Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение экспрессии генов VP7 ротавируса свиней и секретируемой щелочной фосфатазы в составе геномов ремомбинантных аденовирусов

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Изучение экспрессии генов VP7 ротавируса свиней и секретируемой щелочной фосфатазы в составе геномов ремомбинантных аденовирусов"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ НАУК ВНИИ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННОЙ БИОТЕХНОЛОГИЙ

г: г~од :

1 6 МАЙ

ка правах рукописи

ДОРОНИН Константин Кузьмич

ИЗУЧЕНИЕ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ УРТ РОТАБИРУСА СВИНЕЙ И СЕКРЕТИРУЕМОЙ ЩЕЛОЧНОЙ ФОСФАТАЗЫ В СОСТАВЕ ГЕНОМОВ РЕЖШШАНТНЫХ АДЕНОВИРУСОВ.

(специальность ОЗ. 00. 03. - молекулярная биология)

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 1995

Работа выполнена во Всероссийском научно- исследовательском института сельскохозяйственной биотехнологии РАСХН.

Нзучный руководитель: доктор биологических наук,

Народицкий Б.С.

Официальные оппоненты: - член-корреспондент РАМН,

доктор медицинских наук, Каверин II.В. - доктор биологических наук, Орлянкин Б.Г.

Ведуща. 1 организация: Московская государственная

академия ветеринарной медицины и биотехнологии им. К. И. Скрябина, ка|)едра вегери1!арной вирусологии, микробиологии и биотехнологии.

Защита состоится и " 1995г.в час.

на заседании специализированного совета Д 020.40.01 при ЫШЙ сельскохозяйственной биотехнологии РАСХН (127550, Москва, ул. Тимирязевская, д.42,)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВНИИ сельскохозяйственной биотехнологии РАСХН.

Автореферат разослан " " 1995г.

Ученый секретарь специализированного совета, кандидат биологических наук

С.А.Меликова.

I I

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

_Мтхаданость__проблему. Важным этапом работ, связанных с рекомбинантнши ДНК, является введение (доставка) ДНК в клетки животных. Одним из наиболее эффективных методов является грансфекция с помощью вирусных векторов, которые способны обеспечить эффективность трансакции на порядок превышающую эффективность трансфекции при использовании стандартной методики преципитации с фосфатом кальция (GraJiam f.l. at al. 1992). Вирусный вектор позволяет вводить чужеродные гены в цитоплазму (а в случае Ад и в ядро) клетки, используя для этого природный механизм вирусной инфекции, что особенно важно, т.к. позволяет использовать этот метод in vivo, в организме животных. Сравнительно небольшой геном Ад позволяет относительно легко манипулировать с ним in vitro, встраивать чужеродные гены и генноиняенернне конструкции. Наличие так называемой "несущественной области" позволяет получать недефектный вектор, способный к размножению как в культуре клеток, так и в организме животного-хозяина. Имещиеся ■клеточные линии, трансформированные Ад, могут комплементировать мутанпше вирусы, имевдие делешш в EI области, что позволяет рассматривать такие вирусы как потенциальные векторы. Ад инфекция обеспечивает блок трансляции клеточных матриц и наработку большого количества вирусных продуктов, в том числе и продукта встроенного гена. Следовательно, Ад вектор может быть использован для получения белка в эукариотической системе, что обеспечивает его правильный посттрансляциошшй процессинг.

Рекомбинантные Ад. экспрессирушие антигены различных

вирусов, могут рассматриваться как генно-инженерные вакцины против заболеваний человека и животных. Многолетнее использование живых неаттеньшрованных человеческих Ад4 и Ад7 в качестве вакцин, предотвращающих острые респираторные заболевания, вызываемые Ад, убеждает в безопасности использования Ад в качестве вакцин. Особенно перспективным представляется использование генно-инженерных вакцин на основе Ад генома в тех случаях, когда природный тропизм вирусной инфекции совпадает с тропизмом Ад инфекции, как, например, в случае ротавирусов, что позволяет получать местный иммунный ответ у животных, вакцинируемых рекомбннантшм Ад (Preveo L. et al. 1989).

Б настс идее время интенсивно исследуются возможности использования вирусных векторов на основе Ад геномов как инструмента генной терапии для лечения . различных наследственных заболеваний и терапии злокачественных опухолей (Engelhardt J.F. et al. 1994).

_ Цо .та _ и _ з ад гта _ ис с ле г о q п ния. Целью настоящей работы являлось получение серии рекомбинантных Ад на основе генома Ад5, несущих кДНК гена VP7 рот а виру с а свиней штамма К, кодирующего белок внешнего капсида ротавируса и репортерный ген секретируемой щелочной фосфатазы (seap) в EI и ЕЗ областях Ад генома, сравнение уровней экспрессии встроенных генов в недефектном и дефектном по El области Ад генома Ад векторах иод контролем различных промоторов, изучение эффективности использования Ад вектора как средства доставки и экспрессии генов антисмысловых РНК.

В процессе работы предстояло: I. Получить серию недефектных и El-дефектных рекомбинанишх

Ад на основе генома Ад5, несущих в геноме и экплрессирупцих под контролем мьр и нет хе промоторов, соответственно, репортерный ген секретируемой щелочной фосфатазы, ген антисмысловой РНК. против мРНК секретируемой щелочной фосфатазы, кДНК гена УГ7 ротавируса евшей штамма К и ген антисмысловой РНК против гена ур7.

2. Провести исследование экспрессии гена секретируемой щелочной фосфатазы под контролем ?льр и нему 1е промоторов в недефектном и Е1-дефектном рекомбинантных Ад в различных клеточных линиях.

3. Исследовать экспрессию гена \ГР7 в составе геномов недефектного и Е1-дефектного рекомбинантных Ад.

4. Изучить эффект подавления экспрессии гена секретируемой щелочной фосфатазы асРНК, кодируемыми геномами рекомбинантных Ад. Провести исследование влияния экспрессии гена асРНК трт в составе генома рекомбинантного Ад на репродукцию ротавируез в культуре клеток млекопитающих.

_5згзв§я__новизна__и__звжтгтческая__зу<этдуостБ. В результате

проведешюй нами работы впервые получены данные об экспрессии репортерного гена секретируемой щелочной фосфатазы под контролем мьр и нсют ге промоторов в составе генома недефектного и Е1-дефектного рекомбинантных аденовирусов в линиях клеток млекопитающих различного тканевого и видового генеза. Полученные рекомбинантные Ад, экспрессирушие ген беар могут быть использованы для определения возможности доставки чужеродного генетического материала с помощью Ад вектора в любые тестируемые эукариотические клетки и количественного определения уровня экспрессии в данной клеточной системе.

Ротавирусные инфекции являются причиной заболеваний с

высоким уровнем смертности у человека и сельскохозяйственных животных. Экспрессия белков ротавирусов в составе. Ад генома с целью получения генно-инженерных вакцин является одним из наиболее перспективных подходов в созданию протективного иммунитета к ротавирусной инфекции (Greenberg н.в. 1994). Нами были впервые получены рекомбинантные Ад, несущие в геноме кДНК гена VP7 ротавируса свиней, и показана экспрессия данного гена в составе геномов рекомбинантных Ад под контролем mlp и iicmv ie промоторов. Полученные данные позволяют перейти непосредственно к изучению возможности использования данных рекомбинантных Ад как генно-инженерных вакцин против ротавируса свиней.

Били получены рекомбинантные Ад, несущие в геноме гены асРНК против мРНК гена секретируемой щелочной фосфатазы и гена VP7 ротавируса свиней. Исследование влияния экспрессии генов антиемнеловых РЖ против мРНК гена секретируемой щелочной фосфатазы и гена vpt ротавируса свиней, кодируемых геномами рекомбинантных Ад, на уровень экспрессии гена мишени в первом случае и репродукции ротавируса во втором показали перспективность использования Ад вектора для доставки и экспрессии генов антисмысловых РНК. Учитывая что Ад вектор может быть использован 1л vivo, на уровне организма, получетше данные позволяют предположить возможность использования рекомбинантных Ад, несущих гены асРНК как инструментов генно-терапевгического воздействия. Апробауия_работы. Результаты работы были доложены и обсуждены на расширенном заседании отдела генной инженерии ВШИ Сельскохозяйственной биотехнологии и на v конференции РФ "Новые направления биотехнологии" ( май 1992, Пушшо).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 4 печатных работы.

Структура_работы. Диссертационная работа состоит из: введения,

глав "Обзор литературы", "Материалы и методы",

"Результаты","Обсувдение результатов", "Вывода" и списка

литературы. Работа изложена на 116 машинописных страницах, включая 3 таблицы и 22 рисунка.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

Одним из методов современной молекулярной биологии, служащим для изучения экспрессии генов, является использование "репортерных" генов. Эти гены кодируют - ферменты или протеины, которые могут быть легко определены количественно в смеси других белков (j.Alam et al. 1990). Встраивание репортерного гена под промотор, энхансер или другие регуляторные последовательности, с дальнейшим представлением таких конструкций в клетку, позволяет оценивать ■ влияние этих элементов на уровень экспрессии репортерного гена. Мы впервые использовали для количественной оценки уровней экспрессии встроенного гена в составе рекомбинантных Ад геномов репортерный ген секретируемой щелочной фосфатазы (seap), полученный модификацией гена плацентарной щелочной фосфатазы человека (piap). (Berger et al 1938). Встраивание репортерного гена в различные регионы Ад вектора под контролем различных промоторов позволяет изучить особенности доставки чужеродного генетического материала и его экспрессии в составе Ад вектора в различных клеточных линиях, а также in vivo, в организме животшх.

Ген урт ротавирусов кодирует белок внешнего капсида ротавируса, ответственный за адсорбцию на клеточной мембране, представляющий собой гликопротеин с молекулярной массой 37 кДа и вызывающий образование вирус-нейтрализущих антител. Интересной особенностью структуры гена УР7 является его предположительная бицисгроность. Белок УР7 котрансляционно направляется в эндоплазматический ретикулум (ЭР), прикрепляется к внутренней стороне мембраны ЭР и гликозилируется. Экспрессия гена \ПР7 ротавируса свиней в составе генома рекомбинантного аденовируса является одним из подходов к созданию генно-ттенерных вакцин против ротавирусных инфекций.

I. Конструирование рекомбинантных аденовирусов, содержащих в геноме ген секретируемой щелочной фосфатазы и кДНЖ гена УР7 ротавируса свиней штамма К.

Б работе были получены недефектные рекомбинантные а<15Ю/20, а(15ку20н, Ас15КУ14/ур7, несущие гены беар и УР7 в ЕЗ области Ад генома под контролем эндогенного главного позднего промотора Ад5 и Е1-дефектные Аа5\т<2В/зеар, айб'укгв/беарн, АД5УК28/ур7, а(15то28/ур7н, несущие гены зеар и ур7 под контролем нему 1е промотора. Гены, кодирушие беар и ур7 встраивали в плазмидные векторы рН5КУ14 и рте28, которые несут, соответственно, правый и левый концевые фрагменты генома Ад5 с делецией ЕЗ(рН5КУ14) и Е1(рУК28) областей Ад генома и имеют уникальные клонирущие сайты в месте делений. Рекомбинантные вирусы получили котрансфекцией полученных плазмидных конструкций с перекрывающимися фрагментами Ад генома в культуре клеток линии

Недефектные вирусы (замещена ЕЗ область генома Ад)

Условно-дефектные вирусы ] (замещена Е1 область генома Ад)|

Вирусы, несущие в геноме ген БЕАР.

МХР

ЖАР

7вЗ М.Т11

.00

АЛ5КУ20

шд>

—

~1—

1«

ЖАР

со

А(15КУ20К

интрон И сшш доли А

ЯЕАР

НСМУ Ш п^юмотор

>1.5 9.3

Аг15УК28/БЕАР

илтрон и сигнал поди А

£ЯАР

нему пз

промотор

Йз

1.3 ».3

Тео

А<15УК28/ЗЕАРН

Вирусы, несущие в геноме кДНК гена УР7 ротавирусг

иш>

УР7

Ж^ео

АЛ5КУ14/УР7

хгнтрох д

сш-аал поля А

УР7

НСМУ1В прмотор

р5

"1.3

9.3

Ас15УК28/УР7

100

взтроа в

екгяал полз А

I УР7

Г

в!

НСМУШ д^омотор

Последовательности Адб

«1Л 9.3

ШМ Последовательность гена БЕАР А<15УК28/УР7Г*

Последовательность кДНК гена УР7

Рис. I. Структура геномов рекомбинантных аденовирусов.

293. Структура геномов рекомбинантных вирусов представлена на рис. I. Вирусы Ad5KV20R, Ad5VK28/SEAPR,Ad5VK28/VP7R НССуТ чужеродные гены в ориентации, обратной направлению транскрипции т.е. представляют собой гены антисмысловых РНК против мРНК SEAP и VP7, соответственно.

Работа по получению рекомбинантных Ад проводилась совместно с ст.н.с. Института биологии гена РАН Гриненко Н.Ф.

2. Экспрессия гена секретируемой щелочной фосфатазы и гена VP7 ротавируса свиней в составе геномов рекомбинантных аденовирусов.

2.1 .Экспрессия__гена__секретируемой_щелочной__фосфатазы___под

контролем главного позднего промотора Ад5 и под контролем нему те промотора. На поздней стадии вирусной инфекции клеток 293 линии рекомбинантным аденовирусом ad5kv20 культуральная жидкость была отобрана и содержащиеся в ней белки исследовались электрофорезом в SDS-Полиакриламидном геле (рис. 2), После заражения рекомбинантным аденовирусом множественностью 10 БОЕ/клетку, ростовую среду заменяли на MEM без сыворотки. На 72-й час после заражения аликвота культурашюй жидкости была отобрана, и содержащиеся в ней белки разделялись электрофорезом в I0JS ПААГ (Laetttnli.1970), визуализировались окрашиванием Coomassie blue, электрофореграмма денситометрировалась, В качестве отрицательного контроля использовалась культуральная жидкость клеток лшши 293, инфицированных в таким же образом ad5 дикого типа. Нативный seap белок представляет собой димер. Поэтому в одном случае для достижения полной диссоциации субъединиц

растворенная в буфере для нанесения проба прогревалась 95° 15 мин.(трек 2), а в другом случае прогрева не проводили и буфер для нанесения содержал 50мМ dtt (трек 3). На электрофореграмме (рис. 2), таким образом, присутствуют полностью диссоциированный на субъедашицы белок (В), и димер (А). Дймер seap сохранял ферментативную активность, которая выявлялась как в геле, так и после электропереноса на нитроцеллюлозу (грек 5 рис. 2) .В нашем опыте масса субъединицы seap составляла около 67кД.

Денситометрия электрофореграммы позволила определить, что содержание белка seap в культуральной жидкости клеток 293 линии составляло 13,6% от тотального белка или 50 мкг seap белка на 1млн инфицированных клеток. - Ранняя ЕЗ область генома Ад5 расположена мекду поздних областей генома, считываемых с главного позднего промотора, но экслреисируется на ранних стадиях инфекции с собственного ЕЗ промотора. Как было показано ранее, вставка, замещающая ЕЗ область генома, будучи поставлена в прямой ориентации относительно левого конца генома Ад5, может эффективно экспрессироваться как с раннего, так и с главного позднего эндогенных промоторов, используя также эндогенные аденовирусные сигналы сплайсинга и полиаденилирования. (Davis et al.,19S5; Dewar et al., 1989; Johnson et al.,1988; Schneider et al.,1989). Мы исследовали кинетику накопления фосфатэзной активности в культуральной жидкости клеток линии 293, пермиссивных для аденовирусов человека (Graham F.L. et.ai.l97T). а также полупермиссивных клеток линии Rat2, инфицированных Ad5KV20. Монослои клеток соответствующих линий инфицировали Ad5KV20 с множественностью 10 БОЕ/кл. В клетках линии 293 была обнаружена экспрессия

seap на ранних стадиях инфекции (4-IS часов после инфекции), что соответствует включению раннего ЕЗ промотора и затем резкое увеличение скорости накопления белкового, .продукта происходило около 18 часов после инфекции (включение главного позднего промотора и репликация вирусного генома) и достигало плато после 80 часов после инфекции. Высокая чувствительность метода, позволяла обнаруживать достаточно низкие активности SEAP на ранних стадиях инфекции, (рис.ЗА). Кривая экспрессии seap сходна с полученными ранее кривыми синтеза аденовирусных белков р процессе литической инфекции (wold S.M. et al. 1978). При инфицировании Ad5KV20 полупержссивных клеток rat2 (Gailimore Р.Н. 1974), блокируется стадия вирусной репликации и снижается уровень синтеза поздних белков. Мы наблюдали отсутсвпе резкого увеличения ферментативной активности в культуралыюй жидкости в промежуток времени, соответствующий поздней стадии литической инфекции.

Ad5vK28/SEAP не содержит EI области Ад генома и способен к репликации только в метках линии 293, комплементирутацей данный дефект, однако способен инфицировать животные клетки различного происховдения, при этом происходит проникновение генома вируса в клеточное ядро и экспрессия генетического материала рекомбинантного вируса, причем для всех клеток, кроме линии 293 выражение вирусных генов не происходит из-за отсутствия белков EI области, которые необходимы для трансактивации Других ранних и поздних вирусных генов (Graham f.l. 1991). Мы исследовали кинетику накопления seap в культуральной жидкости- различных клеточных линий, инфицированных Ad5VK28/SEAP с множественностью 10 ЕОЕ/кл. (Рис.ЗБ). Уровни экспрессии были сравнимы с уровнем экспрессии

в недефектном рекомбинанте ad5kv20 на ранних стадиях инфекции (до начала репликации генома). Интересно отметить, что несмотря на пермиссивность линии 293 для ad5vk28/seap резкого увеличения уровня синтеза seap на поздних стадиях инфекции не происходило, что, видимо, объясняется блоком трансляции sea? матриц, лишенных грехчастного лидера, характерного для поздних мРНК Ад.

2.2.Экспрессия гена VP7__под__контролем главного__позднего

промотора Ад5 и под контролем hcmv IE промотора. Рекомбннантный Ací5kvI4/vp7 является недефектным, т.к. несет интактную EI область Ад генома н, следовательно, способен к репродукции в различных клеточных линиях, например 293, Не la, кв, А549 и других и, кроме того к ограниченной репродукции в клетках других млекопитающих. Ген vp7 в данном вирусе находится под контролем раннего ЕЗ и главного позднего промоторов Ад5 и, следовательно, транскрипция гена происходит как на ранних, так и на поздних стадиях инфекции. Детекция экспрессии v?7 рекомбинантным M5kvI4/v?7- проводилась с использованием иммунопрецшштации s-^-меченных клеточных 'экстрактов антителами кролика, полученными в результате иммунизации CsCl-очищенными вирионами свиного ротавируса штамма К. (рис.44) опыт проводили на меточной линии HeLa. В качестве отрицательного контроля использовали Ад5 дикого типа и незараженные клетки. В качестве положительного контроля использовали иммунопрецигаиат клеток линии МАЮ4, инфицированных ротавирусом свиней штамм К. Белковый продукт VP7 обнаруживался на ранних стадиях инфекции (до 14 часов) и его количество возрастало на поздних стадиях инфекции (после

14 часов). Молекулярный вес рекомбинантного VP7 был идентичен молекулярному весу VP7, продуцируемого ротявирусом и составлял 37 кДа, что позволяет предположить, что белок VP7 в данной системе экспрессии проходит правильный посттрансляционный процессинг.

Ad5VK28/VP7 является условно-дефектным вирусом, т.к. не содерют EI области Ад генома и способен к репродукции только в клетках линии 293, комплементирующей EI делецшэ, однако способен инфицировать животные клетки различного происхождения, т.е. осуществлять .доставку чужеродного генетического материала и может быть безопаснее, чем недефектный вектор по способности вызывать побочные эффекты, обусловленные эксЛрессией гинов аденовируса. Детекция экспрессии VP7 рекомбинантным Ad5VK28/m проводилась аналогично детекции экспрессии Ad&KVi4/vp7. , Количество синтезируемого инфицированным рекомбинантным Ад клетками бежа было сходным с количеством белка, продуцируемым клетками, зараженными недефектным рекомбинантным Ad5KVl4/VP7 на ранних стадиях Ад инфекции.

рекомбинантный VP7 давал при одномерном пептидном картировании (частичный протеолиз белка по cieviend) с использованием протеазы V v|i staphilocoocus aureus продукты протеолиза, аналогичные таковым при протеолизе VP7, полученного из клеток, инфицированных ротавирусом свиней штамм К, что свидетельствует о правильном процессинге ротавирусного белка в системе экспрессии в составе Ад генома, (рис. 4Е). Мы полагаем, что Ad5KVl4/vP7 и Ad5VK28/vP7 могут быть возможными кандидатами на роль генно-инженерных вгкцин против ротаьируса свиней. Причем недефектный Ad5Kv!4/vP7 может' иметь

M 1 2

! "I

5 6

tsi'Î.S.ïî

Si

A—>-

-B—»- i

Рис.2. Экспрессия SEap в клетках 293 линии, инфицированных Ad5KV20. Греки:

1- Ad5 инфицированные клетки, проба с предварительны!»« прогревом - отрицательный контроль;

2-Ad5KV20 инфицированные клетки, проба с предварительным прогревом;

3-Ad5KV20 инфицированные клетки;

4- Ad5 инфишфовашше клетки - отрицательный контроль;

5- энзимогрямма; Ad^KV20 инфицированные клетки;

6- энзимограмма; Ad 5 инфицированные клетки отрицательный контроль;

M - маркеры: р-галактозвдаза, В5А, овальбумин.

Буквами обозначены димер seap белка (А) и его дассоциирова1шая

на субъедшшцы форма (В).

Б.

и о н

«

i 3

и л

Rat2

20 40 во

Часы после инфекции.

-а: 293

HeLa МА104

20 30 40 SO ео 70 во

Часы после инфекции

Рис.3 А. Кинетика накопления активности SEAP в культуральной жидкости клеток линии 293 и Rat2, инфицированных АД5Ю/20.

Б. Кинетика накопления активности seap в культуральной жидкости клеток линии 293, HeLa и МА.104, инфицированных ad5vk28/seap.

А.

кДа

9766-

i 2

4 5 6 7 8 9

. с

45- ; -•"» <........» < «;;„>. ,>

30- _

«Г «У* « л

-УР7

Б.

кДа 97-

1

66453014-

о 0>

О

«УР7

Продукты протеолиза

24 часа

рис. 4 А. Радоюишунопрецитштация УР7, экспрессируемого рекомбинантными Ас15К'Л4/УР7 и А151Ж28/УР7. Треки:

1-маркеры молокулярных масс.

2-нсинфицирова1шые клетки НеЬа.

3-инфекция Ай5 12 чаоов>

4-инфекщ1я Ас15ку14Уур7

5-илфекция Ас35

6-шгфекция Ас15КУ14/УР7

7-маю4, инфицированные ротавирусом свиней штамм К (8 часов)

8-инфекция Ас15та23/ур7Н 24 часа

9-инфекция М5ук28/ур7

Б. Одномерное пептидное картирование рекомбинантного белка V?7. Линии:

1-протеолиз УР7 из клеток МаЮ4, инфицированных ротавир. -ом свиней штамм К

2-цротеолИ" 1-'Р7 из клеток НеЪа, ИНфИЦИроваННЫХ Ас15КУ14/УР7

преимущество вследствие возможности его ограниченной репродукции в животном, но условно-дефектный, лишенный Е1 области Ад генома, Ы5УК2в/гР7 может быть более безопасным в отношении возможных побочных эффектов. На следующем этапе мы планируем исследовать образование антител против ур7 у лабораторных животных, инокулированных рекомбинантными Ад. несущими ген т.

Данная работа проводилась совместно с ст.н.с. ВНИИ сельскохозяйственной биотехнологии Юровым Г.К.

3. Влияние экспрессии генов антисмысловых РНК против мРНК секретируемой щелочной фосфатазы и УР7 в составе геномов рекомбинантных аденовирусов на экспрессию гена секретируемой щелочной фосфатазы и репродукцию ротавируса в культуре клеток.

Антисмысловые (апи.чепзе) РНК и . ДИК были успешно использованы ддя изучения функционирования' различных генов. Большой интерес представляет также изучение возможностей • ингибирования функции некоторых генов с использованием антисенс-механизма, в частности, как возможный подход в лечении злокачественных опухолей, некоторых наследственных и ненаследственных заболеваний вызванных повышенной по отношению к норме функции генов, а также для создания т.н. исскуственного ангисенс-иммуните та к вирусным инфекциям (Тихоненко Т.И. 1988). Одной из важных проблем остается проблема доставки антисмысловых последовательностей в клетку. Одним из способов является использование для этой цели вирусных векторов. Мы изучали возможность доставки и

экспресс™ генов знтисмысловых РНК с помощью аденовирусного вектора. В качестве модельной системы был использован ген БЕАР, ферментативная активность белкового продукта- которого легко и количественно детектируется в культуральной жидкости.

3-I. Подавление экспрессии гена_____секретируемой_____щелочной

Конструирование недефектного Аа5КУ20И и Е1-дефектного Ас15УК28/ЗЕАРЕ , несущих ген беар в в обратной ориентации под контролем мьр и нсму 1е промоторов, соответственно было описано выше (рис. I). Полученные рекомбинантше АД5КУ2С® и аг15тазе/беарн при инфицировании ими клеток не продуцировали белок зеар, что было показано по отсутствию ферментативной беар- активности в культуральной жидкости клеток линии 293 на которой данные вирусы накапливали. Проводилось тестирование ингибирования экспрессии эеар в культуральной жидкости клеток НеГл, предзараженных Е1-дефектным Ай5та28/ЗЕАР, экспрессирующим беар под контролем нем 1е промотора при последующей инфекции рекомбинзнтными недефектным АсВДУгои (рис. 5А) и Е1-дефектным Аазтегв/ЗЕАРИ (рис. 5Б), несущими ген беар в обратной ориентации под контролем мьр и нему 1в промоторов, соответственно. Клетки линии НеЬа заражали ай5ук28/беар с множественностью 10 БОЕ/кл и через 12 часов супершфицировали к&ьтгоъ с множественностью 5 БОЕ/кл или Ad5ук28/сеарй с множественностью 100 БОЕ/кл. Контролями служили Ad5 дикого типа и Аа5УК28/ур7И, соответственно. При суперинфекции контрольным Ай5УК28/УР7В мы наблюдали снижение экспрессии ;ена эеар на 16%, что, предположительно, можно

объяснить интерференцией рекомбинантных вирусов при совместной инфекции либо токсическим эффектом, высоких доз вируса на клетки (рис. 5Б). При суперинфекши недефектными вирусами, несущими интактную Е1-область генома, наблюдался хелперный эффект по отношению к Е1-дефектному А(15УК28/БЕАР (рис. 5А). Максимальное наблюдаемое снижение активности фермента по отношению к контролю составило 77 % для Ай5КУ2сж и 78% для ай5ук28/5еаре. Для Е1 дефектного а45^к28/8еарн уровень ингибирования был одинаков для 1-3 суток после суперинфекцш. Для недефектного ай5КУ20 ингибированИе на I сутки после суперинфекции составляло 26% от контроля, на 2 сутки- 76% и на 3 сутки- 77%, что отражает включение главного позднего промотора, под контролем которого ген асРНК против мРНК беар находится в данном рек'омбинанте.

Высокие уровни ингибирования • достигались высокой множественностью инфекции для Е1-дефектного вируса или высоким уровнем экспрессии гена асРНК, обусловленным транскрипцией с главного позднего промотора Ад5 в случае недефектного вируса. 3.2. _|Шшш_экспресе£и _гена_ацтисшсловой_Щ_про^_^Щ{_ да в_сос1аЗ§_геаома_рееомбшантного__§5ендевдуса__на ротавируса свиней в культуре клеток. В качестве гена-мишени при подавлении вирусной репродукции антисмысловдаи полинуклеотидами обычно используют ранние вирусные гены, кодирующие трансактиваторы, другие гены, кодирующие белки, необходимые для репродукции вируса и представленные в инфицированной клетке в небольшом количестве. В некоторых случаях описано ингибирование вирусных инфекции энтисмысловыми полинуклеотидами к структурным вирусным генам. Мы использовали в работе в качестве мишени ген ротавируса, кодирущий белок УР7

а и 50 О

Ч

К чо

Б.

£

от

о и

С"1

3

. 13

м

е12 3»

ч 9

я 9 8

Ч

Ы 7 2

в

< 5

м *

Й э § 2

я 1 и 1 н

1 2 3

Сутки после суперпнфекции.

Суперинфекция: • - - -. без суперинфекции

--АЙ5УК28,УР7Я

-а(35\/к28,'бедре?

.1

..Г'

4

г

1.0 1.5 2.0 2.5 3.0

Сутки после суперинфекции.

*

рис 5.А. Ингибирование экспрессии беар в клетках линии НеЬа, инфицированных АаБУкгв/ЗЕАР при суперинфекции рекомбинантным недефектным ланю/гст.

Б. Ингибирование экспрессии беар в клетках линии н..г,а, инфицироватшх Ас^Укгв/ЗЕАР при суперинфекции рекомбинантным Е1- дефекты.™ Ай'жгв/ЗЕАга.

внешнего ротавирусного капсида, обеспечивающий адсорбцию вириона на клеточной поверхности. Уменьшение количества матричной РЩ VP7 при действии антисмысловой РНК, как можно предположить, должно приводить к снижению титра дочернего вируса за счет снижения инфекционности дочерних вирусных частиц. Кроме того, матричная РНК гена VP?, как и мРНК других генов ротавируса служит матрицей для синтеза второй цепи двухцепочечного РНК-генома ротавируса и, следовательно, недостаток любой из II мРНК ротавируса может приводить к снижению титра дочернего ротавируса в инфицированных клетках.

В качестве средства доставки гена асРНК vp7 в клетки использовали Е1-дефектный рекомбинантный вирус Ad5VK28/vi7B, несущий ген vp7 в обратной ориентации под контролем hcmv ie промотора (рис. I). Клетки линии MAI04 непермиссивны для El-дефектных рекомбинантных Ад, т.к. не несут El области Ад генома. Однако в последних работах, посвященных El-дефектным Ад было показано, что вирусные гены могут в некоторой степени экспрессироваться даже при отсутствии продуктов El области т.е. геном El- дефектного Ад может в некоторых случаях не. являться инертным носителем чужеродной генетической информации (Engelhardt j.f. 1994). Мы провели исследование влияния предзаражения El-дефектным вирусом Ad5VK28/seapr на репродукцию ротавируса свиней штамма К в клетках линии MAI04 при низкой множественности инфекции ротавирусом (0.01 Т1%/кл) т.е. в условиях иногораундовой репродукции ротавируса. Был обнаружен эффект ускорения репродукции ротавируса при предзаражении клеток EI-дефектным аденовирусом (рис. 6А), который, как мы предполагаем, может быть обусловлен активацией белка внешнего капсида ротавируса vp4

(гемагглютинин ротавируса) кодируемой геномом Ад трипсин-подобной протеазой. Поэтому в качестве контроля в экспериментах по изучению влияния экспрессии гена асРНК VP7 в составе El-дефектного генома Ad5VK28/\rP7R на ротавирусную инфекцию в культуре клеток мы использовали клетки, предзаражегоше Ad5VK28/SEAïR.

Клетки листа маю4, пермиссшзные для ротавирусов группы А (Estes M.К. et al. 1989) инфицировали AdSVK28/VP7R ИЛИ контрольным вирусом a35vk28/seapb, несунмм ген seap в обратной ориснгашш под контролем всму те промотора с множественностью 10 БОЕ/кл и через 24 часа ¡слетки суперкнф.'щировали ротавирусом свиней штамма К с множественностью инфекции 0.01 ШД^/кл и культивировали далее в бессивороточной среде, содержащей трипсин. На Э сутки после инфекции выхода дочернего ротав1фуса определяли титровашюм. (рис. 6Б). Ингибирование репродукции ротавируса, обусловлегатое экспрессией , асРНК VP7 аденовирусом составляло 90% от контроля.

Полученные нами данные об экспрессии генов VT7 ротавируса и

секретируемой щелочной фосфат азы в смысловой и антисмысловой

ориентациях в составе геномов рсномбинантных аденовирусов на

основе генома Ад5 позволяют заключить, что эукариотическис

векторы на основе геномов Ад представляют собой эффективное

средство доставки и экспрессии чужеродного генетического

материала в клетках млекопитающих. Одной из перспективных

задач конструирования Ад векторов остается повышение уровней экспрессии встроенных в Ад геном генов либо за счет применения более сильных промоторов, либо повышением копийности встроенных генов; другим актуальным направлением является дальнейшая аттеньюация рекомбинантшх Ад, что позволило бы расширить возможности применения данной векторной системы.

А.

СО &

о. £

Пред!аражение' А)5УК28/ЗЕАРР!-100 БОЕ/кп.

---А1Р/К28/ЗЕАРР}-10 ЬОЕЛЛ.

Бе> лрвдэаражения А<1

9 10 11 13 13

Сутки посла инфицирования ротавирусом

Б.

Предзараженив-

□□ М5УК28ВЕАРК-10 БОЕОот,-отрицательный контроль ЕЛ Ай5УК23№7К-10 БОЕ/кп.

9 суток после инфицирования ротавирусом

5

рис. 6 А. Влияние предзаражения Е1-дефектным аденовирусом на репродукцию ротавируса в культуре клеток Щ104.

Б. Влияние экспрессии гена асРНК против гена П7 ротавируса в составе генома Е-1 дефектного рекомбинантного аденовируса на репродукцию ротавируса в культуре клеток.

« *

ВЫВОДЫ:

1) Получены недефектный и Е1-дефектннй рекомбинантные аденовирусы на основе генома Ад5, несуше в геноме репортершей ген секретируемой щелочной фосфатазы под контролем промоторов главного позднего Ад5 и нему 1Е.

2) Исследованы кинетика и уровни экспрессии гена секретируемой щелочной фосфатазы в составе геномов недефектного и Е1-дефектного рекомбинантных аденовирусов под контролем промоторов главного позднего Ад5 и псот ХЕ в различных клеточных лизшях. Показан высокий уровень экспрессии (50 мкг./млн. клеток) гена секретируемой щелочной фосфатазы в составе генома недефектного ла5ЮГ20.

3) Впервые получены недефектный и Е1-дефектный рекомбинантные аденов1фусы на основе генома Ад5, несущие в геноме кДИК гена ГР7, колфукцего белок внешнего капевда ротавируса свиней'; штамм К под контролем промоторов главного позднего Ад5 и пет те.

4) Показано, что полипептид, продуцируемый клетками, инфишфованнкми рекомбинантннми аденовирусами идентичен белку УР7 ротавируса сшшей штамм К по электрофоретичсской подвижности, антигенным свойствам и по результатам одномерного петидного картирования.

5) Получены рекомбинантные аденовирусы, несущие в геноме гены асРНК против мРНК секретируемой щелочной фосфатазы и гена ?Р7 ротавируса свиней под контролем промоторов главного позднего Ад5 и нему 1Е.

6) В модельной системе репортерного гена секретируемой щелочной фосфатазы впервые показана возможность использования аденовирусного вектора для доставки и экспрессии генов антисмысловых РНК. Показано, что экспрессия гена асРНК против гена УР7 ротав:фуса снижает уровень репродукции ротавируса в культуре клеток МАЮ4.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

I. Доронин К.К., Б.А.Кругляк, Н.Ф.Гриненко, Е.В.Прогонова, Н.А.Гродницкая, Б.С.Народшцшй, Т.И.Тихонанко. Получение недефектного аденовирусного вектора на основе генома Ад5 с ЕЗ областью, замещенной плазмидной ДНК с геном устойчивости к канамищшу.// Мол. генетика, микробиология, вирусология.-1993- №i. 31-352. Народищшй Б.С., Доронин К.К., Захарчук А.Н., Гриненко Н.Ф., Каверина E.H., Слезингер М.А Конструирование рекомбинантных аденовирусов и их использование для наработки биологически-активных веществ in vitro и получения трансгенных животных.// V конференция Российской Федерации "Новые направления биотехнологии". Тезисы. Пудашо, 1992, стр. 31.

3. Doronln K.K., A.N. Zakharchuk, K.P. Grlnenko , G.K. Yurov, V.A. Krougliak and B.S. Naroditsky. Expression of the gene encoding secreted placental alkaline phosphatase (SEAP) by a nondefective adenovirus veotor // Gene, 1993, V. 126. pp. 247-250.

4. K.K. Доронин, Г.К. DpoB, Н.Ф. Гриненко, А.Н. Захарчук, Т.С. Денисова, Т.М. Бабурина, В.А. Кругляк, Б.С. Народшдкий. Экспрессия гена, кодирующего белок капсида VP7 ротавируса свиней в составе генома недефектного рекомбинантного аденовируса.// Мол. генетика, микробиология, вирусология.- в печати.

/