -2010, -v.110 -pp. 13491357.
87. Radetsky, P. Return of the good virus // DiscoVer -1996, -v. 17, -pp.50-58.
88. Razatos A., Ong Y.-L., Sharma M.M., Georgiou G. Molecular Determinants of Bacterial Adheasion Monitored by Atomic Force Microscopy // Appl. Biol. Sei., -1998, v.95, - pp. 11059-11064.
89. Robichorn D., Girard J.-C., Centiempo Y., Cavellier J.-F. Atomic Force Microscopy Imaging of Dried or Living Bacteria // C. R. Acad. Sei., Ser. Ill, 1999, - v.322 - pp.687-693.
90. Roos, W. H.; Ivanovska, I. L.; Evilevitch, A.; Wuite, G. Viral capsids: Mechanical characteristics, genome packaging and delivery mechanisms // J. L. Cell. Mol. Life Sei. -2007, -v.64, -pp. 1484-1497.
91. Ruska, H. 'Ober ein neues bei der bakteriophagen Lyse auftretendes Formelement//Naturwissenschaften -1941, -v.29, -pp. 367-368.
92. A Elisabeth Sauer-Eriksson, Gerard J Kleywegt, Mathias Uhlen, T Alwyn Jones. Crystal structure of the C2 fragment of streptococcal protein G in complex with the Fc domain of human IgG // Structure -1995, -v. 3, -pp.265-278.
93. Severin N., Barner J., Kalachev A.A., and Rabe J.P. Manipulation and Overstretching of Genes on Solid Substrates // Nano Lett., 2004, - v.4, - №. 4, -pp.577-579.
94. Shlyakhtenko L.S., Potaman V.N., Sinden R.N. and Lyubchenko Yu.L. Structure and dynamics of supercoil-stabilized DNA cruciforms // Journal of Molecular Biology, 1998, - v.280, - pp.61-72.
95. Caterina Signoretto and Pietro Canepari. Towards more accurate detection of pathogenic Gram-positive bacteria in waters // Current Opinion in Biotechnology -2008,-v. 19,-pp. 248-253.
96. Simmons J.G. Generalized formula for the electronic tunnel effect between similar electrodes separated by a thin insulating film // J. Appl. Phys, 1963, - v. 34, -pp. 1793-1803.
97. Simon, L. D. Infection of Escherichia coli by T2 and T4 Bacteriophages as Seen in the Electron Microscope: T4 Head Morphogenesis // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. -1972, -v.69, -pp. 907-911.
98. Shi В., Lu X., Zou R, Luo J., Chen D., Liang H., Huang L. Observations of the topography and friction properties of macromolecular thin films at the nanometer scale // Wear, 2001, - v.251, - pp.1177-1182.
99. Smith B.L., Gallie D.R., Le H.and Hansma P.K. Visualization of Poly(A)-Binding Protein Complex Formation with Poly(A) RNA Using Atomic Force Microscopy // Journal of structural Biology, 1997, - v. 119, -pp. 109-117
100. Sokolov I.Y., Firtel M., Henderson G.S. In situ Highresolution Atomic Force Microscope Imaging of Biological Surfaces // J. Vac. Sci. Technol., A, 1996, - v. 14, -pp. 674-678.
101. Sophia Hohlbauch. Bibliography of Atomic Force Microscopy In Biological Sciences // Digital Instruments, Veeco Metrology Group Biological Bibliography. URL: http://www.di.com (дата обращения 10.05.2011).
102. Stanley W.M. Isolation of a crystalline protein possessing the properties of tobacco-mosaic virus // Science, 1935, - v.81, - pp.644-645.
103. Stemmer A. and Engel A. Imaging biological macromolecules by STM: quantitative interpretation of topographs // Ultramicroscopy, 1990, - v.34, - pp. 129140.
104. Xiao-Li Su, Yanbin Li. A QCM immunosensor for Salmonella detection with simultaneous measurements of resonant frequency and motional resistance // Biosensors and Bioelectronics -2005, v. 21, -pp. 840-848.
105. Suo, Z.; Yang, X.; Avci, R.; Kellerman, L.; Pascual, D. W.; Fries, M.; Steele,
106. A. HEPES-stabilized encapsulation of Salmonella typhimurium // Langmuir -2007, -v.23, -pp. 1365-1374
107. Ta T.C., Sykes M.T., McDermott M.T. Real-Time Observation of Plasma Protein Film Formation on Well-Defined Surfaces with Scanning Force Microscopy // Langmuir, 1998, - v. 14, - pp.2435-2443
108. Touhami, A.; Jericho, M. H.; Beveridge, T. J. Carbon Nanotube-Based DualMode Biosensor for Electrical and Surface Plasmon Resonance Measurements // Langmuir. -2007, -v.23, -pp.2755-2760.
109. Van der Mei H.C., Busscher H.J., Bos R., de Vries J., Boonaret C.J.P., Dufrene Y.F. Direct Probing by Atomic Force Microscopy of the Cell Surface Softness of a Fibrillated Oral Streptococcal Strain // Biophys. J., 2000, - v.78, - pp.2668-2674.
110. Vijayalakshmi Velusamy, Khalil Arshak, Olga Korostynska, Kamila Oliwa, Catherine Adley. An overview of foodbome pathogen detection: In the perspective of biosensors // Biotechnology Advances -2010, -v. 28 -pp. 232-254.
111. Wahl R, Raff J., Selenska-Pobell S., Mertig M., Pompe W. A Fast Screening Method for Surface Layers on Gram-Positive Bacteria // Biotechnol. Lett., 2001, -v.23,-pp. 1485-90.
112. Waner M.J., Gilchrist M., Schindler M., Dantus M. Imaging the molecular dimensions and oligomerization of proteins at liquid/solid interfaces // J. Phys.Chem.
113. B., 1998, - v. 102, - pp. 1649-1657.
114. Weisenhorn A.L., Drake B., Prater C.B., Gould S.A.C., Hansma P.K., Ohnesorge F., et al. Immobilized proteins in buffer solution at molecular resolution by atomic force microscopy// Biophys. J., 1990, - v.58, -pp.1251-1258.
115. Wendelschafer-Crabb, G.; Erlandsen, S. L.; Walker, D. H. Conditions critical for optimal visualization of bacteriophage adsorbed to bacterial surfaces by scanning electron microscopy // J. Virol. -1975, -v. 15, -pp. 1498-1503.
116. Y.Y. Wong, S.P. Ng, M.H. Ng, S.H. Si, S.Z. Yao, Y.S. Fung. Immunosensor for the differentiation and detection of Salmonella species based on a quartz crystal-microbalance // Biosensors and Bioelectronics -2002, -v. 17,-pp. 676-684
117. Yokota H., Nickerson D.A., Trask B.J., van den Engh G., Hirst M., Sadowski I., and Aebersold R. Mapping a Protein-Binding Site on Straightened DNA by Atomic Force Microscopy // Analytical Biochemistry, 1998, - v.264, - pp. 158-164.
118. Yoshimura, I. K.; Arisaka, F.; Ritani, A.; Ima, K. Atomic force microscope of bacteriophage T4 and its tube-baseplate complex // FEBS Lett. -1993, -v.326, -pp.
119. Zlatanova J., Lindsay S.M., Leuba S.H. Single Molecule Force Spectroscopy in Biology Using the Atomic Force Microscope // Prog. Biophys. Mol. Biol, 2000, -v.74, -pp.37-61.
120. Zhang J., Chi Q., Dong S., and Wang E. STM of folded and unfolded haemoglobin molecules electrochemically deposited on highly oriented pyrolytic graphite // J. Chem. Soc. Faraday Trans., 1995, - v.91, - pp. 1471-1475
121. Zhang J., Chi Q., Dong S., and Wang E. In situ electrochemical scanning tunneling microscopy investigation of structure for horseradish peroxidase and its electrocatalytic property // Biochem Bioenergetics, 1996, - v.39- - on.267-274.39.41.
- Краевский, Сергей Владимирович
- кандидата биологических наук
- Оболенск, 2011
- ВАК 03.02.03
- Исследование морфо-функциональной реакции бактерий на различные воздействия с использованием атомно-силовой микроскопии
- Разработка и применение современных методов изучения и идентификации микроорганизмов с использованием бионанотехнологических подходов
- Микробиологический анализ на основе мономолекулярных пленок антител и сканирующей зондовой микроскопии
- ДНК-ГИДРОЛИЗУЮЩАЯ АКТИВНОСТЬ АНТИТЕЛ К ДНК ПРИ СИСТЕМНОЙ КРАСНОЙ ВОЛЧАНКЕ
- Разработка и применение современных методов изучения и идентификации микроорганизмов с использованием бионанотехнологических подходов