Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Создание неимунной комбинаторной библиотеки одноцепочечных антител человека и получение из этой библиотеки антител против фактора некроза опухоли альфа

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Создание неимунной комбинаторной библиотеки одноцепочечных антител человека и получение из этой библиотеки антител против фактора некроза опухоли альфа"

На правах рукописи

Батанова Татьяна Александровна

СОЗДАНИЕ НЕИММУННОЙ КОМБИНАТОРНОЙ БИБЛИОТЕКИ ОДНОЦЕПОЧЕЧНЫХ АНТИТЕЛ ЧЕЛОВЕКА И ПОЛУЧЕНИЕ ИЗ ЭТОЙ БИБЛИОТЕКИ АНТИТЕЛ ПРОТИВ ФАКТОРА НЕКРОЗА ОПУХОЛИ АЛЬФА

специальность 03.00.03 - молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

Кольцово - 2005

Работа выполнена в Федеральном Государственном Унитарном Предприятии Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» МЗСРРФ

Научный руководитель:

кандидат биологических наук Н.В. Тикунова.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор В.Б. Локтев, кандидат биологических наук В.А. Матвеева

Ведущая организация: Институт цитологии и генетики СОР АН, Новосибирск

Защита состоится декабря 2005 года в 2 часов на заседании

диссертационного совета Д 208.020.01 при Государственном научном центре вирусологии и биотехнологии «Вектор» МЗСР РФ по адресу: Кольцово Новосибирской области, 630559; тел. (383) 336-74-28.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУП Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» МЗСР РФ.

Автореферат разослан , » ноября 2005 г.

Учёный секретарь диссертационного совета доктор химических наук

Э.Г. Малыгин

-

£\цъа.го

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В последнее время рекомбинантные антитела человека все чаще находят применение в терапии некоторых заболеваний. Одним из подходов к получению искусственных антител является конструирование одноцепочечных антител (бсРу), представляющих собой вариабельные домены тяжелых и легких цепей, объединенных пептидным линкером в единую молекулу. Обладая небольшими размерами, одноцепочечные антитела легче проникают в ткани и вызывают меньший неспецифический иммунный ответ. Кроме того, одноцепочечные антитела быстрее выводятся из организма. На основе одноцепочечных антител могут быть сконструированы полноразмерные анпгтела человека путем объединения их вариабельных доменов с константными доменами иммуноглобулинов человека. Одним из способов получения одноцепочечных антител является их отбор из комбинатррных библиотек методом фагового дисплея. При этом ключевым этапом является конструирование комбинаторной фаговой библиотеки, которая представляет собой популяцию бактериофагов, каждый из которых экспонирует на своей поверхности уникальное миниантитело, и в ходе процедуры аффинной селекции с использованием целевого антигена можно отобрать фаговые антитела против этого антигена.

Фактор некроза опухоли (ФНО-а) является главным медиатором острого воспалительного ответа на грамотрицательные бактерии и другие инфекционные агенты. Основная роль его заключается в способности индуцировать провоспалительные медиаторы, такие как ИЛ-1, ИЛ-б, гранулоцитариый макрофагальный колониестимулирующий фактор, а также белки-хемоаттрактанты. Главным стимулятором запуска продукции ФНО макрофагами являются бактериальные липополисахариды, а основным источником ФНО-а в организме являются активированные мононукпеарные фагоциты.

При тяжелых инфекциях, ФНО-а, продуцируемый в большом количестве, может вызывать системные клинические и патологические проявления: индуцировать лихорадку, вызывать увеличение синтеза провоспалительных белков, а также вносить ощутимый вклад при развитии локальных воспалительных реакций. Пролонгированная продукция ФНО-а вызывает и метаболические повреждения, включая кахексию. Поэтому, факторы, блокирующие действие данного цитокина, являются многообещающими в терапии ряда патологий, включая вирусные гемморрагические лихорадки и аутоиммунные заболевания. К таким факторам можно отнести и специфические антитела к ФНО-а.. В настоящее время наиболее перспективными в медицине считаются человеческие моноклональные антитела. Однако получение антител человека с помощью традиционной гибридомной технологии не удовлетворяет требованиям, предъявляемым к медицинским препаратам, поэтому актуально получение рекомбинантных антител человека против ФНО-а.

Для получения рекомбинантных антител человека против ФНО-а, необходимо было на первом этапе сконструировать представительную комбинаторную фаговую библиотеку антител человека, а

Г—

затем отобрать из нее высокоспецифичные рекомбинантные антитела против ФНО-а. Следует отметить, что если сконструированная библиотека обладает большой представительностью, то такая библиотека может послужить источником практически неограниченного спектра антигенов.

Цель данной работы заключалась в конструировании неиммунной фаговой библиотеки одноцепочечных антител человека, отборе из полученной библиотеки антител к ФНО-а и изучении их иммунохимических свойств.

В соответствии с поставленной целью необходимо было решить следующие задачи:

- сконструировать неиммунную комбинаторную библиотеку одноцепочечных антител человека на основе лимфоцитов периферической крови доноров и оценить размер и представительность полученной библиотеки;

- отобрать из полученной библиотеки фаговые антитела, специфически направленные к ФНО-а человека человека и исследовать их специфичность и хаактер связывания с этим антигеном ;

- сконструировать штаммы Escherichia coli, продуцирующие одноцепочечные антитела человека против ФНО-а в растворимой форме;

- получить очищенные одноцепочечные антитела человека против ФНО-а, подтвердить их специфичность и определить аффинность;

- определить аминокислотные последовательности нолученных одноцепочечных антител.

Научная новизна и практическая ценность работы. В настоящей работе впервые в нашей стране сконструирована нативная неиммунная фаговая библиотека одноцепочечных антител человека на основе лимфоцитов периферической крови здоровых доноров, представительность которой составила 2*10* независимых клонов. Проведенные эксперименты подтвердили возможность отбора из сконструированной библиотеки антител против различных антигенов.

Впервые были получены фаговые одноцепочечные антитела против ФНО-а человека и вирусоподобных частиц, образованных коровым белком вируса гепатита В; получены фаговые антитела против вируса осповакцины. В дальнейшем сконструированная библиотека может быть использована для отбора из нее одноцепочечных антител человека против широкого спектра антигенов.

В результате проделанной работы впервые были получены штаммы Escherichia coli, продуцирующие растворимые одноцепочечные антитела sAl и sB3 против ФНО-а, и оценена продуктивность этих штаммов. Получены очищенные одноцепочечные антитела sAl и sB3, показана специфичность взаимодействия этих антител с ФНО-а человека и определены их константы аффинности. Определены аминокислотные последовательности полученных антител. На основе полученных антител в дальнейшем могут быть сконструированы полноразмерные антитела человека, специфично взаимодействующие с ФНО-а.

Апробация работы и публикации. Материалы диссертации были представлены на Международной конференции «Human Antibodies and Hybridomas» (Берн, 2002), на XII Международном вирусологическом конгрессе (Париж, 2002), на Научной конференции «Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера» (Новосибирск, 2002), на XVIII Международной конференции «Antiviral research», (Барселона, 2005), на Международном междисциплинарном симпозиуме «От экспериментальной биологии к превентивной и ингегративной медицине», (Судак, Украина, 2005). По материалам диссертации опубликована одна статья, принята к печати, получено положительное решение о выдаче авторского свидетельства.

Объем я структура диссертации. Диссертация изложена на 126 страницах машинописного текста, включая 27 рисунков и 1 таблицу, и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов и обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы (130 наименований).

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Получение фрагментов ДНК, кодирующих Vh и VI домены иммуноглобулинов человека.

Первым этапом работы при конструировании библиотеки антител человека было выделение лимфоцитов из крови шести здоровых доноров в возрасте 18-22 лет, не вакцинированных вирусом осповакцины, и в чьих сыворотках не были обнаружены антитела против вируса гепатита В. Кровь в процессе отбора в объеме 200 мл от каждого донора, смешивали с антикоагулянтом. Мононуклеары периферической крови выделяли путем центрифугирования в градиенте плотности. Полученные таким образом клетки лизировали в растворе гуанидинизотиоцианата для последующего выделения РНК. Для выделения РНК был использован метод с использованием TRIzola В результате было получено 80 мкг суммарной РНК, выход матричной мРНК составил 10 мкг.

На основе выделенной РНК с использованием реакции обратной транскрипции была синтезирована кДНК, причем синтез кДНК велся в двух вариантах: с использованием в качестве праймеров статистической затравки и с использованием олиго-dT.

Выбор олигонуклеотндов для амплификации (ПЦР) Vh-фрагментов легких и тяжелых цепей иммуноглобулинов обусловлен первичной структурой этих доменов. Вариабельные фрагменты легких и тяжелых цепей иммуноглобулинов состоят из каркасных (FR) и гипервариабельных участков (CDR), причем аминокислотные последовательности каркасных участков высокогомологичны как для легких, так и дня тяжелых цепей антител, в то время как относительно короткие (4-15 а.о.) гипервариабельные области не имеют между собой какой-либо гомологии. Участки ДНК, кодирующие вариабельные фрагменты как тяжелых, так и легких цепей антител в

зрелых В-лимфоцитах, имеют на 3'-конце последовательности, соответствующие J -сегментам, которые участвуют в формировании CDR3 Vh и VI, соответственно. Из-за относительно высокой консервативности участка FR1 и J-сегментов, соответствующие им олигонуклеотиды могут быть использованы в качестве праймеров для амплификации кДНК В-лимфоцитов. Вместе с тем, существует несколько различных J-генов, как минимум 7 семейств Vh-генов, а также по несколько типов для каппа- и лямбда-семейств, причем последовательности FR1 у них несколько различаются. Поэтому, как правило, используют достаточно широкие наборы праймеров.

Набор использованных олигонуклеотидов позволил амплифицировать фрагменты генов антител наиболее широко представленных в организме семейств иммуноглобулинов. Амплификацию тяжелых и легких цепей иммуноглобулинов проводили в объеме 100 мкл с '

использованием Taq ДНК полимеразы и Vent полимеразы. Проводили 25 циклов по схеме 94°С/1 мин., 55°С/35 сек, 72°С/50 сек. Продукты амплификации анализировали в 1,5% агарозном геле В случае Vh цепей полосу размером 340 и.о., а в случае Vk и VX цепей полосу размером 325 п о вырезали из геля, а затем ДНК экстрагировали.

При амплификации проводили сравнительную оценку эффективности наработки генов вариабельных фрагментов разных семейств. В случае относительно низкой эффективности наработки генов одного из семейств, эти фрагменты амплифицировали отдельно, используя при этом уже не смесь праймеров BACK, а отдельный олигонулеотид Таким образом, мы добивались относительно равномерного соотношения разных семейств иммунглобулинов в получаемой библиотеке. После наработки достаточного количества фрагментов ДНК (1 мкг), кодирующих вариабельные домены тяжелых и легких цепей, проводилась их тщательная очистка на силикагеле, необходимая для дальнейших манипуляций.

2. Конструирование библиотеки.

Для конструирования библиотеки вначале было необходимо с помощью нуклеотидной последовательности, кодирующей гибкий пептидный линкер Ser^Gly-iSer^AIaArgGlySerG^Ser, провести объединение вариабельных фрагментов тяжелых и легких цепей иммунопюбулинов человека в ДНК-последовательности, кодирующие одноцепочечные антитела человека При этом был использован олигонуклеотид, кодирующий обратную линкерную последовательность linkApaLI и содержащий сайт для эндонуклеазы рестрикции ApaLI:

5'AGATCCGCCGCCACCCGAACCCGGTGCACTGCCGCCACCACCAGAGCCACCGCCACCTGAm

Объединение проводили в несколько этапов (рис. 1). Сначала с помощью ПЦР линкер достраивали последовательностями, кодирующими 3'-концы вариабельных доменов тяжелых цепей '

иммуноглобулинов: RhuJHl, RhuJH3, RhuJH4 и RhuJH6. Продукт амплификации размером около 100 п.о. экстрагировали из 1,5% агарозного геля. Затем объединяли фрагменты ДНК, кодирующих ,

Vh-домены, с ликкерной последовательностью Далее фрагменты ДНК, кодирующие Vh-домены с линкером, амплифицировали с введением сайта для эндонуклеазы рестрикции Sfil, необходимого для дальнейшего клонирования При этом использовали праймеры, содержащие сайт рестрикции Sfïl с 5' конца. Продукт амплификации анализировали в 1,5% агарозном геле Фрагмент, размером около 460 и.о. экстрагировали из геля.

В случае ле!ких цепей, линкер, достроенный ранее фрагментами ДНК, кодирующими С-концы Vh-доменов, удлиняли последовательностями, кодирующими N-концы Vl-доменов иммуноглобулинов, методом ПЦР Затем удлиненную линкерную последовательность объединяли с фрагментами ДНК, кодирующими VI-домены в реакции ПЦР. Далее фрагменты ДНК, кодирующие Vl-домены с линкером, амплифицировали с введением сайта для эндонуклеазы рестрикции Notl, необходимого для дальнейшего клонирования, используя праймеры, содержащие сайт рестрикции Notl.

Для объединения ДНК-конструкций "Vh-линкер" и "Vl-линкер" в единую ДНК-послелователыюсгь, по 0,5 мкг объединенных с линкером фрагментов обрабатывали эндонуклеазой рестрикции A pal Л. Подготовленные таким образом вариабельные фрагменты тяжелых и легких цепей объединяли в реакции лигирования с использованием ДНК-лигазы фага Т4. Полученные фрагменты ДНК, кодирующие одноцепочечные антитела, амплифицировали, продукт амплификации анализировали в 1,5 % а!арозном геле, фрагмент размером около 800 п.о. экстрагировали из геля 1аким образом, была получена популяция генов, кодирующих одноцепочечные антитела человека.

На следующем этапе полученные гены, кодирующие одноцепочечные антитела человека, встраивали в векторную фагмиду. В качестве вектора для создания библиотеки была выбрана фагмида рНЕ№. Эта фагмида может реплицироваться как обычная плазмида, а, благодаря наличию orí фага М13 и в случае котрансфекции клеток E.coli фагом-помощником М13К07, может упаковываться в фаговые частицы Между последовательностями, кодирующими встраиваемое одноцепочечное антитело и белок рШ бактериофага M13, находится стоп-кодон TAG, который в supE штаммах E.coli транслируется как остаток глутаминовой кислоты, поэтому фагмида pHEN2 обеспечивает в supE штаммах Е coli довольно высокий уровень экспрессии генов одноцепочечных а!ггител в составе химерного белка с оболочечным белком рП1 бактериофага M13

»

1

RhuJh LinMpaH

Jh V

^линкер

VhbackSffl

-B-W Vh Jh ApaLI

^-ink.ApaLI

ihuVI

Jh ApaLI RhuVI

VI

sf Vh AP*U '■■■

Jh ApaLI RhuVI VI

□....... =&»

I • Рестрикция ApaL\ т ' Лигирование • Амплификация

Sfil иь ApaLI v. Noll □ □.......... fr

NotI

l

,M13 Onqine Sfil

AP..

PHEN2 TAG

ColE

Рис 1 Схема конструирования комбинаторной фаговой библиотеки одноцепочечных антител

При комплемешацин в отсутствие фша-помощника одна копия рекомбинантного белка будет включаться в состав фаговой часгицы, что не сказывается па инфекционностн последней Кроме тото, при трансформации несупрессорных штаммов Е coli данная фагмида позволяет получать секретируемые антитела в виде ипдивидульныч молекул, без оболочечного белка

Порученные фра] моты ДНК, кодирующие одноцепочечные антитела, а также 10 мкг ДНК фа! миды pi IPN2 обрабатывали эндонуклеазами рестрикции Sfil и Notl, после чего их очищали с использованием силикагеля, как описано выше Обработанные указанными эндонуклеазами ресгрикциии фрагменты ДНК, кодирующие одноцепочечные антигела, и ДНК фагмиды pHbN2 объединяли в реакции лигирования в соотношении 100 нг к 200 нг. Каждую реакцию проводили в объеме 25 мкл в стандартных условиях с использованием ДПК-лигазы фага Т4. Сконструированная 1акич образом популяция фагмидных ДНК являлась фагмидным вариантом комбинаторной фаговой библиотеки одноцеиочечных антител человека.

Затем получепной популяцией фагмидных ДНК трансформировали клетки Е coli в препаративных количествах. Для трансформации использовали электрокомпетентные клетки супрессорно! о штамма Ecoli TGI. Электро трансформацию проводили с использованием электропоратора BIORAD Gene Pulser (BIORAD, США), при этом для трансформации брали по 20 мкл лигазпой смеси fJccio было проведено 3 электропорации. Полученная популяция клеток являлась клеючным вариантом целевой библиотеки одноцепочечных антител человека

3. Харнктернзация полученной библиотеки.

Для определения размера библиотеки необходимо зиагь количество независимых трансформантов Для этого высевали десятикратные разведения суспензии трансформированных клеток и подсчитывали количество выросших клонов Суммарное количество независимых трансформатов составило 2* 10*, чю является расчетным тигром библиотеки.

Следует отме1игь, что размер комбинаюрнмх библиотеки антител, сконструированных ранее из мРНК лимфоцитов периферической крови доноров, зависит, прежде всего, от количества доноров Например, амти1ела, изолированные из ранее сконструированных комбинаторных натуральных библиотек размера 107 (Majks el al, 1991, de Kruif et al, 1995) обладали аффинностью на микромолярном уровне, что соответствует антителам, образующимся в ходе первичного иммуного ответа, тогда как комбинаторные библиотеки большего размера - 10'"10'° независимых рекомбинангов, позволяют получать специфические антитела с афиинностью I08 М"' и выше, что соответствуе! антителам, образующимся в ходе вторичного иммунного ответа (Vaughan et al, 1996; Sheets et al, 1998) Для создания библиотеки больших размеров (109 - 1010) обычно используют от 20 до 50 доноров (Little M , et al, 1999) Для получения нашей комбинаторной библиотеки антител мы использовали в качестве доноров только 6 человек, соответственно, размер полученной библиотеки составил 2x10* независимых трансформанюв Дтя создания библиотек из неиммуннных В-

лимфоцитов, используемых в качестве источника РНК, комбинаторные библиотеки должны содержать, по крайней мере, 10* индивидуальных независимых рекомбинангов, чтобы воссоздать исходное разнообразие детерминант антител (Gavilondo, 2000). Поэтому, размер нашей библиотеки позволяет предположить возможность получения из нее специфических фаговых антител, обладающих хорошими иммунохимическими свойствами.

Следует отметить, что при работе с библиотекой важнее знать функциональный размер библиотеки, т.е. количество клонов, содержащих корректно собранные гены, без сдвига рамки считывания, стоп-кодонов и делеций Функциональный размер библиотеки всегда будет ниже по сравнению с исходным, но именно он будет определять возможность отбора и свойства антител Для проверки функционального размера библиотеки были наработаны 20 клонов, фагмидные ДНК которых были проанализированы на наличие вставок, кодирующих одноцепочечные антитела около 800 п.н). 19 из 20 фагмидных ДНК содержали вставки, следовательно, приблизительно 95% клонов библиотеки содержали фрагмент ДНК, кодирующий одноцепочечное антитело.

Известно, что не все фаговые антитела, отобранные из библиотеки по специфичности к целевому антигену, могут быть получены в дальнейшем в виде индивидуальных молекул одноцепочечных антител без оболочечного белка бактериофага. Поэтому полезно оценить процент антител из данной библиотеки, которые могут быть переведены в растворимую форму Для этого, полученной популяцией фагмид транформировали несупрессорный штамм Е coli BLRIL. Клетки 11 полученных клонов были наработаны и протестированы на способность продуцировать одноцепочечные антитела в растворимой форме. Было показано, что 10 из 11 клонов продуцировали одноцепочечные антитела, следовательно, можно ожидать, что не менее 90% антител из сконструированной библиотеки могут быть получены в растворимой форме без оболочечного белка бактериофага.

Таким образом, нами была сконструирована и охарактеризована неиммунная библиотека одноцепочечных антител человека на основе периферических лимфоцитов здоровых людей и было показано, что ее размер составил 2* 10*, а функциональный размер - около 1,7* 10*

4. Отбор из полученной библиотеки антител против различных антигенов.

Для того, чтобы иметь возможность отбирать антитела против антигенов различной природы, необходимо оценить функциональную представительность этой библиотеки Для такой оценки можно провести отбор антител против различных антигенов, и по полученным результатам оценить, является ли функциональная представительность сконструированной библиотеки достаточной. Поэтому, для подтверждения возможности отбора из сконструированной библиотеки антител против спектра антигенов была проведена селекция из нее фаговых антител против следующих антигенов: вируса осповакцины (ВОВ), вирусоподобных частиц, образованных коровым антигеном вируса гепатита В (НВс-антигена), и фактора некроза опухоли альфа человека (ФНО-а) (рис. 2).

Комбшшюрная библиотека

Вирус осповакцияы НВс-антиген ФНО-а

Г

Фт овые ашитела

Рис 2 Схема аффинной селекции.

Природа использованных нами антигенов различна: ВОВ, штамм ЛИВГ1 - один из самых крупных вирусов со сложным вирионом, в работе использовали инфекционный препарат, очищенный в фадиенте сахарозы (любезно передан Белановым Е.Ф., ГНЦ ВБ «Вектор»; НВс-ангиген - коровый белок вируса renaiHia В, образующий в результате самосборки в ходе продукции его в клетках Ecoh вирусоподобные частицы диаметром 28 нм, состоящие из 180 или 240 мономеров (препарат любезно передан Карпенко Л.И, ГНЦ ВБ «Вектор») (Карпенко J1., и др, 2005); ФНО-а - рекомбинантный белок, полученный путем аффинной очистки из штамма продуцента Ecoh SG 28858/p'lNT 31, обладающий биологической и иммунологической активностью ФНО-а человека (Шищарова Л.Н. и др., 1997, Коробко В Г и др., 2005), был любезно передан Шишаропой Л Н , Иныисут Биоор! анической химии, Москва.

Как известно, для отбора специфичных антител на первом этапе проводят, как правило, oi 2-ух до 5-ти раундов аффинного обогащения исходной библиотеки (биопэннинг) Процедура бкопзиниша представляет собой инкубацию фаювой библиотеки антител с соответствующим а>пи(еном с последующей огмывкой несвязавшихся и элюцней связавшихся с антигеном бак!ернофагов, несущих на себе одноцепочечпые антитела В качестве элюента можно использовать либо триэтиламии, либо сам антиген (Griffiths A., et al, 1998; Ламан А., и др , 2002)

В данной работе аффинное обогащение библиотеки проводили по методам, описанным ранее (Griffiths A, et al, 1998) с нашими модификациями Для проведения аффинного обогащения библиотеки фаговыми антителами, специфичными к ФНО-а, в первом раунде биопэннинга использовали ФНО-а в концентрации 50 мкг/мл, коюрый сорбировали в иммунологическую пробирку в растворе фосфатно-солевого буфера (ФСБР) При этом контролем служила другая иммунологическая пробирка с ФСБР После блокировки мест неспецифическою связывания обе

иммунологические пробирки заполняли смесью, содержащей 0,5 мл супернатанта с фаговыми антителами (5*10'2 БОЕ) и 0,5 мл раствора ФСБР-Гвин 0,2%. Фаговые антигела инкубировали с анттеном, затем несвязавшиеся фаговые антитела удаляли, а иммунологические пробирки промывали раствором ФСБР-Твин 0,1% и ФСБР В качестве злюнрующе! о раствора использовали ФНО-а человека, разведенный в ФСБР в концентрации 50 мкг/мл, элюат собирали и инфицировали им экспоненциально растущую культуру клеток Ecoli TG1 Выросшие клетки использовали для наработки популяции бактериофагов для проведения дальнейших эксперименте

Аналогично были проведены 2-ои и 3-й раунды аффинной селекции, при тгом концентрация рекомбинантного ФНО-а для сорбции и элюции специфических антител составила 25 мкг/мл для второго раунда и 12,5 мкг/мл - для третьего раунда.

Поликлональные фаговые популяции, полученные в результате первого, второго и третьей) раундов селекции, а также исходную фаювую библиотеку, тесiпровали с помощью ТИФА для оценки изменения связывания с ФНО-а человека. Проведенное тестирование показало значительное превышение сигнала при связывании антигена фаговой популяцией, полученной после 3-ю раунда селекции, над сигналом, обеспечиваемым исходной библиотекой, что указывает на обогащение фаювой популяции специфичными к ФНО-а антителами в резулыаге трех раундов биопэннинга (рис 3)

Аффинное обогащение сконструированной библиотеки клонами, продуцирующими одноцепочечные антитепа к НВс-антш ену и ВОВ проводили аналогично При этом концентрация ВОВ составляла 300 мкг/мл, а концентрация корового белка вируса гепатита В в составе вирусоподобной частицы - 100 мкг/мл для всех раундов селекции Таким образом, были получены популяции бактериофагов, обогащенных фаговыми антителами против ВОВ, ИВс-антигена, и ФПО-а Из обогащенной специфическими антителами к ФНО-а библиотеки, полученной в результате третьего раунда биопэннинга, 29 независимых клонов тестировали методом ТИФА по способности связывать ФНО-а человека. Антиген растворяли в ФСБР и сорбировали на пласгиковые планшеты в концентрации 0,5мк|/мл В качестве отрицательного контроля использовали раствор ФС'ЫМвин 0,1%, в качестве контроля неспецифичсского связывания бактериофаг MI3K07, не несущий антител на своей поверхности Проведенный анализ показал, что более 50% клопов демонстрировали сигнал, в 5 и более раз превышающий значения таковшо для бактериофага М13К07 и отрицательного контроля (рис 4) Таким обратом, было отобрано 15 антител, связывающих ФНО-а человека

Из обогащенных специфическими антителами к ВОВ и НВс-антигену библиотек, полученных в результате соответствующих третьих раундов биопэннинга, по 24 независимых клона тестировали методом ТИФА на наличие фаговых антител, связывающих ВОВ и НВс-антшен, соошезывешю

1 2

1

08 06 04 02 0

исходная библиотека

первый раунд второй раунд третий раунд

Рис 3 Связывание популяций фаговых ашител после 3-х раундов селекции с ФНО-а человека (темные колонки) и с буфером ФСЬР-Твин 0,1% (светлые колонки)

ВОВ и НВс-атиген сорбировали на гюлистироловые планшеты в концентрации 3 мкг/мл (ВОВ) и 1 мкг/мл (ПВс-антш ей) В качестве отрицательною контроля использовали раствор ФСБР-Твин 0,1%, а в качестве контроля неспецифичсского связывания бактериофаг М13К07, не несущий антител на своей поверхности Проведенный анализ показал, что 50% клонов демонстрировали сигнал, в 3 и более раз превышающий значения такового для бактериофага М13К07, и отрицательного контроля неспецифического связывания, на основании чего были отобраны 11 фаювых антител, специфично взаимодействующих с ВОВ (рис 4Б) и 8 антител, связывающих НВс-антиген (рис 4В) Чтобы оценить разнообразие оюбранных антител, кодирующие их 1ены были проанализированы с помощью фнигерпринт-апализа с использованием эндонуклеазы рестрикции Пае III Шесть аитигел, связывающих ФНО-а человека, имели различный рестрикционный профиль (рис 5Л), семь антител, связывающих вирус осповакцииы, были уникальными (рис 5Б) Четыре антитела против вирусоподобных частиц, образованных коровым белком вируса гепатита В были идентифицированы как уникальные ангигела (рис 5В)

Б

А1 Ш С1 П П 01 III А2 02 С2 И2 Г2 Р2 02 Н2 ЛЗ ПЗ ГЗ ПЗ ГЗ РЗ ОЗ III М13К07

В

Рис 4 Скрининг независимых клонов, продуцирующих фаговые антитела, после 3 раунда биоплшиш а, но способности связывать ФНО-а (А), ВОВ (Б) и НВс-антиген (В) ме годом ТИФА

А

Б

В

1 2 3 4 M 5 6

1 23456М7

1 2 3 4M

'¿l>M*i¡Г >. i '

''/-.и

■h г "

.V +îKÎ.'

I'l '>

i,.1 t.

1'ис 5 Олектрофореграмма НасШ - гидролиза гов, кодирующих одноцепочечные антитела против ФНО-o (А), ВОВ (Б) и НВс-ангигетта (В) Нанесение- I — А1, 2 - G1, 3 - В2, 4 A3, 5 В3.6 Г)4 (A), I 1А1, 2 - 1В2, 3 - 1СЗ, 4 IA5, 5 -1D6, 6 - 2А2, 7 - 2D2, 8 - 2G2 (Б), 1 - ICI, 2 - ID1.3- 1BI.4 - 1И (В) M ДНК-маркер 100 и н

5. Исследование специфичности спптыиання отобранных уникальных антител.

Фаговые антитела, полученные в дайной работе, представляли собой фаговые частицы, экспонирующие на своей поверхности в составе минорною белка оболочки pJH бактериофа!а М13 одноцепочечные атигела человека Очевидно, что подобная иммунологическая конструкция обладает способностью к неспецифическому связыванию Поэтому, для контроля уровня иеспецифического связывания было гзыбраио фаговое антитело М13С, экспонирующее на своей поверхности одноцепочечное антитело человека по не связывающее ни ФПО-а человека, пи ВОВ, ни НВс-антшен вируса гепатита В, что было подтверждено методом ПЦР

J 1ля проверки специфичности отобранных атпигел все уникальные аитшела, связывающие ФИО а человека ВОВ и вирусоподобные частицы, образованные Кориным белком вируса тепатита В, были протес 1ироватты в реакциях кроссреактивното связывания В результате проведенных эксперименгов было показано, "по все уникальные фаговые антитела, отобранные против ФНО-а, взаимодействовали только с ФНО-а и не связывались с ВОВ и коровым белком вируса гепатита В; ли in ела. отобранные прошв ВОВ, взаимодействовали только с ВОВ, но не связывались с ФНО-а человека и НВс-атттигепом Birpjca tenant га В, а антитела, отобранные против НВс-антигена вируса гепатита В, выявляли только соответствующий антиген (рис. 6)

в

Рис 6 Связывание фаговых аптигел, специфичных к ВОВ (А), НВс-антигену (В) и ФПО-о человека (В), с ВОВ, с ННс-ангИ1еном в составе вирусоподобных частиц и ФНО-а.

В дальнейшем была протестирована способность отобранных ашител связывав соответствующие антшены меюдом

иммуноблотинга Очищенный ФНО-а

фракционировали методом электрофореза в деншурирующих условиях в 14% Г1АА1 и переносили на нитроцеллюлозную мембрану Белок выявляли с помощью отобранных уникальных фа! овых антител, независимо. В качсст ве контроля неспсцифическо! о связывания использовали бактсриофат, экспонирующий повсрхпосж .шипело МПС, отрицательною контроля моноклинальные анти(ела

на своей а качестве использовали выявляющие

бактериофаг МП (анти-М13-ан1ичета) Было покашю, что только 2 фаговых антитела А1 и ГП, отобранных против ФНО-а человека, выявляли белок с молекулярным песом около 17 кДа, соответствующий молекулярному весу рекомбипанпюго ФНО-а человека (рис 7), тогда как 4 ссыльных отобранных ангигела не связывались вообще с ФНО-а человека в иммуноблоте Возможно, зти 4 антитела взанмодейс1вовзли с ко ¡[форма цио и и мм и эиитопами ФНО-а, которые разрушались мри проведении электрофореза в денатурирующих )еловиях Фаговое антитело М!ЗС, а также анти-М13 моноклоиальные антитела, не выявляли ФНО-а человека (рис 7)

Рис 7 Иммуно-блог анализ ФНО ц человека с использованием фаговых антител С филы 1 А1.2- С1,3-В2,4 ВЗ, 5-АЗ, 6 1)4, 7 -МПС. 8-апИ-МПМКА, М-маркер молекулярных масс

Аналогично, 6 уникальных антител, связываюгцич вирус осповакцины, и 4 уникальных атижела прошв вирусоподобных частиц, образованных коровым белком вируса Iепатита В, были проанализированы с помощью иммуноблот-аналтиа Все фаговые антитела, отобранные против вирусоподобных частиц, образованных коровым белком вируса гепатит В, выявляли белок 24кДа, соответствующий ра4мерам коровою белка вируса гепатита В (рис 8Б) Два антитела из семи про ж» ВОВ 1А! и IА5, взаимодеис!вовали с белком 27 кДа вируса осповакцины, а антитело 2А2 с белком рашером около 54-56 кДа вируса осповакцины (рис 8А). Все остальные фаговые аптшела, отобранные против вируса осповакцины, дополнительных белков по сравнению с контрольным ангггтслом не выявляли Вероятно антигета 1В2, 1СЗ, 1Н4, 2152 узнавали конформационпые »нитоны белков вируса осповакцины

12345678

А

Б

■■» 1

Рис 8 Вестерп-блот анали) белков ВОВ (А) и НВс-знитопл (Ь) с помощью одноцеиочечных фаговых антител Нанесение: 1 -2А2, 2 1 А!, 3 IА5, 4 1В2, 5-MI3C.6 anti-МПМКА (А), 1-1131,2 1С1, 3 -1D1, 4 - 1М, 5 МПС, 6 anti-М13 МКА(Б).

54 - ► кДа

27 кДа

27

кДа

1 2 3 4 S 6

1 2 3 4 5 6

[аким образом, проведенные эксперименты подтвердили возможность отбора из сконструированной комбинаторной библиотеки одноцепочечных антител человека, специфических к аптитенам, различным по своей природе Вошожность такою отбора предопределена как резервами иммунной системы, гак и дополнительной рекомбинацией вариабельных доменов ле1ких и тяжелых цепей иммуноглобулинов, происходящей при конструировании комбинаторной библиотеки одноцепочечных ангтпел Следовательно, сконструированная нами натуральная неиммунная библиотека одноцепочечных антител может быть использована д11я получения антител против широкою спектра антитенов Учитывая, что эта библиотека содержит одноцепочечиые антитела человека, можно предположить, что получаемые антитела в тальпеишем мот>т найти применение не только в качестве диагностических средств, но и л тя получения на их основе терапевтических нрепараюв

6. Получение одноцепочечных антител человека к ФИО-« в растворимой форме.

Одной из целей данной работы являлось получение одноцепочечных антител человека к ФПО-а в растворимой форме Для этою необходимо было выбрать ит полеченных нами уникальных фатовых антител антитела, обладающие наибольшей специфичностью к ФИО а человека и являющиеся более перспективными

Шесть различных фатовых антител - А1, В2, 01, АЗ, ИЗ и 1)4, отобранных нами из сконструированной библиотеки, исследовали на способность специфически связывать ФНО-а человека в ТИФА при последовательных разведениях самих антител ФНО-а сорбировали па полистироловые планшеты в концентрации 0,8 мкг/мл и тестировали взаимодеиствтте с постедовательными разведениями фатовых антител При этом исходная концентрация фаговых антител составляла 10" БОЕ/мл, а нтат при титровании антител - 1 4 В качестве контроля неспецифического связывания использовали фаговое антитело М13С В результате проведенных экспериментов было показано достоверное превышение тначения оптической плотности над контрольной при разведении фаговых атттител до 4*10' БОЬ/мл (рис 9) 1ак как только 10% бактериофагов несут бсРуб на своей поверхности (ОпГГпИч А , с( а1, 1998), следовательно, в лупке находилось только 4*107 фаговых антител, что соответствует 1,7x10 "' МбсРу

Для дополнительной проверки специфичности отобранных антител против ФНО-а было проведено исследование их связывания еще с тремя различными белками - бычьим сывороточным альбумином (БСА), овапьбумином (ОВА) и убиквитином (УБИ) Следует отметить, что альбумин -это основная фракция белков крови, а убиквитин - фермент, ответственный за утилизацию, так называемое, «убиквитин-опосредованное» расщепление внутриклеточных белков Поэтому, взаимодействие отобранных одноцепочечных антител с данными белками сразу же позволит выявить антитела, иснольтование которых будет неприемлимым в медицинских исследованиях

Рис 9. Связывание последовательных разведений фаговых антител с ФНО-а человека. Исходная концентрация антител составляла 4x10' БОЕ/мл.

Все белки, включая ФНО-а, сорбировали иа полистироловые планшеты в концентрации 0,5 мкг/мл В результате проведенных экспериментов было показано, что 5 фаговых антител - Al, В2, A3, ВЗ и D4, - специфично взаимодействовали с ФНО-а человека, не связываясь при этом с другими белками (рис 10) Только одно фаговое антитело G1 продемонстрировало высокий сигнал на ОВА, что свидетельствовало о его недостаточной специфичности.

Поскольку среди уникальных фаговых антител, связывающих ФНО-а человека, только два антитела - А! и ВЗ - обладали наименьшими сигналами на ОВА и УБИ, кроме того, эти два антитела вывляли белок ФНО-а в иммуноблотгинге, то для получения одноцепочечных антител в растворимой форме, были выбраны именно эти антитела, кодируемые фагмидными ДНК pHEN-Al и

pHEN-ВЗ, соответственно.

Следующим этапом работы было получение одноцепочечных антител против ФНО-а человека в растворимой форме, т.е. в виде свободных антител, не связанных с бактериофагом. Для продукции таких антител был использован несупрессорный штамм E.coli НВ2151 (К12, ara, D(lac-pro)), thi/ F' proA+B\ lacF, lacZDM15, транслирующий стоп-кодон TAG, находящийся в структуре антитела перед белком рШ бактериофага, что приводит к экспрессии только гена, кодирующего одноцепочечное антитело. Следует

Рис. 10. Связывание отобранных фаговых антител против ФНО-а, с БСА, ОВА и УБИ в непрямом ТИФА.

отметить, что на С-конце молекулы одноцепочечно!о антитела находится тексамер гистидина, а также С-тус эпиюп для детекции продукции этого атигела

Культуру клеток Б coli 11B2S5I независимо трансформировали фатчидными ДНК pHFN-Al и р! 1EN-B3, очищенными методом щелочною лишса (Birnborm НС, et al. 1479) Индивидуальные клоны после трансформации трижды рассевали до отдельных колонии При этом каждый рат для подтверждения присутствия [енов, кодирующих антитеча sAl и яВЗ в соответствующих клонах проводили финтерпринт-апалпз Наличие анти-ФНО-а активности в лизагах клеток контролировали методом ТИФА В результате были получены штаммы Etoh- lIR2l51/plIFN-4Al п HB2I51'pllFN-чВЗ, обеспечивающие индуцируемый иэопропилтиоталактозндом (ИГПТ) ситттез одноцепочечных антител человека sAl и sB3, способных связываться с ФНО-а че ювека, с уровнем продукции, превышающем около !% суммарного клеточкою белка r) i и тп гаммы были лепопированны в Коллекции культур микроорганизмов ФГУП ГНЦ ВБ «Вектор»

7. Очистка растворимых антител чЛ1 и s!í3.

Для получения одноцепочечных антител sAl и культуру клеток полученных штаммов нарабатывали в 50 мл 2*YT, содержащей 100 мкг/мл ампицилипа и 0,1% глюкозу, подращивали до оптической платности 0,6-0,8, после чего клетки индуцировали ПГШ Из клеток, осажденных центрифугироваттием, выделяли периплазму Периплатмагические фракции затем очищали с помощью набора «Ni-NTA Qiagen» Фракции, полученные при хроматографии периплашатттческих экстрактов клегок Е coli, трансформированных фагмидными Д1IK pllEN AI и pHHN ВЗ.

Рис 11. Элсктрофореграмма фракций, полученных при хроматографии па Ni-N'IA носителе лизагов F coli, содержащих чА1 А - окраска Кумасси R-250, Б иммуноблотгинг с МКА М стандарты молекулярных масс, 1 - периплазматическая фракття клеток Е coli HB2l5l-plIEN Al до нанесения на колонку, 2 - несвязавшаяся периплазматическая фракция клеток Ь coll HB2151-pHEN-A! после нанесения на колонку, 3 - фракция промывки, 4 - элгоат

Ml 234 12М34

япалшировали элект рофоретнчески Пример элекгрофоретического анализа периплазма шческих фракций, а 1акже проведенного иммуноблоггинга очищенных одноцепочечпых антител, подтвердивший их присуклвие в периплазме, приведен на рис. 11

При сканировании гелей, содержащих фракции «элюат» на денситометре «Chromoscan 200» (Great Bntain) было показано, что уровень очистки для обоих одноцепочечпых антител составил около 50% Определение концентрации чистою белка в растворе проводили, используя метод Лоури-Фолина (Досон Р. и др, 1991) Сыло показано, что концентрация белка в растворе, содержащем растворимое am и 1сло А1,

составила 90 мкг/мл, а копнен i рация белка в paciBope, содержащем растворимое антитело ВЗ, 70 мкг/мл С ледова!ельио, учишвая степень очнС!ки, концен фация растворимою scFv Al cooiветствовала 45 мк1/мл. а концещрация расшоримою sclv ВЗ - 35 mki/m.t Выход одноцепочечпых ашитсл АI и ВЗ составлял 270 и 210 мкг на лшр культуры, соответственно.

Для подтверждения соответствия специфичности полученных одноцепочечпых растворимых ашигел sAl и sB3, специфичноегям исходных фаговых антител, данные антитела были исследованы в иммуноблот-аналнзе В качестве кон (роля неспецифического связвания использовали очищенную периплазма шческую фракцию кулыуры клеток Е colt HB2I5I, наработанную в условиях, соответствующих таковым для получения растворимых антшел В результате проведенных эксперимешоп была подтверждена специфичность взаимодействия растворимых антител sAl и sB3 с ФНО-а человека

Я. Определение аминокислотных носледопа гельнос гей одноцепочечпых япштсл sAl и sB3.

Следующим этапом рабо!ы было определение аминокислотных последовательное геи вариабельных доменов тяжелых и ле!ких цепей антител Al и ВЗ. Нуклеотидные последовательное! и генов, кодирующих одноцеиочечиые антитела, определяли по двум направлениям Обработку роулыатов проводили с использованием программы «Vector NTI» и баз данных IgBlast и V-base. Ьыло показано, что нуклеотидная последовательность гена, кодируктщего V-сегмент тяжелой цепи анттела Al, на 98% гомологична последовательности V-сегмента III типа иммуноглобулина человека и принадлежит семейству Vh23 тяжелых цепей антител человека Нукчсошдная носледова1елыюсгь юна, кодирующею V-сегменттяжелой цепи anrniejia ВЗ, иа 89% ЮМ0Л01 ична последовательности V-сегмента 111 шна иммупоиюбулина человека (Matsuda F, et al., 1998) и принадлежи! семейству Vh20 тяжелых цепей Анализ нуклеотидных последовательностей легких цепей аптнгел Al и ВЗ показал их принадлежность к V- сегметам leiiOB к-цепей (Hueber С., et al, 1993, Slraubienger, В , et al , 1988)

Таблица 1 Аминокислотные последовательности вариабельных доменов тяжелой (А) и легкой (Б) цепей одноцепочечных антител $А1 и зВЗ. А.

кло> семейство CDR1 CDR2 CDR3

А1 VHIII, 23 SYAMS AISGSGGSTYYAD VKRSLKGTR

ВЗ УН III, 20 DHGMS DVNWNGGHTGYASSVI ESRFGYWFDS

Knot семейство CDR1 CDR2 CDR3

Al Vk RVTIQSRPQSG AASSLQS LQHNIYP

ВЗ Vk RASQSVTSNYLA —SSRAT QKYGDSPLYTF

Кроме того, в этих V-доменах сравнительный анализ последовательностей полученных нами фрагментов с имеющимися в банке данных позволил выделить в них гипервариабельные и каркасные районы, V-, D-, J-сегменты вариабельных доменов тяжелых цепей и V-, J-сегменты вариабельных доменов легких цепей антител А1 и ВЗ (табл.) (Altschul A., et al., 1993).

9. Определение констант аффинности отобранных антител против ФНО-а человека.

Для количественной оценки аффинности полученных одноцепочечных антител sAl и sB3 использовали метод параллельного титрования антител с известной начальной концентрацией, составляющей для антител 0,225 мкг/мл, на антигене в непрямом ТИФА. Расчет констант ассоциации проводили с использованием программы «Origin 7 0». Графики изменения OD приведены на рис. 14.

1.6

1.5 1,4

1.3

1,2

1,1 1,0 0.9

0,8 0.7

0.6 0.5

0,4

0.3 0,2

0.1 ........, ..........

10"9 Ю 10"7

концентрация антитела s83, М

Рис. 12. Определение констант аффинности одноцепочечных антител зА1 и $ВЗ с использованием непрямого иммуноферментного анализа.

Расчетная величина константы аффинности для одноцепочечного антитела sAl составила К«^ =3,9б±0,52х Ю'М"1, константа аффинности для антитела sB3 К.фф =7,32+0,52* 107М 1 (рис. 23, 24). Следует отметить, что, как правило, антитела, отобранные из фагмилных библиотек размером 107 -10® рекомбинантных клонов, обладают высокой специфичностью, но низкой аффинностью порядка 106М"' (Marks et al., 1991; de Kruif et al, 1995; Ламан А Г, и др., 2002). Однако в нашем случае были получены антитела с К,фф около 10* М"' Это может быть объяснено жесткими условиями отбора ркомбинаптных фагмид Исходя из полученных данных, можно сделать вывод, что даже в библиотеке scFvs небольшой представительности присутствуют среднеаффинные антитела, однако для их выделения требуются жесткие методы отбора клонов.

OD.,

выводы

1. Сконструирована натуральная неиммунная комбинаторная библиотека фаговых антител человека, размер которой составил 2*10' независимых клонов. Показано, что эта библиотека обеспечивает получение одноцепочечных антител в растворимой форме.

2. Методом аффинной селекции отобраны б фаговых антител против ФНО-а, 7 антител против

вируса осповакцины и 4 антитела против НВс-антигена. Показано, что 2 из 6 фаговых антител против ФНО-а способны выявлять этот белок в иммуноблоте; все 4 фаговых антитела против НВс-антигена связывают белок с молекулярным весом 24хДа, соответствующий хоровому белку вируса гепатита В; из 7 антител, связывающие вирус осповакцины, 2 выявляют белок с молекулярным весом 27 кДа, а одно антитело - белок с молекулярным весом около $4-56 кДа.

3. Исследована специфичность полученных антител против ФНО-а в реакциях связывания с различными антигенами и показано, что все они не взаимодействовали с вирусом осповакцины, коровым белком вируса гепатита В, бычьим сывороточным альбумином и убиквнтином; пять из отобранных антител не связывали овальбумин. Показана способность пяти антител выявлять 80 нг ФНО-а при разведении фаговых антител до 4*10' БОЕ/мл, что соответствует 1,7*10"14 М одноцепочечных антител.

4. Впервые получены штаммы Е.соН-зА! и Е.соИ-йВЗ, продуцирующие в растворимой форме одно-цепочечные антитела вА1 и вВЗ против ФНО-а с уровнем продукции 270 и 210 мкг на литр культуры, соответственно. Определены константы аффинности полученных антител в реакции связывания с рекомбинантным белком ФНО-а человека, которые составили для антитела зА1 - 3,96±0,52х Ю'М'1, а для антитела вВЗ - 7,32+0,52* 107М '.

5. Определены аминокислотные последовательности одноцепочечных антител зА1 и йВЗ и показано, что У-сегмент тяжелой цепи антитела зА1 относится к семейству У1>23, а V-сегмент тяжелой цепи антитела вВЗ - к семейству У1)20 111 типа тяжелых цепей иммуноглобулинов человека; У-сегменты легких цепей антител зА1 и вВЗ принадлежат к группе к-цепей.

Основные результаты опубликованы в следующих работах:

1 Морозова В.В., Тикунова Н.В., Батанова Т.А., Юн Т.Э., Бовшик Е.И., Жираковская ЕВ., Воронина В.В, Бобко ДИ., Беланов Е.Ф., Ильичев А.А., Сандахчиев Л.С. Мини-антитела человека против ортопоксвирусов. // Вестник РАМН 2004. № 8. С. 22-27.

2 Батанова Т.А., Улитин А.Ь., Морозова В.В., Ламан А.Г., Жираковская Е.В., Воронина В.В., Бровко Ф.А., Тикунова Н.В. Сощание и характеризация наивной комбинаторной библиотеки одноцепочечных антител человека. // Мол. ген. вирусол. и микробиол. 2005. В печати.

3 Батанова Т.А, Тикунова Н.В., и Юн Т.Э. Рекомбипантная фагмидная ДНК pHEN-TAB, содержащая ген одноцепочечного антитела человека, способного связывать фактор некроза опухоли альфа человека; рекомбинантный штамм бактерий Escherichia coli - продуцент одноцепочечного антитела человека scTAB против фактора некроза опухоли альфа человека; рекомбинантное растворимое одноцепочечное антитело человека scTAB против фактора некроза опухоли альфа человека. // Заявка на патент РФ. Справка о приоритете № 2005129664 от 22.09.05

4. Ilyichev А.А., Morozova V.V., Batanova Т.А.,Tikunova N.V. Human ffliniantibodies against orthopoxviruses. // Human Antibodies and Hybndomas, Conference, 2002, Berne, Switzerland. Human Antibodies. 2002. v.l 1, № 1-2. P.23.

5. Ilyichev A.A, Morozova V.V., Tikunova N.V., Belanov E.F., Batanova T.A., et al Characterization of orthopoxvirus antigenic profile using combinatorial phage antibodies. XII ft International Congress of Virology, 2002, Paris, France. Book of abstracts, p. 460.

6. Морозова В В., Батанова Т.А., Беланов Е.Ф, Бормотов Н.И., Ильичев А.А., Тикунова Н.В. Иммунохимические и биологические свойства рекомбинантных моноклональных антител человека против вируса осповакцины. II Научная конференция «Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера» 2002, Новосибирск. С. 253.

7 Batanova Т, Zhirakovskaya Е, Tikunova N Single chain antibodies from naive combinatorial library Л XVU1 International Conference on Antiviral research, 2005. Barcelona, Spain. Antiviral research. 2005, v. 65, № 3, p. 87-88.

8. Батанова Т., Тикунова H. Получение одноцепочечных антител человека против ФНОа человека из наивной комбинаторной фаговой библиотеки. Международный междисциплинарный симпозиум «От экспериментальной биологии к превентивной и интегративной медицине», 2005, Судак, Украина. С. 24.

Подписано в печать 28.10.200S Формат 60x84 1/16 Печ-л. 1

Заказ №195 Бумага офсетная, 80 гр/м1 Тираж 100

Отпечатано на полиграфическом участке издательского отдела Института катализа им. Г.К. Борескова СО РАН 630090, Новосибирск, пр. Академика Лаврентьева, 5

им : 93

РНБ Русский фонд

2006-4 18555