Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Вариабельные домены антител, направленных к интерлейкину-18, интерферону-γ и фактору некроза опухолей, в норме и при рассеянном склерозе

ВАК РФ 03.01.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Вариабельные домены антител, направленных к интерлейкину-18, интерферону-γ и фактору некроза опухолей, в норме и при рассеянном склерозе"

На правах рукописи

ТЮМЕНЦЕВА МАРИНА АЛЕКСЕЕВНА

ВАРИАБЕЛЬНЫЕ ДОМЕНЫ АНТИТЕЛ, НАПРАВЛЕННЫХ К ИНТЕРЛЕЙКИНУ-18, ИНТЕРФЕРОНУ-у И ФАКТОРУ НЕКРОЗА ОПУХОЛЕЙ, В НОРМЕ И ПРИ РАССЕЯННОМ

СКЛЕРОЗЕ

03.01.03 — молекулярная биология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

2 * СЕН 2014

Новосибирск - 2014

005552777

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН

Научный руководитель:

д.б.н., доцент Тикунова Нина Викторовна

Официальные оппоненты:

Таранип Александр Владимирович, д.б.н.

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт молекулярной и клеточной биологии СО РАН, зав. лабораторией

Попова Нэлли Александровна, к.б.н., доцент

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки

Институт цитологии и генетики СО РАН, с.н.с.

Защита состоится «10» октября 2014 г. в «10:00» часов

на заседании диссертационного совета Д 003.045.01 на базе Федерального государственного бюджетного учреждения науки Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН по адресу: 630090, Новосибирск, проспект академика Лаврентьева, 8

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждения науки Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН и на сайте www.niboch.nsc.ru.

Автореферат разослан «¿3» 2014 г.

Ведущая организация:

Федеральное бюджетное учреждение науки Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии "Вектор" Роспотребнадзора

к

Ученый секретарь диссертационного совета к.х.н., доцент

Коваль В.В.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Антитела (иммуноглобулины, 1^') - это группа сывороточных белков, которые участвуют в реакциях адаптивного (приобретенного) иммунного ответа на чужеродные агенты, такие как бактерии, вирусы, грибы, простейшие и другие. Помимо антител, защищающих организм от чужеродных агентов, в организме также присутствуют антитела, взаимодействующие с антигенами собственного организма (аутоантигенами). Подобные антитела, обнаруживаемые в сыворотке крови здоровых людей, называют естественными аутоантителами. Естественные аутоантитела обеспечивают «первую линию» защиты организма от инфекционных агентов, и, по всей видимости, участвуют в поддержании гомеостаза иммунной системы [Е1коп К., СаяаН Р., 2008].

Давно известно, что антицитокиновые аутоантитела содержатся в плазме крови пациентов, страдающих аутоиммунными заболеваниями, и их уровень повышен при различных аутоиммунных заболеваниях. Так, показано, что рассеянный склероз (РС), хроническое демиелинизирующее заболевание центральной нервной системы (ЦНС), сопровождается нарушениями уровня различных цитокинов и антител против некоторых из них [^Х^апаЬе М. е! а1., 2010]. Роль таких антицитокиновых аутоантител в патогенезе РС до сих пор не ясна, однако известно о существенном вкладе в течение РС аутоантител, направленных к другим антигенам [ЯетсП М. й а1., 2006; ЬаПуе Р.Н., 2008; Веуег N.11. й а!., 2012; Ьеуш М.С. е! а1., 2013]. В связи с этим, изучение особенностей антицитокиновых антител при РС может помочь пониманию их роли в иммунопатогенезе этого заболевания.

Один из подходов к изучению репертуаров антител основан на использовании комбинаторных фаговых библиотек - популяций бактериофагов, каждый из которых экспонирует на своей поверхности уникальный антигенсвязывающий фрагмент антитела. В ходе процедуры аффинной селекции с использованием целевого антигена можно отбирать индивидуальные фаговые антитела против этого антигена. Полагают, что комбинаторная фаговая библиотека размером ~ 108 независимых клонов представляет популяцию антител, единовременно присутствующих в организме человека [Сау11опёо .Г.У., Ьашск 1.\У., 2000; Тикунова Н.В., Морозова В.В., 2009]. Анализ репертуаров генов, кодирующих антитела, отобранные из таких библиотек, позволяет оценить их структурные особенности. Ранее были сконструированы представительные натуральные аутоиммунная и неиммунная комбинаторные библиотеки антител человека (МЭ и N библиотеки) на основе мРНК, выделенной из периферических лимфоцитов больных РС [ОаЫЬоу АЛЗ. с1 а1., 2011] и здоровых доноров [Батанова Т.А. и соавт., 2006].

Цель данной работы заключалась в изучении особенностей популяций антител против интерлейкина (ИЛ)-18, интерферона (ИФН)-у и фатора некроза опухолей (ФИО), отобранных из МБ и N библиотек, на основе сравнительного анализа генных сегментов, кодирующих эти антитела.

В соответствии с поставленной целью необходимо было решить следующие задачи:

• провести сравнение уровня антител против ИЛ-18 в сыворотках крови больных РС и здоровых доноров;

• провести сравнительный анализ репертуаров генных сегментов, кодирующих антитела, содержащиеся в МБ и N библиотеках;

• отобрать из МБ и N библиотек уникальные одноцепочечные антитела, направленные к ИЛ-18, ИФН-уиФНО;

• провести сравнительный анализ репертуаров генных сегментов, кодирующих антитела к ИЛ-18, ИФН-у и ФНО, отобранные из МБ и N библиотек.

Научная новизиа работы. В настоящей работе впервые показано, что у больных РС уровень аутоантител против ИЛ-18 в сыворотке крови ниже, чем у здоровых доноров. Определены генные сегменты, кодирующие вариабельные домены антител против ИЛ-18, ИФН-у и ФНО, отобранных из МБ и N библиотек, сконструированных на основе мРНК лимфоцитов периферической крови больных РС и здоровых доноров соответственно. Проведен сравнительный анализ репертуаров этих генных сегментов и впервые показано наличие в популяциях антител против ИЛ-18 и ИФН-у, отобранных из МБ библиотеки, антител, содержащих Уцб домен, не встречающихся в норме. Обнаружено, что соматический гипермутагенез вноси больший вклад в образование антицитокиновых антител из МБ библиотеки по сравнению с таковыми из N библиотеки. Показано, что гипервариабельные участки СРЮ тяжелых и легких цепей антител против ИЛ-18, ИФН-у и ФНО из МЭ библиотеки в среднем длиннее по сравнению с СОЯЗ участками антител из N библиотеки.

Теоретическая и практическая значимость работы. В рамках работы из МЯ и N библиотек получены панели антител человека, направленных к провоспалительным цитокинам - ИЛ-18, ИФН-у и ФНО. Определены нуклеотидные последовательности 137 уникальных генов, кодирующих вариабельные домены тяжелых цепей, и 132 уникальных генов, кодирующих вариабельные домены легких цепей этих антицитокиновых антител. Полученные нуклеотидные последовательности депонированы в международной базе данных ОепВапк ЛСВ1 и являются важным дополнением к существующим в этой базе последовательностям, кодирующим антитела, циркулирующие в норме и при патологии, что может способствовать изучению роли аутоантител в патогенезе аутоиммунных заболеваний.

Полученные в ходе данной работы вариабельные домены тяжелых и легких цепей иммуноглобулинов человека, специфичные к ИЛ-18, ИФН-у и ФНО, могут быть использованы для создания диагностических тест-систем и конструирования полноразмерных антител человека с целью разработки на их основе иммунотерапевтических препаратов. Так, на основе отобранных одноцепочечных антител против ФНО были созданы репортерные молекулы, способные выявлять низкокопийные белки (патент РФ № 2513686 от 20.04.2014).

Положения, выносимые на защиту. Уровень антител против ИЛ-18 в сыворотке крови больных РС ниже, чем у здоровых доноров. Сегментный состав антител, присутствующих в МБ и N библиотеках, отличается: в составе антител из МБ библиотеки, в том числе антител, направленных против ИЛ-18, ИФН-у и ФНО, чаще присутствуют вариабельные домены, кодируемые проксимальными генными сегментами (Унб-1, ТУ1-21 и Ук4-1). Соматический гипермутагенез вносит больший вклад в образование антицитокиновых антител из МБ библиотеки. Гипервариабельные участки СПКЗ([ и СРКЗь антител против ИЛ-18, ИФН-у и ФНО из МЭ библиотеки длиннее по сравнению с таковыми антител из N библиотеки.

Апробация работы. По материалам диссертации опубликовано 5 статей в журналах из списка ВАК. Материалы диссертации были представлены на Российских конференциях с международным участием: ХЬУ и Х1ЛЛ Международные научные студенческие конференции «Студент и научно-технический прогресс» (Новосибирск, Россия, 2007, 2008); Научная конференция «Медицинская геномика и протеомика» (Новосибирск, Россия, 2009); XXII зимняя молодежная научная школа «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, Россия, 2010); 14-я и 15-я Международные Путинские школы-конференции молодых ученых «Биология наука 21 века» (Пущино, Россия, 2010, 2011); II Международна научная конференция «Физико-химическая биология» (Новосибирск, Россия, 2011); V Российский симпозиум «Белки и пептиды» (Петрозаводск, Россия, 2011); Международные конференции «Фундаментальные науки - медицине»

(Новосибирск, Россия, 2012, 2013); I Конгресс Российского комитета исследователей рассеянного склероза с международным участием «Демиелинизирующие заболевания и нейроинфекции, вопросы диагностики и терапии» (Казань, Россия, 2013).

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов работы, обсуждения полученных результатов, выводов и списка литературы; содержит три приложения. Работа изложена на 223 страницах текста, содержит 37 рисунков и 13 таблиц. Список литературы состоит из 279 ссылок.

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В данной работе были использованы методы фагового дисплея и другие молекулярно-биологические методы, такие как иммуноферментный анализ, Вестерн-блот анализ, выделение и очистка фагмидной ДНК, полимеразная цепная реакция, секвенирование, трансформация клеток Е. coli, экспрессия одноцепочечных антител в клетках Е. coli, очистка препаратов одноцепочечных антител методом металл-хелатной хроматографии. Кроме того, был использован биоинформационный подход для анализа нуклеотидных последовательностей, кодирующих вариабельные домены антител, а также для анализа аминокислотных последовательностей вариабельных доменов антител. Все полученные данные были обработаны статистически.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ 1.1. Уровень антител против ИЛ-18 и концентрация ИЛ-18 в сыворотках крови больных PC и здоровых доноров

На первом этапе работы мы сравнили уровень антител против ИЛ-18 в сыворотках крови больных PC и здоровых доноров и исследовали его зависимость от концентрации ИЛ-18 в крови. Антитела против ИЛ-18 были обнаружены в крови и больных PC, и здоровых доноров. Средний уровень антител против ИЛ-18 в сыворотках крови больных PC составил 0,7 ±0,04 o.e. и был достоверно ниже (р < 0,05), чем у здоровых доноров - 1,0 ±0,1 o.e. (рисунок 1).

Среди больных PC были пациенты, находящиеся на разных стадиях заболевания, поэтому для проведения корреляционного анализа образцы от больных были разбиты на две группы: (i) - образцы от пациентов, находящихся в стадии ремиссии (ремРС), и (ii) - от пациентов в стадии рецидива заболевания (рецРС). В зависимости от принимаемых препаратов из группы (i) была выделена подгруппа образцов от больных, получающих ИФН-Р (ремРС/ИФН-ß), а группа (ii) была разбита на подгруппы образцов от больных, получающих ИФН-ß (рецРС/ИФН-ß) и не получающих ИФН-ß (рецРС/без лечения). Проведенный анализ показал, что уровень антител против ИЛ-18 в подгруппах ремРС/ИФН-ß, рецРС/ИФН-ß и рецРС/без лечения составил 0,7 ±0,1 o.e., 0,7 ±0,1 o.e. и 0,6 ±0,1 o.e., соответственно, и статистически значимо не отличался. Однако, уровень антител против ИЛ-18 во всех этих подгруппах был достоверно ниже (р<0,05), чем у здоровых доноров (рисунок 1).

Средняя концентрация ИЛ-18 в сыворотках крови больных PC составила 243,8 ± 29,3 пг/мл и была достоверно выше (р < 0,05), чем у здоровых доноров -102,0 ± 12,5 пг/мл (рисунок 1). Концентрации ИЛ-18 в сыворотках крови в подгруппах ремРС/ИФН-ß, рецРС/ИФН-ß и рецРС/без лечения составили 272,6 ± 66,9 пг/мл, 252,6 ± 52,1 пг/мл и 190,9 ± 66,1 пг/мл, соответственно, и статистически значимо не отличались. Однако, концентрации ИЛ-18 в подгруппах ремРС/ИФН-ß и рецРС/ИФН-ß были достоверно выше (р < 0,05), чем у здоровых доноров (рисунок 1).

Рисунок 1 - Уровень антител против ИЛ-18 (А) и концентрация ИЛ-18 (Б) в сыворотке крови у больных PC и здоровых доноров (ЗД).

Горизонтальные линии соответствуют средним значениям измеряемых параметров, звездочками обозначены значения р-values (* р< 0,05)

Для того, чтобы оценить возможную корреляцию между уровнем антител против ИЛ-18 и концентрацией ИЛ-18, образцы от здоровых доноров и образцы из подгрупп больных PC были разделены по концентрации ИЛ-18 на «< средней» и «> средней». Была обнаружена тенденция повышения уровня антител против ИЛ-18 при повышении концентрации ИЛ-18 в группе «> средней» здоровых доноров (R = 0,533, р< 0,1) и понижения уровня антител против ИЛ-18 при повышении концентрации ИЛ-18 в группе «> средней» для подгруппы ремРС/ИФН-ß (R = -0,995,p < 0,1).

Учитывая тот факт, что ИЛ-18 играет важную, роль в хронизации воспаления, ассоциированного со старением [Dinarello С.А., 2006], дополнительно была проанализирована взаимосвязь между концентрацией ИЛ-18 и возрастом всех больных PC и здоровых доноров. Была обнаружена статистически значимая положительная корреляция между концентрацией ИЛ-18 и возрастом у здоровых доноров (R = 0,740; р < 0,01), но не у больных PC (как ремРС, так и рецРС).

Таким образом, уровень антител против ИЛ-18 в сыворотке крови у больных PC оказался ниже, чем у здоровых, в отличие от антител против ИФН-у и ФНО, при этом концентрации ИЛ-18, ИФН-у и ФНО у больных PC выше, чем у здоровых [Elkarim R.A. et al., 1998; Mäher S.G. et aL, 2007; Anderson G., Rodríguez M., 2011; Caminero A. et al., 2011]. Возможно, пониженный уровень антител против ИЛ-18 у больных PC объясняется тем, что часть антител находится в связанном состоянии, частично купируя острое воспаление в ЦНС, вызванное повышением концентрации ИЛ-18, в то время как у здоровых антитела против ИЛ-18 циркулируют преимущественно в крови.

1.2. Разнообразие генных сегментов, кодирующих вариабельные домены фаговых антител из MS и N комбинаторных библиотек

На следующем этапе работы было оценено исходное разнообразие популяций антител в MS и N библиотеках. Для этого был проведен ПЦР-скрининг отдельных колоний, который показал, что в MS библиотеке 94% проанализированных клонов содержали вставки ожидаемого размера (~ 900 п.н.), в N библиотеке 95% проанализированных клонов содержали вставки ожидаемого размера. Затем было отсеквенировано по 100 генов, кодирующих антитела, и проведен независимый анализ генных сегментов, кодирующих Vh и Vl домены.

Ун сегменты. Всего для кодирования Vh доменов из MS и N библиотек использовалось соответственно шесть и пять семейств генов из семи существующих в геноме человека, при этом привлекались соответственно 32 и 30 функциональных генных сегментов из 51 существующего (таблица 1). При сравнении распределения Vh семейств в обеих библиотеках обнаружена статистически значимая (р<0,01) перепредставленность Vh4 и Vh6 семейств в

2.В

® 2.4

о 2.0

2 X 1.8

ю о 1.5

Tf

О 0,4

О

0,0

ЗД

ИФН-В ИФН-С пвчания

ремРС рецРС

Li.

ЗД

ИФН-8 ИФН-К лечения ремРС рецРС

МБ библиотеке, а также статистически значимая (р < 0,05) перепредставленность Ун3 семейства в N библиотеке (рисунок 2).

Таблица 1 - Разнообразие Ун генных сегментов, кодирующих вариабельные домены фаговых антител из МБ и N комбинаторных библиотек

Мв библиотека N библиотека

% доменов И* /IV* % доменов

Ун1 25% 1 по 34% 7/10

Ун2 -

Ун3 36% 12/23 53% 17/23

Ун4 22% 9/11 4% 4/ 11

Ун5 6% 2/2 8% 1/2

Ун6 Т/о 1 /1 - -

Ун7 4% 1 / 1 1% 1 /1

К* - количество функциональных генных сегментов, представленных в библиотеке N1,,** - количество функциональных генных сегментов, представленных в геноме

2 3 4 5 6 7 семейство

МЭ N

библиотека библиотека

я О

Ь 2

о ф

£ '

СО (Ц

3" а

60% 40% 20% й 0%

1

2 3 Р семейство

5 6

40%

* 60% и

г I 18 « | 20% I® 0%

3 4 ^сегмент

5 6

Рисунок 2 - Частоты встречаемости Ун (А), О (В) и (Г) семейств, кодирующих Ун домены антител из МБ (темные столбцы) и N библиотек (серые столбцы), в сравнении с распределением генных сегментов зародышевых линий (белые столбцы). Филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей, кодирующих Ун домены антител из МЭ и N библиотек (Б). Звездочками обозначены значения р-уаЫея (* р < 0,05, ** р < 0,01)

Ут_ сегменты. Анализ представленности Уь доменов из МЭ и N библиотек показал, что для их кодирования привлекались соответственно 12 и 16 генных сегментов из 35 Ук функциональных сегментов, а также 15 и 3 из 30 УХ функциональных сегментов, представленных в геноме (таблица 2). При сравнении распределения Уь семейств, кодирующих антитела из обеих библиотек, обнаружена статистически значимая (р < 0,05) перепредставленность генных сегментов Ук1 семейства в репертуаре антител из N библиотеки (рисунок 3).

Р и J сегменты. СОЮ участки Ун доменов антител из МЗ и N библиотек кодировались соответственно 22 и 24 генными сегментами из 27 функциональных сегментов, представленных в геноме (таблица 3). При сравнении встречаемости Э сегментов, кодирующих СРЕЗ участки Ун доменов антител из обеих библиотек, обнаружена статистически значимая (р < 0,05) перепредставленность генного сегмента из семейства в репертуаре антител из М8 библиотеки (рисунок 2).

Все шесть существующих функциональных /н сегментов были обнаружены в популяциях антител из МЭ и N библиотек. При сравнении встречаемости сегментов, кодирующих СОЯЗ участки Ун доменов антител из обеих библиотек, обнаружена статистически значимая (р < 0,05) перепредставленность генных сегментов ^1, Зн2 и .Тнб в репертуаре антител из МЭ библиотеки, а также статистически значимая (р<0,01) перепредставленность генного сегмента 1ц4 в репертуаре антител из N библиотеки (рисунок 2).

Таблица 2 - Разнообразие Уь генных сегментов, кодирующих вариабельные домены фаговых антител из МЭ и N комбинаторных библиотек

МВ библиотека N библиотека

Уь семейство - % доменов Ы* / Ир** % доменов

Каппа (к) домены

Ук1 11% 5/19 52% 9/19

Ук2 5% 3/9 8% 2/9

УкЗ 10% 3/7 16% 4/7

Ук4 5% ] /1 7% 1 / 1

Ук5

Лямбда (X) домены

УМ 15% 3/5 5% 1/5

УХ2 7% 3/5 5% 1/5

УХЗ 30% 3/8 7% 1/8

УА4 4% 1/3 - -

УХ5 - - - -

\Х6 9% 1 /1 - -

2% 2/2 - -

УХ8 1% 1 /1 - -

УЯ.9 1% 1 / 1 - -

Ы* - количество функциональных генных сегментов, представленных в библиотеке - количество функциональных генных сегментов, представленных в геноме

60% 40% 20% 0%

2 3 4 5 6 Карра семейство

з 60%

Р 1 «%

о Ф <0 о г " £20%

0%

2 3 4 5 6 Г 8 I атЬ(4а семейство

10

60%

<Н | 40% о ©

60%

0%

м .¡кг лз

о т га оз х О.

40%

20%

0%

М1 илг .мз илб ла

Рисунок 3 - Частоты встречаемости Ук (А), \Х (Б), 1к (В) и IX (Г) семейств, участвующих в кодировании V,. доменов антител исходных М8 (темные столбцы) и N библиотек (серые столбцы), в сравнении с распределением генных сегментов зародышевых линий (белые столбцы). Звездочками обозначены значения />-уа1иез (*р < 0,05, ** р < 0,01)

Таблица 3 - Разнообразие V генных сегментов, кодирующих СОЯЗ участки Ун доменов фаговых антител из МБ и N комбинаторных библиотек

М5 библиотека N библиотека

% доменов м* /КГР** % доменов 14* /1МР**

14% 4/5 19% 5/5

т 19% 4/4 18% 4/4

эз 31% 5/5 27% 5/5

В4 9% 2/4 12% 3/4

Г>5 9% 3/4 6% 3/4

т 14% 3/4 18% 4/4

О! 4% 1 /1 - -

Т>1* - количество функциональных генных сегментов, представленных в библиотеке 1ЧР** - количество функциональных генных сегментов, представленных в геноме

Все пять существующих функциональных 1к сегментов были обнаружены в репертуарах антител из обеих библиотек. Помимо 1к сегментов, в репертуаре антител из МЭ и N библиотек обнаружены соответственно 1X1-3, Д.6-7 и Ш, 1X3 сегменты. При сравнении встречаемости 1ь сегментов, кодирующих СОЯЗ участки Уь доменов антител из обеих библиотек, обнаружена статистически значимая перепредставленность генных сегментов 1кЗ (р <0,05) и 1к5 (р < 0,01) в репертуаре антител из МЗ библиотеки, а также статистически значимая (р < 0,05) перепредставленность генных сегментов 1к1 и 1к4 в репертуаре антител из N библиотеки (рисунок 3).

Таким образом, только в МЭ библиотеке присутствуют антитела, кодируемые проксимальными генными сегментами Унб и Э7, в отличие от N библиотеки. Глубокое секвенирование этой же МЭ библиотеки подтвердило наличие в ней антител, кодируемых

генным сегментом Унб семейства, в том же процентном соотношении ¡Ъотакш У.А. & а1., 2014]. Более того, соотношение к- и >,-цепей в антителах из МЭ библиотеки составило 1 : 2, в то время как у здоровых людей это отношение составляет приблизительно 2 : 1 [ТОепеув V. е1 а1., 200!]. Эти данные предполагают возникновение определенных изменений в процессе образования функциональных иммуноглобулиновых генов при РС.

1.3. Отбор фаговых антител, направленных к ИЛ-18, ИФН-у и ФИО, из и N

библиотек

Для получения панелей антицитокиновых антител было проведено три раунда аффинной селекции Мв и N библиотек на целевых антигенов (ИЛ-18, ИФН-у и ФИО). Поскольку три раунда не обеспечили обогащение МЭ библиотеки специфическими антителами к ИФР1-у, были проведены два дополнительных раунда обогащения МЭ и N библиотек антителами к этому антигену.

Для отбора фаговых антител, направленных к цитокинам (ИЛ-18, ИФН-у и ФНО), были протестированы сотни отдельных клонов из обогащенных популяций МБ и N библиотек (таблица 4). Супернатанты, полученные при культивировании каждого клона и содержащие фаговые антитела, исследовали методом ИФА по их связыванию с целевыми антигенами (ИЛ-18, ИФН-у и ФНО). Связывание с антигенами бактериофага-помощника М13К07, не экспонирующего на своей поверхности антитела, служило контролем неспецифического связывания, а связывание с 3% раствором БСА в ФСБР - отрицательным контролем. Критерием отбора положительных клонов служило превышение сигнала оптической плотности в ИФА в 3-5 раз над сигналом, который наблюдался в контроле неспецифического связывания, и отсутствие связывания с блокирующим агентом и пластиком иммунологического планшета (рисунок 4). В результате скринингов были получены панели, содержащие от 65 до 351 клона, которые продуцировали фаговые антитела, способные связывать ИЛ-18, ИФН-у или ФНО (таблица 4).

Таблица 4 - Разнообразие антител против ИЛ-18, ИФН-у и ФНО, отобранных из М8 и N библиотек

Количество

Антиген Количество портестированных клонов положительных клонов(% от количества протестированных клонов) Количество отсеквенированных генов, кодирующих антитела Количество уникальных антител

МЭ библиотека

ИЛ-18 235 101 (42,6%) 96 13

ИФН-у 355 100 (28,2%) 78 56

ФНО 116 65 (48,3%) 33 33

N библиотека

ИЛ-18 300 281 (93,6%) 143 7

ИФН-у 402 351 (87,3%) 101 12

ФНО 209 105 (50,2%) 34 34

Секвенирование генов, кодирующих вариабельные домены антител, продуцируемых отобранными клонами, позволило выявить от 7 до 56 уникальных антител (таблица 4). Для исследования способности уникальных фаговых антител связывать линейные и/или конформационные эпитопы проводили Вестерн-блот анализ рекомбинантных цитокинов с использованием очищенных фаговых антител (рисунок 5).

3,5 3 2.5 2 1.5 1

0,5 О

г . . в 1

!

1 !

1 □

П I 1 м Н

1. . 1 4 УШ- I IX 1 Г \ 1

1«. I Л И ШИ ■ 1. 1. 1. и л и Ж 1 1ь! П 1 И ] 1...

4

3,5 3

I 2'5 ? 2

0,5 0

ь1е,»1

п 1

1ьк |1 В

АН 1 Лт гит 1аиь 1Й1 : . иъ. ]Ш.Ь. 1 .....Н1 1

2.5 2 1,5 1

0.5 0

МЭ библиотека

N библиотека

Рисунок 4 - Примеры скрининга независимых клонов, продуцирующих фаговые антитела, после раундов аффинной селекции, по способности связывать ИЛ-18 (А), ИФН-у (Б) и ФИО (В)

2 3 4 5 878 9101112

66.2

45

35 ИЙМЩЧ

25 —>

18.4 ¡¡ИИ

14.4

«— ИЛ-18 ; , ' <—ФНО

Рисунок 5 - Примеры Вестерн-блот анализа ИЛ-18 (2-6) и ФНО (7-12) с использованием очищенных фаговых антител. Дорожки: 1 — маркер молекулярных масс (кДа); 2 - М13К07; 3 -1ПО; 4 -311Е; 5 -413Е; 6 -514Е; 7 - М13К07; 8 -антитело 1,9- антитело 3; 10 - 4М; 11 - антитело 15; 12 - антитело 24*

1.4. Разнообразие генных сегментов, кодирующих вариабельные домены анти-ИЛ-18 антител, отобранных из Мв и N библиотек

Ун сегменты. Всего для кодирования Ун доменов анти-ИЛ-18 антител из МЭ и N библиотек использовалось по три семейства генов из семи существующих в геноме человека (рисунок 6). При сравнении распределения Ун семейств, привлекающихся для кодирования анти-ИЛ-18 антител, отобранных из обеих библиотек, было показано, что антитела, кодируемые генным сегментом Унб семейства, встречаются только в М8-панели, и эта перепредставленность является статистически значимой (р < 0,05). Антитела, кодируемые генными сегментами УН1 семейства, обнаружены только в 1Ч-панели анти-ИЛ-18 антител (рисунок 6).

60%

? I 40% о ф

« О) 3" о.

в

то

о а>

й" ? &

20% 0%

80% 60% 40% 20% 0%

семейство

2 3 4 5 6 О семейство

МиЗ

У„5

1 Ун6

МБ библиотека

60%

я Э £ 2 О а:

(а

40% 20% 0%

У„ 3

Ун5

■ УИ1

N

библиотека

3 4 5 ^сегмент

Рисунок 6 - Частоты встречаемости Ун (А), Б (В) и (Г) семейств, кодирующих Ун домены анти-ИЛ-18 антител из МБ-панели (темные столбцы) и из К-панели (серые столбцы), в сравнении с распределением генных сегментов зародышевых линий (белые столбцы). Филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей, кодирующих Ун домены анти-ИЛ-18 антител, отобранных из М8 и N библиотек (Б). Звездочками обозначены значения р-уаЫеэ (* р < 0,05)

Уг сегменты. Всего для кодирования У[. доменов анти-ИЛ-18 антител из МБ и N библиотек использовалось соответственно три и два семейства генов из всех существующих Ук и УХ семейств (рисунок 7). При сравнении распределения VI, семейств, кодирующих анти-ИЛ-18 антитела, отобранные из обеих библиотек, было показано, что фаговые антитела, кодируемые генными сегментами из семейства Ук2, встречаются только в Мв-панели (рисунок 7).

Р и J сегменты. При сравнении встречаемости Э сегментов, кодирующих С0113 участки анти-ИЛ-18 антител, отобранных из обеих библиотек, было показано, что антитела, кодируемые генными сегментами 01, Х)4, 05 и 1)1 семейств, встречаются только в МЭ-панели. Также обнаружена статистически значимая {р < 0,05) перепредставленность генных сегментов из семейства ОЗ в >1-панели анти-ИЛ-18 антител (рисунок 6).

3 4 5 6 Карра семейство

О I.....■::....¿1......; .::..,<:...

23456789 10 [.атЬйа семейство

В

60%

0%

^ 100%

!-

о 80%

ГО £ о 3 ф 60%

!- го

о (б ~ а 40%

x а.

V-о 20%

т

0%

Лс1 ¿к2 .)кЗ Jк4 ак5

ЛЛ1 М2 ЛЛЗ .Мб М

Рисунок 7 - Частоты встречаемости \'к (А), УХ (Б), (В) и ЗХ (Г) семейств, участвующих в кодировании VL доменов анти-ИЛ-18 антител из МЭ-панели (темные столбцы) и из М-панеяи (серые столбцы), в сравнении с распределением генных сегментов зародышевых линий (белые столбцы)

При сравнении встречаемости 1ц сегментов, кодирующих анти-ИЛ-18 антитела, отобранные из обеих библиотек, было показано, что антитела, кодируемые генным сегментом ,1н5, встречаются только в М8-панеяи, а сегментом 1ц2 - только в Ы-панели. Кроме того, сегмент ,1нЗ статистически чаще (р < 0,05) кодирует анти-ИЛ-18 антитела из М-панели (рисунок 6).

При сравнении распределения семейств, кодирующих анти-ИЛ-18 антитела, отобранные из обеих библиотек, было показано, что антитела, кодируемые генным сегментом ,1к5, встречаются только в М8-панели, а - только в М-панели (рисунок 7).

Таким образом, обнаружены существенные различия в составе генных сегментов, кодирующих вариабельные домены антител против ИЛ-18 из МБ и N библиотек. Вариабельные домены, кодируемые проксимальными генными сегментами Унб и V)!, а также генными сегментами Ш, П4, Б5, Т>1, 1ц5, Ук2 и 1к5, присутствуют только в составе антител против ИЛ-18 из МБ библиотеки, а вариабельные домены, кодируемые Ун1, .1н2 и ,1к4 - только в составе антител из N библиотеки. Антитела против ИЛ-18, кодируемые генным сегментов Унб, достоверно перепредставлены в МЭ библиотеке, а генными сегментами БЗ и ,1нЗ - в N библиотеке.

1.5. Разнообразие генных сегментов, кодирующих вариабельные домены анти-ИФН-у антител, отобранных из М8 и N библиотек

Ун сегменты. Всего для кодирования Ун доменов анти-ИФН-у антител из М8 и N библиотек использовалось соответственно шесть и два семейства генов из семи существующих в геноме человека (рисунок 8). При сравнении распределения Ун семейств, привлекающихся для кодирования анти-ИФН-у антител, отобранных из обеих библиотек, было показано, что антитела, кодируемые генными сегментами Уц4, Уц5, Унб и Ун7 семейств, встречаются только в МБ-панели (рисунок 8).

Уг_ сегменты. Всего для кодирования Уь доменов анти-ИФН-у антител из МБ и N библиотек использовалось соответственно девять и четыре семейства генов из всех существующих Ук и УХ семейств (рисунок 9). При сравнении распределения Уь семейств, которые кодируют анти-ИФН-у антитела, отобранные из обеих библиотек, было показано, что антитела, кодируемые генными сегментами Ук5, УХ1, УХ2, УХ4 и УХ6 семейств, встречаются только в М8-панели (рисунок 9).

Я О О 0)

ё" « ф

т ?

о ш

100% 80% 60% 40% 20%

1 2 3

за . л » 8 о 4 5 6 Ун семейство

У„3

-......| V

С1Л/ У„1

У„6 ун4

мэ

библиотека

Ун3

К- у„1

N

библиотека

В

о га о Ь 5

Р 41 ¡¡2

я 100% 80% 60% 40% 20% 0%

11

I.

2 3 4 6 6 О семейство

и

г| £ Й

Й " га <1>

зг а.

100% 80% 60% 40% 20% 0%

Г 1

I В

3

ин сегмент

ш 5

Рисунок 8 - Частоты встречаемости Ун (А), Э (В) и 1н (Г) семейств, кодирующих Ун домены анти-ИФН-у антител из МБ-панели (темные столбцы) и из ]Ч-панели (серые столбцы), в сравнении с распределением генных сегментов зародышевых линий (белые столбцы). Филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей, кодирующих Ун домены анти-ИФН-у антител, отобранных из Мв и N библиотек (Б). Звездочками обозначены значения р-уаЩев (* р < 0,05, ** р < 0,01)

Р и J сегменты. При сравнен™ встречаемости О сегментов, кодирующих СОЯЗ участки анти-ИФН-у антител, отобранных из обеих библиотек, было показано, что антитела, кодируемые генными сегментами В4, 05 и 07 семейств, встречаются только в МЭ-панели. Обнаружена статистически значимая (р < 0,05) перепредставленность генных сегментов О! семейства в Ы-панели анти-ИФН-у антител (рисунок 8).

При сравнении встречаемости 1н сегментов, кодирующих анти-ИФН-у антитела, отобранные из обеих библиотек, было показано, что антитела, кодируемые генными сегментами 1н6, встречаются только в Мв-панели, а 1н1 - только в 1^-панели. Обнаружена статистически значимая перепредставленность генного сегмента 1н6 (р < 0,01) в МБ-панели анти-ИФН-у антител и генных сегментов 1ц1 и 1цЗ(р < 0,05) - в Ы-панели (рисунок 8).

При сравнении распределения .[г. семейств, кодирующих анти-ИФН-у антитела, отобранные из обеих библиотек, было показано, что ангитела, кодируемые генными сегментами 1к5, 1X1, 1X3 и 1X7 встречаются только в Мв-панели. Обнаружена статистически значимая (р < 0,05) перепредставленность генного сегмента 1к5 в МБ-панели анти-ИФН-у антител, а также статистически значимая (р < 0,05) перепредставленность генного сегмента 1к4 в 1М-панели анти-ИФН-у антител (рисунок 9).

s 100%

н

<0 S о о г <в 80% I 60%

ь к

о га «а 40%

Т а.

о 20%

т 0%

1 2 3 4 5 6 7 Kappa семейство

123456789 10 Lambda семейство

В

S; 100%

t~

(И £ О О Е 80% ЙЛО/

О Ф О и /О

(- «о

о я У ф 40%

■у а.

ь о 20%

ш 0%

К!

I II

3j 100%

1-

5 Ц О S о 80% 60%

го

и ГС У (11 40%

т с.

ь о 20%

ш 0%

I,

JK1 JK2 JK3 JK4 JK5

JA1 JA2 JA3 JA6 JA7

Рисунок 9 - Частоты встречаемости Ук (А), V). (Б), 1к (В) и Я (Г) семейств, участвующих в кодировании Уь доменов анти-ИФН-у антител из МЭ-панели (темные столбцы) и из Ы-панели (серые столбцы), в сравнении с распределением генных сегментов зародышевых линий (белые столбцы). Звездочками обозначены значения р-уаЬеэ (* < 0,05)

Таким образом, обнаружены существенные различия в составе генных сегментов, кодирующих вариабельные домены антител против ИФН-у из и N библиотек. Проксимальные генные сегменты Унб и а также сегменты Ун4, Ун5, Ун7, И5, Jн6, Ук5, УХ1, УХ2, УХ4, УХ6, .Гк5, Я1, АЗ и А7 кодируют только антитела против ИФН-у из М8 библиотеки, а сегмент ,1н1 - только из N библиотеки. Антитела против ИФН-у, кодируемые генными сегментами и 1к5, достоверно перепредставлены в МБ библиотеке, а генными сегментами Б1, 1ц1,1нЗ, и 1к 4 - в N библиотеке.

1.6. Разнообразие генных сегментов, кодирующих вариабельные домены анти-ФНО антител, отобранных из М8 и N библиотек

Ун сегменты. Всего для кодирования Ун доменов анти-ФНО антител из МЭ и N библиотек использовалось по три семейства генов из семи существующих в геноме человека (рисунок 10). При сравнении распределения Ун семейств, привлекающихся для кодирования анти-ФНО антител, отобранных из обеих библиотек, было показано, что антитела, кодируемые генными сегментами Ун4 семейства, встречаются только в Мв-панели, а сегментами Ун5 семейства - только в "Ы-панели (рисунок 10).

Уг сегменты. Всего для кодирования VI. доменов анти-ИФН-у антител из МЭ и N библиотек использовалось соответственно девять и четыре семейства генов из всех существующих Ук и УХ семейств (рисунок 11). При сравнении распределения Уь семейств, кодирующих анти-ФНО антитела, отобранные из обеих библиотек, было показано, что антитела, кодируемые генными сегментами Ук4, Ук5, УХ1, УХ6 и УХ7 семейств, встречаются только в УК-панели. Обнаружена статистически значимая (р < 0,05) перепредставленность генных сегментов Ук4 семейства в МЭ-панели анти-ФНО антител (рисунок 11).

« У

га о X а. н

100% 80% 60% 40% 20% 0%

В

о П5 О

и 2 о о

11 X & I-о ш

100% 80% 60% 40% 20% 0%

2 3 4 5 Ун семейство

1 2

; ш 4

I

5 6 7

унз

; ч г

• Ун4

5

О Ф е га 2 х га т

х а (о

4

т

библиотека

100% 80%

60%

40%

20% ,.. 0% ; : ® -1 2

Мн3

! Ч*

N

библиотека

I

I

О семейство

4 5 6

сегмент

Рисунок 10 - Частоты встречаемости Ун (А), Э (В) и 1п (Г) семейств, кодирующих Ун домены анти-ФНО антител из Мв-панели (темные столбцы) и из 1Ч-панели (серые столбцы), в сравнении с распределением генных сегментов зародышевых линий (белые столбцы). Филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей, кодирующих Ун домены анти-ФНО антител, отобранных из МБ и N библиотек (Б). Звездочками обозначены значения />-уа1иеб (*р< 0,01)

Р и J сегменты. При сравнении встречаемости О сегментов, кодирующих СОЮ участки анти-ФНО антител, отобранных из обеих библиотек, было показано, что антитела, кодируемые генными сегментами семейства 05, встречаются только в Ы-панели (рисунок 10).

При сравнении встречаемости 1н сегментов, кодирующих анти-ФНО антитела, отобранные из обеих библиотек, было показано, что антитела, кодируемые генными сегментами 1н1, встречаются только в 1Ч-панели. Обнаружена статистически значимая перепредставленность генного сегмента 1Н6 (р < 0,01) в М8-панели анти-ФНО антител (рисунок 10).

При сравнении распределения семейств, кодирующих анти-ФНО антитела, отобранные из обеих библиотек, было показано, что антитела, кодируемые генными сегментами 1к5, 1X3 и 1X7 встречаются только в МБ-панели, а 1к4 - только в К-панели. Обнаружена статистически значимая перепредставленность генного сегмента 1к5 (р < 0,01) в МЭ-панели анти-ФНО антител, а также статистически значимая (р < 0,05) перепредставленность генных сегментов 1к1 и 1к4 в Ы-панели анти-ФНО антител (рисунок 11).

tu ~

H 5

О ®

I- Ш О У га a

T a

100% : ; 80% 60% 40%

в

0%

100% ; 80%

ш

S

H- та

О У

ТО <J>

X CL

I I 111

12 3 4

. l.. 5

6 7

60%

h 20%

II

JK1

Карра семейство

1а.........oS I

Jk2 JK3 JK4 JK5

Л

о ®

P Ш

о у

я о

3" P-

100% 80% 60% 40%

20% 0%

I.

23456789 10 Lambda семейство

100% 80% 60% 40% 20% 0%

JA1 JA2 JA3 JÀ6 JA7

Рисунок 11 - Частоты встречаемости Ук (А), УХ (Б), Лс (В) и Л (Г) семейств, участвующих в кодировании VI доменов анти-ФНО антител из МЭ-панели (темные столбцы) и из Ы-панели (серые столбцы), в сравнении с распределением генных сегментов зародышевых линий (белые столбцы). Звездочками обозначены значения р-уаЬеБ (* р < 0,05, ** р < 0,01)

Таким образом, обнаружены различия в составе генных сегментов, кодирующих вариабельные домены антител против ФИО из 1УК и N библиотек. Антитела против ФИО, кодируемые проксимальным генным сегментом Ук4, а также сегментами Ун4, Ук5, УЫ, УХ6, УХ7, ,1к5, ЛЗ и Я7, встречаются только в МЭ библиотеке; генными сегментами Ун5, Р5, 1Н1, 1к4 - только в N библиотеке. При этом антитела против ФНО, кодируемые генными сегментами ,1н6, Ук4 и 1к5 встречаются чаще в МЭ библиотеке, а сегментами .1x1 и ,1к4 - в N библиотеке.

1.7. Сравнение генных сегментов, кодирующих вариабельные домены антител против ИЛ-18, ИФН-у и ФНО, отобранных из VI8 и N библиотек, с генами зародышевых линий

В ходе работы были независимо проанализированы последовательности Ун и Уь доменов антител, направленных против цитокинов (ИЛ-18, ИФН-у и ФНО), как из МЭ-панели, так и из 1Ч-панелей с использованием программного обеспечения 1УЮТ У-ОиЕЭТ (ЬНр://ипе1.ог^1МОТ_Уоие81/удце51?Цуге1=0&Ор1юп=Ьитап1е) и IMGT/DomainGapAlign (Ьйр:/Лтт.огр/ЗРз1гае1иге-РВ/еаШотатОарАиа11.ся).

Вариабельные домены антител против ИЛ-18. Было показано, что нуклеотидные последовательности, кодирующие Ун домены анти-ИЛ-18 антител из М5-панели, имеют достоверно (р < 0,05) меньшую степень сходства с генами зародышевых линий, чем последовательности, кодирующие Ун домены анти-ИЛ-18 антител из Ы-панели (таблица 5). Для Уь доменов анти-ИЛ-18 антител из МБ- и N-naнeлeй такой зависимости обнаружено не было (таблица 5). Затем, для Ун и Уь доменов анти-ИЛ-18 антител, отобранных из обеих библиотек, с использованием программного обеспечения 1МСТ/РотатОарА1щп было оценено количество аминокислотных замен. Было показано, что в Ун доменах анти-ИЛ-18 антител из Мв-панели количество аминокислотных замен было достоверно больше (р < 0,05)

(таблица 5). Для Уь доменов анти-ИЛ-18 антител из МЭ- и К-панслсй такой зависимости обнаружено не было (таблица 5). Кроме того, с помощью программного обеспечения ШСТ/ЛоташСарА^п мы оценили долю аминокислотных замен, приводящих к смене класса а.о., в последовательностях V доменов отобранных антител относительно а.о., закодированных генами зародышевых линий. Оказалось, что для анти-ИЛ-18 антител МБ- и Ы-панслей доли таких замен статистически значимо не отличались (таблица 5).

Таблица 5 - Отличие последовательностей вариабельных доменов антител против ИЛ-18, ИФН-у и ФНО из МЭ и N библиотек от последовательностей, кодируемых генами зародышевых линий

Ун домены Уь домены

Антиген Степень идентичности, % (диапазон) Количество замен, % (диапазон) Доли замен, приводящих к смене класса а.о. Степень идентичности, % (диапазон) Количество замен, % (диапазон) Доли замен, приводящих к смене класса а.о.

МБ библиотека

ИЛ-18 : 95,4 ± 1,4% =(82,8% -99,7%) , 8,0 -ь 2,0 : (1-25) . 48,9 ± 8,2% 95,3 ± 0,7% (93,0% - 97,3%) 6,0 ± 1,3 (3-10) 49,2 ± 15,0%

ИФН-у ■ 94,5 ±0,6% -(82,5% -99,7%) 8,2 ±0,9 ' (0- -21) 48,2 ±4,2% 95,3 ±0,4% (83,5% - 99,0%) 6,2 ±0,6 (0- 18) . 66,4 ±4,4% ;

ФНО г' -89,9* 1,8% 1 '{72,2%-99,3%) 8,4 ± 1,3 (0 - 20) 54,2 ± 6,2% 95,1 ±0,8% (79,6% - 99,3%) 5,6 ± 0,7 (1 - 15) ' 70,0 4 5,2% .

N библиотека

ИЛ-18 . 98,5 ±0.5% (96,5% -99.7%) 2,3 ±1,0 ; (1-7) ^ 40,6 ± 16,6% 96,24 ± 1,26% (92,5% - 100%) 3,9 ± 1,6 (0-9) 49,2 ± 15,7%

ИФН-у :■ 97,2 ±0,7% - (93,8% - 99,7%). . 5,0 ±1,4 (0-33).. ' '32,8 ±10,3% 97.2 ±0,6% (9 >,2% -100%) 3,8 ±0,8-(0-10) 58,0 ±8,0% 5

ФНО 94,2 ±0,7% -(84,4% -100%)- 7,6 ± 1,0 (0-21) 50,1 ±4,6% 94,2 ± 1,0% (66,1% - 100%) 6,4 ± 0,7 (0-15) 53,7 ± 4,4%

Серым выделены параметры, достоверно отличающиеся для антител из МБ и N библиотек

Вариабельные домены антител против ИФН-у. Нуклеотидные последовательности, кодирующие Ун и Уь домены анти-ИФН-у антител из МБ-панели, имеют достоверно (р < 0,05) меньшую степень сходства с генами зародышевых линий, чем последовательности, кодирующие Ун и Уь домены анти-ИФН-у антител из Ы-нанели (таблица 5). Количество аминокислотных замен в Ун и Уь доменах анти-ИФН-у антител из МЯ-пане.ти было достоверно (р < 0,05) больше по сравнению с Ун и Уь доменами анти-ИФН-у антител из панели (таблица 5). Было показано, что доля замен, приводящих к смене класса аминокислоты, была достоверно (р < 0,05) больше в Ун и Уь доменах анти-ИФН-у антител из МЭ-панели по сравнению с антителами из >1-панели (таблица 5).

Вариабельные домены антител против ФНО. Нуклеотидные последовательности, кодирующие Ун домены анти-ФНО антител из МБ-панели, имеют достоверно (р < 0,05) меньшую степень сходства с генами зародышевых линий, чем последовательности, кодирующие Ун домены анти-ФНО антител из 1Ч-панели (таблица 5). Для Уь доменов анти-ФНО антител из МЭ- и М-ианелей такой зависимости обнаружено не было (таблица 5). Количество аминокислотных замен в Ун и VI, доменах анти-ФНО антител из Мй-и N1-панелей было сопоставимо (таблица 5). Было показано, что доли замен, приводящих к смене класса аминокислоты, в Ун доменах анти-ФНО антител из МБ- и М-панелей статистически значимо не отличались (таблица 5). В то же время, было обнаружено, что доля таких замен

была достоверно (р < 0,05) больше в Уь доменах антн-ФНО антител из МЭ-иансли по сравнению с антителами из М-панели (таблица 5).

Таким образом, генные сегменты, кодирующие антитела против ИЛ-18, ИФН-у и ФНО, отобранные из МБ библиотеки, в отличие от антител из N библиотеки, накопили большее количество мутаций и менее сходны с генами зародышевых линий, а также имеют большее количество замен, в том числе и замен, приводящих к смене класса аминокислоты и физико-химических свойств антител. Можно предположить, что вариабельные домены этих антител из МБ библиотеки образовались, скорее всего, в результате гипермутирования генов зародышевых линий. Напротив, антицитокиновые антитела из N библиотеки принадлежат к репертуару наивных аутоантител, которые присутствуют в нашем организме от рождения. Такие антитела зачастую полиреактивны, обладают умеренной аффинностью, отвечают за поддержание иммунного гомеостаза в организме и обеспечивают первую линию защиты от инфекционных агентов [Е1коп К., СазаИ Р., 2008].

1.8. Анализ последовательностей гипервариабельных участков СБКЗн и СОКЗг антител против ИЛ-18, ИФН-у и ФНО, отобранных из и N библиотек

С помощью программного обеспечения МОТЯипШопАпа^^ (http://imgt.org/lMGT ¡с1а/1сга?Иуге1=0). были оценены длины и значения изоэлектричеЬкнх точек (р1) СЭИЗц и СБЮ^ последовательностей, количество безматрично синтезированных (N1-) и экзонуклеолитически удаленных нуклеотидов в ]ипс1юп-участке СЭЯЗн и СОЮь участков антител против цитокинов (ИЛ-18, ИФН-у и ФНО), из МБ и N библиотек.

СПКЗп участки. Гипервариабельные участки СБЮн антител против ИЛ-18, ИФН-у и ФНО из МЭ библиотеки длиннее по сравнению с таковыми антител из N библиотеки (таблица 6), причем СРЮн участки антител, направленных к ИФН-у и ФНО, из Мй-папелей были достоверно (р < 0,05 и р < 0,005 соответственно) длиннее по сравнению с таковыми соответствующих антител из М-панелей (таблица 6).

Средние количества М-нуклеотидов в УцО регионах Ун доменов антител против ИЛ-18 и ИФН-у из МЭ-панелей были существенно (р < 0,02 и р < 0,05 соответственно) меньше по сравнению с таковыми соответствующих антител из М-панелей (таблица 6). Средние количества М-нуклеотидов в регионах Ун доменов антител против ИЛ-18 и ФНО из МЭ и N библиотек были сопоставимы между собой (таблица 6). Только у антител против ИФН-у из МЗ-панели среднее количество М-нуклеотидов в 0.1н регионах Уц доменов были достоверно (р < 0,05) больше по сравнению с таковым для антител против ИФН-у из Ы-панели (таблица 6).

Средние количества нуклеотидов, отщепленных с УнЗ", Э5', ОЗ' и .1н5' концов в рпсиоп-регионах Уп доменов антицитокиновых антител из МБ и N библиотек, были сопоставимы между собой (таблица 6). Только у антител против ИЛ-18 из МБ-панели средние количества нуклеотидов, отщепленных с и 1ц5' концов в ]ипсиоп-репюнах Ун доменов были достоверно (р< 0,001 и р < 0,05) меньше по сравнению с таковыми для антител против ИЛ-18 из М-панели (таблица 6).

С/37? участки. Гипервариабельные участки СБЯЗь антител против ИЛ-18, ИФН-у и ФНО из МЭ библиотеки длиннее по сравнению с таковыми антител из N библиотеки (таблица 7). При этом СБИЗь участки антител, направленных к ИФН-у и ФНО, из МЭ-панелей были достоверно (р < 0,001) Длиннее по сравнению с таковыми соответствующих антител из М-панелей (таблица 7). Средние количества М-нуклеотидов в регионах Vl.1l, как и средние количества нуклеотидов, отщепленных с УгЗ' и ^5' концов в ^псНоп-регйонах доменов антител против ИЛ-18, ИФН-у и ФНО из МБ и N библиотек были'сопоставимы между собой (таблица 7).

Таблица 6 - Анализ последовательностей гипервариабельных участков СОЯЗц антител против ИЛ-18, ИФН-у и ФНО, отобранных из М8 и N библиотек

Антиген

Средняя дайна, а.о.,

Среднее количество нуклеотидов(диапазон)

Среднее количество отщепленных нуклеотидов (диапазон)

(диапазон) УнО Ш„ Ун3' 05" БЗ' Ь5-

МЭ библиотека

ИЛ-18 15,8 ±1,4 (9-23) шт - 6,4 ± 1,8 (1-24) 1,6 ±0,6 (0-6) 4„4 ± 1,5 'и-17) 5,3 ±1,6 (1-16) шт

ИФН-у 179-41* 1,0 ..(10-275 (0-27) 10-2 »1 ! 1,4 ±0,3 ! (о-ю) 6,6 ± 0,9 (0-25) 3,9 ± 0,5 (0-14) 7,0 ± 0,8 (1-29)

ФНО яшашл 7,3 ±1,4 (0-18) 6,0 ± 1,0 (0-15) 0,9 ± 0,3 (0-4) 5,2 ±1,2 (0-17) 5,4 ± 0,8 (0-11) 7,2 ±1,1 (2-20)

N библиотека

ИЛ-18 13,1 ±0,8 1 (9-16) ЯШ 5,4 ± 0,8 (3-7) 3,0 ±0,9 (0-7) 1(1,0.- 1,5 ' -: >; 3,3 ±1,4 (0-10) 12,3 1 1,9 ■ (3-1/)>

ИФН-у 14,я ¡.о 11 '1.: ч \ Ян шт 4Д к 11-1(1) 2,2 ± 0,7 (0-6) 10,6 ±1,9 (1-18) 3,8 ±0,7 (1-9) 7,0 ±2,2 (0-18)

ФНО свш 6,1 ±1,1 6,0 ± 0,9 1,2 ±0,2 7,1 ± 1,0 6,4 ± 0,9 7,9 ±1,0

(0-24) (0-25) (0-4) (0-26) (0-15) (0-20)

Серым выделены параметры, достоверно отличающиеся для антител из МЭ и N библиотек

Таблица 7 - Анализ последовательностей гипервариабельных участков СБЯЗь антител против ИЛ-18, ИФН-у и ФНО, отобранных из МЭ и N библиотек

Среднее Среднее количество отщепленных

Антиген Средняя длина, количество 14- нуклеотидов(диапазон)

а.о., (диапазон) нуклеотидов в Vi.Il (диапазон) 1x5'

МБ библиотека

ИЛ-18 9,6 ± 0,4 1,4 ± 0,5 3,2 ± 1,3 1,2 ±0,8

(9-11) (0-3) (0-6) (0-4)

ИФН-у Щ 1 (8-11) 2,3 ± 0,4 (0-12) 2,9 ± 0,4 (0-12) 2,2 ± 0,3 (0-7)

ФНО ; . ' (8-13) 2,1 ±0,5 (0-15) 2,4 ± 0,5 (0-15) 2,2 ± 0,3 (0-5)

N библиотека

ИЛ-18 9,3 ± 0,2 (9-Ю) 5,5 ±2,3 (0-17) 7,0 ±2,4 (2-20) 3,1 ±0,5 (1-4)

ИФН-у 9,1 • 0,1 (9-10) 1,9 ±0,8 (0-8) 4,0 ± 0,8 (1-9) 2,3 ± 0,4 (1-4)

ФНО «¿±0,1 - 2,2 ± 0,6 3,4 ± 0,5 1,8 ±0,3

(0-15) (0-14) (0-7)

Серым выделены параметры, достоверно отличающиеся для антител из МБ и N библиотек

Средние значения р1 СОЛЗн и СРЯЗь участков антител, направленных к ИЛ-18, ИФН-у и ФНО, из МБ и N библиотек были сопоставимы между собой. Только среднее значение р1 СОЯЗц участков антител против ИФН-у из МЭ библиотеки было достоверно (р < 0,05) меньше по сравнению с таковым антител против ИФН-у из N библиотеки.

В СРЮн и СОЯЗь участках антител, направленных против цитокинов (ИЛ-18, ИФН-у и ФНО), как из МЗ-панели, так и из 1Ч-панели были выявлены замены остатков тирозина (Туг),

серина (Ser), триптофана (Тгр) и глицина (Gly), закодированных преимущественно в генах зародышевых линий, на остатки аргинина (Arg), валина (Val), треонина (Thr) и пр., характерные для антител, претерпевших процесс аффинного созревания. Кроме того, в CDR3h и CDR3l участках анти-ИЛ-18 антител из обеих панелей было обнаружено появление остатков фенилаланина (Phe), пролина (Pro) и гистидина (His), которые, как известно, стабилизируют конформацию CDR3 участков [Clark L.A. et al., 2006].

Таким образом, CDR3h и CDR3l участки антител, направленных к ИЛ-18, ИФН-у и ФНО, из MS библиотеки длиннее по сравнению с таковыми антител из N библиотеки. Значимых различий в других параметрах, характеризующих гипервариабельные участки CDR3h и CDR3], антицитокиновых антител из обеих библиотек, не обнаружено.

1.9. Оценка потенциального селективного давления со стороны антигена на вариабельные домены антител против ИЛ-18, ИФН-у и ФНО, отобранных из MS и N

библиотек

Для выявления потенциального селективного давления антигена на IGHV-гены, кодирующие вариабельные домены антител против ИЛ-18, ИФН-у и ФНО из MS и N библиотек, были использованы два алгоритма: «Multinomial Model» (полиномиальная модель) и «Focused binomial test» (фокусированный биномиальный тест) в составе программного обеспечения CLIP: Detecting selection in Ig V region sequences (http://clip.med.yale.edu/sel/index.php') [Lossos LS. et al., 2000; Hershberg U. et al., 2008; Uduman M. et al., 2011]. Мы использовали два алгоритма, поскольку каждый из этих двух наиболее часто используемых методов связан с потенциальными ограничениями: взаимодействие между позитивной и негативной селекцией в полиномиальной модели и недооценка позитивной селекции в CDR участках в фокусированном биномиальном тесте [MacDonald С.М. et al., 2010].

С помощью двух описанных моделей мы обнаружили наличие Vh доменов с признаками селективного давления со стороны антигена как в MS-панелях антител против ИЛ-18, ИФН-у и ФНО, так и в N-панелях антител против ИФН-у и ФНО. Последнее может быть объяснено тем, что такие антитела возникают вследствие перенесенных инфекций, при которых повышается концентрация ИФН-у и ФНО. Причем, чем выше уровень антител против этих цитокинов, тем более тяжело протекает следующее инфекционное заболевание [Browne S.K., Holland S.M., 2010]. Наличие Vh доменов с признаками селективного давления со стороны антигена в MS-панелях обусловлено стимуляцией B-клеток провоспалительными цитокинами, концентрации которых повышены при PC [Caminero A. et al., 2011; Mäher S.G. et al., 2007; Anderson G., Rodriguez M., 2011]. Сходная тенденция обнаружена для Vl доменов антицитокиновых антител, отобранных из обеих библиотек. При этом, наибольшее количество VL доменов с признаками селекции обнаружены в MS-панели антител против ИФН-у и N-панели антител против ФНО.

Таким образом, признаки антигенной селекции обнаруживались чаще в вариабельных доменах антител против ИЛ-18 и ИФН-у из MS-панелей по сравнению с N-панелями, тогда как для вариабельных доменов антител против ФНО характерно обратное.

выводы

1. Впервые показано, что уровень антител против ИЛ-18 в сыворотке крови больных PC достоверно ниже (р < 0,05), чем у здоровых, в то время как концентрация ИЛ-18 у больных PC значительно выше (р < 0,05) по сравнению со здоровыми донорами. Обнаружена статистически значимая положительная корреляция между концентрацией ИЛ-18 и возрастом у здоровых доноров, но не у больных PC.

2. Впервые показано, что вариабельные домены, кодируемые генными сегментами Vh6 и D7, присутствуют только в составе антител из MS библиотеки, сконструированной на основе мРНК лимфоцитов периферической крови больных PC, а вариабельные домены, кодируемые генными сегментами Vh4, JH1, Jh2, Jh6, Jk3 и Jk5, встречаются в ней достоверно чаще по сравнению с таковыми из N библиотеки, сконструированной на основе мРНК лимфоцитов периферической крови здоровых доноров.

3. Обнаружены достоверные различия в составе генных сегментов, кодирующих вариабельные домены антицитокиновых (ИЛ-18, ИФН-у, ФИО) антител из MS и N библиотек: в MS библиотеках чаще встречаются антицитокиновые антитела, кодируемые сегментами VH6, Jh6, Vk4 и Jk5, а в N библиотеках - сегментами Dl, D3, JH1, Jh3, JkI и Jk4.

4. Показано, что соматический гипермутагенез вносит больший вклад в образование антицитокиновых антител из MS библиотеки по сравнению с таковыми из N библиотеки, и соответствующие вариабельные домены несут большее количество замен аминокислотных остатков, которые чаще приводят к смене класса аминокислоты.

5. Обнаружено, что гипервариабельные участки CDR3h и CDR3l антицитокиновых антител из MS библиотеки в среднем длиннее по сравнению с CDR3h и CDR3l участками антицитокиновых антител из N библиотеки.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ ДИССЕРТАЦИИ ОПУБЛИКОВАНЫ В РАБОТАХ

1. Vikhrova М.А.. Shveygert M.V., Khrapov Е.А., Filipenko M.L., Gileva I.P., Morozova V.V., Tikunova N. V. Selection of naturally occurring autoantibodies to interleukin-18 from phage display library // Hum. Antibodies - 2010. - V. 19. - P. 71-78.

2. Вихрова M.A.. Морозова B.B., Хлусевич Я.А., Тикунова H.B. Комбинаторные библиотеки фаговых антител: использование для анализа генных сегментов, кодирующих вариабельные домены аутоантител к фактору некроза опухолей // Молекулярная биология -2011.-Т. 45.-С. 96-107.

3. Вихрова М.А.. Батанова Т.А., Лебедев Л.Р., Шингарова Л.Н., Франк Л.А., Кирпичников М.П., Тикунова Н.В. Одноцепочечные антитела человека, направленные к фактору некроза опухолей // Биоорганическая химия - 2011. - Т. 37. - С. 334-343.

4. Тюменцева М.А.. Коробко Д.С., Малкова H.A., Тикунова Н.В. Анти-интерлейкин-18 аутоантитела в крови больных рассеянным склерозом // Практическая медицина - 2013. - Т. 68. - С. 74-75.

5. Tvumentseva М.А.. Morozova V.V., Lebedev L.R., Babkin I.V., Tikunova N.V. Presence of aberrant VH6 domains in anti-interferon-y autoantibodies in multiple sclerosis // Hum. Antibodies -2013.-V. 22.-P. 31-49.

Подписано в печать 29.07.2014 Формат 60x84 1\16 Усл. печ. л. 1, 25 Объем 20 стр. Тираж 100 экз. Заказ № 167 Отпечатано Омега Принт 630090, г. Новосибирск, пр. Ак.Лаврентьева,6 email: omegap@yandex.ru