Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Использование аденовирусного вектора для доставки и регулируемой экспрессии гена интерлейкина-10 in vivo

ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации по теме "Использование аденовирусного вектора для доставки и регулируемой экспрессии гена интерлейкина-10 in vivo"

Московский Государственный Университет им. М.В. Ломоносова Биологический факультет Кафедра клеточной физиологии и иммунологии

на правах рукописи

Мягков Алексей Витальевич

УДК 612.017.12

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ АДЕНОВИРУСНОГО ВЕКТОРА ДЛЯ ДОСТАВКИ И РЕГУЛИРУЕМОЙ ЭКСПРЕССИИ ГЕНА ИНТЕРЛЕЙКИНА-10 IN VIVO

03.00.25 - клеточная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

Москва -1998

Работа выполнена на кафедре клеточной физиологии и иммунологии Биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор

И.Г. Харитоненков

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, академик АМН РФ, профессор

доктор биологических наук, профессор

И.П. Ашмарин А.А. Кущ

Ведущая организация:

Научно-исследовательский институт молекулярной биологии им.В.А. Энгельгардта РАН

Защита состоится « 1998 г. в 15' ~часов на заседании

Специализированного Совета Д.053.05.95 при Московском Государственном Университете по адресу: 119899, Москва, Воробьевы горы, Биологический факультет МГУ.

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке Биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан «%>> »

1998 г.

Учёный секретарь Специализированного Совета

кандидат биологических наук Н.В. Воробьёва

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы

Генная терапия является новым перспективным методом лечения многих заболевании включая аутоиммунные [Anderson, W.F. 1998; Chen, Y. 1998; Mathisen, P.M. and Tuohy, V.K. 1998;]. В основе данного метода лежит идея доставки «терапевтических» генов в поражённую клетку, что служит альтернативой использованию рекомбииантных белков. Для доставки терапевтических генов в клетки организма используют разные способы, среди которых Широкое распространение получила доставка генетического материала с помощью вирусных векторов [Anderson, W.F. 1998], Рекомбинантпые вирусы являются наиболее эффективными векторами, известными в настоящее время.

Аутоиммунные заболевания характеризуются наличием фаз острого воспаления, чередующихся с периодами относительной ремиссии. Постоянно высокая продукция терапевтических белков в организме может приводить к нарушению функциональной активности иммунной системы, делающему неприемлемым данный способ лечения. В связи с этим создание векторов, позволяющих регулировать экспрессию доставленных в клетку терапевтических генов, является одной из основных проблем генной терапии аутоиммунных заболеваний.

Варлей (Varley) и соавторами был сконструирован аденовирусный вектор, несущий промотор СЗ-компонента комплемента [Varley, A.W. et al. 1997;]. Данный промотор содержит участки связывания для факторов транскрипции, активирующихся под действием нро-воспалигельных цнтокинов (IL-Iß, 1L-6) [Kawamura, N. et al. 1992;]. Таким образом было

показано, что экспрессия генов, находящихся под контролем промотора СЗ-компонента комплемента, может регулироваться под действием про-воспатитсльных цнгокинов. Полученные результаты указывают на возможность автономной регуляции экспрессии терапевтических генов, доставленных in vivo в составе такого вектора [Miagkov, A.V. et al. 1998;].

Цель и задачи исследования

Целью данной работы являлось изучение биологической активности аденовирусного вектора, несущего терапевтический ген ннтерлсйкнна-10 (IL-10), находящегося под контролем промотора СЗ-компонента комплемента.

В экспериментальные задачи исследования входило:

1. Изучить транскрипционную активность промотора СЗ компонента комплемента:

а) под действием про-воспалительных факторов in vitro.

б)в модельной системе протеогликан-индуиировашюго ревматоидного артрита in vivo.

2. Изучить экспрессто и биологическую активность терапевтического гена ингерлейкина-10 (IL-10), доставленного при помощи аденовирусного вектора, содержащего промотор СЗ компонента комплемента in vitro.

3. Исследовать экспрессию и биологическую активность гена 1L-10, доставленного в составе аденовирусного вектора, содержащего промотор СЗ компонента комплемента, на модели протеогликан-индуцированиого ревматоидного артрита в системе in vivo.

Г

Научная новизна работы

Впервые па основе аденовируса, содержащего ген IL-10 под контролем промотора СЗ-компонента комплемента, был разработан вектор, позйоляющий осуществлять доставку и регулируемую экспрессию гена IL-I0 в суставе животного, поражённого артритом. В системах in vitro и in vivo впервые показано, что экспрессия генов под контролем промотора СЗ компонента комплемента в составе аденовирусного вектора регулируется про-воспалительными цитокннами. На примере экспериментачыюго ревматоидного артрита впервые показан терапевтический эффект IL-iO, доставленного в составе такого вектора. Экспрессия гена 1L-10, находящегося под контролем промотора СЗ компонента комплемента, регулируется уровнем воспалительной реакции в артритном суставе и коррелирует с уровнем провоспалительных щггокинов.

Теоретическое и практическое значение работы

Результаты работы показали, что аденовирусный вектор, содержащий промотор СЗ компонента комплемента, можно использовать как новый перспективный подход в исследованиях механизмов рефляции функциональной активности клетки под действием биологически активных белковых молекул. Данный аденовирус является новым перспективным вектором, позволяющим осуществлять доставку и регулируемую экспрессию.терапевтических трансгенов in vivo. Он может быть использован в генной терапии не только аутоиммунных, но и широкого спектра других заболеваний, характеризующихся повышением уровнем экспрессии про-воспалительных щггокинов.

Апробация работы

Материалы диссертации были доложены на двух международных симпозиумах по ревматологии (Вашингтон, 7-11 ноября 1997 года; Сан-Днего, 8-12 ноября 1998 года), а также на заседании кафедры фшиолопш человека н животных Биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова. Апробация диссертации проведена на заседании кафедр|.| клеточной физиологии 'и иммунологии МГУ им. М.В. Ломоносова.

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 2 и принята в печать I печатная работа.

Структура диссертации

Диссертация сосгоит из разделов «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты», «Обсуждение полученных результатов», «Выводы», «Список литературы» (141 ссылка). Работа изложена на 101 странице машинописного текста и содержит 1 таблицу и 13 рисунков.

Содержание диссертации

Материалы и методы

Аденовирусные векторы

Аденовирусные векторы (Рис. 1) были получены на основе рекомбипаптпого аденовируса серологического типа А(15, дефектного по

Е1А иЕ1В участкам вирусного генома по методике, описанной Варлей и соавторами [Varley, A.W. et al. 1997].

AdRR5 ("пустой" вектор)

Рис.1 Схемы аденовирусных векторов

AdC3/Luc или AdC3/ll-10. В данных векторах под контролем промотора СЗ-компонента комплемента находится ген tat - трансактиватор вируса иммунодефицита человека (ВИЧ). Ген люциферазы или интерлейкина-10 находится под контролем промоторного региона ВИЧ. Активация промотора СЗ-компонента комплемента вызывает экспрессию белка far, который в свою очередь активирует промотор ВИЧ, контролирующий экспрессию люциферазы или интерлейкина-10.

AdRR5 («пустой» вектор) содержал только ген tat под контролем промотора СЗ-компонента комплемента и промоторный регион ВИЧ.

AdCMV/Luc или AdCMV/IL-10 содержали ген люциферазы или ген интерлейкина-10 под контролем промотора цитомегаловируса (CMV).

Модель ревматоидного артрита

В качестве экспериментальной модели ревматоидного артрита был использован протеогликан-индуцированный артрит, вызываемый введением в сустав крысы багстериан.ных протеогликанов полученных из стенок бактерий Streptococcus pyogenes [Esser, R.E. et al. 1985: Stimpson, S.A. et al. 1987].

Первичные ешкюлоциты

В работе были использованы первичные фибробласты (синовиоциты), выделенные из полости пяточных суставов крыс, поражённых артритом. Их выделение и культивирование проводили по методике описанной Макаровым и соавторами [Makarov et al, 1996].

Определение активности нроиогора СЗ-комнонента комплемента в первичных сшюшюннтах in vitro, под дейсгвнсм LPS н про-восналнгельиых цнтокинов

Первичные синовиоциты инфицировали аденовирусными векторами AdC3/Luc, AdRR5 (отрицательный контроль), AdCMV/Luc (положительный котроль) в концентрации 100 БОЕ на клетку. Через 24 часа после инфскнии клетки стимулировали 1 мкг/мл лнпонолисахарида Е. coli (LPS, Sigma, США), или 10 лг/мл рскомбинантного крысиного фактора некроза опухоли (TNFa, BioSource, США), или 20 нг/мл рекомбииантного крысиного интерлейкнна-1 ß (IL-lß, BioSource, США), или 20 нг/мл рекомбииантного крысиного интерлейкипа-б (IL-6, BioSource, США), в течение 6 часов. После стимуляции клетки собирали, активность люциферазы определяли в тотальных клеточных лизатах по методике, описанной ранее [Makarov et al, 1996]. Активность люциферазы выражена в относительных единицах (О.П.) ЛЮМИНССИСНШ1И. Среднее значение и стандартное отклонение определяли по 2 измерениям в каждой экспериментальной точке.

Анализ экспрессии гена нитерленкина-Ю первичными стювиошгтами, инфицированными аденовирусным вектором AdC3/IL-10

Первичные крысиные синовиоциты инфицировали аденовирусными векторами: AdC31L-IO, AdRR5 (отрицательный контроль) или AdCMV/lL-10 (положительный контроль) в концентрации 100 БОЕ на клетку. Через 24 часа после введения вируса среду культивирования заменяли двумя миллилитрами свежей среды, содержащей 1 мкг/мл LPS или 10 иг/мл TNFa. Через 48 часов после стимуляции культурапьные супернатанты собирали и содержание иптерлейкина-10 в них определяли методом иммуноблоттнцга и твердофазного иммуиоферментного анализа.

' Иммуноблотгннг, Белки, содержащиеся в культуральных супернатантах разделяли при помощи электрофореза в 12% полиакриламидном геле при редуцирующих условиях по методике Лэммли [Laemmli, U.K. 1970;]. Белки из геля на нитроцеллюлозную мембрану (Amersham, США) переносили методом «влажного» переноса [Hudson, L. and F. С. Hay. 1989]. Детекцию IL-10 проводили с помощью полирональных антител козла против человеческого интерлейкина-10 (SantaCru?, США),.

Твердофазным нммуноферментный анализ. Концентрацию интерлейкинаИО в анализируемых образцах определяли с помощью твёрдофазиого иммунофермеитного анализа (метод «oiunim-F.LLSA) используя набо фирмы «BioSource» согласно протоколу, прилагаемому фирмой-производителем. Среднее значение и стандартное отклонение определяли по 2 измерениям в каждой экспериментальной точке.

Определение биологической активности ипгерлейкина-10 по его влиянию на ДНК-связывающую и транскрипционную активность NF-кВ

Определение ДНК-спязмпаюшсй активности

транскрипционного фактора NF-кВ. Первичные крысиные сииовиоциты рассаживали в 100 мм чашки Петри в концентрации 6х 1 клеток на читку. Через 24 часа клетки преинкубировали с (1L-10)-содсржащнми культуральиыми супсрнатантами, полученным» от клеток, инфицированных аденовирусами AdRR5, AdC3/lL-10 или AdCMV/IL-10 и стимулированными 10 иг/мл TNFa (см «Анализ экспрессии гена ннтерлейкина-10 первичными синовиоцитами, инфицированными аденовирусным вектором AdC3/IL-IO»). Положительным контролем служили клетки, преинкубированпые с 10 иг/мл рекомбинантного человеческого итерлейкина-10 (BioSourcc, США). Через 5 ■ минут преинкубацни с супсрнатантами или реко.мбипаитпым П.-10 клетки стимулировали 100 лгУмл TNFa. Через 15 минут после стимуляции TNFa ДНК связывающую активность NF-кВ определяли методом «гель-шифт» как описано Балдвиным [Baldwin, A. S„ Jr. 1990].

Определение транскришшонной активности NF-кВ. Первичные крысиные синовиоциты рассаживали в 100 мм чашки Петри в концентрации 6x105 клеток на чашку. Через 24 часа клетки трансфецировали репортерным вектором, содержащим ген люциферазы под контролем NF-кВ-регулирусмого промогора (4хк'В-).ис. Clonthech, США). Трансфскднто проводили с помощью реактива «СупСрфект» ("Superfecf, Qiagen, США), по протоколу фирмы-производителя.- Через 24 часа, после трансфекции клетки преинкубировали 20 .минут с супсрнатантами, как описано в разделе «Определение Д11 ¡{-связывающей

активности транскрипционного фактора NF-кВ». Через 5 минут после преинкубации с культуральными супернатаптами или с рекомбинантным IL-10 клетки стимулировали 100 нг/мл TNFa или 1 мкг/мл LPS. Через 6 часов клетки собирали и определяли активность люциферазы в тотальных клеточных лизатач. Показателем изменения активности NF-кВ служил активационный индекс (АИ) расчитапый по формуле: AH=An/A(), где An-активность люциферазы в стимулированных клетках; Ао-активность люциферазы в нестммулированных клетках. Средние значения и стандартные отклонения АИ посчитаны по 2 параллельным измерениям.

Анализ активности промотора СЗ-комионента комплемента in vivo

•Через 21 день после внутрисуставной инъекции бактериальных протеогликанов, в полость пяточного сустава крыс (группа из 8 животных) вводили аденовирус AdC3/Luc, AdRR5 (отрицательный контроль) или AdCMWLuc (положительный контроль). Инъекцию аденовирусных векторов проводили в 20 мкл физиологического раст вора в концеиграции 107 БОЕ на сустав. Через 48 часов реактивацию артрита индуцировали внутривенным введением бактериальных протеогликанов. Активность люциферазы измеряли в тотальных белковых экстрактах, полученных из суставов перед и через 24, 48, 72, 96 часов после индукции артрита: Среднее значение ir стандартное отклонение активности люциферазы, выраженной в относительных единицах (O.E.), подсчитывалось по 4 параллельным измерениям.

Инъекция аденовирусных векторов, содержащих ген интер.эейкина-Ю

В экспериментах, аналогичных описанным в предыдущем разделе в полость пяточного сустава крыс (группа из 10 животных) вводили

'9

аденовирусные лекторы А<1СЗ/1Ь-10, (отрицательный контроль)

или Ас1СМУ/1Ь-10 (положительный контроль). Инъекцию аденовирусных векторов, так же, как в предыдущих экспериментах, проводили в 20 мкл физиологического раствора в концентрации Ю7 БОЕ на сустав. Через 48 часов развитие артрита индуцировали внутривенным введением бактериальных протеогликанов.

Для анализа влияния внутрисуставной »инъекции АбСЗЛЬ-Ю на развитие артрита суставы и внутрисуставную жидкость собирали у Двух животных из каждой группы перед и через 1, 2, 3 и 4 дня после индукции артрита. Анализ содержания интерлейкина-10 производили при помощи нммуноблоттинга и иммуноферментного анализа как описано ранее. О развитии артрита судили по увеличению диаметра суставов, концентрации суспензионных клеток в полости сустава и концентрации интерлейкина-1 и шперлейкина-6 во внутрисуставной жидкости.

Сбор внутрисуставной жндкостн

Полость пяточных суставов крыс промывали 0,5 мл стерильного

физиологического (0,9% ИаС1) раствора как описано Мэлоном (Ма1опс,

13X5. С1 а1. 1991;!. 4 ..

Определение содержании 1Ь-10 во вну грисусгавнон Ж11Д1^осгн

Содержание интерлсйкина-10 во внутрисуставной жидкости определяли методом нммуноблоттинга и методом твердофазного иммуноферментного анализа как описано в разделе «Анализ экспрессии гена интерлейкина-10 первичными синовиоцитами, инфицированными аденовирусным вектором Ас1СЗ/1Ь-10».

Измерение диаметра суставов

Через 21 день после внутрисуставной инъекции бактериальных протеогликанов животных инфицировали аденовирусными векторами и индуцировали развитие артрита как описано в разделе «Инъекция аденовирусных векторов, содержащих ген иптерлепкина-10». Диаметр суставов измеряли при помощи цифрового штангенциркуля. Диаметр каждого сустава измеряли трижды и определяли среднее значение из трёх измерений. Среднее значение из измерений суставов 6 животных в каждой группе использовали для анализа уровня развития артрита в группе. Количество параллелей в каждой точке равнялось 12. Достоверность полученных данных оценивали по критерию Стыодента. Результаты считали достоверными при Р<0,05.

Подсчёт числа клеток во внутрисуставной жидкости

Подсчет клеток производили перед и через 1, 2, 3, 4 дня после "индукции артрита. Для этого собранную внутрисуставную жидкость центрифугировали 5 минут, 1500 об/мин при +4°С. В полученном осадке определяли концентрацию клеток при помощи автоматического счётчика клеток (ВесЮп-ГНскепБоп, США). Количество параллелей в каждой точке равнялось 4. Достоверность полученных данных оценивали по критерию Стыодента. Результаты считали достоверными при РО,05.

Определение концентрации интерленкина-6 и нптер.тснкпна-1 во внутрисуставной жидкости

Концентрацию интерлейкина-1 и интерлейкина-б измеряли во внутрисуставной жидкости, собранной перед и через 1, 2, 3 п 4 дня после индукции артрита. Определение концентраций проводили методом «сэндвич»-Ей8А с помощью наборов реактивов фирмы «ВюЯоигсе» по

протоколу фирмы-производителя. Количество параллелей в каждой точке равнялось 4. Достоверность полученных данных оценивали по критерию Стыодента. Результаты считали достоверными при Р<0,05,

Полученные результаты и их обсуждение

Па основе рекомбинантного аденовируса Ad5 был создан вектор, имеющий в своём составе промотор гена СЗ-комцонента комплемента, являющимся белком острой фазы воспаления (Рис. 1). Было показано, что такой промотор активируется in vivo в ответ на введение животным LPS [Varley, A.W. et al. 1997;]. Таким образом, созданный вектор можно было рассматривать как перспективный переносчик для обеспечения регулируемой экспрессии терапевтических трансгенов.

В данной работе были исследованы механизмы . активации промотора СЗ-компонента комплемента в составе аденовирусного вектора. С этой целыо в качестве модельного гена, служащего маркером активации СЗ-промотора, использовали ген люциферазы (Рис. 1). На основании опубликованных данных [Varley, A.W. et al. 1997; Varley, A.W. et al. 1995;] мы предположили, что факторы воспаления могут активировать СЗ-промотор. Результаты проведённых экспериментов показывают, что промотор СЗ-компонента комплемента обладает низкой базальной активностью в не стимулированных спновноцитах, в то время как широкий спектр про-воспалительных факторов, включающий LPS, TNFa, IL-ip и 1L-6, приводят к активации промотора, возрастающей в среднем на 4 порядка (Рис. 2А ). В отличие от промотора СЗ-компонента комплемента, CMV-промотор активен в нсстимулированных клетках и уровень его активности не зависит от стимуляции клеток (Рис. 2А).

Б

ы О

10» 107 10« 105

10*

103 10г

j

J

i

о X

ы

о'

с.

и •в»

jF <f> «fr

•Vo V ^ V ^

□ AdRR5

□ AdCMV/Luc 0 AdC3/Luc

0 2 3 4

Дип после реактивации артрита

Рис. 2. Активность промотора СЗ компонента комплемента в первичных крысиных синовиоцитах под действием про-воспалительных факторов in vitro (A) vi после реактивации артрита in vivo (Б).

Для проверки индуцнбельности промотора СЗ-компоиента комплемента in vivo была использована модель протеоглнкан-индуцированного артрита [Esser, R.E. et al. 1985;]. Введенный in vivo ген люциферазы в составе AdC3/Luc не экспрессировался до момента индукции артрита. Индукция артрита, которая сопровождается воспалительной реакцией, являлась актнвационным сигналом для промотора СЗ-ко.мпонснта комплемента, его активность возрастала в 30 раз и держалась на прежнем уровне в течении всего эксперимента (Рис.

Векторы: Стимуляция:

AdRRS

AdCMV/ 1Ы0

AdC3/ 1L-10

o -J

"T

£ *

£ £ Р 2

IL-10-

—'ПГ

a. g £ -J С о

Г" Sí

a

u.

z f-

200 0

□ AdRR5

□ AdCMV/IL-10 AdC3/IL-10

Контр TNFa LPS

Рис.3. Экспрессия"интерлейкнна-10 первичными синовиоцитами, инфицированными аденовирусом AdC3/lL-10 In vitro. Данные получены методом иммуноблоттинга (А) и твердофазного иммуноферментыого анализа (Б).

2Б). Таким образом, как in vitro, так и in vivo, промотор СЗ-компонента комплемента не активен, активация промотора происходит при действии провоспалительных цитокинов in vitro (Рис. 2А) и при развитии воспалительной реакции in vivo (Рис. 2Б), что также связано с

Векторы:

Стимуляция: t±

s о

AdRR5

AdCMV/ IL-10

AdC3/ 1L-I0

20 18 16 14 12 10 8 6 4. 2 0

j3

| | Контроль [3 TNFa (100 иг/мл) F| LPS (1) мкг/мл)

Jfj

AdRRS

AdCMV/ AdC3-tat/ IL-IO HIVIL-IO

Рис.4. Влияние интерлейкина-10, продуцируемого синовиоцитами, инфицированными AdC3/IL-10, на ДНК-связывающую (А) и транскрипционную (Б) активность NF-kB.

В отличие от вышеописанных систем вектор, несущий в своём составе терапевтический трансген под контролем промотора СЗ-компонента комплемента может найти более широкое применение, потому что активация СЗ-нромотора зависит от присутствия цнтокннов воспаления, экспрессия которых повышается при многих заболеваниях {Isomaki, P. iind Punnonen, J. 1997; Link, П. 1998; Van der Meide, P.M. and Sclicllekens, H. 1996;].

Экспериментальные доказательства активации СЗ-промотора и экспрессии гена люциферазы, стоящего под его контролем, in vitro и in vivo под действием факторов воспаления (Рис. 2) позволили перейти к следующему этапу: исследованию регуляции экспрессии терапевтического трансгена, стоящего под контролем промотора СЗ-компонента комплемента в составе аденовирусного вектора, в экспериментальных моделях in vitro и in vivo.

В качестве экспериментальной модели in vitro были использованы первичные синовиоциты, выделенные из суставов крыс. В качестве модельной системы in vivo использовали протеогликан-индуцированный артрит [Stimpson, S.A. et al. 1987;).

Критерием выбора терапевтического гена служили особенности ревматоидного артрита [Evans, С.Н. and Robbins, P.D. 1995; MullerLadner, U. 1996;] и существующие подходы в генной терапии данного заболевания [Chernajovsky, Y. et al. 1998;]. На основании этого в качестве экспериментального терапевтического гена был выбран интерлейкин-10. Ген IL-10 человека был включйи в состав аденовирусного вектора под

контролем исследуемого промотора СЗ-компонснта комплемента в '

(AdC3/IL-10). В качестве положительного контроля использовали аденовирус, несущий ген IL-10 под контролем промотора CMV (AdCMV/ÍL-Ю). Экспрессия гена 1L-10 в составе AdC3/lL-10 регулируется под действием LPS и TN Fa in vitro (Рис. 3).

А

Векторы:

Дни после реактивации артрита:

. 11.110-:

§ ЛЛГМУЛЫО.« А(1СЗ/11.-10

0 1 2 3 4 0 1

3 4

О «Як «3»

Я

я я а Ь

о

■л

600 500 400 ' 300 • 200 100 0

I

□ Ас1Рт5

□ АсЮМУ/И-Ю . □ Ас)СЗ/11-10

Хг

1

12 3 4

Дни после реактивации артрита

Рис. 5. Содержание 11-10 во внутрисуставной жидкости животных, инфицированных Ас1СЗ/1Ы0. Данные получены Методом ■ иммуноблоттинга (А) и твбрдофазного иммуноферментного анализа (Б).

11.-10, продуцирующийся клетками в результате экспрессии гена 11.-10-я составе вектора А11СЗ/Н.-10, является биологически активным. Биологическую активность 11.-10 определяли по его способности

2.5

to -

о

a

я 1.5

I 1

ч

4»

I 0.5

£ О

Рис. 6. ——j—

AdRRS •

AdCMV/IL-10

AdC3/IL-10

Дни после роак-гнвацин артрита

Изменение диаметров суставов (А) н концентрация суспензионных клеток во внутрисуставной жидкости (Б) животных, инфицированных аденовирусным вектором

даезлыо.

ингибировать активацию транскрипционного фактора NF-кВ (Рис. 4) [Lentsch, А.В. et al. 1997; Dokter, W.H.A. et al. 1996;] и сравнивали со

• .9

стандартным препаратом рекомбинантного IL-10 (Рис. 4А, дорожка «TNFa+lL-Ю»). Таким Образом, в результате регулируемой экспрессии гена IL-10, доставленного вектором AdC3/lL-10, инфицированные клетки секретируюг биологически активный IL-10, терапевтический эффект которого исследовался на модели экспериментального ревматоидного артрита.

Для оценки терапевтического эффекта экспрессии гена IL-10 in vivo использовали три критерия: диаметр суставов, количество суспензионных клеток [Erlandsson Harris, Н. et al. 1997;] и концентрацию

о К

AdRR5

AdCMV/IL-10 AdC3AL-lO

Дни после реактивации артрита

Рис.7. Концентрация про-воспалительных цитокинов IL-1[)(A) и IL-6 (Б) во внутрисуставной жидкости животных, инфицированных AdC3/lL-10.

цитокинов воспаления IL-I и IL-6 [Isomaki. P. and Pimnonen, J. 1997;] во внутрисуставной жидкости.

Результаты экспериментов показали, что виугрисуставпое введение AJC3/IL-10 приводит к подавлению артрита по всем трем измеряемым параметрам (Рис. 6 и 7). Терапевтический' эффект, полученный при использовании вектора AdC3/IL-10, содержащего ген 1L-I0 под контролем промотора СЗ-компоиснта комплемента сравнивали с эффектом введения рскомбииаптного 1L-10 в модели коллаген-индуцированного артрита [Walmsiey, М. et al. 1996;]. В данной работе Вол мел и и соавторы показали потенциальную возможность применения 1L-10 в качестве терапевтического агента.

Сравнение терапевтического эффекта, полученного при использовании IL-10 в составе аденовирусных векторов иод контролем СЗ- и CMV-промоторов, показало, что обе векторные системы являются терапевтически активными (Рис. 6 и 7). Использование аденовируса AdCMV/IL-10, несущего ген IL-10 под контролем CMV-промотора, служило положительным контролем, так как известно, что векторы, несущие терапевтические трансгеиы, экспрессия которых регулируется CMV-промотором, являются высокоэффективными и широко используемыми [Anderson, W.F. 1998;].

Основным отличием вектора AdC3/lL-10 от вектора AdCMV/IL-10 является регулируемая, под действием цитокинов воспаления,

экспрессия гена 1L-10 (Рис. 3 и 5).

0

Сравнение экспрессии генов люциферазы и. IL-10 под контролем промотора СЗ-компонента комплемента in vivo показывает, что экспрессия обоих генов индуцируется при реактивации артрита (Рис. 2Б и 5). После активации промотора СЗ-компонента комплемента, вызванной развитием артрита, экспрессия гена люциферазы держится конституитивио высокой на протяжении всего эксперимента (Рис. 2Б), в

о '

то время как экспрессия гена IL-10 достигает максимального уровня на 2-ой день после реактивации артрита и возвращается к базалыюму уровню на 4-ый день (Рис. 5).

Сравнение кинетики экспрессии IL-10 in vivo, доставляемого с помощью аденовируса AdC3/IL-10 (Рис. 5) и провоспалительных цитокинов IL-Iß (Рис. 7А) и IL-6 {Рис. 7Б), позволяет предположить, что появление цитокинов воспаления на 1-ый день после индукции apTpirra ведёт к активации промотора СЗ-компонента комплемента и, как следствие, индукции экспрессии IL-10, высокая концентрация которого

детектируется в суставах животных на второй дейь после индукции артрита (Рис. 5). Синтезированный 11.-10 ингнбирует экспрессию провоспалительных цитокинов 1Ь-1р и 1Ь-6, уровень.°которой становится недетектируемым на 2-ой день после реактивации артрита и держится па этом уровне в последующие дни эксперимента (Рис. 7). В свою очередь, исчезновение цитокинов воспаления нсдСг к ингнбированпю активности СЗ-промотора и экспрессии 1Ь-10*(Рис. 5). Этого не происходит когда, СЗ-промотор контролирует экспрессию гена люциферазы (Рис. 2Б). В данном случае появление провоспалительных цитокинов активирует промотор СЗ-компопента комплемента и экспрессию гена люциферазы, но в отличие от !Ь-10, люцифераза не ингнбирует продукцию провоспалительных цитокинов и их уровень во внутрисуставной жидкости остается высоким на протяжении всего эксперимента. Постоянное присутствие провоспалительных цитокинов удерживает СЗ-промотор в активном состоянии, что отражается в постоянно высоком уровне экспрессии гена люциферазы (Рис. 2Б).

Таким образом, исследованный в данной работе аденовирусный вектор, несущий в своём составе промотор СЗ-компонента комплемента, позволяет регулировать экспрессию доставленного трансгсна под действием факторов воспаления. Такой вектор можно рассматривать как перспективный для использования в генной терапии не только ревматоидного артрита, но и многих других заболеваний, характеризующихся развитием хронической воспалительной реакции.

Выводы

1. На основе аденовируса, содержащего ген 11,-10 под контролем промотора СЗ-компонента комплемента разработан вектор,

позволяющий доставлять и экспрессировать ген IL-10 в суставе животного, поражённого артритом.

2. В системе in vitro показано, что промотор СЗ-компонента комплемента активируется в первичных крысиных синовиоцитах под действием на клетка провоспалительпых факторов (LPS, TNFa, IL-Iß, 1L-6).

3. На модели протсогликан-индуцированного артрита крыс показало, что промотор СЗ-компонента комплемента активируется in vivo и его активность коррелирует с уровнем воспаления в суставе.

4. В экспериментах in vitro показано, что экспрессия интерлейкина-10, ¡щадящегося иод конгролем промотора СЗ-компонента комплемента в составе аденовирусного вектора AdC3/lL-10 регулируется действием бактериального липополисахарида и TNFa in vitro.

5. В системе in vivo на крысах показано, что экспрессия гена интерлейкина-10, доставленного в артритный сустав в составе аденовирусного вскторр AdC3/lL-IO, регулируется уровнем воспаления в суставе.

6. В моделях in vitro и in vivo показано, что шгтерлейкнн-10, синтезирующийся клетками как продукт экспрессии гена в составе аденовирусного вектора AdC3/lL-10, является биологически активным.

7. На модели экспериментального ревматоидного артрита показано, что экспрессия гена 1L-Í0, доставленного при помощи аденовирусного

вектора AdC3/lL-10 в пораженный сусгав, ннГибирует развитие заболевания.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Miagkov А. V., Varley A. W., Kharitonenkov I. G., Munford R. S., and

Makarov S. S. //Inflammation-regulated expression of IL-10 inhibits the

»

recurrence of streptococcal cell wall (SCW)-induced arthritis in rat. -Arthritis and Rheumatism, (1998), vol. 41, No 9, p. S246.

2. Miagkov A. V., Kovalenko D.V., Brown C.E., Didsbury J.R., Cogswell J.P., Stimpson S.A., Baldwin A.S., Makarov S.S. // NF-кВ activation provoides the potential link between inflammation and hyperplasia in the arthritic joint/ -Proc. Nail. Acad.Sci USA, (1998), vol. 95, pp. 000-000. -в печати.

3. Makarov S.S., Miagkov A.V., Kovalenko D.V., Brown C,E., Didsbury J R., Cogswell J.P., Stimpson S.A., and Baldwin A.S. //NF-кВ controls apoplosis in arthritis/ -Arthiritis and Reumdtism, (1997), vol. 40, No 9, p. S254.

Заказ 969

Тираж 100 jКЗ.

Подписано в печать 19. <1.9S

Типография МИФИ, Каширское шоссе, 31

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Мягков, Алексей Витальевич, Москва

Московский Государственный Университет им. М.В. Ломоносова Биологический факультет Кафедра клеточной физиологии и иммунологии

на правах рукописи

Мягков Алексей Витальевич

Использование аденовирусного вектора для доставки и регулируемой экспрессии гена интерлейкина-10 т vivo

03.00.25 - клеточная биология

диссертация на соискание учёной степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор И.Г. Харитоненков

Москва -1998

Содержание

Содержание ____________________ -2

Список использованных сокращений__5

Введение_________________ 6

Обзор литературы _______9

Основные мишени генной терапии аутоиммунных заболеваний.__9

Экспрессия противовоспалительных цитокинов___9

Блокирование лиганд-рецепторных взаимодействий__10

Блокирование межклеточных взаимодействий_12

Подавление активации факторов транскрипции__14

Элиминация патогенных клеток______ 15

Восстановление поврежденной ткани_17

Методы доставки генетического материала__18

Использование чистой ДНК__18

Комплексы ДНК с полимерами__18

Вирусные системы доставки ___20

Ретровируеы ___________ 21

Аденовирусы____23

Аденоассоциированные вирусы (ААВ)___ 25

Сравнительная характеристика экспериментальных моделей ревматоидного

артрита ______________25

Адъювант-индуцированный артрит____26

Коппаген-индуцированный артрит_ 27

Протеогликан-ивдуцированный артрит__28

Материалы и методы_30

Аденовирусные векторы_30

Модель ревматоидного артрита_31

Получение первичных синовиоцитов__31

Измерение активности люциферазы_32

Определение активности промотора СЗ-компонента комплемента в первичных синовиоцитах in vitro, под действием LPS и про-воспалнтельных иитокинов__33

Анализ экспрессии гена интерлейкина-10 первичными синовиоцитамн, инфицированными аденовирусным вектором AdC3/IL-W_34

Определение биологической активности интерлейкина-10 по его влиянию на ДНК связывающую и транскрипционную активность NF-kB_35

Анализ активности промотора СЗ-компонента комплемента in vivo_38

Инъекция аденовирусных векторов, содержащих ген интерлейкина-10_39

Сбор внутрисуставной жидкости_40

Определение содержания IL-10 во внутрисуставной жидкости_40

Измерение диаметра суставов_ 40

Подсчёт числа клеток во внутрисуставной жидкости_41

Определение концентрации интерлейкина-6 и интерлейкина-1 во

внутрисуставной жидкости__41

Результаты_42

Активность промотора СЗ-компонента комплемента в первичных крысиных синовиоцитах регулируется липополисахаридом и про-воспалительными цитокинами_42

Активность промотора СЗ-компонента комплемента in vivo в суставах

животных после индукции экспериментального артрита_48

Регулируемая экспрессия гена интерлейкина-10, доставленного аденовирусным вектором AdC3/IL-10 in vivo._49

Терапевтический эффект экспрессии гена IL-10, доставленного в составе аденовирусного вектора AdC3/IL-10 в модели экспериментального артрита 51

Обсуждение полученных. результатов ______i_ ^ 53

Выводы_75

Список литературы__77

Список использованных сокращений

ААВ аденоассоциированные вирусы

ПААГ полиакриламидный гель

РА ревматоидный артрит

PC рассеянный склероз

СКВ системная красная волчанка

ФСБ фосфатно-солевой буфер

Ad адено

CMV цитомегаловирус

IL-ip итерлейкин-1 бета

IL-6 ингерлейкин-б

IL-10 интерлейкин-10

LPS липополисахарид

Pro промотор

TNFa фактор некроза опухоли альфа

Введение

Современной медицине известно более 80 аутоиммунных заболеваний, различающихся по своим клиническим проявлениям. Их общим свойством является наличие иммунного ответа против собственных антигенов, что приводит к развитию воспалительной реакции и разрушению тканей. В связи с этим, ингабирование иммунного ответа и регенерация повреждённых тканей служат основными стратегиями лечения аутоиммунных заболеваний.

В настоящее время известно много естественных белковых иммунорегуляторов которые способны специфически подавлять развитие иммунного ответа [Sozzani, S. et al. 1998; Geissler, К. 1996;]. Рекомбинантные формы природных иммуномодуляторов уже применяют в клинической практике, однако их использование ограничено нестабильностью и иммуногенностью подобных соединений [Asnis, L.A. an dm Gaspari, A.A. 1995;]. Кроме того их биологическая активность намного ниже по сравнению с природными молекулами. Также немаловажным фактором является высокая себестоимость таких терапевтических препаратов.

Генная терапия является новым перспективным методом лечения многих заболеваний включая аутоиммунные [Anderson. W.F. 1998; Chen, Y. 1998; Mathisen, P.M. and Tuohy, V.K. 1998;]. В основе данного метода лежит идея доставки «терапевтических» генов in vivo, что служит альтернативой использованию рекомбинантных белков. Для доставки «терапевтических генов

в клетки организма используют разные способы среди которых широкое распространение получила доставка генетического материала с помощью вирусных векторов [Anderson, W.F. 1998;], которые являются наиболее эффективными векторами, известными в настоящее время.

Одной из основных проблем генной терапии является создание векторов, позволяющих регулировать экспрессию доставленных in vivo терапевтических трансгенов. Известно, что аутоиммунные заболевания характеризуются наличием фаз острого воспаления, чередующихся с периодами относительной ремиссии. Постоянно высокая продукция терапевтических белков в организме может приводить к нарушению функциональной активности иммунной системы, делающему неприемлемым данный способ лечения.

Одним из способов регуляции экспрессии введённых терапевтических агентов является использование векторов, несущих в своём составе трансген под контролем промоторов, чувствительных к антибиотикам (тетрациклин, рапамицин) [Allgood, V.E. and Eastman, Е.М. 1997; Miller, N. and Whelan, J. 1997;]. В этом случае экспрессия терапевтического гена в организме полностью зависит or введения данных антибиотиков.

Альтернативным подходом является создание векторов, в которых экспрессия терапевтических генов находится под контролем промоторов, активирующихся при развитии воспалительной реакции в организме. В ар лей (Valley) и соавторами был сконструирован аденовирусный вектор, несущий промотор СЗ-компонента комплемента [Valley, A.W. et al. 1997;,]. Данный

промотор содержит участки связывания для факторов транскрипции активирующихся под действием про-воспалительных цитокинов (IL-ip, IL-6) [Kawamura. N. et al. 1992;], и таким образом потенциально возможно, что экспрессия генов, находящихся под контролем промотора СЗ-компонента комплемента, может регулироваться под действием про-воспалительных цитокинов. Полученные результаты указывают на возможность автономной регуляции экспрессии терапевтических генов, доставленных гп vivo в составе такого вектора [Miagkov, A.V. et al. 1998;].

Целью данной работы являлось изучение биологической активности аденовирусного вектора, несущего терапевтический ген под контролем промотора СЗ-компонента комплемента.

Обзор литературы

Основные мишени генной терапии аутоиммунных заболеваний.

Экспрессия противовоспалительных цитокинов

Патологические проявления аутоиммунных заболеваний связаны с нарушением в регуляции иммунной системы. Многочисленные данные указывают на «дисбаланс» между ТН1 и Тн2 субпопуляциями I-лимфоцитов [O'Garra, A. et al. 1997;]. Например развитие системной красной волчанки (СКВ) связано с чрезмерной активностью Тн2 субпопуляции Т-лимфоцитов, в го время как ревматоидный артрит (РА) и рассеянный склероз (PC) характеризуются сдвигом баланса в сторону TH1 [Link, H. 1998; Olsson, T. 1995;]. В основе деления лимфоцитов на ТН1 и Тн2 лежит различие в спектре продуцируемых ими цитокинов. Интерферон гамма (IFNy) и интерлейкин-2 (IL-2) являются примерами ТН1 специфических цитокинов, в то время как источником интерлейкина-4 (IL-4), интерлейкина-5 (IL-5) и интерлейкина-10 (IL-10) служат Тн2 [O'Garra, A. et al. 1997; Muraille, Е. and Leo, О. 1998; Romagnani, S. 1991;]. Показано, что перекрёстная регуляция между ТН1 и Тн2 лимфоцитами связанна со способностью ТН1-цитокинов ингибировагь активность Тн2-лимфоцитов, и наоборот. Это свойство Тн1/Тн2 цитокинов можно использовать для восстановления баланса между ТН1 и Тн2 субпопуляциями лимфоцитов, нарушающегося в случае аутоиммунных

заболеваний [Adorini, L. et al. 1996;]. Например использование IL-10 является новым перспективным методом лечения аутоиммунных заболеваний, связанных с гиперактивацией ТН1 лимфоцитов [Mosmaim, T.R. and Moore, K.W. 1991; Lalani, I. et al. 1997;]. Терапевтический эффект экспрессии гена IL-10 in vivo получен в экспериментальных моделях аутоиммунного диабета [Moritani, М. et al. 1996;], ревматоидного артрита [Whalen, J.D. et al. 1997; Apparailly, F. et al. 1998;] и рассеянного склероза [Mathisen, P.M. et al. 1997;]. Наряду с IL-10, для подавления гиперактивации ТН1 лимфоцитов используют и другие цитокины, в частности трансформирующий ростовой фактор бета (TGFp) [Song, X.Y. et al. 1998; Croxford, J.L. et al. 1998; Chernajovsky, Y. et al. 1997; Raz, E. et al. 1995:], IL-4 [Croxford, J.L. et al. 1998;], и интерлейкина-13 (IL-13) [Croxford, J.L. et al. 1998; Bessis, N. et al. 1998;]. Примером цитокина, продуцируемого TH1 лимфоцитами и используемого для лечения аутоиммунных заболеваний является IL-2. Терапевтический эффект гена IL-2 in vivo получен в экспериментальной модели СКВ [Gutierrez-Ramos, J.С. et al. 1990;].

Блокирование лиганд-рецепторных взаимодействий

Известно, что в сыворотке больных, страдающих аутоиммунными заболеваниями, повышена концентрация «провоспалительных» цитокинов [Arend, W.P. and Dayer, J.M. 1995;]. При помощи антител, распознающих различные цитокины, было показано, что основной вклад в развитие воспалительной реакции вносят интерлейкин-1 (EL-1), шггерлейкин-6 (П.,-6) и

фактор некроза опухоли (TNFa) [Àrend, W.P. and Dayer, J.M. 1995; Feldmann, M. et al. 1996; Maini, R.N. et al. 1997;]. Эти цитокины продуцируются ТН1 субпопуляцией Т-лимфоцитов [Muraille, Е. and Leo, О. 1998;]. Их биологическая активность опосредована специфическими рецепторами, экспрессирующимися на поверхности клеток. Цитокин-рецепторны е взаимодействия приводят к активации эффекторных клеток иммунной системы, сопровождающейся воспалительной реакцией. Блокирование взаимо действий провоспалительных цитокинов с рецепторами является одним из подходов ингибирования воспалительной реакции при аутоиммунных заболеваниях. В настоящее время для блокирования лиганд-рецепторных взаимодействий используются антитела, направленные против цитокинов и препятствующие их связыванию с рецепторами, а также рецепторы цитокинов в растворимой форме. Так например, инъекция антител, препятствующих взаимодействию TNFa или IL-1 с их рецепторами, приводит к подавлению развития экспериментального артрита [Maini, R.N. et al. 1997; Feldmann, M. et al. 1996;]. Основным недостатком антител, как терапевтических агентов, является их собственная способность активировать иммунокомпетентные клетки, опосредованная взаимодействием Fc-фрагмента иммуноглобулинов с Fc-рецепторами на поверхности клеток. Попытки использовать антитела, не несущие этот фрагмент, успеха не принесли из-за нестабильности подобных молекул [Chemajovsky, Y. et al. 1998;].

Более перспективным методом разобщения щггокин-рецепторных взаимодействий является использование растворимых форм рецепторов. В

качестве блокирующих агентов были успешно использованы растворимые формы рецепторов IL-1 [Doughty, L.A. et al. 1997; Bakker, А.С. et al. 1997: Ghivizzani, S.C. et al. 1998; Pelletier, J.P. et al. 1997; Makarov, S.S. et al. 1996;], IL-6 [Saggio, I. et al. 1997;] и TNFa [Doughty, L.A. et al. 1997; Ghivizzani, S.C. et al. 1998; Le, C.H. et al. 1997;]. Терапевтический эффект использования растворимых форм рецепторов показан в экспериментальных моделях ревматоидного артрита [Bakker, А.С. et al. 1997; Ghivizzani, S.C. et al. 1998; Le, C.H. et al. 1997; Muller-Ladner, U. et al. 1997b;], СКВ [Kalden, J.R. and Manger, B. 1998;] и ряда других заболеваний [Evans, C.H. and Robbins, P.D. 1994;]. Экспрессия таких молекул in vivo приводит к ингибироваиию биологической активности провоспалительных цитокинов, что сопровождается снижением уровня иммунного ответа и воспалительных реакций [Muller-Ladner. U. 1996;]. В настоящее время проведены первые успешные клинические испытания экспрессии антагониста рецептора EL-1 в лечении ревматоидного артрита [Evans, C.H. et al. 1996;].

Блокирование межклеточных взаимодействий

Для развития специфического иммунного ответа помимо распознавания антигена В- и Т-клеточными аюиген-специфическими рецепторами, необходимы дополнительные межрецепторные взаимодействия. Так например, взаимодействие CD40 - рецептора В-лимфоцитов с молекулой CD40L, эксиресснруемой на поверхности Т-хелперов, является одним из самых важных ко-стимуляторных сигналов для В-лимфоцитов [Banchereau, J. et al. 1994;]. Для активации Т-лимфоцитов необходимым сигналом является взаимодействие

между CD28 - рецептором Т-лимфоцитов и В7 - молекулой экспрессирующейся на поверхности антиген-презентирующих клеток [Wyss-Coray, Т. et al. 1993;]. Другим лигандом молекулы В7 является CTLA4 - рецептор цитотоксических Т-лимфоцитов, служащий «негативным» регулятором их функциональной активности [Greenfield, Е.А. et al. 1998;]. Блокирование CD40/CD40L и CD28/B7 взаимодействий приводит к подавлению иммунного ответа [Wyss-Coray, Т. et al. 1993; Greenfield, Е.А. et al. 1998;], следовательно, этот подход можно использовать в терапии аутоиммунных заболеваний. Первые положительные результаты блокирования CD40/CD40L взаимодействий получены в экспериментальной модели ревматоидного артрита [Durie, F.H. et al. 1993;], рассеянного склероза [Samoilova, E.B. et al. 1997;] и ряда других заболеваний [Kunzendorf, U. et al. 1996; Daikh, D.I. et al. 1997;]. Также был получен терапевтический эффект при разобщении CD28/B7 взаимодействия [Arima, Т. et al. 1996; Herold, К.С. et al. 1997;]. С этой целью использовали растворимую форму молекулы CTLA4, аффинность которой в 50 раз выше по сравнению с аффинностью CD28 [Greenfield, Е.А. et al. 1998;].

Развитие иммунного ответа также зависит от способности лимфоцитов мигрировать из кровотока через трансэдотелиальный барьер в район воспаления. Регуляция этого процесса осуществляется молекулами адгезии, экснрессирующимися на поверхности лимфоцитов и клеток эндотелия. Блокирование межклеточной адгезии является ещё одной мишенью генной терапии аутоиммунных заболеваний [Foster, С. А. 1996;].

Подавление активации факторов транскрипции

Транскрипционные факторы - это семейство белков, которые регулируют транскрипцию генов, связываясь со специфическими для каждого фактора мотивами ДНК в промоторной области гена. NF-кВ и АР-1 (activation protein 1) являются факторами транскрипции, активность которых ассоциирована с развитием воспалительных реакций [Barnes, P.J. 1997; Barnes, P.J. and Karin, M. 1997; Barnes, P.J. and Adcock, I.M. 1997;]. NF-кВ впервые был описан как белок, взаимодействующий с промотором гена каппа-цепи иммуноглобулинов [Sen, R. and Baltimore, D. 1986;]. В настоящее время показано, что промоторные области генов, кодирующих провоспалительные цитокины, такие как IL-1. 11,-6, TNF а, хемокин IL-8, молекулы адгезии ICAM-1, VCAM-1, Е-селектин и многие другие белки, содержат участки связывания NF-кВ [Baldwin, A.S., Jr. 1996;]. Также многие из перечисленных генов, продукты которых являются «маркёрами воспаления», помимо NF-кВ-сайтов несут и участки связывания АР-1 [Adcock, IM. 1997; Koj, А. 1996;]. Таким образом экспрессия этих генов находится под контролем этих транскрипционных факторов.

Исследования показали, что во многих случаях у больных аутоиммунными заболеваниями повышена активность NF-кВ и АР-1 [Asahara, II. et al. 1997; Sliiozawa, S. et al. 1997; Handel, M.L, et al. 1995;]. Иншбирование активности этих факторов в модельных системах приводит к подавлению воспалительной реакции и наступлению ремиссии. Например, введение в сустав двуцепочечных олигонуклеотидов, несущих участок связывания NF-kB,

подавляет развитие эксперимвитального артрита у крыс [Makarov, S.S. and Baldwin, A.S., Jr. 1996;].

Получены также первые положительные результаты, демонстрирующие эффективность блокирования активности фактора АР-1 в терапии аутоиммунных заболеваний. Активация АР-1 в синовиоцитах больных ревматоидным артритом ведёт к массивной продукции ферментов, разрушающих хрящевую и костную ткань. С целью инактивации АР-1 был использован белок junD, известный, как природный негативный регулятор активности АР-1. Экспрессия junD в синовиоцитах, культивируемых in vitro ведёт к остановке их пролиферации и блокированию продукции ферментов, разрушающих костную гкань [Wakisaka. S. et al. 1998;].

Таким образом, накопленные в настоящее время экспериментальные данные указывают на то, что активность транскрипционных факторов может являться одной из потенциальных мишеней генной терапии аутоиммунных заболеваний.

Элиминация патогенных клеток

Патологические проявления аутоиммунных заболеваний связаны с чрезмерной активностью определённых клеток, характерных для каждого заболевания. Например, разрушение хрящевой и костной ткани в артритном суставе связано с «гиперак п гаацией» синовиоцитов, клеток, окружающих полость сустава [Muller-Ladner, U. 1996;]. Активация синовиоцитов при ревматоидном артрите происходит под действием цитокинов и ростовых

факторов, продуцируемых активированными Т-лимфоцитами [Isomaki, P. and Puimonen, J. 1997;]. Элиминация активированных синовиоцитов может предотвратить разрушение сустава и остановить прогрессию артрита.

Показано, что при аутоиммунном диабете повышена активность цитотоксических Т-лимфоцитов, мишенью которых являются гшсули�