Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Разработка и применение современных методов изучения и идентификации микроорганизмов с использованием бионанотехнологических подходов

ВАК РФ 03.02.03, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Разработка и применение современных методов изучения и идентификации микроорганизмов с использованием бионанотехнологических подходов"

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ НАУКИ

11-1

574

«Государственный научный центр прикладной

микробиологии и биотехнологии» -4-__->

ФГУН ГНЦ ПМБ

ИГНАТОВ СЕРГЕЙ ГЕОРГИЕВИЧ

РАЗРАБОТКА И ПРИМЕНЕНИЕ СОВРЕМЕННЫХ МЕТОДОВ ИЗУЧЕНИЯ И ИДЕНТИФИКАЦИИ МИКРООРГАНИЗМОВ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БИОНАНОТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ ПОДХОДОВ

03.02.03 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Оболенск - 2010

Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении науки «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.

Научный консультант:

доктор медицинских наук, профессор Дятлов Иван Алексеевич

Официальные оппоненты:

член-корреспондент РАН, доктор биологических наук, профессор доктор ветеринарных наук, профессор доктор биологических наук

Гальченко Валерий Федорович Светоч Эдуард Арсеньевич Коломбет Любовь Васильевна

Ведущая организация:

Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, Биологический факультет

Защита диссертации состоится 24 марта 2011 г. в 13-00 часов на заседании диссертационного совета Д 350.002.01 при ФГУН «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» по адресу: 142279, Оболенск Серпуховского района Московской области.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУН «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии»

Автореферат разослан «¿X» декабря 2010 г.

Отзывы в двух экземплярах, заверенные печатью, просим отправлять по адресу:

142279, Оболенск Серпуховского района Московской области, ФГУН ГНЦ прикладной микробиологии и биотехнологии, ученому секретарю совета Н.К. Фурсовой. Факс 8(4967) 36-00-10, e-mail: fursova@obolensk.org

Ученый секретарь

диссертационного совета, /

кандидат биологических наук Н.К. Фурсова

РОССИЙСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ БИБЛИОТЕКА 2011

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы

Разработка новых методов анализа в микробиологии имеет большое значение для развития науки и применения ее результатов в различных отраслях народного хозяйства. Одним из наиболее востребованных направлений в микробиологии является разработка быстрых и чувствительных методов изучения и идентификации бактерий на основе бионанотехнологий.

В настоящее время разнообразный анализ бактериальных клеток имеет большое значение в биотехнологии и медицине при создании биопрепаратов, оптимизации микробиологического синтеза продуктов и других биотехнологических процессов, а также при разработке новых методов контроля и диагностики. Наличие между клетками и измерительным прибором промежуточного звена в виде поддерживающей среды обуславливает ряд недостатков этих методов: инерционность процесса измерений и усреднение измеряемых параметров. Поэтому электрооптический метод анализа, основанный на исследовании клеток как электрофизических объектов со слоистой структурой и измерении поляризационных характеристик клеточных структур, представляет собой новый подход к оценке прижизненных физиологических параметров клеток и их гетерогенности (Guliy et al., 2007). Различие электрических свойств среды культивирования (поддерживающей среды) и бактериальных клеток приводит к появлению индуцибельных зарядов при наличии поля. Взаимодействие индуцированных зарядов с электрическим полем является причиной возникновения вращательного момента, задающим ориентацию клеткам. Изменение ориентации бактериальных клеток приводит к изменению оптических свойств суспензии. Оптическая плотность суспензии может изменяться на 1-2%, однако этого достаточно для электрооптического анализа бактериальных клеток (Bunin and Angersbach, 2008). Этот метод измерений является прижизненным, он не использует дополнительных меток и не вызывает изменений в исследуемом объекте. Преимуществом данного метода яв-

ляется то, что влияние среды на точность измерения поляризационных параметров является незначительным и предсказуемым. Воздействие на бактериальные клетки измерительной процедуры также незначительно, и при этом микроорганизмы сохраняют свою жизнеспособность. С помощью электрооптического метода возможно определить количество и жизнеспособность бактерий. Метод является оперативным, причем процесс измерений может быть полностью автоматизирован.

Применение электрооптического метода для оценки состояния микроорганизмов в ходе технологического процесса и для анализа взаимодействия бактерий со специфическими антителами и фагами является актуальной и будет раскрыта в данной работе

Классические методы определения бактерий, основанные на культивировании микроорганизмов с последующим микробиологическим и биохимическим анализом, являются трудоемкой и длительной процедурой с использованием дорогостоящего оборудования. Биосенсоры аналитически чувствительная и недорогая альтернатива стандартным методам, применяемым сегодня для идентификации бактерий (Deisingh and Thompson, 2002). Они представляют собой аналитические приборы для селективного определения веществ и организмов, в которых используется комбинация биологической системы узнавания и физического преобразователя. Увеличение числа анализируемых образцов, требующих проверки и контроля, и потребность в высокой чувствительности, скорости и точности аналитических измерений стимулировали значительный интерес к развитию биосенсоров в качестве мощной и недорогой альтернативы по отношению к стандартным химическим и эн-зимологическим методам, используемым на сегодняшний день. Вместе с тем, несмотря на применение биосенсоров на основе бактериальных клеток (Buchinger et al., 2010), практически нет данных по использованию клеточных фрагментов или субклеточных структур для повышения чувствительности и специфичности измерений субстратов. Отсутствуют также литературные данные и по использованию простых систем «искусственного носа» и

систем на основе оптоволоконных пучков для идентификации бактерий. Перспективным направлением является разработка биосенсора для анализа антиоксидантной активности веществ с последующим изучением их влияния на защитные функции макроорганизма.

Бионанотехнология - современная биологическая наука, оперирующая наноразмерными объектами. Возможности получения нанообъектов и способность анализировать их качественно изменяют уже существующие подходы в исследованиях. Сканирующая зондовая микроскопия (СЗМ) получила такое название благодаря ключевому элементу, обязательно присутствующему во всех её модификациях - зонду (Cuenat, 2010). Микроскопический зонд двигается, как правило, построчно вдоль поверхности исследуемого образца, взаимодействуя с ним таким образом, что становится возможным детектировать количественную характеристику этого взаимодействия, которая, в конечном счёте, и несёт информацию о свойствах объекта. Атомно-силовая микроскопия (АСМ) принадлежит к семейству проксимальной зон-довой микроскопии для анализа поверхности и ее свойств на атомно-молекулярном уровне. В течение последних десятилетий достигнут большой прогресс в развитии АСМ как инструмента изучения нанообъектов в микробиологии (Dufrene 2002, Dufrene et al., 2009). С помощью АСМ можно получить трехмерное изображение поверхностных ультраструктур на молекулярном уровне в реальном времени и при физиологических условиях путем анализа взаимодействия между анализируемой поверхностью и специальным наконечником кантилевером. Однако все исследования с применением АСМ в основном сводились лишь к наноразмерному анализу бактериальной поверхности. До проведения настоящей работы не была осуществлена специфическая иммобилизация вирусов и бактериальных клеток и/или их на-нофрагментов для анализа и идентификации бактерий.

Важным аспектом бионанотехнологии является определение бактерицидной активности наносоединений (Nel ct al., 2006). Следует учитывать, что

наряду с этим, важна также их роль в функционировании макрофагов при фагоцитозе патогенов.

Бионатехнологии открывают новые перспективы для значительного увеличения чувствительности анализа и идентификации микроорганизмов. Результаты работы очень важны для микробиологии, поскольку существенно расширяют и дополняют представления о методах идентификации прокариот и вносят существенный вклад в понимание процессов анализа бактериального мира.

Цель исследования

Основной целью работы является разработка и применение новых высокоэффективных методов изучения и идентификации бактерий на основе элетрооптических, биосенсорных и бионанотехнологических подходов.

Задачи исследования

1. Разработка электрооптического метода для анализа и контроля физиологического состояния бактерий и их выживаемости в ходе биотехнологических процессов.

2. Выявление электрооптических изменений микробиологических систем, которые могут служить удобным инструментом идентификации микроорганизмов при анализе взаимодействия бактерий со специфическими антигенами и фагами.

3. Разработка биосенсоров с применением системы искусственного носа на основе высокоплотных оптоволоконных пучков для бесконтактной идентификации микроорганизмов.

4. Изучение возможности использования глюкозного биосенсора для контроля синтеза авермиктина.

5. Разработка биосенсоров на основе бактериальных клеток или их фрагментов для определения глюкозы, лактата и определения концентрации бактерий.

6. Разработка биосенсора для определения антиоксидантной активности веществ.

7. Определение наличия микроорганизмов по анализу летучих компонентов бактериальной культуры. Изучение возможности использования простой модификации метода спектрофотометрического анализа для быстрого выявления присутствия микроорганизмов либо по выделению ими летучих компонентов, либо по их поглощению из окружающей среды.

8. Получение аффинных поверхностей и их анализ для использования бионанотехнологического подхода на основе атомно-силовой микроскопии для высокоспецифичной идентификации микроорганизмов.

9. Изучение токсического действия наносоединений на микроорганизмы.

Научная новизна

Разработан электрооптический метод диагностики физиологического состояния бактериальных клеток в процессе производства биологических препаратов и идентификации бактерий.

Впервые предложено использовать цитоплазматические мембраны бактерий для конструирования новых био сенсоров для определения лактата и оценки бактериальной обсемененности свежего коровьего молока. Использованы новые подходы для определения антиоксидантной активности веществ и их роли в ходе инфекционного процесса. Разработан новый простой метод определения бактерий по анализу органических летучих компонентов.

Впервые разработана система специфической визуализации прокариот с помощью АСМ. Предложены методы оценки бактерицидной активности наносоединений.

Практическая значимость

Разработан электрооптический метод анализа выживаемости бактериальных клеток и оценки целостности клеточной оболочки в биотехнологических процессах, а также идентификации микроорганизмов (подана заявка на патент). Создана новая система биологического узнавания биосенсора на основе цитоплазматической мембраны бактерий, увеличивающая чувствительность определения лактата по сравнению с

биосенсорами на основе бактериальных клеток. Реализована методология специфической визуализации прокариотических клеток и их фрагментов для сверхчувствительной идентификации микроорганизмов с помощью АСМ на основе аффинных поверхностей (Патент России RU 2261279 С1). Разработанные методические рекомендации широко используется Институтом теоретической и экспериментальной физики (г. Москва) в вопросе исследования микроорганизмов с помощью атомно-силовой микроскопии. Разработан метод оценки бактерицидной активности наносоединеий для микроорганизмов и фагоцитарной активности макрофагов (готовится заявка на патент). Результаты работы применяются Национальным исследовательским технологическим университетом «МИСиС» при разработке новых видов нанопокрытий с учетом их бактерицидных свойств и функциональной активности фагоцитов.

Личный вклад соискателя

Соискателю принадлежит решающая роль в выборе направлений исследований, в формулировании проблемы, постановке целей и задач, разработке экспериментальных подходов и обобщении результатов. Соискатель принимал участие во всех этапах исследований. В работах, выполненных в соавторстве, соискатель принимал участие в проведении экспериментальной работы, в обобщении и интерпретации научных результатов, в подготовке научных публикаций, а также выступал с научными докладами.

Апробация работы

Основные положения диссертационной работы были представлены: на Всесоюзной конференции «Липиды биологических мембран» (Ташкент, 1980 г.), на XI научной конференции по итогам НИР ВНИИ ПМ (Оболенск, 1986 г.), на Всесоюзной конференции «Теория и практика электрооптических исследований коллоидных систем» (Велегож, 1990 г.), на международной конференции «Развитие медицинского оборудования» (Подольск 1996 г.), на международном симпозиуме «Стресс и азотный обмен» (Москва, 1996 г.), на международном рабочем совещании НАТО «Быстрые методы анализа биологических материалов в окружающей среде» (Варшава, 1997 г.), на междуна-

родном рабочем совещании НАТО «Новые направления в развитии биосенсоров» (Киев, 1998 г.), на международной конференции «Биокатализ-98» (Пущино, 1998 г.), на международной конференции «Биокатализ-2000» (Москва, 2000 г.), на Всероссийской конференции «Проблемы медицинской и экологической биотехнологии», (Оболенск, 1999 г.), на международной конференции «Современные проблемы биохимии и биотехнологии бактерий» (Пущино, 2000 г.), на международной конференции «Биосенсоры 2000» (Сан-Диего, США, 2000 г.), на международной конференции «Окись азота: фундаментальные исследования и применение в клинике» (Эриче, Италия, 2001 г.), на международных конференциях «1Т + МЕ» (Гурзуф, 2003 г., 2007 г.), на международной конференции «Канадский биологический коллоквиум» (Москва, 2004 г.), на 5 международном совещании МНТЦ/Корея (Сеул, Корея, 2004 г.), на 37 международном совещании МНТЦ-Япония по наноматериалам (Цукуба, Япония, 2004 г.), на международной конференции «Нанотех» (Бостон, США, 2006 г.), на VII Межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ "Чрезвычайные ситуации международного значения в общественном здравоохранении и санитарная охрана территории государств-участников СНГ" (Оболенск, 2006 г.), на IX ежегодном зимнем совещании «Успехи в исследованиях на молекулярном уровне для биологии и нанонауки» (Линц, Австрия, 2007 г.), на Первой Всероссийской Школе-семинаре «Современные достижения бионаноскопии» (Москва, 2007 г.), на Международной конференции «Сенсоры для окружающей среды, здравоохранения и безопасности (Виши, Франция, 2007 г.), на IV международной конференции «НаноБио и другие новые перспективные биотехнологии» (Пущино, 2007 г.), на VI Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Молекулярная диагностика 2007» (Москва, 2007 г.), на Международном совещании экспертов по разработке лекарств (Москва, 2007 г.), на Международном форуме по нанотехнологиям (Москва, 2008 г), на Международной научно-практической конференции «Нанотехнологии в сельском хозяйстве» (Москва, 2008 г.), на Международ-

ной конференции «Евромат-2009» (Глазго, Великобритания, 2009 г.) и на Семинаре «Производство и применение наноматериалов в России: токсикологическое воздействие и нормативные вопросы" (Москва, 2009 г.).

Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, методов исследований, результатов исследований и их обсуждения, заключения, выводов, списка литературы. Диссертация изложена на 229 страницах, содержит 11 таблиц, 88 рисунков. Список литературы включает 223 работы.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 58 печатные работы, 23 из которых представлены в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК, издана одна монография, получен один патент.

Место выполнения работы

Работа проводилась в ГНЦ прикладной микробиологии и биотехнологии (Оболенск) в рамках НИР и международных проектов.

Основные защищаемые положения

1. Электрооптический метод анализа бактерий позволяет контролировать физиологическое состояние бактерий и их выживаемость в ходе биотехнологических процессов.

2. Новые биосенсоры на основе системы искусственного носа, ферментов, фагов, бактериальных клеток или их фрагментов увеличивают чувствительность и скорость определения глюкозы, лактата и определения концентрации бактерий в анализируемой системе.

3. Использование бионанотехнологического подхода на основе атомно-силовой микроскопии (АСМ) совместно с получением аффинных поверхностей повышает чувствительность выявления микроорганизмов и их идентификации.

4. Применение АСМ позволяет более нативно анализировать аффинные взаимодействия в микробиологии.

5. Токсичность наноматериалов может оцениваться с помощью микробиологических приемов.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Объекты и методы исследований

В работе использовали бактерии Escherichia coli, Micrococcus luteus, Salmonella typhimurium, Salmonella enteritidis, Acetobacter aceti, Mycobacterium tuberculosis, Bacillus brevis, Bacillus subtilis, Bacillus thuringiensis, Pseudomonas aeruginosa, Yersinia pseudotuberculosis, Streptomyces avermitilis и ac-комицет Neurospora crassa. Для индукции специфических ферментативных активностей микроорганизмы культивировали на минимальных средах с различными источниками углерода. Мицелий аскомицета выращивали на модифицированной среде Фогеля, содержащей минеральные соли, сахарозу и биотин.

Выделение мембран проводили путем осмотического лизиса сферопла-стов (Игнатов и др. 1981), полученных после обработки клеток лизоцимом с последующей промывкой центрифугированием при охлаждении. Путем субстратной индукции получали цитоплазматические мембраны (ЦПМ) с заранее заданными ферментативными свойствами. Наличие нативной иммобилизации ферментативных ансамблей в липидном бислое обеспечивает более стабильную и чувствительную систему анализа. Поверхностный заряд ЦПМ изменяли, используя положительно заряженные цетилтриаммоний бромид и полилизин и отрицательно заряженные додецилсульфат натрия и полиаспа-рагиновую кислоту.

Для проведения криоиммобилизации клетки и мембраны смешивали с заранее приготовленным 10 %-ным раствором поливинилового спирта. Суспензию раскапывали по пластиковой поверхности и помещали в холодильник для формирования криогеля. После 24 ч экспозиции при низкой температуре гранулы иммобилизованных клеток и мембран оттаивали, промывали несколько раз фосфатным буфером (pH 7,4) и хранили в нем. Приготовлен-

ные заранее навески иммобилизованных биокатализаторов использовали для детекции соответствующих активностей.

Для размножения и титрования фагов использовали полужидкий L-arap с 0,4 %-ной глюкозой. Для экспериментов использовали заранее размноженные фаги в концентрации - Ю10-Юи частиц/мл.

Исследования антиоксидантной активности соединений проводили в электрохимической ячейке, имеющей трехэлектродную конфигурацию. Ячейка объемом 1мл включала Ag/AgCl/ 1М КС1 электрод сравнения и Pt обратный (рабочий) электрод. Циклическую вольтаметрию осуществляли с использованием системы "Автолаб" Для измерения антиоксидантной активности модифицированный золотой электрод поляризовали при +150мВ по отношению к Ag/AgCl. В качестве потенциостата использовали «Биоанализатор» фирмы Kreijci Engineering (Чехия).

При определении лактата для приготовления чувствительной к кислороду волоконно-оптической системы готовили тонкую силановую пленку с чувствительным к кислороду флуоресцентным красителем, рутений дифе-нилфенантролином, которую механически крепили на конце оптического волокна. Пленку готовили путем приготовления фотополимеризующего раствора, содержащего мономер силоксана, раствора красителя и индуктора на поверхности чашки. При помощи УФ лампы индуцировали полимеризацию раствора и механическое включение красителя в полимер. Полимерную пленку помещали в раствор дистиллированной воды и хранили в темноте перед использованием. На поверхность этого чувствительного к кислороду слоя помещали препарат ЦПМ, адсорбированный на целлюлозном диске. Всю конструкцию крепили на оптическое волокно нейлоновой сеточкой с помощью резинового кольца.

АСМ-измерения проводили на атомно-силовом микроскопе Nanoscope Illa (Digital Instruments, США) в режимах постоянного и прерывистого контакта. При измерениях в контактном режиме сканирования использовали коммерческие кантилеверы из нитрида кремния (Si3N4) с жёсткостью 0,06,

0,32, 0,58 и 0,12 Н/м (в зависимости от объекта). Для измерений в режиме прерывистого контакта на воздухе использовали коммерческие кантилеверы из кремния с номинальной жесткостью 42 Н/м. Резонансная частота сканирования лежала в диапазоне 280-310 кГц. Измерения в жидкости проводили с использованием жидкостной ячейки (Digital Instruments, США) для режима прерывистого контакта, применяя коммерческие кантилеверы из нитрида кремния жесткостью 0,58 Н/м, при частоте сканирования 8-10 кГц.

Мышиные перитонеальные макрофаги получали путем инъекции стерильного раствора NaCl (0,9 %) в перитонеальную область мышей. После абдоминального массажа собирали перитонеальную жидкость, которую помещали на покровное стекло в присутствии среды 199 с 10 %-ной эмбриональной телячьей сывороткой в стерильной чашке Петри с нанообразцами. Затем добавляли 100 мкл бактериальной суспензии (106 клеток/мл) и культивировали 2 час при 37 °С. После инкубации монослой макрофагальных клеток на покровном стекле фиксировали этанолом и окрашивали по Романовскому. Изменения бактерицидной активности макрофагов изучали с помощью светового микроскопа Olympus ВХ41.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Глава 1 Электрооптические методы исследования

На примере клеток Е. coli и В. thuringiensis показана эффективная возможность оценки жизнеспособности бактерий на основных этапах биотехнологического производства биопрепаратов этапах ферментации, концентрирования и сушки. На получение и обработку электрооптических данных уходит не более 20 мин. При определении интактных клеток учитывался тот факт, что в интервале 7,5 < lgf0 <7,8 (где f0 частота задаваемого поля) электрооптический сигнал практически равен нулю. Оценку инактивирующего воздействия оценивали (в %) путем сравнения величины электрооптического эффекта (ЭОЭ) до и после воздействия в выбранном нами интервале частоты электрического поля. Электрооптические результаты сравнивали с результа-

тами, полученными путем высева бактериальных клеток на твердые питательные среды, с последующим подсчетом колониеобразующих единиц (КОЕ). Как видно из табл. 1, электрооптический метод позволяет аккуратно и быстро оценить жизнеспособность микроорганизмов после определенного экстремального воздействия.

Таблица 1 - Изменение ЭОЭ и жизнеспособности клеток Е.соИ и В. /киг-т%1ет18 на этапах ферментации, концентрирование и сушки_

Биотехнологический этап Е. coli В. thuringiensis

Выживаемость клеток, % ЭОЭ, % Выживаемость клеток, % ЭОЭ, %

Инокулят 100 100 100 100

Ферментация 80±8 78±8 82±8 80±8

Концентрирование 67±8 65±8 78±8 77±8

Сушка 13±7 9±7 40±7 39±7

Небольшое занижение результатов выживаемости бактериальных клеток, получаемое электрооптическим методом, объясняется тем, что данный метод регистрирует как летальные, так и сублетальные повреждения бактерий. Данные повреждения и их репарация детально исследованы при изучении замораживания и оттаивания клеток, а также при их лиофилизации. Оказалось, что при замораживании-оттаивании активность мембраносвязанных оксидазных и дегидрогеназных ферментов, а также содержание цитохромов не меняется. Не наблюдается также структурных перестроек в липидной фазе мембраны и изменений в ее липидном составе. Однако замораживание-оттаивание вызывает повреждение целостности клеточного барьера, с последующим разобщением окислительного фосфорилирования. В ходе восстановительных процессов (репарации) после экстремальных воздействий наблюдается восстановление целостности клеточного барьера, с последующим восстановлением синтеза АТФ в ответ на искусственно созданную протондви-жущую силу.

Выбор электрофизических параметров эксперимента определялся тем, чтобы для данного вида микроорганизмов электрооптический сигнал успевал за минимально возможное время достичь максимума при включении поля и

вернуться к исходному уровню при его выключении. Измерение поляризационных параметров клеток как функции частоты электрического поля или частотной дисперсии анизотропии поляризуемости (ЧДАП) - позволяет определить физиологическую активность клеток. После оптимизации состава поддерживающей среды и электрофизических параметров электрооптических измерений было изучено влияние реакции антиген-антитело на ЧДАП комплекса микроорганизм антитело. К суспензии бактерий (Е. соИ или еЫегШсИз) в фосфатно-солевом буфере добавляли раствор антител, специфичных, соответственно, к Е. соИ или еМегШсИя. Полученную смесь инкубировали 20 мин при 37 °С и легком помешивании. Полученную суспензию помещали в измерительную ячейку электрооптического анализатора. Под действием переменного электрического поля (напряженность Е=100 в/см; время действия сек.; диапазон частот 10-30000 кГц) происходили изменения оптических свойств суспензии, которые регистрировали в виде ЧДАП (рис. 1-2). В качестве контроля использовали бактерии, не взаимодействовавшие с антителами.

600 500 ■ ОТ. ед. —*-Е.с.

400 - \

300 ■ А' \ \

200 ■ 100 ■ ■ / ■ \ / л ,.«•'/ л

кНг

10 100 1000 10000 100000

Рисунок 1 - ЧДАП суспензии бактерий Е. соИ после взаимодействия со специфическими антителами

На основании полученных результатов можно дать некоторую оценку электрофизических и морфометрических параметров полученных комплексов ан-

тиген-антитело. Общее снижение амплитуды электрооптического сигнала в присутствии антител может быть следствием образования конгломератов бактериальных клеток. Сдвиг максимума ЧДАП в область низких частот указывает на возможное нарушение целостности бактериальных мембран.

Рисунок 2 ЧДАП суспензии бактерий еМегШсИз после взаимодействия со специфическими антителами

Рисунок 3 - ЧДАП после взаимодействия бактериальной суспензии клеток E.coli 057 с фагом V18/A157

Была изучена возможность использования электрооптического метода для идентификации микроорганизмов путем анализа специфического взаимодействия микробных клеток с бактериофагом. На рис. 3 представлены ЧДАП контрольной суспензии бактерий Е. coli и ЧДАП тех же бактерий по-

еле 30-минутной инкубации с фагом V18/A157. На рис. 4 показаны ЧДАП контрольной суспензии S. enteriditis и суспензии тех же бактерий после 30-минутной инкубации с фагом 39. Здесь же представлена ЧДАП суспензии бактерий S. enteriditis после 30-минутной инкубации с фагом V18/A157 специфичным для Е. coli, очевидно, невзаимодействующим с бактериями S. enteriditis. Полученные данные подтверждают возможность использования бактериофагов для идентификации микроорганизмов.

Рисунок 4 - ЧДАП после взаимодействия бактериальной суспензии клеток S. enteriditis с фагами V18/A157 и 39

При исследовании взаимодействия клеток В. thuringiensis с фагом Vf, было обнаружено, что если проводить инкубацию бактерий с фагом без аэрации (как в вышеуказанных случаях с Е. coli и S. enteriditis), то даже спустя 90 минут не наблюдается существенного изменения ЧДАП (рис. 5).

Однако при инкубации клеток В. thuringiensis с бактериофагом Vf в условиях аэрации результаты получаются сходными с теми, которые были получены при изучении взаимодействия с фагами факультативно анаэробных бактерий Е. coli и S. enteriditis (рис. 6). Через 60 мин инкубации бактерий с фагами ЧДАП практически исчезает, что указывает на драматическое нарушение целостности бактериальных оболочек в этих условиях определения.

Рисунок 5 ЧДАП после взаимодействия бактериальной суспензии клеток В. без аэрации с фагом

Рисунок 6 - ЧДАП после взаимодействия бактериальной суспензии клеток В. 1Ьипп£1еп518 при аэрации с фагом

Для улучшения измерения ЭОЭ при низкой величине напряженности ориентирующего поля был разработан численный алгоритм определения анизотропии поляризуемости бактериальных клеток, снимающий существенные ограничения на проведение эксперимента.

Глава 2 Биосенсоры

Целью данной части работы является разработка новой генерации биосенсоров на основе системы искусственного носа, ферментов, фагов, бактериальных клеток или их фрагментов для увеличения чувствительности и скорости определения глюкозы, лизина, лактата, а также для определения концентрации бактерий.

2.1 Бесконтактное определение микроорганизмов Разработан бесконтактный метод определения бактерий с применением системы искусственного носа на основе высокоплотных волоконно-оптических биосенсорных пучков. Принцип определения бактерий основан на анализе воздушного пространства над образцом для определения летучих компонентов (ЛК). Известно, что выделяемые бактериями ЛК определяют специфический запах бактерий, что может служить характерным признаком данной бактерии. Сенсорным элементом являются полистирольные микросферы с флуоресцентным красителем интерколированные в проксимальный конец волоконной системы. ЛК способны влиять на микроокружение микросфер, изменяя флуоресцентные характеристики красителя. Таким образом, анализируя летучие вещества, можно идентифицировать бактерии (рис. 7).

Рисунок 7 - Бесконтактная идентификация бактерий при использовании системы искусственного носа

Развивая данный подход, была показана принципиальная возможность использования простой модификации метода спектрофотометрического анализа для быстрого выявления присутствия микроорганизмов либо по выделению ими ЛК, либо по их поглощению из окружающей среды. Кроме того, данный метод позволяет различить мутанты N. сгазза, дефектные по метаболизму азота, от штамма дикого типа. По-видимому, пИ-2 и пЫ-б гены гриба связаны с образованием ЛК у этого организма.

2.2 Биосенсор для определения глюкозы

Биосенсоры представляют собой недорогую альтернативу классическому анализу веществ в ходе биотехнологических процессов. Антибиотик авермиктин играет большую роль как в медицине, так и в ветеринарии. Он продуцируется бактериями смегтИШь в ходе процесса длительного культивирования (72 ч). Характерно, что максимальный выход этого антибиотика наблюдается в короткий промежуток времени при минимальной концентрации глюкозы в среде. Для оптимизации условий выделения антибиотика важно определить минимальную концентрацию глюкозы в среде очень быстро, так как авермиктин быстро распадается при отсутствии глюкозы. Был разработан глюкозный биосенсор для контроля концентрации авермиктина. Для приготовления глюкозного модуля использовали бычий сывороточный альбумин, глюкозооксидазу и глутаровый альдегид. Глюкозный модуль помещали на торец рОг-электрода. Линейный ответ биосенсора наблюдали в диапазоне концентраций глюкозы от 1 до 30 мМ. Данная система очень перспективна для быстрого определения глюкозы в среде культивирования бактерий с целью увеличения выхода антибиотика.

2.3 Разработка бисенсорной системы узнавания на основе бактериальных клеток и их фрагментов с помощью криоиммобилизации

Бактериальные клетки можно рассматривать как систему, содержащую различные ферменты в их естественном окружении, для конструирования биосенсоров. Такая биокаталитическая система на основе бактерий осуществляет ферментативные реакции в оптимальных, естественных условиях, и,

как ожидается, будет более стабильной по сравнению с ферментами, полученными путем выделения и очистки. Для создания потенциально новых систем биологического узнавания на основе бактериальных клеток и их фрагментов исследовали три типа бактерий со специфически индуцированными ферментативными системами. Для индукции лактатоксидазной системы культивировали штаммы Е. coli и М. luteus в среде, где в качестве источника углерода использовали соли лактата. Клетки А. aceti выращивли в анаэробных условиях для индукции этанолоксидазной системы.

На примере метода криоиммобилизации были отработаны методы иммобилизации бактериальных клеток и их фрагментов. Сущность метода состоит в замораживании микробных клеток в растворе поливинилового спирта, в ходе которого происходит формирование макро- и микроструктуры матрицы криогеля, при этом поликристаллы замороженного растворителя выступают в роли порообразователей. Получаемые гранулы (пленки) обладают, наряду с высокой пластичностью, достаточно высокой механической прочностью. Матрица криогеля, будучи высокопористой структурой, не создает диффузионных затруднений для основной массы соединений.

Установлено, что удельная респираторная активность иммобилизованных клеток и мембран бактерий была постоянной во всех образцах и не зависела от величины навески, а количество потребляемого кислорода в реакционной ячейке зависело от количества иммобилизованного биокатализатора.

2.4 Биосенсоры на основе ЦПМ

Цитоплазматические мембраны (ЦПМ) бактерий представляют собой липидный бислой с инкорпорированными белками. Бактериальные ЦПМ играют важную роль в многочисленных биологических процессах, таких как дыхание и перенос энергии. Способность индукции определенных ферментативных систем в ЦПМ в ходе культивирования бактерий делает мембраны весьма привлекательным инструментом при конструировании биосенсора путем выделения таких мембраносвязанных ферментативных комплексов с

последующей иммобилизацией их на твердой подложке с сохранением на-тивности и биологической активности.

Была изучена возможность модификации поверхностного заряда ЦПМ бактерий для дальнейшего изучения его влияния на чувствительность и стабильность биосенсорного узнающего элемента. Для этого мы использовали модификаторы поверхностного заряда: цетилтриметиламмоний бромид (ЦТАБ) (положительно заряженный) и додецилсульфат натрия (SDS) (отрицательно заряженный). Первоначально было показано, что добавление ЦТАБ в диапазоне концентраций 10-50 мкМ увеличивает потребление кислорода ЦПМ бактерий в присутствии НАДН, отрицательно заряженного субстрата дыхания. Добавление же SDS в диапазоне концентрации 10-50 мкМ в этих же условиях, наоборот, уменьшало потребление кислорода мембранами. По-видимому, данное изменение потребления кислорода ЦПМ и связано с электростатическим взаимодействием заряженного субстрата с заряженной поверхностью бактериальных мембран. Для доказательства наличия зарядовой модификации поверхности мембран мы решили оценить изменения поверхностного заряда с помощью положительно заряженного флуоресцентного зонда disC и отрицательно заряженного флуоресцентного зонда ANS. В качестве модификаторов поверхностного заряда мы использовали ЦТАБ и SDS. Добавление к мембранам положительно заряженного модификатора ЦТАБ увеличивало интенсивность флуоресценции отрицательно заряженного зонда ANS. В свою очередь, добавление отрицательно заряженного модификатора SDS уменьшало интенсивность данного флуоресцентного зонда.

Таким образом, была установлена возможность модификации поверхностного заряда бактериальных ЦПМ с помощью положительно заряженного модификатора ЦТАБ и отрицательно заряженного модификатора SDS. Дальнейшие исследования показали, что поверхностный заряд является барьером проницаемости мембранного аппарата для заряженных субстратов и должен учитываться при конструировании биологической системы узнавания биосенсора.

2.5 Оптоволоконный биосенсор для определения лактата на основе

цпм

Лактат является важным метаболитом при анализе пищи, поэтому для его определения создано большое количество биосенсорных измерителей. Данные подходы анализа лактата требуют присутствия НАДН или ДЕАЕ-декстран-.лактинола, а также присутствия термостабильной пероксидазы из сои. Нестабильность таких комплексов и необходимость присутствия коэн-зимов существенно ограничивают их практическое применение.

Держатель ЦПМ и силановая рЕЕК трубка

пленка с рутением

250 мкм оптическое волокно

Рисунок 8 - Схема волоконно-оптического биосенсора для определения лактата

В нашей работе описана конструкция волоконно-оптического биосенсора, основанного на новом типе биологического узнающего элемента - бактериальных цитоплазматических мембран (ЦПМ). В качестве вторичного преобразователя использовали волоконно-оптический сенсор для определения кислорода, а в качестве биологического узнающего элемента - ЦПМ. В результате такой комбинации был сконструирован новый тип биосенсора для определения лактата (рис. 8). Его специфичность оценивали по влиянию таких биологически важных соединений как глюкоза, фруктоза и глутаминовая

кислота на сигнал прибора.

На рис. 9 видно, что присутствие данных субстратов в концентрации 50 мМ не влияет на определение лактата. Нами было обнаружено, что кова-лентное связывание чувствительного к кислороду слоя красителя на поверх-

о,

о.б

0.5

I

5

О 0.2

+ 50 шМ Фрукточа

+ 2.5 тМ лактлт

0.1

0.0

о

3

б 9 12 15

Время (ш1и)

Рисунок 9 - Специфичность лактатного биосенсора к другим субстратам

ность оптического волокна улучшает механическую стабильность сенсора. Другие инструментальные приспособления при конструировании данного сенсора не оказывали значительного влияния на его ответ. Таким образом, была показана способность конструирования биосенсора на основе ЦПМ бактерий. Полученный биосенсор специфически реагирует с лактатом и нечувствителен к наличию в среде измерения таких субстратов как глюкоза, фруктоза и глутаминовая кислота. Уникальная организация ЦПМ совместно с высокой чувствительностью волоконно-оптической системы позволяет применять данные сенсоры как для анализа активных субстратов, так и для косвенного определения бактериальных клеток.

Для определения лактата в молоке был разработан биосенсор на основе бактериальных цитоплазматических мембран (ЦПМ). Нативная организация ферментативных комплексов в липидных бислоях ЦПМ обеспечивала стабильность и высокую чувствительность узнающего элемента биосенсора.

Для подсчета бактериальных клеток в свежем молоке коровы его образцы высевали на плотные питательные среды и подсчитывали колонии после 18 час инкубации. С помощью биосенсора удалось установить корреляцию между концентрацией лактата в молоке и его бактериальной обсемененно-

стью. Концентрация лактата в молоке, равная 5 мМ, соответствует 0,3x106 клеток/мл. После 3 ч инкубации при 37 °С концентрация лактата составляла 10 мМ, а бактерий - 106 клеток/мл; после 6 час инкубации - 20 мМ лактата и 107 клеток/мл. С помощью нашего биосенсора можно определить критическую точку, характеризующую качество молока, которая соответствует концентрации бактерий 106 клеток/мл или 10 мМ лактата.

2.6 Амперометрический биосенсор для определения антиоксидант-ной активности

На рис. 10 представлена схема определения антиоксидантной активности различных субстратов. нА 3 4 5 6

I ип

Рисунок 10 Схема отклика сенсорного электрода на образование супероксида при добавлении антиокисиданта и супероксидцисмутазы. 1 - добавление 100 мМ гипоксантина; 2 - добавление ксантиноксидазы, 50 мЕ/мл; 3,4,5 - добавление антиокисиданта; 6 - добавление супероксидцисмутазы, 2 Е/мл. А, А' и А"- понижение сигнала при различной концентрации антиокисиданта в среде

Как известно, антиоксиданты предохраняют организмы от вредного воздействия активных форм кислорода. Поэтому использование биосенсорного подхода для регистрации антиокидантных свойств веществ нашло важное

применение в медицине и пищевой промышленности. Для определения анти-оксидантной активности различных веществ показана высокая эффективность использования супероксидно-специфического амперометрического биосенсора (рис. 10).

Антиоксидантная активность субстратов представлена в табл. 2.

Таблица 2 Антиоксидантная активность субстратов, где 1зо /^.ас - концентрация аскорбиновой кислоты, вызывающая 50% ингибирование генерации супероксида, 15о - концентрация субстрата, вызывающая 50% ингибирование генерации супероксида, Е щс^ - Единицы аскорбиновой кислоты (I 50

Л5.ас/ I 5о)_

Вещество Сигнал I 50 As.ас, I 50, Е L-' asc.ac

электрода, нА мкМ нМ

(-) Эпигаллокатехин 0,8 9,0 83,7 107,5

(+) Катехин 0,4 9,6 600,0 16,0

(+/-) Катехин 0,8 9,0 277,0 32,4

Пирогаллол 0,8 9,0 262,7 34,3

Мирицетин 0,6 7,7 454,7 17,0

Кверцетин 0,7 4,8 2400,0 2,0

Танниновые кислоты 0,8 6,6 473,0 14,0

Исследование данных веществ показало их высокую антиоксидантную активность. Установлено, что обработка бактериальных клеток данными ан-тиоксидантами частично предотвращает их элиминацию в мышиных макрофагах.

Глава 3 Бионанотехнологические подходы исследования в микробиологии

3.1 АСМ микроскопия вирусов

Вирусы были выбраны для исследования как наименьшие живые биологические структуры. Существует два метода иммобилизации вирусов: специфическая и неспецифическая. Неспецифический метод заключается в нанесении капли вирусной суспензии на поверхность. Специфический метод основан на предварительной модификации поверхности специфическими антителами. Стандартные методы получения монослоев вирусных антител базируются на ковалентном связывании антител с поверхностью. Хорошо известно, что монослои антител и ферментов могут терять свою активность.

27

Чтобы этого не происходило, используют амфифильные полиэлектролиты и липиды. Был разработан метод с использованием лэнгмюровских пленок антител на амфифильном полиэлектролите для иммобилизации ротавирусов и аденовирусов с последующей визуализацией методом АСМ. Аденовирусы и ротавирусы - важные патогены человека. На рис. 11 представлены АСМ изображения аденовирусов и ротавирусов, полученные с помощью неспецифической иммобилизации.

Рисунок 11 - АСМ изображение аденовирусов (А) и ротавирусов (Б) на поверхности. Справа показан вертикальный профиль поверхности

Такие образцы очень нестабильны и быстро разрушаются при хранении. Чтобы повысить специфичность и стабильность иммобилизованных вирусов, использовали антитела для их специфического связывания с поверхностью. Для этого применяли лэнгмюровские пленки антител на амфифильных электролитах - полиэтиленимине и полибензилгистидине. Применение таких электролитов делает возможным предохранение конформации белковой глобулы от действия инактивирующих факторов на границе раздела фаз воздух/вода и приводит к усилению взаимодействий между компонентами лэнгмюровских пленок. Были протестированы различные условия образования монослоев полиэлектролитов. В качестве критерия использовали степень шероховатости получаемых пленок. В случае полибензилгистидина стало возможным получать пленки толщиной 1,5-2 нм и шероховатостью 0,2 нм, что в результате приводит к увеличению аффинности пленок полимер/антитело.

После месяца хранения при +5 °С пленки антител оставались целыми, сохраняя свою иммунную активность. Для определения толщины получен-

ной пленки антител специально разрушали небольшую область ее поверхности. Разница в высоте разрушенного и целого слоев интерпретировалась как толщина пленки, которая составляла 8-12 нм в зависимости от выбранной области и материала субстрата (рис. 12).

Рисунок 12 - Пленка аденовирусных антител на поверхности подложки. Слева (А) показан участок пленки, специально разрушенный для оценки толщины пленки. Справа (В) показана нативная пленка

Используя этот подход, можно получать специфически иммобилизованные аденовирусы и ротавирусы. На рис. 13 представлены АСМ изображения ротавирусов и трехмерное изображение аденовирусов.

А Б

Рисунок 13 - АСМ изображение ротавирусов (А), и трехмерное АСМ изображение аденовирусов (Б), специфически связанных с пленкой соответствующих антител, образованной на амфифильном полимере

3.2 АСМ микроскопия бактерий

Существует множество методов исследования бактерий. Качественную и количественную характеристики бактериальных клеток можно получить методами световой и электронной микроскопии, фотоэлектронной микроскопии Х-лучей, ИК-спектроскопии, измерениями контактного угла и элек-трофоретической мобильности. Однако многие из этих методов требуют спе-

циальной подготовки и условий вакуума во время анализа и не могут быть использованы для нативных исследований. В последние годы в микробиологии открыт новый способ исследования бактерий. АСМ микроскопия обеспечивает получение 3D изображения поверхностных ультраструктур с молекулярным разрешением, в режиме реального времени и физиологических условиях. Поверхность живых бактериальных клеток - это очень сложная гетерогенная структура, содержащая липидные, белковые и углеводные компоненты. Организация некоторых мембранных областей играет важную роль во взаимодействии клеток с поверхностью и между собой. Вместе с тем, несмотря на то, что ультраструктура микробной поверхности изучается методом электронной микроскопии уже более 30 лет, прямой информации о ее строении в нативном состоянии получить таким способом нельзя. Понимание процессов адгезии и агрегации бактериальных клеток требует не только знания физико-химических свойств (гидрофобности и электрических свойств) и химического состава, но также наномеханических свойств и ультраструктуры их поверхности. Уникальная возможность АСМ представлять бактериальный мир в субнанометровом диапазоне и в водном растворе может быть использована для исследования как самих клеток, так и их поверхности в физиологических условиях. АСМ дает изображения бактериальных клеток и их поверхности с высоким разрешением. Эти изображения используются для анализа внешнего вида и свойств поверхности бактерий. АСМ может быть использована для изучения физиологических процессов, таких как клеточный рост и прорастание спор, а также для исследования морфологических изменений живых бактерий под действием антибиотиков. В водных средах микроорганизмы имеют тенденцию образовывать колонии на твердых поверхностях, создавая биопленки. Это вызывает загрязнение трубопроводов, морских сооружений и кораблей. Протекающие при этом коррозиционные процессы также изучаются методами АСМ.

В данной работе мы использовали АСМ для идентификации патогенных бактериальных клеток. Некоторые АСМ изображения получены с использованием неспецифической адсорбции бактерий (рис. 14).

Рисунок 14 - АСМ изображение клеток М. tuberculosis

Для специфической визуализации бактерий был разработан новый подход, основанный на иммобилизации специфических антител непосредственно на твердой подложке через связывание антител стафилококковым белком А. Белок А специфически узнает и связывает Fc-фрагменты антител. Получены изображение слоя белка А (рис. 15) и 3D изображения специфически иммобилизованных бактерий и спор (рис. 16) с использованием слоя белка А для чувствительной иммобилизации специфических антител.

Рисунок 15 - Трехмерное реконструированное АСМ изображение слоя белка А

АСМ очень важна при быстрой и суперчувствительной детекции патогенов. Уникальные возможности АСМ можно использовать в дальнейших исследованиях в нанобиотехнологии не только для детекции бактериальных клеток и вирусов, но и для очень чувствительного определения нанофрагмен-тов этих объектов.

Рисунок 16 - Трехмерное реконструированное изображение клеток (слева) и спор (справа) В. thuringiensis с использованием слоя белка А

3.3 Изучения взаимодействия фаг-бактерия

Был разработан протокол приготовления образцов для визуализации с помощью АСМ взаимодействия бактерий с бактериофагами. Для этого растворы, содержащие живые бактерии Е. coli и бактериофаги, специфичные к данному штамму, смешивали и помещали в термостат при 37 °С. Через определенные промежутки времени из термостатируемого раствора извлекали 510 мкл смеси для нанесения на слюду и АСМ-мониторинга. Полученные результаты показали эффективность использования АСМ для такого рода систем. На рис. 17 и 18 хорошо видна динамика взаимодействия фаг-бактерия.

А Б

Рисунок 17 - АСМ изображение E.coli при отсутствии фагов (А) и через 15 мин после добавления фагов (Б)

А Б

Рисунок 18 - АСМ изображение клетки Е. coli после 35 мин (А) и 65 мин (Б) инкубации с фагом

На рис. 17А приведено изображение единичной бактериальной клетки при отсутствии бактериофагов. Через 15 мин после добавления бактериофагов (рис. 17Б) изображение бактериальной клетки изменяется и можно видеть фаговую "шубу" на поверхности бактерии. После 35 мин инкубации бактерий с фагами (рис. 18А) наблюдается выход большого количества фагов из бактериальной клетки в результате ее лизирования. На рис. 18Б изображена бактериальная клетка после фагового лизиса (видны морфологические изменения бактерии и следы выхода бактериофагов). Данная картина является типичной после инкубирования бактерий с бактериофагом более 1 ч.

Кроме этого, были проведены исследования наноструктуры аффинных поверхностей, представляющих собой антитела, закрепленные на латексных и магнитных частицах. Получены изображения высокого разрешения, позволяющие произвести визуальную оценку процесса агглютинации латексных частиц, несущих специфичные антитела, с антигеном и изображения биона-нообъектов, отражающие динамику взаимодействия фагов с бактериальной клеткой - мишенью.

3.4 Изучение фрагментов бактериальных клеток

Для изучения специфического связывания фрагментов бактерий с аффинной поверхностью нами была предложена следующая структура этой поверхности: активированная слюда - белок в - антитело. Активированная в тлеющем разряде слюда улучшает адсорбцию на нее белка в, который в свою очередь увеличивает степень адгезии на него антител (в силу их специфического взаимодействия). Толщина слоя белка в возрастает с увеличением его концентрации в растворе, причем оптимальная величина находится в диапазоне 0,1-0,6 мг/мл, при которой толщина слоя составляет до 1,3 нм (рис. 19).

о

О 04 08 1 2 1 6 2 ЮТ

Line. 383 dX. -0.6873 gm dY 5 826 nm

0 08 16 2.4 32 4 gm

dX 0 8144 ют dY 6 33 nm

Рисунок 19 - ACM изображения обработанной в тлеющем разряде (0,2 мА, 60 с) поверхности слюды, (А) экспонированной в растворе (0,1 мг/мл) моноклональных антител к Е. coli', (Б) экспонированной последовательно в растворе белка G (0,1 мг/мл), а затем (после промывки) в растворе моноклональных антител к Е. coli.

Поверхности, модифицированные «родными» антителами (к Е. coli), а также «чужими» антителами (к Salmonella), были изучены как поверхности для связывания с фрагментами клеток Е. coli. Из АСМ-изображений, представленных на рис. 20, следует, что количество нанофрагментов, адсорбиро-

ванных «родными» антителами, в сотни раз больше, чем «чужими». При приготовлении образцов, представленных на рис. 20, время экспозиции поверхности с нанофрагментами составляло 3 мин, а объем раствора с антигеном -5 мкл. При таких параметрах адсорбции поверхность переставала эффективно адсорбировать антиген с концентрациями 107 клеток/мл и ниже. В связи с этим, параметры адсорбции подбирались таким образом, чтобы позволять детектировать малые концентрации.

Lim 317 dX 16 63 И" dV 4J 1Л09 iwn ün«. 95dX 1 23 lim dY. -61 09 nm

Рисунок 20 - ACM изображения модифицированных антителами к Е. coli (А) и к Salmonella (Б) поверхностей после их экспонирования в растворе, содержащем разрушенные фрагменты клеток Е. coli с концентрацией (по целым клеткам) 109 клеток/мл

Для этого уменьшали концентрацию антигена в суспензии, в которую помещали изготовленную поверхность. На рис. 21 показано АСМ изображение поверхности слюды, активированной в тлеющем разряде, модифицированной белком G и антителами к Е. coli, экспонированной в течение 10 мин в суспензии фрагментов клеток Е. coli, с исходной концентрацией клеток 102 клеток/мл. Как видно из АСМ изображения, на нем присутствуют частицы, которые и являются предположительно фрагментами бактерий. На рис. 21Б и 22В представлены сечения, проведенные по верхней и нижней

пунктирным линиям на АСМ изображении. Верхнее сечение демонстрирует профиль бактериального нанофрагмента, а нижнее - глубину белковых слоев на поверхности слюды (белок в + антитело), целостность которых была нарушена в ходе царапающего эксперимента кантилевером атомно-силового микроскопа.

Рисунок 21 - АСМ изображение поверхности слюды, активированной в тлеющем разряде, модифицированной белком G и антителами к Е. coli, экспонированной в течение 10 мин в суспензии, содержащей фрагменты клеток Е. coli с исходной концентрацией 102 клеток/мл (А); (Б) - сечение, проведенное по верхней пунктирной линии на АСМ изображении, демонстрирующее профиль бактериального фрагмента; (В) - сечение, проведенное по нижней пунктирной линии на АСМ изображении, демонстрирующее результат царапающего эксперимента

При дальнейшем уменьшении концентрации антигена его количество становится настолько маленьким, что вероятность даже специфического связывания очень мала. Поэтому требуется повысить эффективность специфического связывания, понизив при этом эффективность неспецифического. Для решения этой задачи модифицировали методику нанесения следующим образом. Во-первых, связывание антигена с аффинной поверхностью и последующую промывку стали проводить при pH 8,2 и температуре 32 °С, что благоприятствует специфическому связыванию. Во-вторых, промывку проводили погружением подложки в буфер с последующим вращением на шей-кере в течение 10 мин, чтобы повысить эффективность очищения от неспецифически связавшегося с поверхностью материала за счет дополнительно возникающих гидродинамических потоков вблизи поверхности.

Рисунок 22 - ACM изображения поверхностей, модифицированных белком G и антителами к Е. coli, экспонированных в (А) суспензии, содержащей фрагменты клеток Е. coli с концентрацией (по целым клеткам) 10° клеток/мл, (Б) суспензии, содержащей фрагменты клеток Е. coli с концентрацией (по целым клеткам) 101 клеток/мл. Все изображения приведены к одному масштабу по высоте. Размеры изображений составляют 50 мкм. (В) - диаграмма значений V для образцов, полученных при экспонировании аффинных к Е. coli поверхностей в суспензии Е. coli с концентрациями 10° и 101 клеток/мл в сравнении с контрольным изображением

Для того, чтобы оперировать количественными критериями изучаемого взаимодействия, была разработана схема статистического анализа АСМ изображений. Сначала строится гистограмма распределения по высотам всех объектов на контрольном изображении и выбирается такая высота hmin, ниже которой лежит подавляющее большинство объектов. В дальнейшем анализируются лишь объекты, высоты которых превышают hmin. Такое отбрасывание более низких объектов позволит избежать анализа примесей. После этого для анализируемого изображения (с бактериальными фрагментами) строится

распределение изображенных на нем объектов с высотами, большими /?„„■„, по объемам и рассчитывается суммарный объем объектов V на АСМ изображении. Затем суммарный объем нормируется на площадь АСМ изображения v=V/S. Таким образом, величина v, имеющая смысл количества присоединившегося к поверхности материала на единицу площади, служит критерием для оценки наличия или отсутствия специфического связывания.

Разработанная методика оценки чувствительности аффинной поверхности была применена к антигену со сверхмалыми концентрациями 10° и 101 клеток/мл. Соответствующие АСМ изображения приведены на рис. 22А, Б, а значения параметра v - на рис. 22В. Сравнение значений параметра v показывает, что чувствительность к определению малых концентраций становится значительно меньше, а для концентрации 10° клеток/мл значение v практически совпадает с контрольным.

Таким образом, была показана возможность специфической визуализации (идентификации) не только целых бактериальных клеток, но и их фрагментов с помощью АСМ. Глава 4 Изучение токсичности нанообъектов

Для анализа бактерицидной активности были приготовлены 6 групп образцов с многофункциональными биоактивными наноструктурными покрытиями (МБНП). Их получали путем магнетронного напыления в атмосфере аргона или смеси аргона с азотом.

Грамотрицательные бактерии Е. coli X-blue, Е. coli 09, S. typhimurium и P. aeruginosa и грамположительные бактерии В. brevis и В. subtilis выращивали на твердой среде LB с 2 % агара в течение ночи в присутствии 6 образцов с МБНП. Не обнаружено разницы в росте бактерий, как в присутствии, так и в отсутствии образцов.

Кроме того, грамотрицательные бактерии Е. coli X-blue и Р aeruginosa и грамположительные бактерии В. brevis и В. subtilis выращивали в жидкой среде LB. Исходная концентрация бактерий составляла 106 клеток/мл. Бактериальный рост анализировали по изменению оптической плотности при

625 нм. После 4 ч культивирования в контролях и опытах не было обнаружено разницы в росте. Таким образом, установлено, что образцы с МБНП не обладали бактерицидной активностью при культивировании бактерий как на твердых, так и в жидких питательных средах.

Анализ функциональной активности перитонеальных фагоцитов против клеток Y. pseudotuberculosis проводили в присутствии тех же 6-ти образцов с МБНП. Полученные результаты не выявили статистически достоверной разницы в бактерицидной активности макрофагов в присутствии всех протестированных образцов с МБНП. Это означает, что данные МБНП не изменяют бактериальный статус и системы защиты макроорганизма. Таким образом, данные МБНП могут использоваться для имплантантов, работающих под нагрузкой.

При анализе наноповерхностей титана, модифицированных одной из трех активных добавок - ЮСаО + 2КМпС>4, или 20%Zr02 (TiZrCON), или на-носеребром, показано, что после первых 3 ч культивирования оптическая плотность уменьшалась в 1,5 раза при инкубации образца с добавлением Ag с клетками Е. coli по сравнению с оптической плотностью бактерий при отсутствии образцов в среде культивирования. Для остальных образцов бактерицидный эффект не был обнаружен.

Анализ фагоцитарной активности показал, что в присутствии образца (TiC+lOCaO + 2КМПО4) в среде бактерицидная активность макрофагов не изменялась. В присутствии образца (TiC+20%Zr02 (TiZrCON)) количество живых макрофагов уменьшалось вдвое, при этом оставшиеся (живые) макрофаги обладали нормальной фагоцитарной активностью. В присутствии образца Ag почти все макрофаги были повреждены, а оставшиеся живые макрофаги не обладали фагоцитарной активностью.

Таким образом, с помощью микробиологических приемов можно оценивать токсичность наноматериалов.

39

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Современные методы анализа и идентификации микроорганизмов направлены на повышение чувствительности и уменьшение времени процедур. С этой точки зрения применение электрооптического и биосенсорного подходов изучения бактерий представляется весьма привлекательным благодаря нативности и чувствительности (для электрооптики), и чувствительности и быстроте (для биосенсоров), а использование бионанотехнологических подходов способствует не только визуализации процессов в нанометровом разрешении, но и увеличению чувствительности определения бактериальных клеток.

Электрооптический метод анализа клеток обеспечивает контроль электрофизических и связанных с ними морфологических и функциональных параметров бактерий. Интерпретация электрофизических параметров клеточных структур, фракционного состава популяции и морфометрии построена на взаимосвязи структуры и функций клетки. Результаты электрооптических исследований взаимодействия микроорганизмов с антителами или с частицами, модифицированными антителами, позволяют оценить возможность совмещения достижений в области иммуноидентификации и электрофизических измерений. Электрооптическое исследование взаимодействия фаг-бактерия также может быть применено для обнаружения и идентификации микроорганизмов. На основании итогов многолетней работы по разработке основ электрооптики микроорганизмов, можно сделать обобщающий вывод о создании теоретической и методической базы для широкого внедрения электрофизического метода анализа клеточных структур и определения гетерогенности клеточных популяций.

Современные методы анализа и идентификации микроорганизмов могут быть чувствительными, недорогими, с хорошими количественными и качественными характеристиками. Однако их применение требует обученного персонала и длительных временных процедур. Биосенсоры представляют собой разумную альтернативу традиционным методам, сокращая процедуру изме-

рения и улучшая ее качество. В данной работе расширена область применения известных биосенсоров и разработаны новые биосенсорные элементы.

В представленной работе предпринята попытка идентификации микроорганизмов путем анализа летучих компонентов (ЛК) бактерий. Принцип определения бактерий основан на анализе воздушного пространства над образцом для определения ЛК компонентов с помощью системы искусственного носа. Разработаны два метода неконтактного определения бактерий. Первый - простой анализатор летучих компонентов (термостатируемый и для постоянного мониторинга) для определения бактерий и грибов по анализу газов над микробными культурами. Второй метод - система искусственного носа на основе оптических волокон высокой плотности, позволяющая определять бактерии. Пористые силиконовые микросферы с флуоресцентным красителем, инкорпорированные в оптоволоконные системы, использовали для оценки изменения их флуоресценции после взаимодействия с ЛК. Анализ достоверности результатов эксперимента показал возможность применения системы искусственного носа на основе оптоволоконной системы для определения бактерий.

Известно, что максимальный выход антибиотика авермиктина наблюдается при полном потреблении глюкозы в среде роста микроорганизма. Биосенсор на глюкозу позволяет оперативно контролировать уровень содержания данного углевода в среде культивирования. Биосенсорная система определения глюкозы на основе фермента глюкозооксидазы и кислородного датчика была успешно применена для оптимизации условий выделения антибиотика авермиктина.

Применение микроорганизмов в качестве узнающего элемента биосенсора широко практикуется при анализе окружающей среды и пищи. Однако микроорганизмы представляют собой сложные полиферментные системы, а наличие сложных метаболических процессов мешает интерпретации сигнала. Поэтому разработка узнающего элемента биосенсора на основе цитоплазма-тической мембраны микроорганизмов позволяет увеличить специфичность и

чувствительность биосенсора. Более того, путем индукции ферментативных комплексов при культивировании можно получить биосенсор на определенный субстрат.

Особенно стоит отметить разработку биосенсора для оценки антиокси-дантной активности. Влияние антиоксидантов на выживание бактериальных клеток в настоящее время не изучено. Поэтому разработка такого типа биосенсора является перспективным инструментом оценки антиоксидантной активности соединений для выяснения их роли в процессах переживания микроорганизмов в макрофагах.

Бионанотехнологические подходы в микробиологии современный тренд в исследовательских направлениях, позволяющий детализировать процессы в микробиологии на нано-уровне. Применение атомно-силовой микроскопии позволило визуализировать такие процессы, как реакция гемагглюти-йации и взаимодействие фагов с бактериальными клетками. Кроме того, данный подход с использованием антител позволил специфически визуализировать нанофрагменты бактерий. Следует учитывать, что работа в новых областях с применением наноподходов требует хотя бы предварительного изучения возможных рисков при работе с наноматериалами. Предварительные данные показали, что, несмотря на инертность наноповерхностей, в особых случаях мы можем наблюдать токсический и бактерицидный эффект наноча-стиц.

ВЫВОДЫ

1. Показана принципиальная возможность применения электрооптического метода для анализа физиологического состояния бактерий и их выживаемости в ходе биотехнологических процессов. Разработан численный алгоритм определения анизотропии поляризуемости бактериальных клеток, снимающий существенные ограничения на проведение эксперимента.

2. Выявлены электрооптические изменения микробиологических систем, которые могут служить удобным инструментом идентификации микроорганизмов при анализе взаимодействия бактерий со специфическими антитела-

ми или магнитными частицами с иммобилизованными специфическими антителами и фагами.

3. Разработаны биосенсоры с применением системы искусственного носа на основе высокоплотных оптоволоконных пучков для бесконтактной идентификации микроорганизмов. Показана принципиальная возможность использования простой модификации метода спектрофотометрического анализа для быстрого выявления присутствия микроорганизмов по выделению или поглощению ими летучих компонентов, из окружающей среды. Кроме того, данный метод позволяет различить мутанты N. crassa, дефектные по метаболизму азота, от штамма дикого типа.

4. На примере синтеза антибиотика авермиктина бактериями S. avermitilis показана принципиальная возможность использования биосенсора для контроля продукции антибиотика. Биосенсорная система определения глюкозы на основе фермента глюкозооксидазы и кислородного датчика была успешно применена для оптимизации условий выделения данного антибиотика.

5. Впервые сконструирован оптоволоконный биосенсор на основе цито-плазматических мембран бактерий для анализа концентрации лактата и установлена корреляция между содержанием лактата и бактериальной обсеме-ненностью коровьего молока.

6. Разработан амперометрический супероксидный биосенсор для анализа антиоксидантной активности веществ, с последующим изучением действия антиоксидантов на выживаемость бактерий в макрофагальных клетках.

7. Впервые показано использование бионанотехнологического подхода на основе атомно-силовой микроскопии совместно с получением аффинных поверхностей для специфической визуализации бактериальных нано-фрагментов, позволяющих повысить чувствительность выявления микроорганизмов и их идентификации.

8. Для визуализации и анализа взаимодействия фаг-бактерия использованы уникальные возможности АСМ для получения трехмерного изображе-

ния ультраструктур на молекулярном уровне в реальном времени и при физиологических условиях.

9. Для поверхностей с многофункциональными биоактивными наност-руктурными покрытиями и наноматериалов разработаны методы оценки токсичности с помощью микробиологических приемов. Разработана методика оценки бактерицидной активности макрофагов в присутствии наносоедине-ний.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

Монографии, статьи в реферируемых журналах, главы в книгах международных издательств, патенты:

1. Игнатов С.Г., Красильников В.А., Перелыгин В.В., Капрельянц A.C. Островский Д.Н. Изучение функциональных и структурных изменений мембран E.coli после низкотемпературного замораживания.// Биохимия. - 1981. Т. 46.-№11. - С. 1996-2003.

2. Игнатов С.Г., Андреева О.В., Евдокимова O.A., Арцатбанов В.Ю., Перелыгин В.В., Капрельянц A.C., Островский Д.Н. Изучение репарации мембранных повреждений, вызванных низкотемпературным замораживанием клеток E.coli.// Биохимия. - 1982. - Т. 47. - №10. - С. 1621-1628.

3. Игнатов С.Г., Драгунова С.Ф. Перелыгин В.В., Воробьев A.A. Роль комплемента в защите макроорганизма от бактерий.// Журнал микробиол. эпидемиол. и иммунол. - 1987. - № 5. - С. 97-102.

4. Лапыш М.Е., Игнатов С.Г., Брезгунов В.Н., Волошин А.Г., Бунин В.Д., Светогоров Д.Е. Щепкина А.Н. Использование электрооптического метода для оперативного определения жизнеспособности бактериальных клеток.// Микробиол. - 1989. - Т. 58. - № 3. - С. 515-517.

5. Лапыш М.Е., Светогоров Д.Е., Игнатов С.Г. Определение анизотропии поляризуемости бактериальных клеток при средней степени ориентации.// Коллоидный журнал. - 1991. - Т. 55. - С. 365-367.

6. Игнатов С.Г., Андреев С.Н., Драгунова С.Ф. Биосенсор на лизин на основе рСОг кондуктометрического электрода.// Биотехнология. 1992. № 5.-С. 110-111.

7. Игнатов С.Г., Андреев С.Н., Драгунова С.Ф. L-лизиновый биосенсор на основе рСОг кондуктометрического электрода.// Биотехнология. 1992. № 6. - С. 63-64.

8. Ignatov S.G., Dragunova S.F. Surface charge controls the barrier properties of the E.coli cell envelope.// J. Biochem. Org. - 1994. V.l. - P. 363-373.

9. Игнатов С.Г. Новый метод определения комплемент-опосредованного бактериолитического действия сыворотки на клетки E.coli.// Журнал микробиол. эпидемиол. и иммунол. - 1994. - № 6. - С. 99-100.

10. Игнатов С.Г., Бесаева С.Г Кувичкин В.В. Изучение потребления глюкозы при культивировании S.avermitilis 1301 с использованием биосенсорного измерителя.// Биотехнология. - 1995. - Т. 32. - № 1/2. - С. 54-55.

11. Волошин А.Г., Лапыш М.Е., Игнатов С.Г., Бунин В.Д. Использование электрооптического метода для контроля бактериальных препаратов. Прикладная биохим. и микробиол. - 1996. - Т. 32. - № 6. - С. 669-670.

12. Ignatov S.G. Rapid method for bacterial counting in the milk by using biosensor based on E.coli cells.// In book "Rapid Methods for the Analysis of Biological Materials in the Environment" (Ed.P.J.Stopa, M.A.Bartoszcze), NATO ASI Series. - 2000. V 30.- P. 93-100.

13. Ignatov S.G., Ge В., Scheller F.W., Lisdat F. Detection of the antioxidant activity of flavonoids by using superoxide sensor.// In book "Nitric oxide: basic research and clinical application" (Ed.R.J.Gryglewski, P.Minuz) IOS Press, NATO Science Series, Science A: Life Science. - 2001. - V 317. - P. 168-180.

14. Ignatov S.G., Ferguson J.A. Walt D.R. A fiber-optic lactate sensor based on bacterial cytoplasmic membranes.// Biosensors and Bioelectronics. - 2001. V. 16. -№ l.-P. 109-113.

15. Stitzel S.E., Albert K.A., Ignatov S.G., Walt D.R. Artificial nose employing microsphere sensor for detection of volatile organic compounds.// Proc. SPIE. 2002.-V 4575. - P. 132-137.

16. Ignatov S., Shishniashvili D., Ge В., Scheller F.W., Lisdat F. Amperometric biosensor based on a fiinctionalized gold electrode for the detection of antioxidants.// Biosensors and Bioelectronics. - 2002. - V. 17. - № 3. - P 191-199.

17 Вирясов C.H., Голутвин И.А., Насикан H.C. Бикетов С.Ф., Игнатов С.Г., Игнатюк Т.Е. Способ приготовления аффинных поверхностей на основе химически прошитого белка А.// Патент РФ 2005. RU 2261279 С1, Бюл. 27.

18. Игнатов С.Г., Волошин А.Г., Бунин В.Д., Дятлов И.А. Электрооптический анализ в микробиологии.// Монография - Оболенск, ГУП МО «Серпуховская типография» - 2007 - С. 1 - 161.

19. Dubrovin Е., Ignatov S., Ignatyuk Т., Kraevsky S., Voloshin A., Yaminsky I. Visualization of pathogen-host interaction using AFM. //Biophysical Journal. 2007. - Suppl. S. - P. 514A-515A.

20. Ignatyuk Т.Е. Ivanova O.E., Efremova T.P., Fedjukina G.N., Voloshin A.G., Akimova L.A., Mochalov V V., Ignatov S. G. Immobilization of viruses using Langmuir antibody films based on amphiphilic polyelectrolites for Atomic Force microscopy.// In book "Proceedings of the IX Linz Winter workshop 2007" Austria. - 2008. - P. 86-90.

21. Dubrovin E. V., Voloshin A. G., Kraevsky S. V., Ignatyuk Т. E., Abram-chuk S. S., Yaminsky I. V , Ignatov S. G. Atomic Force Microscopy Investigation of Phage Infection of Bacteria.// Langmuir. - 2008. V 24. № 22. - P. 1306813074.

22. Ignatov S. G., Voloshin A.G., Filippovich S. Yu, Walt R.D. Bacteria detection - biosensors.// In book: Sensors for Environment, Health and Security. M.-I. Baraton (ed.), © Springer Science + Business Media B.V. - 2009. - P. 267-276.

23. Ignatov S. G., Voloshin A.G.,. Viijasov S. N, Fedjukina G.N. Mochalov V V., Ganina E.A., Dubrovin E.V., Kraevsky S.V., Ignatyuk Т.Е. Bionano - microbiology.// In book: Sensors for Environment, Health and Security. M.-I. Baraton (ed.), © Springer Science + Business Media B.V - 2009. - P. 333-345.

24. Волошин А.Г., Филиппович С.Ю., Бачурина Г.П., Бесаева С.Г., Игнатов С.Г. Спектрометрический анализ летучих компонентов микроорганизмов.// Приклад, биохим. и микробиол. - 2010. - Т. 46. - №3. - С. 331-335.

25. D.V. Shtansky, N.A. Gloushankova, A.N. Sheveiko, Ph.V. Kiryukhantsev-Korneev, I.A. Bashkova, B.N. Mavrin, S.G. Ignatov, S.Yu. Filippovich, C.Rojas. Si-doped multifunctional bioactive nanostructured films.// Surf. Coat. Technol.-2010.- V 205.- N 3.- P. 728-739.

Другие публикации:

26. Игнатов С.Г., Волошин А.Г., Лапыш М.Е., Светогоров Д.Е. Использование электрооптического метода и кратковременных экстремальных воздействий для оценки устойчивости бактериальных клеток к процессу высушивания.// Теория и практика электрооптических исследований коллоидных систем, Велегож. - 1990. - С. 24.

27. Ignatov S.G. Biosensors based on CPM In International Symposium "Development of medical equipment technology converted from weapon sciences", Podolsk, Moscow Region. - 1996. - P 54.

28. Ignatov S.G. The role of diamines on bacterial survival after freezing. In "International symposium on stress and inorganic nitrogen assimilation & the 2nd FOHS biostress symposium" Moscow. - 1996. - P. 34.

29. Ignatov S.G. Rapid method for bacterial counting in the milk by using biosensor based on E.coli cells. NATO ASI SERIES Workshop "Rapid Methods for the Analysis of Biological Materials in the Environment" Warsaw. 1997. - P 33.

30. Ignatov S.G. Biosensor based on bacterial cytoplasmic membranes. ARW "New trends in biosensor development" Kiev, Ukraine. - 1998. - P. 25.

31. Ignatov S.G. Bacterial cytoplasmic membranes as a native organized bio-catalysis system in biosensorology.// Biocatalysis-98: fundamental and applications. Pushino. 1998. - P. 18.

32. Ignatov S.G. New recognition element for biosensor based on cytoplasmic membranes.// 6th SAS-Deauville Conference-98. Valencia, Spain. 1998. - 98P. P. 375.

33. Ignatov S.G. Biosensor based on the bacterial cells for glucose monitoring in the blood.// IT + ME. Gurzuf, Ukraine. - 1999. - P 100.

34. Ignatov S.G. Development of the rapid method for determination of complement-mediated serum bactericidal activity against gram-negative bacteria.// IT + ME. Gurzuf, Ukraine. - 1999. - P. 100.

35. Ignatov S.G., Besaeva S.G. Avermitelis controlling in cultivation media by using glucose biosensor.// IT + ME. Gurzuf, Ukraine. - 1999. - P. 101.

36. Makhlis Т., Efremenko E., Varfolomeev S., Kaprelyants A.S., Ignatov S.G. Elaboration of stable biosensors based on the membranes of regular and dormant

cells Micrococcus luteus, immobilized in poly (vinyl alcohol) cryogen for the detection of NADH and lactate.// Biocatalysis-2000. Moscow. - 2000. - P. 121.

37. Ignatov S.G., Ge B., Shishniashvili D., Scheller F.W., Lisdat F. The antioxidant activity detection of the flavonoids using superoxide sensor.// Modern problems of microbial biochemistry and biotechnology. Pushchino. - 2000. - P. 95.

38. Ge B., Lisdat F. Shishniashvili D., Ignatov S.G., Scheller F.W. Detection of antioxidant activity using a superoxide sensor.// Biosensor-2000. San Diego USA. - 2000. - P. 251.

39. Ignatov S. G., Viijasov S. N., Kozodaev M.A., Ignatyuk T. E., Suvorov A. L. AFM study of bacteriaphages.// IT + ME. Gurzuf, Ukraine. - 2002. - P. 356-357.

40. Ignatov S. G., Virjasov S. N., Golutvin I. A., Nasikan N. S., Ignatyuk T. E., Suvorov A. L. Nanobiotechnology for microbiology.// MicroRobots, MicroMachines and MicroSystems. Moscow. - 2003. - P. 345.

41. Ignatov S. G., Virjasov S. N., Golutvin I. A., Nasikan N. S., Ignatyuk T. E., Suvorov A. L. AFM study for specific visualization of bacteria and spores.// IT + ME. Gurzuf, Ukraine. - 2003. - P. 218-219.

42. Ignatov S.G. Bionanotechnological analysis of affinity surfaces.// The 5-th ISTC/Korea workshop on biotechnology. Korea. - 2004. - P. 67-102.

43. Ignatov S. G. Atomic force microscopy for nano analysis of bacteria.// Canadian Biological Colloquium. Moscow. - 2004. - P. 79.

44. Ignatov S. G., Virjasov S. N., Fedjukina G.N., Baranova E.V., Golutvin I. A., Nasikan N. S., Ignatyuk T. E., Suvorov A. L. Bionanotechnological analysis of affinity surfaces for sensitive bacteria detection.// The proceedings for the 37 ISTC Japan Workshop on Advances Nanomaterials in Russia/CIS. Tsukuba, Japan. 2005.-P. 148-162.

45. Ignatov S. G., Virjasov S. N., Fedjukina G.N., Baranova E.V., Biketov S.F. Nano-approach for sensitive monitoring of bacteria.// NSTI Nanotech. Boston. USA. - 2006. - P. 57.

46. Dubrovin E., Fedyukina G., Ignatov S., Ignatyuk T., Kraevsky S., Voloshin A., Yaminsky I. Visualization of pathogen-host interaction using AFM.// 8th International EMBL PhD Student Symposium. Heidelberg, Germany. - 2006. - P. 46.

47. Ignatov S., Walt D. Bacteria detection - biosensors.// ASI "Sensors for environment, health and security: Advanced materials and technologies" Vichy, France. - 2007. - P. 29-30.

48. Ignatov S., Voloshin A., Ignatyuk T. Bionano - microbiology.// ASI "Sensors for environment, health and security: Advanced materials and technologies" Vichy, France. - 2007. - P.31-32.

49. Ignatov S. G., Virjasov S. N., Fedjukina G.N., Baranova E.V Ganina E. A. Mochalov V V., Dubrovin E.V., Kraevsky S.V Ignatyuk T.E. Specific AFM visualization of bacteria and bactericidal activity of nano-objects.// IV International conference on "NanoBio and related new and perspective biotechnologies" Pushchino. - 2007. - P. 193-195.

50. Kholodenko V.P., Chugunov V.A., Kobzev E.N., Borzilov A.I., Gerasimov V.N., Biketov S.F., Ignatov S.G., Potapov V.D., Turin E.A., Dyatlov I.A.. Nano-

technologies and problems of biosafety.// IV International conference on "NanoBio and related new and perspective biotechnologies". Pushchino. - 2007. - P. 199-200.

51. Игнатов С.Г., Вирясов C.H. Федюкина Г.Н., Баранова Е.В., Ганина Е.А., Мочалов В.В., Е.В. Дубровин, С.В. Краевский, Т.Е. Игнатюк. Применение АСМ для специфической визуализации микроорганизмов.// VI Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием «Молекулярная диагностика -2007» - 2007. - Т. 1. - С. 81-82.

52. Ignatov S. G., Voloshin A.G., Virjasov S. N., Fedjukina G.N., Mochalov V.V., Dubrovin E.V., Kraevsky S.V., Ignatyuk Т.Е.. International expert meeting drug design and development. Moscow. - 2007. - P. 14-15.

53. Ignatov S. G., Viijasov S. N., Fedjukina G.N., Baranova E.V., Golutvin I.

A., Nasikan N. S., Ignatyuk Т. E. Specific visualization of bacteria and spores by AFM.// IX Annual Linz Winter Workshop "Advances in Single-Molecule Research for Biology & Nanoscience" Austria. - 2007. - P. 4-14.

54. Игнатов С.Г., Волошин А.Г., Федюкина Г.Н., Баранова Е.В., Ганина Е.А., Мочалов В.В., Перовская О.Н., Дубровин Е.В., Краевский С.В., Игнатюк Т.Е. Специфическая АСМ визуализация бактериальных нанофрагмен-тов.// Международный форум по нанотехнологиям. Сб. тезисов докладов научно-технологических секций, т. 2. Москва. - 2008. - С. 150-151.

55. Игнатов С.Г., Волошин А.Г., Вирясов С.Н., Федюкина Г.Н., Баранова Е.В., Ганина Е.А., Мочалов В.В., Перовская О.Н., Дубровин Е.В., Краевский С.В., Игнатюк Т.Е. Нано в микробиологии: специфическая визуализация бактериальных нанофрагментов и нанотоксичность.// Нанотехнологии в сельском хозяйстве. Доклады Международной научно-практической конференции. Москва. - 2008. - С. 34-36.

56. Игнатов С.Г., Волошин А.Г., Вирясов С.Н., Федюкина Г.Н., Ганина Е.А., Мочалов В.В., Перовская О.Н., Е.В. Дубровин, С.В. Краевский, Т.Е. Игнатюк. АСМ анализ взаимодействия фаг-бактерия.// Материалы 1-ой Международной научной школы "Наноматериалы и нанотехнологии в живых системах" - 2009. - С. 32

57. Ignatov S.G., Bachurina G.P., Filippovich S.Yu. Evaluation of Antifungal Activity of Multi-functional Bioactive Nano-structured Films for Load-bearing Implants.// European Congress on Advanced Materials and Processes. Glasgow, Scotland. 2009. - P. 66.

58. Игнатов С.Г., Волошин А.Г., Федюкина Г.Н., Ганина Е.А., Мочалов

B.В., Филиппович С.Ю., Перовская О.Н. Оценка бактерицидной активности многофункциональных биоктивных наноструктурных покрытий, работающих под нагрузкой.// Тезисы международной конференции «Токсикологические и нормативные аспекты производства и применения наноматериалов в России». Москва. - 2009. - С. 74.

11-57?

2010183176

2010183176