Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Использование фаговых мини-антител для иммуноанализа диагностически-значимых антигенов

ВАК РФ 03.01.06, Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат диссертации по теме "Использование фаговых мини-антител для иммуноанализа диагностически-значимых антигенов"

На правах рукописи

ФОМИН АЛЕКСАНДР СЕРГЕЕВИЧ

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ФАГОВЫХ МИНИ-АНТИТЕЛ ДЛЯ ИММУНОАНАЛИЗА ДИАГНОСТИЧЕСКИ-ЗНАЧИМЫХ АНТИГЕНОВ

03.01.06 - биотехнология (в том числе бионанотехнологии) 03.02.03 — микробиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

5 ДЕК 2013

Саратов-2013

005541742

005541742

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Саратовский государственный аграрный университет имени Н.И. Вавилова»

Научные руководители: доктор биологических наук

Староверов Сергей Александрович

доктор биологических наук старший научный сотрудник Дыкман Лев Абрамович

Официальные опоненты: Щербаков Анатолий Анисимович

доктор биологических наук, профессор, ФГБОУ ВПО «Саратовский государственный аграрный университет имеш! Н.И. Вавилова», профессор кафедры микробиологии, вирусологии и биотехнологии

Киреев Михаил Николаевич

кандидат медицинских наук, ФКУЗ Российский научно-исследовательский тютивочумный институт «Микроб», ведущий научный сотрудник лаборатории экспериментальной биотехнологии

Ведущая организация: Филиал Федерального государственного бюджетного учреждения науки института биоорганической химии имени академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН.

Защита состоится ЦЩ> ¿/.уж^Л 2013 года в //./РО часов на заседании диссертационного совета Д 220.061.04 на базе ФГБОУ ВПО «Саратовский государственный аграрный университет им Н.И Вавилова» по адресу: 410005, г. Саратов, ул. Соколова®, 335, диссертационный зал.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБОУ ВПО «Саратовский ГАУ» по адресу: 410005, г. Саратов ул. Соколовая, 335. Автореферат разослан 2013 г.

Отзывы на автореферат направлять по адресу: 410012, г. Саратов, Театральная пл., 1, ФГБОУ ВПО «Саратовский ГАУ», ученому секретарю диссертациошюго совета.

Ученый секретарь

диссертационного совета

Доктор биологических наук, профессор

Карпушша Л.В.

Общая характеристика работы Актуальность темы. Успехи современной медицины и сельского хозяйства зачастую зависят от того, удается ли обнаруживать специфические антигены в организме животных или человека, в растениях, воде, почве или других объектах окружающей среды. Например, профилактику и лечение любого инфекционного заболевания значительно облегчает ранняя и точная идентификация вызвавшего его патогенного микроорганизма. Для проведения многих диагностических процедур необходимо сначала вырастить культуру потенциального патогенного микроорганизма и лишь затем проанализировать спектр его физиологических свойств. Хотя подобные тесты весьма эффективны и обладают достаточно высокой специфичностью, они занимают много времени и являются весьма дорогостоящими. Это относится к идентификации бактерий и других паразитических микроорганизмов. Кроме того, весьма ограничена возможность выявления тех патогенных микроорганизмов, которые плохо растут в культуре либо вообще не поддаются культивированию. Чтобы устранить эти принципиальные ограничения был разработан (наряду с методиками молекулярной диагностики) широкий спектр иммунохимических методов (Глик, 2002; Madsen, 2013; Кипа, 2013). К иммунохимическим относятся методы, основанные на взаимодействии растворимых или корпускулярных антигенов (Аг) со специфическими антителами (Ат). Как сами методы, так и их приложения в клинической лабораторной практике чрезвычайно разнообразны (Воробьев, 2002).

Степень разработанности проблемы. Современная иммунохимия предлагает широкий ассортимент качественных и количественных методов анализа Аг, отличающихся по чувствительности и степени сложности (Коллинз, 1991; Joshua, 1995; Mclntyre, 1995). В основе современного иммунохимического исследования лежат, в частности, разнообразные модификации иммунохроматографических и иммунопреципитационных методов (Ройт, 2000; Дзантиев, 2010). Эти методы, основанные на обнаружение различных Аг, варьируются от простых (иммуноанализ) к более сложным (иммуносенсоры). Для оценки качества современных иммунохимических анализов есть определенные требования, которых придерживаются в современной иммунодиагностике. Во-первых, Ат для проведения анализа должны соответствовать определенным условиям для создания надежного биоспецифического взаимодействия (нормы ISO 15087). Во-вторых, нормы наличия целевых соединений (Аг) в матрице продукта, который будет

исследоваться, должны быть приняты во внимание в связи с пределом обнаружения в рабочем диапазоне анализа (Meulenberg, 2012). Однако, в целом, все иммунохимические методы зависят, в первую очередь, от качества специфических Ат, используемых для получения диагностических систем. Одним из способов улучшения качества Ат стал метод гибридомной технологии для получения моноклональных антител (Kohler, Milstein, 1975). Однако гибридомы, подобно большинству других клеточных культур животных, растут относительно медленно, не достигают высокой плотности и требуют сложных и дорогих сред. Получаемые таким образом моноклональные антитела весьма дороги, что не позволяет широко использовать их в клинической практике. Чтобы решить эту проблему, были предприняты попытки создания своего рода «биореакторов» на основе генетически модифицированных бактерий, растений и животных. Для эффективной доставки и функционирования некоторых иммунотерапевтических средств достаточно одной антигенсвязывающей области (Fab- или scFv-фрагмента), т.е. присутствие Fc-фрагмента молекулы иммуноглобулина необязательно (Глик, 2002). Одним из таких методов является техника фагового дисплея Ат, ее основоположниками являются Джон Маккаферти с соавт. (McCafferty, 1990). Ими было показано, что антиген-связывающие фрагменты Ат (scFv, Fab), представленные на поверхности нитевидного фага (мини-антитела), могут быть отобраны на иммобилизованном Аг. Использование в диагностичеких методах мини-антител, отобранных из рекомбинантной фаговой библиотеки, с нашей точки зрения, является весьма актуальной задачей для современной биотехнологии и микробиологии.

Цель работы — использование высокоспецифичных фаговых мини-антител и их применение для детекции биоактивных молекул и микроорганизмов в биологических объектах.

Задачи исследования:

1. Выделить ферритин из печени коров и получить к нему специфические мини-антитела с использованием фагового дисплея антител.

2. Разработать эффективный метод идентификации ферритина с использование поликлональных и фаговых антител.

3. Получить мини-антитела на диминазен и разработать метод детекции диминазена в биологических жидкостях с использованием иммунодот-анализа.

4. Разработать методы применения мини-антител на туберкулин для идентификации возбудителя туберкулеза с помощью световой и электронной микроскопии и твердофазного иммуноанализа.

5. Оценить эффективность применения фаговых мини-антител для

иммуноанализа бактерий рода А20.щгШит.

Научная новизна работы. Впервые был разработан метод идентификации ферритина в сыворотке крови коров методом твердофазного иммуноанализа с использованием мини-антител на ферритин. Разработан метод индикации диминазена в биологических жидкостях методом иммунодот-анализа с использованием мини-антител на диминазен. Впервые получены мини-антитела на туберкулин и изучена возможность их применения для идентификации возбудителя туберкулеза методами световой и электронной микроскопии и твердофазного иммуноанализа. Полученные мини-антитела на антигенные структуры бактерий рода Аго.чртИит предложено использовать для детекции данного микроорганизма микроскопическими методами.

Теоретическая и практическая значимость работы. Полученные в настоящей работе высокоспецифичные мини-антитела на ферритин, диминазен, туберкулин и антигены азоспирилл и разработанные эффективные методики их применения для идентификации этих (и других) диагностически значимых антигенов в биологических объектах, открывают перспективы использования данных антител в разнообразных тест-системах, для решения широкого круга научных и прикладных задач в области микробиологии, биотехнологии, ветеринарии и медицины. По материалам диссертационной работы опубликовано учебно-методическое пособие «Этиология, диагностика и профилиактика железо дефицитной анемии поросят», для студетов 3, 4, 5-го курсов специальности «Ветеринария» (в соавторстве с Винниковым Н.Т., Анниковой Л.В., 2010). Материалы исследований используются в учебном процессе и научной работе ФГБОУ ВПО «Саратовский ГАУ», ИБФРМ РАН, ФГБОУ ВПО «Донской ГАУ», ФГБОУ ВПО «Воронежский ГАУ», УО «Витебская ордена «Знак Почета» государственная академия ветеринарной медицины» (Республика Беларусь).

Методология и методы исследования. Методологической базой послужили труды отечественных и зарубежных ученых по вопросам получения моноклональных и поликлональных антител и их использования в иммунологических тест системах. Основу данного исследования составляют комплексный анализ и системный подход в изучении рассматриваемой темы. При проведении исследования и изложении материала автором были применены общенаучные методы: теоретико-методологический анализ литературных источников, эмпирические методы исследования в форме наблюдения,

эксперимента, описания, измерения и сравнительно-сопоставительного анализа. Применение указанного методов, а также анализ фактического материала позволили обеспечить объективность полученных выводов и результатов.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Использование фаговой библиотеки антител обеспечивает получение in vitro мини-антител против ферритина, диминазена, туберкулина и азоспирилл.

2. Одновременное использование поликлональных и мини-антител для диагностики ферритина методом ИФА является оптимальным способом детекции ферритина в биологических жидкостях животных.

3. Полученные при помощи фаговой библиотеки мини-антитела к диагностически значимым антигенам обладают высокой специфичностью и чувствительностью и могут быть использованы для создания современных иммунологических тест-систем.

Апробация результатов исследования. Основные положения диссертационной работы были доложены и обсуждены на: IX семинаре Ассоциации практикующих ветеринарных врачей РФ (Казань, 2010); V Всероссийской конференции молодых ученых «Стратегия взаимодействий микроорганизмов и растений с окружающей средой» (Саратов, 2010); Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы современной ветеринарии» (Краснодар, 2011); Международной научно-практической конференции «От теории - к практике: вопросы современной ветеринарии, биотехнологии и медицины» (Саратов, 2011); IV съезде биофизиков России (Нижний Новгород, 2012); VIII молодежной школе-конференции с международным участием «Актуальные аспекты современной микробиологии» (Москва, 2012).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 12 работ, в том числе 3 статьи в журналах, рекомендованных ВАК РФ.

Работа выполнена на кафедре «Терапия, акушерство и фармакология» факультета ветеринарной медицины и биотехнологии ФГБОУ ВПО «Саратовский государственный аграрный университет имени Н.И. Вавилова». Работа частично поддержана грантом Министерства образования и науки Российской Федерации № 8852 (2012-2013 гг.).

Структура и объем диссертации: диссертация состоит из введения, литературного обзора, собственных исследований, включающих объекты, материалы и методы исследования, результаты исследований и их

обсуждение, а также заключения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 118 страницах, иллюстрирована 36 рисунками и включает 4 таблицы. Список литературы включает в себя 190 источников.

Собственные исследования Объекты и методы исследований

Объекты. Поголовье крупного рогатого скота породы черно-пестрая в хозяйстве ООО «Роща», Саратовская обл., Новобурасский район. Исследовали КРС различных возрастных групп: телята 20 голов (5 мес), нетели 20 голов (2,5-3 года), коровы 20 голов (4-5 лет). Кролики породы шиншила (9 животных, возраст 2-3 года) и крысы белые лабораторные беспородные (10 животных, возраст 3 мес.) содержались в условиях стационара Саратовского ГАУ им. Н.И. Вавилова. В работе использовали бактериальные клетки Azospirillum brasilense Sp245 и Е. coli XLl-BIue, полученные из коллекции микроорганизмов ИБФРМ РАН. Mycobacterium bovis вакцинного штамма БЦЖ, М. phlei и М. smegmatis, Staphylococcus aureus 209-R, Brucella abortus вакцинный шт. 82 были получены из лаборатории туберкулеза и бруцеллеза Саратовского научно-исследовательского ветеринарного института РАСХН.

Методы. Выделение ферритна из печени крупного рогатого скота проводили по методу, предложенному в работах (Kong, 2003; Mete, 2005) с небольшими модификациями, с последующей очисткой на колонке Sephadex G-150.Аффинную селекцию антител (биопаннинг) проводили по методу предложенному McCafferty (1990).Метод дот-иммуноанализа основан на визуализации специфического взаимодействия адсорбированного на мембране Аг и меченых (коллоидными или молекулярными метками) Ат. Детально протоколы получения кроличьих антифаговых Ат, их конъюгатов с пероксидазой, коллоидным золотом и золотыми нанооболочками на ядрах из двуокиси кремния представлены в работах (Khlebtsov, 2006; Khanadeev, 2011). В нашем исследовании мы использовали стратегию непрямого мечения, то есть сначала проводили биоспецифическую реакцию Аг+фаговые Ат, а затем визуализовали ее с помощью меченых наночастицами поликлональных кроличьих антифаговых Ат.Коллоидное золото (КЗ) со средним диаметром частиц 15 нм получали по методу (Frens, 1973), используя реакцию восстановления золотохлористоводородной кислоты цитратом натрия. Средний размер частиц контролировали по спектрофотометрической калибровке и

методом трансмиссионной электронной микроскопии. Для конъюгации с антителами определяли «золотое число» (минимальное количество вещества, защищающего золь от солевой агрегации) для водного раствора антифаговых Ат. Конъюгацию проводили простым смешением реагентов без использования сшивающих агентов (Дыкман, 2008).Выделение перитонеальных макрофагов осуществляли по общепринятой методике (Пастер, 1989). Количество выделенных клеток определяли в камере Горяева,При изучении биодинамических параметров различных лекарственных форм диминазена нами использовался водный и мицеллярный препарат диминазена. Животных для экспериментов подбирали по принципу аналогов. Сформировали 2 группы по 3 овцы. Кровь у животных отбирали из яремной вены через 0.5, 2, 4, 6, 8, 24, 48 ч. Хроматографический анализ диминазена основан на определении количественного содержания диминазена с применением внутреннего стандарта - имидокарба дипропионата - с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) на колонке с обращенной фазой с применением спектрофотометрического детектора. Пробоподготовка заключалась в твердофазной экстракции диминазена из плазмы крови и эритроцитов на патронах SPE Chromabond С18. Детектирование вели по интенсивности поглощения при длинах волн света 370 и 240 нм для диминазена и имидокарба дипропионата, соответственно. Чувствительность метода составляла 300 пг в пробе, нанесенной на колонку.

Результаты исследований и их обсуждение Получение мини-антител на ферритин и их использование в дот-анализе. Следует отметить: несмотря на то, что анемия — одно из наиболее распространенных заболеваний КРС, характеризующееся снижением концентрации гемоглобина и гематокрита и протекающее в несколько стадий, -в доступной специализированной литературе отсутствует информация о наличии простых и достоверных тест-систем для диагностики данного заболевания. В частности в российской ветеринарной медицине практически отсутствует упоминание о таком важном показателе как ферритин, выполняющем роль основного внутриклеточного депо железа. Кроме того, не рассматривается роль ферритина, как самого информативного индикатора запасов железа в организме. Первым этапом нашей работы было выделение ферритина из печени коров. У полученного белка определили молекулярную массу электрофорезом в 10% полиакриламидном геле (ПААГ) (Рисунок 1). На Рисунке 1 видно, что полученный нами белок, при проведении нативного

Рисунок 1 - Элекгрофорез ферритина в 10%ПААГ

электрофореза, выходит единичной полосой с молекулярной массой 460 кДа, что указывает на степень чистоты выделенной нами фракции.На следующем этапе работы нами были получены фаговые Ат на ферритин. После выделения мини-Ат была проведена их наработка с клонированием фагов до титра 1:8192, которые в дальнейшем использовали в иммуноанализе в разведении 1:100. Сначала было необходимо определить минимальную концентрацию Аг, детектируемую визуально с помощью дот-анализа. На Рисунке 2 представлен дот-иммуноанализ ферритина, выделенного из печени коров, с использованием в качестве метки конъюгатов 15 нм КЗ, золотых нанооболочек и пероксидазы хрена с антифаговыми Ат. Видно, что использование в качестве метки 15 нм КЗ, нанооболочек и пероксидазы дает сходные результаты: чувствительность методов во всех трех случаях составила 0.225 мкг/мл. В случае негативного контроля (БСА, нижний ряд) никаких окрашенных пятен на мембране не наблюдали. Следует, однако, отметить, что применение коллоидных частиц снижает время детекции в среднем на 1 ч по сравнению с ферментной меткой.

штрггттт!

чш I I их:

ллп I мил

Рисунок 2 - Дот-иммуноанализ ферритина, выделенного из печени коров, с использованием в качестве маркеров конъюгатов антифаговых антитела с 15 нм КЗ (А), золотыми нанооболочками (Б), пероксидазой хрена(В); контроль - БСА (Г)

Затем был проведен дот-анализ ферритина, содержащегося в сыворотках крови КРС различных половозрастных групп. На Рисунках 3, 4, 5 представлены результаты дот-иммуноанализа ферритина в сыворотках крови КРС с

использованием в качестве метки конъюгатов 15 нм КЗ, золотых нанооболочек и пероксидазы хрена с антифаговыми антителами. В верхнем ряду коровий ферритин (выделенный нами из печени КРС) в концентрации от 15 мкг/мл до 0.225 мкг/мл, в нижнем ряду сыворотки крови исследуемых животных, концентрация ферритина составила от 1.7 мкг/мл до 0.6 мкг/мл. При проведении планшетного иммуноферментного анализа (ИФА) по методу (НотЬеск, 1991) были получены аналогичные данные.

Рисунок 3 - Дот-иммуноанализ ферритина с использованием в качестве метки конъюгатов 15 нм КЗ. А1-А8 - очищенный ферритин КРС в концентрации от 15 мкг/мл до 0.225 мкг/мл, В1-В5 и С1-СЗ - сыворотка крови КРС, С4 - БСА, С5 - лошадиный

ферритин

1 I 1 4 5 6 ' 8

Рисунок 4 - Дот-иммуноанализ ферритина с использованием в качестве метки золотых нанооболочек. А1-А8 - очищенный ферритин в концентрации от 15 мкг/мл до 0.225 мкг/мл, В1-В5 и С1-С2 - сыворотка крови КРС, СЗ - БСА, С4 - лошадиный

ферритин

1 ,> з 5 « - я

Рисунок 5 - Дот-иммуноанализ ферритина с использованием в качестве метки пероксидазы хрена. А1-А8 - очищенный ферритин в концентрации от 15 мкг/мл до 0.225 мкг/мл, В1-В7 — сыворотка крови КРС, В8 - лошадиный ферритин

При использовании в качестве метки пероксидазы хрена повышается трудоемкость процесса постановки дот анализа, увеличивается время выявления метки (3-4), усиливается неспецифическое прокрашивание фона мембраны. Золотые нанооболочки и коллоидные золотые наночастицы со средним диаметром 15 нм являются оптимальными метками. При схожей с ферментными

исследования по определению видовой специфичности полученных мини-Ат. Для этого проводили изучение перекрестных реакций Ат на туберкулин у

Рисунок 11 - Дот-анализ микобактерий с использованием мини-Ат на туберкулин (А -М. bovis; В - М. smegmatis; С - М phlei)

М. bovis и атипичных видов микобактерий: М. phlei и М. smegmatis. Нами было установлено, что полученные мини-Ат давали частичный перекрест в больших концентрациях (от 2.5хЮ8 микробных тел в мл и выше) с М. smegmatis. Перекрест мини-Ат с М. phlei в иммунодот-анализе нами обнаружен не был (Рисунок 11). Полученные результаты дали возможность в дальнейшем

Рисунок 12 - Выявление туберкулинового Аг на клетках М. bovis шт. БЦЖ при помощи мини-Ат. Выявление фаговых частиц проводили с использованием конъюгатов антифаговых Ат с КЗ

иммунологических исследованиях. В дальнейшем полученные антитела планируется использовать для создания диагностикума наМ tuberculosis.

Получение мини-антител к поверхностным антигенам Azospirillum brasilense Sp245 и их использование для детекции микробных клеток

Значительный интерес представляет изучение возможности получения мини-Ат на целые клетки и компоненты клеточной стенки азотфиксирующих бактерий рода Azospirillum, участвующих в ассоциативных взаимоотношениях с растениями, для решения вопросов быстрой идентификации почвенных бактерий. В связи с этим, основная задача данного этапа исследований заключалась в получении фаговых Ат на Аг клеточной стенки типового штамма A. brasilense Sp245 при использовании овечьей фаговой библиотеки, а также изучение возможности их применения при анализе поверхностных Аг клеточных структур и детекции клеток с помощью микроскопических методов. Было проведено 3 раунда селекции мини-Ат на целые клетки A. brasilense Sp245 и 1 раунд селекции на ЛПС и флагеллин клеток этого штамма с использованием клонов, обладающих более высокой чувствительностью и продуктивной активностью.

Среди основных Аг бактериальной поверхности азоспирилл как грамотрицательных микроорганизмов особый интерес представляет липополисахарид или О-Аг. Строение его О-специфического полисахарида определяет иммунохимическую специфичность микроорганизмов, что служит основой для их внутривидовой классификации. Н-антигеном называют белок, из которого построены жгутики бактерий. Антигенными свойствами обладают как целые жгутики (свободные и в составе бактериальной клетки), так и формирующий их белок флагеллин. У бактерий рода Azospirillum флагеллин, являющийся родоспецифичным Аг, покрыт чехлом полисахаридной природы. Поэтому в дальнейшей работе мы уделили внимание именно этим Аг- клеточной поверхности азоспирилл. Для электронно-микроскопической идентификации взаимодействия клеток A. brasilense Sp245 с мини-Ат готовили препараты с концентрацией клеток 106 на 1 мл, инкубировали 0.5 мл суспензии микроорганизмов в забуференном физиологическом растворе с 10 мкл раствора гомологичных Ат с концентрацией 100 мкг/мл в течение 1 ч на шейкере. После чего центрифугировали суспензию при 12000 g 5 мин и ресуспендировали осадок клеток в 0.5 мл буфера. Инкубировали суспензию со 100 мкл раствора маркера антифаговые Ат + КЗ (D52o 0.5) в течение 1 ч. Повторяли операции осаждения и ресуспендирования. Приблизительно 20 мкл суспензии наносили на

5. Использование фаговых мини-антител для определения концентрации ферритина в сыворотке крови животных Z A.C. Фомин, С.А. Староверов, C.B. Козлов [и др.] ZZ Российский ветеринарный журнал. 2012. №. 4. С. 30-33.

6. Preparation of miniantibodies to Azospirillum brasilense Sp245 surface antigens and their use for bacterial detection Z L.A Dykman, S. A Staroverov, O.I. Guliy, O.V. Ignatov, AS. Fomin [et al.] ZZ Journal Immunoassay Immunochem. 2012. V. 33, №. 2. P. 115-127.

7. Определение концентрации ферритина с использованием рекомбинаторной антительной фаговой библиотеки Z A.C. Фомин, С.А. Староверов, Н.Т. Винников [и др.] ZZ В сб. статей "Ветеринарная медицина домашних животных". — Казань: Печатный двор, 2010. С. 269-272.

8. Изучение механизмов взаимодействия туберкулина PPD с клетками иммунной системы лабораторных животных / С.А Староверов, М.Л. Малинин, A.C. Фомин [и др.] ZZ От теории - к практике: вопросы современной ветеринарии, биотехнологии и медицины: Матер, межд. научи.-практ. конф. -Саратов: ГНУ СНИВИРАСХН, 2011. С. 277-281.

9. Изучение механизма воздействия туберкулина PPD на клетки иммунной системы лабораторных животных Z В Н. Ласкавый, A.C. Фомин, МЛ. Малинин [и др.] // Актуальные проблемы современной ветеринарии: Матер, межд. науч,-практ. конф. - Краснодар: КубГАУ, 2011. С. 276-278.

10. Использование фаговой библиотеки для получения антител на ферритин Z A.C. Фомин, С.А. Староверов, Н.Т. Винников [и др.] ZZ Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой: Матер. V всеросс. конф. молодых ученых. - Саратов: Научная книга, 2010. С. 143.

11. Использование электроакустического датчика для детекции микробных клеток при их взаимодействии с мини-антителами Z О.И. Гулий, Б.Д. Зайцев, И.Е. Кузнецова, А.М. Шихабудинов, O.A. Караваева, Л.А. Дыкман, С.А. Староверов, A.C. Фомин [и др.] ZZ IV Съезд биофизиков России. - Нижний Новгород, 2012. С. 84.

12. Получение мини-антител к поверхностным антигенам Azospirillum brasilense и их использование для детекции микробных клеток Z О.И. Гулий, О.А Караваева, С.С. Макарихина, Д.Ю. Володин, С.А. Павлий, Л.А. Дыкман, С.А. Староверов, АС. Фомин [и др.] II Актуальные аспекты современной микробиологии: VIII Молодежная школа-конф. с межд. Участием. - Москва, 2012. С. 120.

Формат 60x84 1/16. Бумага офсетная. Подписано в печать 18.11.2013.

Гарнитура Times. Печать Riso. _Усл. печ. л. 1,00. Тираж 100 экз. Заказ 0491__

Отпечатано с готового оригинал-макета в типографии ИП «Экспресс тиражирование» 410005, Саратов, Пугачёвская, 161, офис 320 9 27-26-93

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Фомин, Александр Сергеевич, Саратов

Федеральное государственное бюджетное образовательное

учреяедение высшего профессионального образования «Саратовский государственный аграрный университет имени Н.И. Вавилова»

ФОМИН АЛЕКСАНДР СЕРГЕЕВИЧ

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ФАГОВЫХ МИНИ-АНТИТЕЛ ДЛЯ ИММУНОАНАЛИЗА ДИАГНОСТИЧЕСКИ-ЗНАЧИМЫХ

АНТИГЕНОВ

03.01.06 - биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

04201454498

На правах рукописи

03.02.03 - микробиология

ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научные руководители:

доктор биологических наук С.А. Староверов

доктор биологических наук, старший научный сотрудник Л.А. Дыкман

Саратов - 2013

ОГЛАВЛЕНИЕ

Введение...................................................................................4

Глава 1. Обзор литературы.........................................................10

1.1. Общие сведения об иммунной системе; биосинтез поликлональных антител....................................................................................10

1.2. Получение мини-антител с использованием технологии фагового дисплея....................................................................................18

1.3. Иммунохимические методы в биотехнологической и

микробиологической практике......................................................24

Глава 2. Собственные исследования............................................38

2.1. Объекты, материалы и методы исследований...............................38

2.1.1. Объекты исследования.........................................................38

2.1.2. Выделение ферритина из печени крупного рогатого скота............39

2.1.3. Процедура аффинной селекции мини-антител...........................39

2.1.4. Дот-иммуноанализ..............................................................41

2.1.5.Выделение перитонеальных клеток..........................................42

2.1.6. Микроскопические методы....................................................43

2.1.7. Фармакодинамические методы...............................................44

2.1.8. Хроматографический анализ.................................................45

2.1.9. Получение наночастиц золота и их конъюгатов с антителами........47

2.2. Результаты исследований и их обсуждение..................................49

2.2.1. Применение антител для детекции ферритина...........................49

2.2.1.1. Получение мини-антител на ферритин и их использование в дот-анализе....................................................................................49

2.2.1.2. Получение поликлональных антител на ферритин и исследование уровня выработки интерлейкинов в процессе иммунизации..................55

2.2.1.3. Конструирование сэндвич-метод ИФА для обнаружения ферритина в сыворотке крови крупного рогатого скота.......................59

2.2.1.3.1. Протокол прямого ИФА ферритина при помощи поликлональных антител.............................................................59

2.2.1.3.2. Протокол прямого ИФА ферритина при помощи фаговых антител....................................................................................62

2.2.1.3.3. Исследования чувствительности и специфичности поликлональных и фаговых антител на ферритин..............................64

2.2.1.3.4. Протокол выявления ферритина с помощью фаговых и поликлональных антител сэндвич-методом.......................................67

2.2.2. Использование мини-антител для определения биодинамических , параметров различных лекарственных форм диминазена.....................73

2.2.3. Применение мини-антител для детекции возбудителя туберкулеза животных.................................................................................82

2.2.4. Получение мини-антител к поверхностным антигенам АгояртПит

ЬгаяИете Бр245 и их использование для детекции микробных клеток.....87

Заключение.............................................................................93

Выводы..................................................................................98

Список сокращений и условных обозначений................................99

Список литературы................................................................100

ч

Введение

Актуальность темы. Успехи современной медицины, ветеринарии и фитопатологии зачастую зависят от того, удается ли детектировать специфические антигены в организме животных или человека, в растениях, почве, воде или других объектах окружающей среды. В частности, профилактику и лечение многих инфекционных заболеваний существенно облегчает точное и быстрое обнаружение вызвавших их патогенных микроорганизмов. Для диагностики многих заболеваний необходимо сначала вырастить культуру потенциального патогенного микроорганизма и проанализировать спектр его физиолого-биохимических особенностей. Хотя классические микробиологические тесты проверены временем и обладают достаточно высокой специфичностью, они весьма трудоемки и дорогостоящи. Кроме того, имеются сложности идентификации тех патогенных микробов, которые неактивно растут в культуре или совсем не поддаются культивированию. Чтобы устранить эти принципиальные ограничения был разработан (наряду с методиками молекулярной диагностики) широкий спектр иммунохимических методов [5, 122, 149].

К иммунохимическим относятся методы, основанные на взаимодействии растворимых или корпускулярных антигенов (Аг) со специфическими антителами (Ат). Как сами методы, так и их приложения в клинической лабораторной практике чрезвычайно разнообразны [35].

Степень разработанности проблемы. Современная иммунохимия предлагает широкий ассортимент качественных и количественных методов анализа Аг, отличающихся по чувствительности и степени сложности [13, 113, 132].

В основе современного иммунохимического исследования лежат, прежде всего, разнообразные модификации иммунохроматографических и иммунопреципитационных методов [40, 99]. Эти методы, основанные на обнаружение различных Аг, варьируются от простых (иммуноанализ) к более сложным (иммуносенсоры).

Для оценки качества современных иммунохимических анализов есть определенные требования, которых придерживаются в современной иммунодиагностике. Во-первых, Ат для проведения анализа должны соответствовать определенным условиям для создания надежного биоспецифического взаимодействия (нормы ISO 15087). Во-вторых, нормы наличия целевых соединений (Аг) в матрице продукта, который будет исследоваться, должны быть приняты во внимание в связи с пределом обнаружения в рабочем диапазоне анализа [134].

Однако в целом все иммунохимические методы зависят, в первую очередь, от качества специфических Ат, используемых для получения диагностических систем.

Одним из способов улучшения качества Ат стал метод получения моноклональных антител с использованием гибридомной технологии [121]. Однако гибридомы, как и большинство культур животных клеток, растут довольно медленно, не достигая высокой плотности, и требуют дорогих сложных сред. Получаемые моноклональные антитела весьма дороги, что не дает возможности широко использовать их в клинической практике. Для решения этой проблемы, были созданы своего рода «биореакторы» с использованием генетически модифицированных бактерий и растений. Для использования Ат в качестве иммунотерапевтических средств достаточно только антигенсвязывающей области (Fab- или scFv-фрагмента), т.е. присутствие тяжелого Fc-фрагмента антитела необязательно [5].

Одним из таких методов является технология фагового дисплея Ат, ее основоположниками являются Джон Маккаферти с соавт. [157]. Ими было показано, что антиген-связывающие фрагменты Ат (scFv, Fab), эксппонированные на поверхности нитевидных фагов, возможно выделить с использованием иммобилизации Аг. Использование в диагностичеких методах мини-антител, отобранных из рекомбинантной фаговой библиотеки является весьма актуальной проблемой современной биотехнологии и микробиологии.

Цель работы - использование высокоспецифичных фаговых мини-антител и их применение для детекции биоактивных молекул и микроорганизмов в биологических объектах.

Задачи исследования:

1. Выделить ферритин из печени коров и получить к нему специфические мини-антитела с использованием фагового дисплея антител.

2. Разработать эффективный метод идентификации ферритина с использование поликлональных и фаговых антител.

3. Получить мини-антитела на диминазен и разработать метод детекции диминазена в биологических жидкостях с использованием иммунодот-анализа.

4. Разработать методы применения мини-антител на туберкулин для идентификации возбудителя туберкулеза с помощью световой и электронной микроскопии и твердофазного иммуноанализа.

5. Оценить эффективность применения фаговых мини-антител для иммуноанализа бактерий рода Azospirillum.

Научная новизна работы. Впервые был разработан метод идентификации ферритина в сыворотке крови коров методом

твердофазного иммуноанализа с использованием мини-антител на ферритин. Разработан метод индикации диминазена в биологических жидкостях методом иммунодот-анализа с использованием мини-антител на диминазен. Впервые получены мини-антитела на туберкулин и изучена возможность их применения для идентификации возбудителя туберкулеза методами световой и электронной микроскопии и твердофазного иммуноанализа. Полученные мини-антитела на антигенные структуры бактерий рода АгояртИит предложено использовать для детекции данного микроорганизма микроскопическими методами.

Теоретическая и практическая значимость работы. Полученные в настоящей работе высокоспецифичные мини-антитела на ферритин, диминазен, туберкулин и антигены азоспирилл и разработанные эффективные методики их применения для идентификации этих (и других) диагностически значимых антигенов в биологических объектах, являются перспективным направлением при создании разнообразных тест-систем для решения широкого круга научных и прикладных задач в области микробиологии, биотехнологии, ветеринарии и медицины. По материалам диссертационной работы опубликовано учебно-методическое пособие «Этиология, диагностика и профилиактика железодефицитной анемии поросят», для студетов 3, 4, 5-го курсов специальности «Ветеринария» (в соавторстве с Винниковым Н.Т., Анниковой Л.В., 2010). Материалы исследований используются в учебном процессе и научной работе ФГБОУ ВПО «Саратовский ГАУ», ИБФРМ РАН, ФГБОУ ВПО «Донской ГАУ», ФГБОУ ВПО «Воронежский ГАУ», УО «Витебская ордена «Знак Почета» государственная академия ветеринарной медицины» (Республика Беларусь).

Методология и методы исследования. Методологической базой послужили труды отечественных и зарубежных ученых по вопросам

получения моноклональных и поликлональных антител и их использование в иммунологических тест системах. Основу данного исследования составляют комплексный анализ и системный подход в изучении рассматриваемой темы.

При проведении исследования и изложения материала автором были применены общенаучные методы: теоретико-методологический анализ литературных источников, эмпирические методы исследования в форме наблюдения, эксперимента, описания, измерения и сравнительно-сопоставительного анализа.

Применение указанных методов, а так же анализ фактического материала позволили обеспечить объективность полученных выводов и результатов.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Использование фаговой библиотеки антител обеспечивает получение in vitro мини-антител против ферритина, диминазена, туберкулина и азоспирилл.

2. Одновременное использование поликлональных и мини-антител для диагностики ферритина методом ИФА является оптимальным способом детекции ферритина в биологических жидкостях животных.

3. Полученные при помощи фаговой библиотеки мини-антитела к диагностически значимым антигенам обладают высокой специфичностью и чувствительностью и могут быть использованы для создания современных иммунологических тест-систем.

Апробация результатов исследования. Основные положения диссертационной работы были доложены и обсуждены на: IX семинаре

Ассоциации практикующих ветеринарных врачей РФ (Казань, 2010); V Всероссийской конференции молодых ученых «Стратегия взаимодействий микроорганизмов и растений с окружающей средой» (Саратов, 2010); Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы современной ветеринарии» (Краснодар, 2011); Международной научно-практической конференции «От теории - к практике: вопросы современной ветеринарии, биотехнологии и медицины» (Саратов, 2011); IV съезде биофизиков России (Нижний Новгород, 2012); VIII молодежной школе-конференции с международным участием «Актуальные аспекты современной микробиологии» (Москва, 2012).

Публикации: по теме диссертации опубликовано 12 работ, в том числе 3 статьи в журналах, рекомендованных ВАК РФ.

Работа выполнена на кафедре «Терапия, акушерство и фармакология» факультета ветеринарной медицины и биотехнологии ФГБОУ ВПО «Саратовский государственный аграрный университет имени Н.И. Вавилова.

Работа частично поддержана грантом Министерства образования и науки Российской Федерации № 8852 (2012-2013 гг.).

Структура и объем диссертации: диссертация состоит из введения, литературного обзора, собственных исследований, включающих объекты, материалы и методы исследования, результаты исследований и их обсуждение, а также заключения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 118 страницах, иллюстрирована 36 рисунками и включает 4 таблицы. Список литературы включает в себя 190 источников.

Глава 1. Обзор литературы

1.1. Общие сведения об иммунной системе; биосинтез поликлональных антител

В настоящее время система иммуннитета рассматривается как контрольный механизм, который обеспечиваеет целостность организма и его индивидуальность. Действие иммунй сисеммы основано на способности различать собственные структуры организма и чужеродные генетически, а также элиминировать и перерабатывать последние. Началом всякой иммунологической реакции является процесс распознавания Аг: если иммунная система организма определяет, что это «чужое», а не «свое», то запускаются механизмы иммунного ответа [10].

Система врожденного и приобретенного (адаптивного) иммунитета, фибринолиз и гемостаз является единой гуморально-клеточной защитной системой организма (ретикулоэндотелиальная система). В общей работе этой системы основную роль играют лейкоциты (лимфоциты, моноциты и др.), система комплемента, макрофаги и эндотелий сосудистой стенки [18].

Как правило, иммунный ответ основан на распознавании патогена или другого чужеродного вещества и запуска неспецифических или специфических реакций, направленных на их устранение. В широком смысле, все разнообразие форм иммуннологического ответа разделяют на два типа - врожденный и приобретенный (адаптивный) иммунитет. Принципиальное различие между этими двумя типами иммунных реакций состоит в том, что адаптивный иммунитет обладает высокой специфичностью по отношению к каждому конкретному виду антигена [34].

Принято разделять естественный (врожденный) и адаптивный (приобретенный) иммунитет. Врожденный иммунитет обеспечивает природную устойчивость организма. Основной механизмам этого типа резистентности - фагоцитоз. Если возбудитель не устраняется путем фагоцитоза, в организме синтезируются сенсибилизированные лимфоциты и Ат (иммуноглобулины). Их специфическое взаимодействие с чужеродными Аг обеспечивает необходимую защиту. Иммуноглобулины составляют основу адаптивного гуморального иммунного ответа. Его можно приобрести пассивно - с помощью иммунной сыворотки. Сенсибилизированные лимфоциты обеспечивают клеточный иммунитет [21].

Система иммунитета образована специализированными органами и клетками. К клеткам иммунной системы относят лимфоциты, фагоциты, гранулярные лейкоциты, тучные клетки, а также несколько типов эпителиальных и ретикулярных клеток. Органы иммунной системы представлены костным мозгом, вилочковой железой, селезенкой, лимфатическими узлами, пейеровыми бляшками, миндалинами и другими скоплениями лимфоидных клеток. Иммунная система состоит из огромного количества клеток. Часть их локализована в органах иммунной системы. Другие разрознены и способны самостоятельно передвигаться по всему организму [28].

Лимфоидные органы (или органы иммунной системы) подразделяют на два типа: первичные (центральные) и вторичные (периферические). В центральных органах созревание лимфоцитов происходит без существенного влияния Аг, развитие периферических, напротив, непосредственно зависит от антигенного воздействия. Лишь при контакте с Аг в них начинаются процессы пролиферации и дифференцировки [56].

К центральным органам иммунной системы относят тимус и сумку Фабрициуса {Bursa Fabricii), обнаруженную только у птиц. У млекопитающих роль сумки Фабрициуса, возможно, выполняет костный мозг, в котором вырабатываются стволовые клетки - предшественники лимфоцитов. Полного эквивалента сумки Фабрициуса у млекопитающих обнаружить, пока не удалось. Оба центральных органа иммунной системы являются местами дифференцировки определенных популяций лимфоцитов: в тимусе образуются тимусзависимые, или Т-лимфоциты, а в сумке Фабрициуса - В-лимфоциты [93, 104].

К периферическим лимфоидным органам относят селезенку, лимфатические узлы, миндалины, а также ассоциированную с кишечником и бронхами лимфоидную ткань. К моменту рождения они ещ