Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Исследование мембранодестабилизирующих свойств гликопротеина NSP4 ротавирусов
ВАК РФ 03.01.04, Биохимия
Автореферат диссертации по теме "Исследование мембранодестабилизирующих свойств гликопротеина NSP4 ротавирусов"
на правах рукописи
00460
693
Пономарева Наталья Вячеславовна
Исследование мембранодестабилизирующих свойств гликопротеина №Р4 ротавирусов
03.01.04. - биохимия
Автореферат
диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
2 ЗАПР^й
Нижний Новгород - 2010
004601693
Работа выполнена в ГОУ ВПО «Нижегородском государственном университете им. Н.И. Лобачевского» и ФГУН «Нижегородский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. акад. И.Н. Блохиной» Роспотребнадзора
Научный руководитель:
Официальные оппоненты:
доктор биологических наук, профессор
Новикова Надежда Алексеевна
доктор биологических наук, профессор
Корягин Александр Сергеевич
доктор медицинских наук, Лавровский Сергей Николаевич
Ведущая организация:
Нижегородская государственная медицинская академия
Защита состоится: « » 2010 г. в час СОтт на заседании
диссертационного совета Д. 212.166.15. при Нижегородском госуниверситете им. Н.И. Лобачевского по адресу: 603950, Нижний Новгород, пр. Гагарина, 23. С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ННГУ.
Автореферат разослан: « в » ССН^и^^ 2010 г.
Ученый секретарь
диссертационного совета, __
кандидат биологических наук / C.B. Копылова
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. Гликопротеин NSP4 ротавируса обладает свойствами энтеротоксииа и играет ведущую роль в патогенезе ротавирусной инфекции, которая обусловливает до 70% случаев госпитализаций детей с острой кишечной инфекций в возрасте до 5 лет и является частой причиной смертности детей в развивающихся странах [Glass R.I., 2005]. Энтеротоксин NSP4 имеет молекулярную массу 20,2 кДа и представляет продукт трансляции 10 сегмента днРНК генома ротавируса [Estes М.К., Cohen J.,1989].
Ротавирусы характеризуются широким антигенным и генетическим разнообразием. У ротавирусов группы А человека и животных установлено существование 14 G-серотипов (детерминирован гликопротеином VP7) и 27 Р-гепотипов (детерминирован протеазочувствительным белком VP4) [Khamrin P. et al., 2007]. Полиморфизм по гену NSP4 отражает существование 11-ти генотипов NSP4 ротавирусов человека и животных [Matthijnssens J. et al., 2008]. Изучение генетического разнообразия NSP4 представляет важную и актуальную задачу - в плане расширения информации о спектре NSP4-renoTnnoB, циркулирующих на территории России и современной классификации ротавирусов, основанной на свойствах каждого геномного сегмента.
NSP4 влияет на жизненноважные процессы, протекающие в инфицированных клетках кишечника: дезорганизует микроструктуру цитоскелета энтероцитов, ингибирует транспорт клеточных белков, аминокислот и дисахаридаз, нарушает ионный баланс в клетках кишечника посредством повышения внутриклеточной концентрации ионов кальция, что приводит к нарушению ресорбции воды энтероцитами и, как следствие, к диарее. Высвобождение ионов кальция из внутриклеточных хранилищ (ЭПР) объясняется разрушением их мембран в результате мембранодестабилизирующей активности ротавирусного энтеротоксина [Tian P. et al., 1996]. Но и на сегодняшний день до конца не ясны молекулярные основы вирулентности ротавирусов, не существует четких представлений о механизме развития патогенеза ротавирусной инфекции в целом и роли в нем энтеротоксина NSP4. Исследование биологической активности функционально значимых участков белковой молекулы NSP4 ротавирусов разных генотипов в модельной бактериальной
векторной системе может внести новые аспекты в изучение влияния биологических особенностей NSP4 на выраженность проявлений ротавирусной инфекции и способствовать разработке альтернативных ротавирусных вакцин на основе NSP4. Поэтому изучению биохимических и молекулярно-биологических свойств данного белка и кодирующего гена является чрезвычайно важной и актуальной задачей.
Цель исследования: исследование мембранодестабилизирующих свойств гликопротеина NSP4 ротавирусов группы А различных антигенных типов и NSP4-генотипов.
Задачи исследования:
1. Оптимизировать метод ОТ-ПЦР для амплификации полноразмерной последовательности и открытой рамки считывания гена NSP4 ротавируса группы А.
2. Установить нуклеотидные последовательности гена NSP4 российских изолятов ротавирусов разных 0[Р]-типов и определить их NSP4 генотипы.
3. Изучить генетические взаимосвязи исследуемых изолятов ротавируса с ротавирусами группы А человека, выделенными на разных территория земного шара, и ротавирусами животных.
4. Охарактеризовать мембранодестабилизирующую активность NSP4 разных генотипов в модельной бактериальной векторной системе на основе способности ротавирусного энтеротоксина лизировать мембраны клеток Escherichia coli.
5. Провести сравнительный анализ аминокислотной последовательности NSP4, установить наличие/отсутствие взаимосвязи аминокислотных замен в функционально-активных консервативных и вариабельных регионах белковой молекулы с мембранодестабилизирующей активностью NSP4 разных генотипов.
Научная новизна и практическая значимость работы: Подобраны и апробированы праймеры для универсальной амплификации гена NSP4 ротавирусов группы А разных генотипов, что может быть использовано при разработке тест-систем на основе ПЦР для диагностики ротавирусного гастроэнтерита. Разработанная методика амплификации гена NSP4 применяется при проведении НИР по изучению штаммов ротавирусов.
Впервые установлена первичная структура гена NSP4 15-ти российских изолятов ротавируса с доминирующими антигенными типами. Нуклеотидные последовательности NSP4 данных изолятов ротавируса депонирваны в GenBank под
номерами DQ270104 - DQ270118, что расширяет международную базу данных последовательностей генома ротавирусов.
Определены генотипы энтеротоксина NSP4 новых российских изолятов ротавирусов группы Л: NSP4-A (E2), -В(Е1) и С (ЕЗ). Показано доминирование изолятов ротавируса, характеризующихся генотипом NSP4-B (Е1).
Впервые установлены филогенетические связи по гену NSP4 ротавируса G1P[8] типа со штаммами, выделенными на территории Скандинавских стран, а G3P[8] и G3P[9] типов со штаммами из стран Юго-Восточной Азии. Установлено, что ротавирусы генотипов Gl, G3, G4 и Р[8] типа по гену NSP4 фиогенетически родственны ротавирусам свиней; G3P[6], G3P[9] и G2P[4] типов - ротавирусам крупного рогатого скота, G3P[9] типа - ротавирусам кошек.
Эти результаты дополняют представления о распространении штаммов ротавируса на разных территориях земного шара и свидетельствуют об эволюционных связях между ротавирусами животных и человека, подчеркивая необходимость их одновременного мониторинга.
На основе вектора рЕТ22Ь+ создано три авторских генетических конструкции (pET22b-G3P[9]-NSP4-C, pET22b-G I P[8]-2-NSP4-B, pET22b-G9P[6]-NSP4-A), экспрессирующие в клетках Escherichia coli энтеротоксин NSP4 разных генотипов.
Впервые проведен сравнительный анализ мембранодестабилизирующей активности NSP4 штаммов ротавирусов разных GfPJ-типов, выделенных от детей с гастроэнтеритом (G1P[8], G3P[9]) и бессимптомной формой инфекции (G9P[6]).
Впервые в сравнительном плане охарактеризованы аминокислотные последовательности NSP4 российских изолятов ротавирусов с разной выраженностью клинических проявлений инфекции. Полученные в ходе настоящего исследования результаты имеют значение для разработки альтернативной ротавирусной вакцины.
Основные положения, выносимые на защиту: 1. Разработана методика синтеза и амплификации кДНК полноразмерной последовательности и открытой рамки считывания гена энтеротоксина NSP4, позволившая охарактеризовать 1\'8Р4-гепотипы ротавирусов группы А, актуальных для территорий России. Спектр NSP4 генотипов ротавируса представлен тремя генотипами - А (Е2), В (Е1) и С (ЕЗ).
2. Ротавирус G1P[8] типа, циркулирующий на территории Н.Новгорода, проявляет филогенетическое родство по гену NSP4 со штаммами из Скандинавских стран, а G3P[8,9] типа со штаммами из стран Юго-Восточной Азии. Ротавирусы Gl, G3, G4 и Р[8] типов генетически родственны ротавирусам свиней, G3P[6,9] и G2P[4] типов - ротавирусам крупного рогатого скота, G3P[9] типа - ротавирусам кошек.
3. Создано три генетические конструкции (pET22b-G3P[9]-NSP4-C, pET22b-GlP[8]-2-NSP4-B, pET22b-G9P[6]-NSP4-A), экспрессирующие в клетках E.coli энтеротоксин NSP4 генотипов А, В и С. Экспрессия сопровождается торможением экспоненциального роста культуры E.coli, что свидетельствует о сходных мембранодестабилизирующих свойствах ротавирусов разных NSP4-reno™noB
4. Ротавирусы, обнаруженные у детей с диареей и бессимптомной формой инфекции, не имеют значимых аминокислотных замен в важных для проявления энтеротоксических свойств доменах NSP4.
Апробация работы:
Основные положения диссертации доложены и обсуждены:
• на VII Нижегородской сессии молодых ученых (г. Н. Новгород, 2009 г.);
• на заседаниях Ученого Совета Нижегородского НИИ эпидемиологии и микробиологии имени академика И.Н. Блохиной и проблемных научно-практических семинарах института.
• на юбилейной Всероссийской научно-практической конференции «Научное обеспечение противоэпидемической защиты населения», посвященной 90-летию ННИИЭМ им. акад. И.Н. Блохиной Роспотребнадзора и 20-летию Приволжского окружного центра по профилактике и борьбе со СПИД (г. Н. Новгород, 2009 г.);
• диссертация апробирована на заседания кафедры молекулярной биологии и иммунологии Нижегородского государственного университета им. Н.И. Лобачевского (02 февраля 2010 г.).
Объем и структура диссертации:
Материалы диссертации изложены на 116 страницах машинописного текста. Работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, собственных результатов и их обсуждения, заключения, выводов и указателя литературы, включающего 152 источников литературы отечественных и зарубежных авторов. Диссертация иллюстрирована 17 рисунками и 10 таблицами.
По результатам диссертации опубликовано 8 печатных работ.
Работа поддержана грантом H2Û4 в рамках программы «Развитие научного потенциала высшей школы», 2005 г.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования
В работе использовали:
• рогавируссодержащие образцы фекалий детей, госпитализированных в инфекционные стационары г. Нижнего Новгорода в период 1992-2004 гг. и Городской клинический перинатальный центр г. Омска в период 2002-04 гг.; штамм ротавируса SA 11. Всего исследовано 30 проб.
• нуклеотидные последовательности геномных кДНК ротавирусов, собранных в базе данных GenBank /EMBL/ DDBJ [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/]. Всего использовано 75 последовательностей.
• бактериальные штаммы: E.coli Тор 10 F'; E.coli BL21gold (DE3); E.coli BL21gold (DE3) codon plus (любезно предоставлены Институтом Вирусологии им. Д.И. Ивановского, Москва).
• питательные среды: LB, 2xYT, SOC
• компьютерные программы «Oligo 4,0», 1989-91 (США); «GeneDoc, версия 2.5.000», 1997 (США), «MegAlme», «ClustalW» » из набора программ MEGA v.3.1, BLAST [http://www.ncbi. nlm.nih.gov/BLAST/].
Экстракцию РНК ротавируса и её электрофоретипирование методом электрофореза в ПААГ осуществляли, как описано [Новикова H.A., Епифанова Н.В., 1994]. РНК ротавирусов для постановки ОТ-ПЦР выделяли методом высокосолевой очистки (патент №2313792) и с использованием комплекта реагентов «РИБО-сорб» производства ФГУН ЦНИИЭ (Москва), согласно инструкции по применению. Олигонуклеотидные праймеры для постановки ОТ-ПЦР синтезировали в фирме «Литех», Москва. Продукты ПЦР анализировали методом электрофореза в 1,5% агарозном геле в трис-боратной буферной системе.
Филогенетический анализ и построение дендрограмм осуществляли по алгоритму Neighbor-joning в двухпараметрической модели Kimura-2 в программе
MEGA v.3.1. Достоверность топологии филограмм оценивали методом повторных, выборок на основании анализа 1000 псевдореплик [Kumar S. et al., 2004].
Экстракцию ДНК из 1%-го агарозного геля проводили с использованием набора реагентов «РИБО-сорб» производства ФГУН ЦНИИЭ (Москва), согласно инструкции производителя.
Определение нуклеотидной последовательности гена NSP4 осуществляли с использованием праймеров: NSP4R и NSP4F, набора реагентов ABI PRISM BigDye Terminator v.3.1, в автоматическом режиме на приборе ABI Prism Avant 3130, согласно рекомендациям производителя. Работа проведена на базе Института вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН в совместной работе с к.б.н. Д.В. Новиковым, и д.б.н. Г.А. Прилиповым.
Выделение плазмидной ДНК из клеток E.coli осуществляли с использованием набора реагентов «Mitiiprep Kit» (США, 1997) согласно инструкции производителя.
Компетентные клетки E.coli трансформировали в электропораторе BioRad (США) согласно инструкции производителя. Экспрессию белка индуцировали 1 мМ ИПТГ.
Детекцию NSP4, экстрагированного из культуры клеток E.coli, проводили методом электрофореза в ПААГ с использованием буферных растворов Лэммли [Laemmli U.K., 1970].
Результаты и их обсуждения
Оптимизация методики ОТ-ПЦР для амплификации полноразмерной последовательности гена NSP4 ротавируса группы А. Последовательность NSP4 кодируется 10-м геномным сегментом днРНК, имеющим у ротавирусов группы А размер 754 н.о. Синтез кДНК гена NSP4 и определение ее нуклеотидной последовательности обеспечивают базис для изучения вариабельности гена NSP4 и энтеротоксических свойств белковой молекулы в целом и ее отдельных доменов. К началу наших исследований в научной зарубежной литературе были представлены праймеры для амплификации полноразмерной последовательности гена NSP4, подобранные более 10 лет назад [Zhang M, Zeng C.Q.-Y., Dong Y., 1998]. Расширение информации о последовательностях гена NSP4, и вариабельность генома ротавирусов
послужили основанием для модификации праймеров с целью их адаптации к современным штаммам ротавирусов.
На первом этапе работы с использованием программы Mega 3.1. проведен сравнительный анализ 27 полных нуклеотидных последовательностей гена NSP4 разных генотипов, представленных в GenBank/EMBL/DDBJ к настоящему времени, по результатам которого сконструированы собственные версии праймеров для амплификации полноразмерной последовательности гена NSP4: NSP4-F 1-[5'-ggCTTTTAA AAgTTCTgT-3']-18 и.о., NSP4-R 729-[5'-
ggTCACRYTAAgACCRTTCCTTC-3']-752 н.о. Регион 5'-конца, соответствующий области прямого праймера, предложенного Zhang М. с соавт., не имеет нуклеотидных замен, поэтому мы сократили его последовательность до 18 и.о. Регион 3'-конца, соответствующий обратному праймеру, предложенному Zhang М. с соавт., характеризуется вариабельностью нуклеотидов. С целью повышения специфичности обратного праймера мы модифицировали его путем введения вырожденных оснований (R - A/G; Y - С или T/U) и увеличением последовательности до 23 и.о. Модифицированные праймеры фланкируют участок гена NSP4 размером 752 и.о., что соответствует полноразмерной кДНК 10-го сегмента генома ротавирусов.
Для эффективной амплификации кДНК гена NSP4 были оптимизированы условия постановки ПЦР с учетом температуры плавления праймеров, установленной при помощи компьютерной программы «OLIGO 4.0» (США). На основе проведенного анализа температура отжига праймеров составила 55°С.
Теоретически подобранные условия проведения ПЦР и специфичность модифицированных праймеров были экспериментально подтверждены на пробах, содержащих РНК ротавируса разных G[P] типов. ПЦР осуществляли в режиме: 94 °С-3 мин; 45х(94°С-30 с, 55°С-30 с, 72°С-1 мин); 72°С - 5 мин. С использованием оптимизированной методики амплификации была синтезирована кДНК полноразмерной последовательности 10-го сегмента генома 15 природных изолятов ротавируса человека с доминирующими и необычными электрофоретипами РНК, относящихся к различным G[P] типам и SG подгруппам. Электрофоретипы РНК и субгрупповая принадлежность изолятов ротавируса были определены в совместной работе с сотрудниками лаборатории молекулярной эпидемиологии вирусных
инфекций ННИИЭМ им. академика И.Н. Блохиной. При проведении многолетних наблюдений в период 1997-05 гг. на территории Нижегородской области была установлена циркуляция ротавирусов семи в[Р] типов: 01Р[8], С1Р[6], С2Р[4], ОЗР[8]. ОЗР[6], СЗР[9] и 04Р[8| с доминированием типаС1Р[8]. В сезон 2004-05 гг. зафиксировано перераспределение генотипов ротавируса, что отразилось в доминировании типаС2Р[4].
1Ш Сншпя Ш1 , 4 „ * « а Й 0 38 65 30 а В 19 П ' ---V- — г:: г:; :r =:== = = = — — ::
И
6
Ш 7,8 9
IV Ш
¡зад сщм дщг щц <зщ-5 седа oejsj «ад ще
Рис. 1. Схема электрофоретипов РНК ротавирусов группы Л. использованных в настоящей
работе
Сверху цифрами обозначены номера ЭФ-типов РНК; внизу указаны GfPJ-типы ротавирусов.
SAI 1 - обозначение референтного штамма ротавируса обезьян
Тип G4P[8] являлся минорным на протяжении всего периода наблюдения [Новикова H.A. и др., 2007; Федорова О.Ф., 2006]. Спектр Ст[Р]-типов ротавирусов, исследуемых в настоящей работе, определен на основании предыдущих наблюдений и охватывает все перечисленные GfPj-типы, распространенные на территории Нижегородской области. Профили миграции сегментов РНК изучаемых вариантов ротавируса доказаны на рисунке ¡.
Разработанная методика явилась базой для изучения первичной структуры гена NSP4 у различных штаммов ротавируса человека, актуальных для территории России.
Синтезированные с применением данной методики полноразмерные последовательности 10-го сегмента генома ротавирусов также использовали в качестве матриц для амплификации открытой рамки считывания гена NSP4 с целью клонирования ее в экспрессирующей бактериальной векторной системе.
Изучение вариабельности гена NSP4 ротавпруса группы А разных G|P]-типов. На следующем этапе работы определена первичная структура 10-го сегмента генома исследуемых изолятов ротавируса.
Установленные последовательности гена NSP4 депонированы в GenBank/EMBL/DDBJ по номерами DQ270104 - DQ270118. Известно, что 10-й сегмент генома ротавирусов характеризуется высоким уровнем вариабельности, что отражает существование различных NSP4 генотипов. По последним данным установлено существование 11-ти NSP4-reno™noB (E-enterotoxin 1-11).
Нуклеотидные последовательности гена NSP4 15-ти российских изолятов ротавируса, установленные в настоящей работе, использовали для множественного выравнивания и филогенетического анализа с соответствующими последовательностями типовых штаммов различных К8Р4-генотипов и штаммов ротавирусов человека известных G[PJ типов, выделенных на территориях разных стран, и представленных в GenBank/EMBL/DDBJ. Гомологию последовательностей определяли с помощью программы BLAST. На рисунке 2 видно, что при построении филогенетического дерева нижегородские штаммы РВ образовали три кластера, соответствующие NSP4-A (Е2), В (El) и С (ЕЗ) генотипам. Различия в нуклеотидных последовательностях РВ разных генотипов достигали 25% и не превышали 7,9% для последовательностей одного генотипа в пределах субкластера и 13,7% - в пределах кластера.
Большинство геновариантов ротавируса, обладающих «длинным» ЭФ-типом РНК и SGII специфичностью, группировались с референтным штаммом Wa (AF200224), имеющим NSP4-B генотип. Данный генотип установлен у штаммов с доминирующими антигенными типами и электрофоретипами РНК в 73,3% и представлен в основном типом G1P[8], генотип G4 являлся минорным, что соответствовало спектру распределения геновариантов ротавируса на территории Нижегородской области в период 1997-2004 г [Новикова H.A. и др., 2007].
Кластер \Уа-подобных штаммов состоит из 3-х субкластеров (I, II и III), различия в нуклеотидных последовательностях которых по отношению к штамму \\'а достигали 2,6%, 6,2% и 7,7%. Генетические варианты ротавируса серотипа 01 и субгенотипов Р[8]-1 и Р[8]-2, входящие в данный кластер, образовали самостоятельные группы (1а и 16).
100
г
JLN.N." h.N.e;
N N 392 О1РГ61-(В01 N N 1?R13niPIRl-9-f79\
LN.N. 12705 G1P[8]-2-(61) 13518 G4P[81-2-(85) .83117 G1PI81-2-I46) ■N.N.131 GiPi8l-1-M> N N ЯЯЯ? mp[Rl-1-i4i 16 N.N.6919 G1P[8]-1-(3) •Wa
■N.N.623 G3P[8]-2-(88)
la
VNSP4-E1(B)
755~lN.N.13286 G3P(8l-(87) '.N.12908G4P[9J-(90) ||( -AG4 120
У
100 ' 100
-CMP034
J26-02P6
RV176-00
> }
NRP4-FPI генотип
NSP4-E6 генотип
-с: t ■—
LI—N.N.12871G3P[9J-(10) AU1
_|-PP-1 "1
10Г1-RV52/9§T
-BAP E5 генотип
11825 G3PIfiW19l "" 13144 G3PI9W68) -N.N.12698 G2PI4W701 DS-1
j-W N "l-N.N.
NSP4-E3 (С) генотип NSP4-E8 генотип
ЕЗ (А) генотип
-Ch-1
—Tv-1
-EW NSP4-E10(F) генотип
NSP4-E4(E) генотип NSP4-E11 генотип -AvRV-1 NSP4-E7 (D) генотип
Рис. 2. Определение генотипа NSP4 изолятов ротавирусов группы А
Показаны индексы поддержки > 60; названия референтных штаммов выделены жирным шрифтом
Названия референтных штаммов выделены жирным шрифтом
Римскими цифрами I, II и III указаны субкластеры в кластере, сформированном ротавирусами, принадлежащих генотипу NSP4-B; 1а -группа, образованная субгенотипом Р[8]-2; 16 - группа, образованные субгенотипом Р[8]-1
Генетические варианты ротавируса с «коротким» и «широким» ЭФ-типами РНК (подгруппа SGI), составили единый кластер с референтным штаммом DS-1
(AFI74305), имеющим генотип NSP4-A. Эти результаты подтверждают данные зарубежных авторов о связи NSP4-renoTnna ротавируса с \Ф6-субгруппой, а именно, связи генотипа NSP4-A с подгруппой SOI, а генотипа NSP4-D с подгруппой SGII [Iturriza-Goinara M. et al., 2002J. Высокий уровень различий (13,7%) между нуклеотидными последовательностями гена NSP4 исследуемых изолятов ротавируса, входящих в разные субкластеры в кластере, сформированном ротавирусами генотипа NSP4-A, позволяет предположить существование новых генотипов NSP4.
Необычный вариант ротавируса N.N.12871-G3P[9]-(10)/SGI с «широким» 10-м ЭФ-типом РНК группировался с референтным штаммом Au-1 (D89873), имеющим генотип NSP4-C. Гомология нуклеотидных последовательностей составила 99,8%.
Проведен филогенетический анализ по гену NSP4, позволивший проследить родство штаммов ротавируса, циркулирующих среди населения центральной России (Н.Новгород), со штаммами, выделенными на других территориях земного шара (рис.3). Генетический вариант ротавируса GlP[8]-l-(3) типа, доминировавший на территории европейской части России в 1984-96 гг., и ассоциирующийся с тяжелой формой ротавируспого гастроэнтерита с выраженным респираторным синдромом [Новикова Н.А. и др., 1992,1998,2007], оказался генетически близкородственным штамму ротавируса G1P[8]-1, выделенному в Финляндии [Maunula L. et al., 2002]. Представляется вероятным, что российский доминирующий генетический вариант ротавируса GlP[8]-l-(3)/NSP4-B имел общее происхождение со штаммом, циркулировавшим на территории Скандинавских стран, или являлся тем же штаммом. Другие генетические варианты (4-й, 34-й ЭФ-типы РНК) ротавируса G1P[8]-1 типа циркулировали в более поздние сроки и, по всей вероятности, являются дериватами штамма GlP[8]-l-(3). В то же время генетические варианты ротавируса GlP[8]-2 (46-й, 61-й и 72-й ЭФ-тилы), G4P[8]-2 (85-й ЭФ-тип), а также G1P[6] (86-й ЭФ-тип) могут иметь самостоятельное происхождение.
Варианты ротавируса генотипа NSP4-B типов G3P[8]-2 (88-й и 87-й ЭФ-типы РНК) и G4P[9]-(90), а также необычный вариант G3P[9]-(10)-NSP4-C группируются со штаммами из Тайваня и Китая. Эти данные могут свидетельствовать о заносе штаммов ротавируса на территорию России из стран Юго-Восточной Азии.
Штаммы G3P[6]-(!9) и ОЗР[9]-(68) подгруппы SGI с ЭФ-типом РНК, характеризующимся широким разбегом 5-6 сегмента РНК в ПААГ, что характерно
для ротавирусов крупного рогатого скота, составили субкластер в кластере DS-1 подобных штаммов. Ротавирусы G2P[4]-NSP4-A типа, выделенные на территориях различных стран и континентов, в том числе и на территории России, образовали самостоятельную группу близкородственных штаммов, что свидетельствует об устойчивости данной генетической комбинации серотипа и генотипа.
N.N.392 G1P[6]-(86) N.N.12813 G1P[8]-2-{72) N.N.127Q5 G1P[8]-2-{61) N.N.13518 G4P[8]-2-{35) N.N.83117 G1P[8]-2-<46) Fin-G4-91-Major Finland Fin-Gt-97-Major Finland Wa G1P[8] N.N.131 G1P[8J-1-(4) .6932 G1P[8]-1-(34) .6919 G1P[8].1-(3) TI25 G3P(8] Taiwan TG59 G1P(8J Taiwan
________j N.N.623 G3P[8}-24S8)
100 I N.N.13286 G3P[8]-2-(87) N.N. 12908 G4P[9H90) 97SZ37 G9 China
- CMH134/04 G3P[9J Tailand
-- N.N.12871 G3P[9]-i10)
У
J
AU1 G3P[9J
}
100
J- N.N.11825 G3P[6]-(19) Л
I- M.N.
J.13144G3P[9H68)
DS-1 G2P[4]
■ 92H102G2 Japan S2 G2 Australia N.N.12698 G2P[4]-(70> 97SZ8G2 China - 1040 G2P[4] India
0.С2
Рис. 3. Филограмма, построенная на основе выровненных нуклеотидных последовательностей генаК8Р4 российских изолятов РВ-А разных С[Р]-типов и №Р4-генотипов и штаммов ротавирусов человека, выделенных на территориях
других стран
Показаны индексы под держки > 60.
Указаны названия штаммов, их географическое происхождение, 0[Р]-тнпы, в скобках указан номер ЭФ-типа РНК. Названия референтных штаммов выделены жирным шрифтом
Проведен филогенетический анализ ротавирусов человека и штаммов ротавирусов животных, представленных в базе данных СепВапк. Установлено, что основная масса изучаемых вариантов ротавируса, образует самостоятельный геномный кластер «истинных» ротавирусов человека, включающий штаммы типов
G1P[8]-1, GlP[8]-2, G3P[8]-2 и G4P[8]-2 (Wa-геногруппэ) (рис.4). Эта группа штаммов РВ человека по последовательности гена NSP4 близка к ротавирусам свиней. Идентичность нуклеотидных последовательностей составила 87,7-91%. Штаммы ротавируса человека G3P[6]/NSP4-A и G3P[9]/NSP4-A, принадлежащие геногруппе DS-1, кластеризовались со штаммами ротавируса крупного рогатого скота. Идентичность нуклеотидных последовательностей составила 90,4-90,8%. По всей вероятности данные штаммы ротавируса или их предки являются реассортантами с ротавирусами крупного рогатого скота и приобрели от них ген NSP4.
Штамм G3P[9]/NSP4-C, имеющий ЭФ-тип РНК, характерный для гсногруппы Аи-1, оказался в кластере, формируемом ротавирусами кошек. Уровень гомологии нуклеотидных последовательностей составил 97,5%. Данный вариант вируса может являться реассортантом между ротавирусами кошек и человека, возникшим вследствие трансмиссии генов.
7Sf N.N.392G1P[6]-(861
NN.12313 С1Р[81-2-<72) N.N. 12706 G1P[8]-2-(S1) N.N.13518 G4P[8]-2-{86) N.N.83117 G1P[8J-2.(46) N.N.131 G1P[8J-1-(4) .6932 G1P[8l-1-(34) 6919 G1P[8H3) N.N.12908 G4P[9]490) N.N.623 G3P[8J-2-(88) N.N.13286 G3P[8]-2-<87) J RU172 porcine A34 porcine I
A2 porcine j
OSU porcine J
FRV384 feline
12871 G3P[9]-(10) FRV1 feline WC3 bovine CBNU-2 bovine
Г N.N.11 N.N.13
3144 G3P[9J-<68)
MF66 bovine N.N.12698 G2P[4]-(70)
CP-1 bovine
EC murine pa-A мышей Ch-1 Avian PS_A птац
Рис. 4. Филограмма, построенная на основе выровненных нуклеотидных последовательностей гена 1\8Р4 нижегородских изолятов РВ-А разных 0[Р]-типов и
штаммов ротавирусов животных Показаны индексы поддержки > 60.
Указаны названия штаммов, их видовая принадлежность, С[Р]-типы, в скобках указан номер ЭФ-типа РНК
Таким образом, в результате проведенной работы впервые установлена нуклеотидная последовательность гена NSP4 российских (Нижний Новгород) изолятов ротавирусов группы А доминирующих антигенных G[P] типов и показана вариабельность по гену NSP4. На основе проведенного анализа подобраны варианты ротавируса для изучения мембранодестабилизирующих свойств NSP4 разных генотипов. Особый интерес представляли изоляты ротавируса, выделенные от детей с симптоматической и бессимптомной формой инфекции.
Изучение энтеротокснческих свойств NSP4 ротавирусов группы А разных генотипов. Выраженность диареи при инфицировании различными геновариантами ротавирусов, возможно, объясняется молекулярно-биологическими свойствами энтеротоксина NSP4. Экспрессия NSP4 в бактериальной векторной системе может служить моделью для оценки токсических свойств на основе способности NSP4 перфорировать мембраны бактериальных клеток. Возможность применения в качестве модели для изучения токсических свойств NSP4 цитоплазмагической мембраны E.coli объясняется тем, что мембраны кишечной палочки по липидному составу идентичны мембранам эндоплазматического ретикулума [Browne Е.Р., 2000].
Схема эксперимента по изучению мембранодестабилизирующей активности NSP4 разных генотипов, разработанная в ходе данного исследования, включала: синтез кДНК открытой рамки считывания гена NSP4, создание экспрессиругощей NSP4 генетической конструкции на основе вектора рЕТ22Ь, трансформацию компетентных клеток рекомбинантными плазмидами, несущими вставку последовательности гена NSP4, и индуцируемую экспрессию энтеротоксина в культуре клеток E.coli. (рис. 5).
Для получения экспрессии NSP4 в клетках E.coli необходимо было получить кДНК открытой рамки считывания (ОРС) гена энтеротоксина. С этой целью на основе сравнительного анализа 42-х нуклеотидных последовательностей NSP4 разных генотипов, были сконструированы собственные версии праймеров для амплификации ОРС гена NSP4, удовлетворяющие условиям клонирования: NSP4-F(OPC) 33-[5'-TGCggACATATggATAAgCTTgCCgACCTC-3']-64 и.о., NSP4-R(OPC) 549-[5'-TCAACCTCgAgCATKgATgCAgTCACTTC-3 ']-577 и.о.
Так как целью работы являлось получение векторной системы для экспрессии ОРС, при конструировании праймеров в их последовательности были внесены сайты
17
узнавания для эндонуклеаз рестрикции Ndel (cat atg внесен в прямой праймер), Xhol (ctc gag внесен в обратный праймер), что необходимо для корректной ориентации вставки последовательности ОРС NSP4 при постановке ее под экспрессию.
да X«» ш* « огс<шт*л
J к
Рис. 5. Схема проведения эксперимента по экспрессии NSP4 в E.coli
Регион 5'-концевого участка последовательности, соответствующего области прямого праймера, представляет собой консервативный участок, что и определило выбор праймера. Нуклеотидные замены в регионе 3'-концевого участка последовательности, соответствующего области обратного праймера, определили необходимость введения вырожденных оснований (К - G/T). Сконструированные нами праймеры, NSP4-F (ОРС) и NSP4-R (ОРС), фланкируют фрагмент гена NSP4 размером 544 и.о., расположенный с 33 по 577 и.о. Температура отжига праймеров, выбранная с использованием программы «OLIGO 4.0» (США), составила 55°С.
Теоретически подобранные условия проведения ПЦР и специфичность сконструированных праймеров экспериментально апробованы в реакции, где в качестве матрицы для амплификации открытой рамки считывания гена NSP4 служила полноразмерная кДНК энтеротоксина ротавирусов человека. ПЦР осуществляли в режиме: 94 °С-3 мин; (94 °С-10 с, 55 "С-10 с, 72 °С-10 с)х42; 72 °С - 5 мин.
С использованием разработанной нами методики синтезированы последовательности ОРС гена NSP4 ротавируса геновариантов G1P[8]-2~NSP4-B, G3P[9]-NSP4-C, вызывающих симптоматическую инфекции, и G9P[6]-NSP4-A типа, выделенного от новорожденного с бессимптомной формой инфекции. Для экспрессии ОРС гена NSP4 перечисленных изолятов ротавируса в клетках E.coli штамма BL2I(DE3) codon plus выбран вектор pET22b+, обладающий сильным промотором гена 10 фага Т7, подходящей для вставки емкостью и простотой селекции. В результате генетических манипуляций получена кольцевая форма рекомбинантной ДНК, содержащая вставку последовательности ОРС гена NSP4. и пригодная для трансформации: pET22b-NSP4-GlP[8]-2, pET22b-NSP4-G3P[9], pET22b-NSP4-G9P[6] (рис.6).
XhcJ М
Рис. 6. Схема генетической конструкции pET22b-NSP4(OPC)
Компетентные клетки E.coli BL2KDE3) codon plus трансформировали полученными рекомбинантными плазмидами и индуцировали ИПТГ. В качестве контроля использовали клетки, трансформированные плазмидой рЕТ22Ь без вставки гена NSP4.
Контроль экспрессии NSP4 проведен методом электрофореза в полиакриламидном геле, где показано присутствие искомого белка в бактериальной культуре после индукции экспрессии (рис.7).
28 20,2
14,3
Рис. 7. Электрофореграмма белков, полученных из клеточного дебриса культуры Е.соН. индуцированной для экспрессии Ы8Р4 1,7- Ы8Р4, экспрессированный в составе рекомбинантной плазмиды рЕГ22Ь-01Р[8]-2-Ы8Р4-В; 2, 8 - ШР4, экспрессированный в составе рекомбинантной плазмиды рЕТ22Ь-СЗР[9]-Ы8Р4-С; 3,9- ШР4, экспрессированный в составе рекомбинантной плазмиды рЕТ22Ь-09Р[6]-К8Р4-А; 1,2,3 -№>Р4, экстрагированный из жидкой культуры Е.соН; 7,8,9 -И8Р4, экстрагированный из клеточного дебриса Е.соН; 5 — протеинкиназа К - 14,3 кДт; 6—лизоцим - 28 кДт
После индукции экспрессии Ы8Р4 была проведена серия замеров оптической плотности трансформированных бактериальных культур, результаты которой показали статистически значимое по сравнению с контролем (р < 0.05) нарушение способности Е.соН к наращиванию биомассы (рис. 8).
N814-0 геноварианта ротавируса ОЗР[9] типа, близкородственного ротавирусам кошек, при экспрессии в модельной системе Е.соП вызывал угнетение
роста бактериальной культуры. Приобретение генов ротавируса кошек не снизило вирулентность исследуемого изолята для человека.
К5Р4-В эпидемически значимого варианта ротавируса 01Р|8]-2 типа, вызывающего гастроэнтерит, характеризующийся интенсивным диарейным синдромом и высокой частотой госпитализаций, проявил одинаковую способность нарушать рост бактериальной культуры наряду с генотипов А и С.
ШР4-А ротавируса геиотипа 09Р[6], выделенного от новорожденного с бессимптомной формой инфекции, при экспрессии в клетках Е.соП вызывал угнетение роста бактериальной культуры, подобно ротавирусам генотипов С1Р[8]-2-№Р4-В и ОЗР[9]-М8Р4-С ротавирусов, выделенных от детей с гастроэнтеритом.
Рис. 8. Изменение оптической плотности культур-продуцентов Е.соП после индукции
экспрессии NSP4
Таким образом, установлено, что NSP4 разных генотипов ротавирусов, обнаруженных у детей с симптоматической и бессимптомной формой инфекции, при экспрессии в клетках Е.соП характеризуются эффектом торможения роста бактериальной культуры, что свидетельствует об их сходных мембранодестабилизирующих свойствах. Эти результаты могут свидетельствовать, что бессимптомное течение ротавирусной инфекции, вероятно, обусловлено не
молекулярно-биологическимн свойствами вирусного энтеротоксина Ы5Р4, а иными факторами вирусной природы, либо факторами организма хозяина.
С целью подтверждения отсутствия связи молекулярно-биологических свойств КЯР4 разных генотипов с выраженностью диарейного синдрома у инфицированных ротавирусами детей проведен сравнительный анализ аминокислотных последовательностей Ы8Р4 исследуемых изолятов ротавируса в регионах трансмембранного и цитоплазматического доменов белковой молекулы (табл. 1).
Таблица
Сравнение аминокислотных последовательностей NSP4 разных генотипов в
регионе цитоплазматического домена белковой молекулы 140 150 160
170
обобщенная последовательность
HDNLIVRPVD
VJDMSKEFNQ KNIKTLDEWE SGKNPYEPKE VTASM
G[P]-iim NSP4-генотип
G1P[8]-1 В _т____ ___S_ _____
GlP[8]-2 В к S
G3P[8]-2 В Y т Т N I
G4P[8]-2 В _ А К___ ___
G4P[9] В __К^ _____А _ ________ _____ _____ _____ ___ _____
GlP[6]-2 В К s
G2P[4] А ____ Е_. __V _Е___ _____ ___A_
G3P[6] А к м т D Т I V Е т A
G9P[6] А к м т Е Т I V Е A
G3P[9] С __1К___ К_ __TQ 1_ R Q F __ __N__Т Е_Е__ ____L
Обобщенная последовательность, составлена из наиболее часто встречающихся аминокислотных оснований
Известно, что регион, соответствующий цитоплазматической части белковой молекулы NSP4, обладает выраженной функциональной активностью, характеризуется высокой вариабельностью и отвечает за проявление энтеротоксических свойств NSP4, а аминокислотные замены в нем могут изменять (снижать) способность энтеротоксина индуцировать диарею и обуславливать рахчичные клинические проявления ротавирусной инфекции [Huang Н. et al., 2004; Deepa R.,2007], Обнаружено, что и в цитоплазматической части, и в
трансмембранном регионе молекулы NSP4 имеются специфичные, свойственные определенному NSP4-rcH0Tvniy, а также уникальные замены аминокислот. Однако обнаруженные замены не влияли на мембранодестабилизирующую активность энтеротоксина.
Суммируя все вышесказанное, можно заключить, что разработанная нами методика ПЦР с использованием сконструированных праймсров явилась методической базой для изучения первичной структуры гена NSP4 у различных штаммов ротавируса человека, актуальных для территории России. С использованием оптимизированной методики синтезированы кДНК полноразмерного гена NSP4 и его открытой рамки считывания ротавирусов группы А человека. Впервые показана принадлежность российских изолятов ротавирусов к трем из 11-ти известных NSP4-генотипов - А (Е2), В (El), С (ЕЗ), с доминированием штаммов, относящихся к генотипу NSP4-B. Проведенный на основе последовательности гена NSP4 сравнительный анализ, выявил филогенетическое родство ротавирусов типа G1P[8] со штаммами из Скандинавских стран, a G3 серотипа - со штаммами из стран Юго-Восточной Азии. Установлено, что изоляты ротавируса Gl-, G3-, G4- и Р[8] типов являются близкородственными ротавирусам свиней, G3P[6]-, G3P[9]- и G2P[4] типов - ротавирусам крупного рогатого скота и GЗР[9] типа - ротавирусам кошек. Эти данные свидетельствуют об эволюционных связях между ротавирусами человека и животных. Созданы генетические конструкции на основе вектора рЕТ22Ь, содержащие открытую рамку считывания гена NSP4 разных генотипов. Получена экспрессия NSP4 в составе рекомбинантных плазмид в бактериальной культуре E.coli uiT.BL21(DE3)codon plus. Присутствие NSP4 в культуре E.coli после индукции экспрессии подтверждено методом элетрофореза в полиакриламидном геле. Установлено, что экспрессия NSP4 исследуемых изолятов ротавируса, выделенных от детей с симптоматической и бессимптомной формой инфекции, характеризовалась эффектом торможения роста бактериальной культуры, что свидетельствует о сходных мембранодестабилизирующих свойствах NSP4 разных генотипов ротавируса. Обнаруженные замены аминокислот в трансмембранном и цитоплазматическом доменах белковой молекулы NSP4 исследуемых изолятов ротавируса были генотипспецифическими и не влияли на способность энтеротоксина перфорировать мембраны клеток E.coli.
23
ВЫВОДЫ
]. Разработаны оригинальные версии праймеров для универсальной амплификации кДНК полноразмерного гена энтеротоксина NSP4 ротавирусов группы А и его открытой рамки считывания.
2. Впервые установлены NSP4-A (Е2), -В (El) и С (ЕЗ) генотипы российских изолятов ротавирусов группы А разных 0|1']-типов. Изоляты ротавируса, характеризующиеся генотипом NSP4-B (El), доминировали.
3. Установлены филогенетические связи по гену NSP4 российских изолятов ротавируса G1P[8] типа со штаммами ротавируса из Скандинавских стран, a G3 серотипа со штаммами из стран Юго-Восточной Азии.
4. Впервые установлено родство по гену NSP4 российских изолятов ротавирусов Gl, G3, G4 генотипов и Р[8] типа с ротавирусами свиней, G3P[6], G3P[9] и G2P[4] типов - с ротавирусами крупного рогатого скота и G3P[9] типа - с ротавирусами кошек.
5. Созданы генетические конструкции pET22b-NSP4-GlP[8]-2, pET22b-NSP4-G3P[9], pET22b-NSP4-G9P[6], экспрессирующие NSP4 в культуре Е.соП, штамм BL21(DE3) codon plus. Экспрессия сопровождалась торможением экспоненциального роста культуры E.coli независимо от типа NSP4.
6. Установлено, что замены аминокислот в вариабельных регионах белковой молекулы NSP4 не влияют на способность ротавирусного энтеротоксина дестабилизировать мембраны клеток E.coli.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
I. Работы, опубликованные в ведущих рецензируемых научных журналах и изданиях, определенных ВАК:
1. Пономарева Н.В. Синтез лолноразмерной кДНК reHaNSP4 ротавируса группы А / Пономарева Н.В., Новиков Д.В., Савельев P.C., Новикова H.A. // Вестник ННГУ. 2006. № 11. С. 139-141.
2. Пономарева Н.В. Изучение связи клинических проявлений ротавирусной инфекции с аминокислотными заменами в последовательности энтеротоксина NSP4 / Пономарева Н.В., Новиков Д.В., Новикова H.A. // Вестник военно-медицинской академии. Санкт-Петербург. 2008. № 22. С. 546-547.
3. Новикова H.A. Анализ нуклеотидных последовательностей гена NSP4 ротавирусов группы А, изолированных в Нижнем Новгороде / Новикова H.A., Пономарева Н.В., Новиков Д.В., Прилипов Г.А., Епифанова Н.В., Голицына Л.Н. // Вопросы Вирусологии. 2008. №6. С. 35-39.
II. Статьи, доклады, тезисы докладов региональных и всероссийских конференций:
1. Пономарева Н.В. Анализ последовательностей гена энтеротоксина NSP4 штаммов ротавируса человека / Пономарева Н.В., Новиков Д.В., Новикова H.A. // Материалы Всероссийской научно-практической конференции «Инфекционные болезни: проблемы здравоохранения и военной медицины». СПб. 2006. С. 254-254.
2. Пономарева Н.В. Вариабельность гена энтеротоксина NSP4 ротавирусов человека // Докл. XI нижегородской сессии молодых ученых (Естественнонаучные дисциплины). Нижний Новгород. 2006. С. 196-197.
3. Пономарева Н.В. Генетические взаимосвязи ротавирусов человека и животных // Материалы Всероссийской медико-биологической научной конференции молодых ученых «Фундаментальная наука и клиническая медицина» (X Всероссийская конференция «Человек и его здоровье»). СПб. 2007. С. 355-356.
4. Пономарева Н.В. Генетические взаимоотношения между ротавирусами человека, выделенными в России и других регионах мира // Докл. XII нижегородской сессии молодых ученых (Естественнонаучные дисциплины). Нижний Новгород. 2007. С. 24-25.
5. Пономарева Н.В. Энтеротоксин и его роль в патогенезе рогавирусной инфекции t Пономарева Н.В., Новикова H.A. // Материалы юбилейной Всероссийской научно-практической конференции «Научное обеспечение противоэпидемической защиты населения». Нижний Новгород. 2009. С. 158-162.
Подписано в печать 02.04.2010 г. Гарнитура Тайме. Печать RISO RZ 570 ЕР. Усл.печ.л.1,0. Заказ ЛЬ 422. Тираж 100 экз.
Отпечатано ООО «Стимул-СТ» 603155, г.Нмжний Новгород, ул.Трудовая,6 Тел.:436-86-40
Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Пономарева, Наталья Вячеславовна
ВВЕДЕНИЕ.
I.ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.
1.1 Структурная и молекулярная организация ротавируса.jq
1.1.1. Морфология ротавириона.2 q
1.1.2. Геном.
1.1.3. Белки ротавируса.yi
1.2. Молекулярная классификация ротавирусов.
1.3. Роль NSP4 в патогенезе ротавирусной инфекции.
1.3.1. Патогенез ротавирусной инфекции.
1.3.2. Влияние NSP4 на изменение концентрации ионов кальция.
1.3.3. Влияние NSP4 на активацию нервной системы кишечника.
1.3.4. Влияние NSP4 на реоганизацию цитоскелета энтероцитов.3 ^
1.3.5. Мембранодестабилизирующая активность NSP4.
1. 3.6. Влияние мутаций в молекуле NSP4 на вирулентность ротавируса
II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.
2.1. Исследуемые объекты.
2.2. Электрофоретипирование РНК ротавирусов в полиакриламидном геле.
2.3. Обратная транскрипция-полимеразная цепная реакция.
2.4. Выделение фрагментов ДНК из агарозы.
2.5. Клонирование и экспрессия гена NSP4.
2.5.1. Выделение плазмидной ДНК.4^
2.5.2. Рестрикция плазмидной ДНК и фрагментов амплификации.4^
2.5.3. Лигирование вектора и фрагмента гена NSP4.
2.5.4. Приготовление компетентных клеток Escherichia coli.4
2.5.5. Трансформация клеток Escherichia coli методом электропорации
2.5.6. Выделение NSP4 из культуры Escherichia coli.4
2.5. 7. Электрофорез белков в полиакриламидном геле.
2.5. 8. Экспрессия гена NSP4.
2.6. Статистический анализ результатов.
III. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.
3.1. Оптимизация методики ОТ-ПЦР для амплификации полноразмерной последовательности гена NSP4 ротавируса человека и животных.
3.2. Изучение вариабельности гена NSP4 российских изолятов ротавируса человека.
3.2.1. Характеристика электрофоретипов и GfPJ-типов исследуемых изолятов ротавируса человека.
3.2.2. Определение генотипа NSP4 российских изолятов ротавируса человека.
3.2.3. Филогенетический анализ российских изолятов ротавирусов человека на основе гена NSP4.
3.3. Изучение энтеротоксических свойств NSP4 ротавирусов группы А разных генотипов.
3.3.1. Разработка методики ОТ-ПЦР для амплификации последовательности ОРС гена NSP4 ротавируса человека.
3.3.2. Создание генетической конструкции для экспрессии NSP4.
3.3.3. Оптимизация условий экспрессии NSP4.
3.3.4. Экспрессия NSP4 в составе рекомбинантной плазмиды рЕТ22Ь
3.4. Анализ аминокислотной последовательности NSP4 ротавируса разных GfPJ-типов.
Введение Диссертация по биологии, на тему "Исследование мембранодестабилизирующих свойств гликопротеина NSP4 ротавирусов"
Актуальность проблемы. Гликопротеин NSP4 ротавируса (семейство Reoviridae, род Rotavirus) обладает свойствами энтеротоксина и играет ведущую роль в патогенезе ротавирусной инфекции, которая обусловливает до 70% случаев госпитализаций детей с острой кишечной инфекций в возрасте до 5 лет и является частой причиной смертности детей в развивающихся странах [61]. Энтеротоксин NSP4 имеет молекулярную массу 20,2 кДа и представляет продукт трансляции 10 сегмента днРНК генома ротавируса [16,48].
Ротавирусы характеризуются широким антигенным и генетическим разнообразием. У ротавирусов группы А человека и животных установлено существование 14 G-серотипов (детерминирован гликопротеином VP7) и 27 Р-генотипов (детерминирован протеазочувствительным белком VP4) [83]. Полиморфизм по гену NSP4 отражает существование 11-ти генотипов NSP4 ротавирусов человека и животных [99]. Изучение генетического разнообразия NSP4 представляет важную и актуальную задачу - в плане расширения информации о спектре NSP4-reHoranoB, циркулирующих на территории России и современной классификации ротавирусов, основанной на свойствах каждого геномного сегмента.
NSP4 влияет на жизненноважные процессы, протекающие в инфицированных клетках кишечника: дезорганизует микроструктуру цитоскелета энтероцитов, ингибирует транспорт клеточных белков, аминокислот и дисахаридаз, нарушает ионный баланс в клетках кишечника посредством повышения внутриклеточной концентрации ионов кальция, что приводит к нарушению ресорбции воды энтероцитами и, как следствие, к диарее. Высвобождение ионов кальция из внутриклеточных хранилищ (ЭПР) объясняется разрушением их мембран в результате мембранодестабилизирующей активности ротавирусного энтеротоксина [141]. Но и на сегодняшний день до конца не ясны молекулярные основы вирулентности ротавирусов, не существует четких представлений о механизме развития патогенеза ротавирусной инфекции в целом и роли в нем энтеротоксина NSP4. Известно, что NSP4, обладающий иммуногенными свойствами, является потенциальным кандидатом для разработки альтернативной ротавирусной вакцины [18,114,134]. Исследование биологической активности функционально значимых участков белковой молекулы NSP4 ротавирусов разных генотипов в модельной бактериальной векторной системе может внести новые аспекты в изучение влияния биологических особенностей NSP4 на выраженность проявлений ротавирусной инфекции и способствовать разработке альтернативных ротавирусных вакцин на основе NSP4. Поэтому изучению биохимических и молекулярно-биологических свойств данного белка и кодирующего гена является чрезвычайно важной и актуальной задачей.
Цель исследования: исследование мембранодестабилизирующих свойств гликопротеина NSP4 ротавирусов группы А различных антигенных типов и NSP4- генотипов.
Задачи исследования:
1. Оптимизировать метод ОТ-ПЦР для амплификации полноразмерной последовательности и открытой рамки считывания гена NSP4 ротавируса группы А.
2. Установить нуклеотидные последовательности гена NSP4 российских изолятов ротавирусов разных GfPJ-типов и определить их NSP4 генотипы.
3. Изучить генетические взаимосвязи исследуемых изолятов ротавируса с ротавирусами группы А человека, выделенными на разных территория земного шара, и ротавирусами животных.
4. Охарактеризовать мембранодестабилизирующую активность NSP4 разных генотипов в модельной бактериальной векторной системе на основе способности ротавирусного энтеротоксина лизировать мембраны клеток Escherichia coli.
5. Провести сравнительный анализ аминокислотной последовательности NSP4, установить наличие/отсутствие взаимосвязи аминокислотных замен в функционально-активных консервативных и вариабельных регионах белковой молекулы с мембранодестабилизирующей активностью NSP4 разных генотипов.
Научная новизна и практическая значимость работы:
Подобраны и апробированы праймеры для универсальной амплификации гена NSP4 ротавирусов группы А разных генотипов, что может быть использовано при разработке тест-систем на основе ПЦР для диагностики ротавирусного гастроэнтерита. Разработанная методика амплификации гена NSP4 применяется при проведении НИР по изучению штаммов ротавирусов.
Впервые установлена первичная структура гена NSP4 15-ти российских изолятов ротавируса с доминирующими антигенными типами. Нуклеотидные последовательности NSP4 данных изолятов ротавируса депонирваны в GenBank под номерами DQ270104 - DQ270118, что расширяет международную базу данных последовательностей генома ротавирусов.
Определены генотипы энтеротоксина NSP4 новых российских изолятов ротавирусов группы A: NSP4-A (Е2), -В (Е1) и С (ЕЗ). Показано доминирование изолятов ротавируса, характеризующихся генотипом NSP4-B (Е1).
Впервые установлены филогенетические связи по гену NSP4 ротавируса G1P[8] типа со штаммами, выделенными на территории Скандинавских стран, а G3P[8] и G3P[9] типов со штаммами из стран Юго-Восточной Азии. Установлено, что ротавирусы генотипов Gl, G3, G4 и Р[8] типа по гену NSP4 фиогенетически родственны ротавирусам свиней; G3P[6], G3P[9] и G2P[4] типов — ротавирусам крупного рогатого скота, G3P[9] типа - ротавирусам кошек.
Эти результаты дополняют представления о распространении штаммов ротавируса на разных территориях земного шара и свидетельствуют об эволюционных связях между ротавирусами животных и человека, подчеркивая необходимость их одновременного мониторинга.
На основе вектора рЕТ22Ь+ создано три авторских генетических конструкции (pET22b-G3P[9]-NSP4-C, pET22b-GlP[8]-2-NSP4-B, pET22b
G9P[6]-NSP4-A), экспрессирующие в клетках Escherichia coli энтеротоксин NSP4 разных генотипов.
Впервые проведен сравнительный анализ мембранодестабилизирующей активности NSP4 штаммов ротавирусов разных GfPJ-типов, выделенных от детей с гастроэнтеритом (G1P[8], G3P[9]) и бессимптомной формой инфекции (G9P[6]).
Впервые в сравнительном плане охарактеризованы аминокислотные последовательности NSP4 российских изолятов ротавирусов с разной выраженностью клинических проявлений инфекции. Полученные в ходе настоящего исследования результаты имеют значение для разработки альтернативной ротавирусной вакцины.
Основные положения, выносимые на защиту:
1. Разработана методика синтеза и амплификации кДНК полноразмерной последовательности и открытой рамки считывания гена энтеротоксина NSP4, позволившая охарактеризовать Ы8Р4-генотипы ротавирусов группы А, актуальных для территорий России. Спектр NSP4 генотипов ротавируса представлен тремя генотипами - А (Е2), В (Е1) и С (ЕЗ).
2. Ротавирус G1P[8] типа, циркулирующий на территории Н.Новгорода, проявляет филогенетическое родство по гену NSP4 со штаммами из Скандинавских стран, a G3P[8,9] типа со штаммами из стран Юго-Восточной Азии. Ротавирусы Gl, G3, G4 и Р[8] типов генетически родственны ротавирусам свиней, G3P[6,9] и G2P[4] типов — ротавирусам крупного рогатого скота, G3P[9] типа - ротавирусам кошек.
3. Созданы генетические конструкции (pET22b-G3P[9]-NSP4-C, pET22b-G1Р[8]-2-NSP4-B, pET22b-G9P[6]-NSP4-А), экспрессирующие в клетках E.coli энтеротоксин NSP4 генотипов А, В и С. Экспрессия сопровождается торможением экспоненциального роста культуры E.coli, что свидетельствует о сходных мембранодестабилизирующих свойствах ротавирусов разных NSP4-генотипов
4. Ротавирусы, обнаруженные у детей с диареей и бессимптомной формой инфекции, не имеют значимых аминокислотных замен в важных для проявления энтеротоксических свойств доменах NSP4. Апробация работы:
Основные положения диссертации доложены и обсуждены:
• на VII Нижегородской сессии молодых ученых (г. Н. Новгород, 2009 г.);
• на заседаниях Ученого Совета Нижегородского НИИ эпидемиологии и микробиологии имени академика И.Н. Блохиной и проблемных научно-практических семинарах института.
• на юбилейной Всероссийской научно-практической конференции «Научное обеспечение противоэпидемической защиты населения», посвященной 90-летию ННИИЭМ им. акад. И.Н. Блохиной Роспотребнадзора и 20-летию Приволжского окружного центра по профилактике и борьбе со СПИД (г. Н. Новгород, 2010 г.);
• диссертация апробирована на заседания кафедры молекулярной биологии и иммунологии Нижегородского государственного университета им. Н.И. Лобачевского (02 февраля 2010 г.).
Объем и структура диссертации:
Материалы диссертации изложены на 116 страницах машинописного текста. Работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, собственных результатов и их обсуждения, заключения, выводов и указателя литературы, включающего 152 источников литературы отечественных и зарубежных авторов. Диссертация иллюстрирована 17 рисунками и 10 таблицами.
Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Пономарева, Наталья Вячеславовна
ВЫВОДЫ:
1. Разработаны оригинальные версии праймеров для универсальной амплификации кДНК полноразмерного гена энтеротоксина NSP4 ротавирусов группы А и его открытой рамки считывания.
2. Впервые установлены NSP4-A (Е2), -В (Е1) и С (ЕЗ) генотипы российских изолятов ротавирусов группы А разных GfPJ-типов. Изоляты ротавируса, характеризующиеся генотипом NSP4-B (Е1), доминировали.
3. Установлены филогенетические связи по гену NSP4 российских изолятов ротавируса G1P[8] типа со штаммами ротавируса из Скандинавских стран, a G3 серотипа со штаммами из стран Юго-Восточной Азии.
4. Впервые установлено родство по гену NSP4 российских изолятов ротавирусов Gl, G3, G4 генотипов и Р[8] типа с ротавирусами свиней, G3P[6], G3P[9] и G2P[4] типов - с ротавирусами крупного рогатого скота и G3P[9] типа — с ротавирусами кошек.
5. Созданы генетические конструкции pET22b-NSP4-GlP[8]-2, pET22b-NSP4-G3P[9], pET22b-NSP4-G9P[6], экспрессирующие NSP4 в культуре E.coli, штамм BL21(DE3) codon plus. Экспрессия сопровождалась торможением экспоненциального роста культуры E.coli независимо от типа NSP4.
6. Установлено, что замены аминокислот в вариабельных регионах белковой молекулы NSP4 не влияют на способность ротавирусного энтеротоксина дестабилизировать мембраны клеток E.coli.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Серьезность проблемы заболеваемости ротавирусной инфекцией на территории России и недостаточность знаний о механизмах развития патогенеза инфекции определили актуальность проведения настоящего исследования.
Работа посвящена изучению вариабельности гена энтеротоксина NSP4, играющего основополагающую роль в патогенезе ротавирусной инфекции, определению NSP4-reH0THn0B ротавируса, циркулирующего на территории России, а также характеристике молекулярно-биологических свойств NSP4 ротавирусов группы А разных GfPj-типов и Ы8Р4-генотипов.
Синтез кДНК гена NSP4 и определение ее нуклеотидной последовательности обеспечивают базис для изучения вариабельности гена NSP4 и энтеротоксических свойств белковой молекулы в целом и ее отдельных доменов. К началу наших исследований в научной зарубежной литературе были представлены праймеры для амплификации полноразмерной последовательности гена NSP4, подобранные более 10 лет назад [146]. Расширение информации о последовательностях гена NSP4, и вариабельность генома ротавирусов послужили основанием для модификации праймеров с целью их адаптации к современным штаммам ротавирусов. В связи с этим на первом этапе работы с использованием программы Mega 3.1. поведен сравнительный анализ 27 полных нуклеотидных последовательностей гена NSP4 разных генотипов, представленных в GenBank/EMBL/DDBJ к настоящему времени, по результатам которого сконструированы собственные версии праймеров для амплификации полноразмерной последовательности гена NSP4: NSP4-F l-[5'-ggCTTTTAAAAgTTCTgT-3']-18 и.о., NSP4-R 729-[5'-ggTCACRYTAAgACCRTTCCTTC-3 ']-752 н.о. Регион 5'-конца, соответствующий области прямого праймера, предложенного Zhang М. с соавторами (1998), не имеет нуклеотидных замен, поэтому мы сократили его последовательность до 18 н.о. Регион 3'-конца, соответствующий обратному праймеру, предложенному Zhang М. с соавторами, характеризуется вариабельностью нуклеотидов. С целью повышения специфичности обратного праймера мы модифицировали его путем введения вырожденных оснований (R - A/G; Y — С или T/U) и увеличением последовательности до 23 н.о. Модифицированные праймеры фланкируют участок гена NSP4 размером 752 н.о., что соответствует полноразмерной кДНК 10-го сегмента генома ротавирусов.
Для эффективной амплификации кДНК гена NSP4 были оптимизированы условия постановки ПЦР с учетом температуры плавления праймеров, установленной при помощи компьютерной программы «OLIGO 4.0» (США). На основе проведенного анализа температура отжига праймеров составила 55°С.
Теоретически подобранные условия проведения ПЦР и специфичность модифицированных праймеров были экспериментально подтверждены на пробах, содержащих РНК ротавируса разных G[P] типов. ПЦР осуществляли в режиме: 94°С-3 мин; 45х(94°С-30 с, 55°С-30 с, 72°С-1 мин); 72°С - 5 мин. С использованием оптимизированной методики амплификации была синтезирована кДНК полноразмерной последовательности 10-го сегмента генома ряда природных изолятов ротавируса человека с доминирующими и необычными электрофоретипами РНК, относящихся к различным G[P] типам и SG подгруппам, которые были определены в совместной работе с сотрудниками лаборатории молекулярной эпидемиологии вирусных инфекций ННИИЭМ им. академика И.Н. Блохиной. Разработанная методика явилась методической базой для изучения первичной структуры гена NSP4 у различных штаммов ротавируса человека, актуальных для территории России.
Синтезированные с применением данной методики полноразмерные последовательности 10-го сегмента генома ротавирусов также использовали в качестве матриц для амплификации открытой рамки считывания гена NSP4 с целью клонирования ее в экспрессирующей бактериальной векторной системе.
На следующем этапе работы определена первичная структура 10-го сегмента генома исследуемых изолятов ротавируса. Установленные последовательности гена NSP4 депонированы в GenBank/EMBL/DDBJ по номерами DQ270104 - DQ270118. Известно, что 10-й сегмент генома ротавирусов характеризуется высоким уровнем вариабельности, что отражает существование различных NSP4 генотипов. Нуклеотидные последовательности гена NSP4 15-ти российских изолятов ротавируса, установленные в настоящей работе, использовали для множественного выравнивания и филогенетического анализа с соответствующими последовательностями типовых штаммов различных NSP4-reH0THn0B и штаммов ротавирусов человека известных G[P] типов, выделенных на территориях разных стран, и представленных в GenBank/EMBL/DDBJ. Гомологию последовательностей определяли с помощью программы BLAST.
При построении филогенетического дерева нижегородские штаммы РВ образовали три кластера, соответствующие NSP4-A (Е2), В (Е1) и С (ЕЗ) генотипам. Различия в нуклеотидных последовательностях РВ разных генотипов достигали 25% и не превышали 7,9% для последовательностей одного генотипа в пределах субкластера и 13,7% - в пределах кластера.
Большинство геновариантов ротавируса, обладающих «длинным» ЭФ-типом РНК и SGII специфичностью, группировались с референтным штаммом Wa (AF200224), имеющим NSP4-B генотип. Данный генотип установлен у штаммов с доминирующими антигенными типами и электрофоретипами РНК в 73,3% и представлен в основном типом G1P[8], генотип G4 являлся минорным, что соответствовало спектру распределения геновариантов ротавируса на территории Нижегородской области в период 1997-2004 г [9].
Кластер Wa-подобных штаммов состоит из 3-х субкластеров, различия в нуклеотидных последовательностях которых по отношению к штамму Wa достигали 2,6%, 6,2% и 7,7%. Генетические варианты ротавируса серотипа G1 и субгенотипов Р[8]-1 и Р[8]-2, входящие в данный кластер, образовали самостоятельные группы, что отражает существование двух происхождений ротавирусов G1P[8] типа.
Генетические варианты ротавируса с «коротким» и «широким» ЭФ-типами РНК (подгруппа SGI), составили единый кластер с референтным штаммом DS-1 (AF1743 05), имеющим генотип NSP4-A. Высокий уровень различий (13,7%) между нуклеотидными последовательностями гена NSP4 исследуемых изолятов ротавируса, входящих в разные субкластеры в кластере, сформированном ротавирусами генотипа NSP4-A, позволяет предположить существование новых генотипов NSP4.
Необычный вариант ротавируса N.N.12871-G3P[9]-(10)/SGI с «широким» 10-м ЭФ-типом РНК группировался с референтным штаммом Au-1 (D89873), имеющим генотип NSP4-C. Гомология нуклеотидных последовательностей составила 99,8%.
Проведен филогенетический анализ по гену NSP4, позволивший проследить родство штаммов ротавируса, циркулирующих среди населения центральной России (Н.Новгород), со штаммами, выделенными на других территориях земного шара. Генетический вариант ротавируса GlP[8]-l-(3) типа, доминировавший на территории европейской части России в 1984-96 гг., и ассоциирующийся с тяжелой формой ротавирусного гастроэнтерита с выраженным респираторным синдромом [6, 7, 9], оказался генетически близкородственным штамму ротавируса G1P[8]-1, выделенному в Финляндии [100]. Представляется вероятным, что российский доминирующий генетический вариант ротавируса GlP[8]-l-(3)/NSP4-B • имел общее происхождение со штаммом, циркулировавшим на территории Скандинавских стран, или являлся тем же штаммом. Другие генетические варианты (4-й, 34-й ЭФ-типы РНК) ротавируса G1P[8]-1 типа циркулировали в более поздние сроки и, по всей вероятности, являются дериватами штамма GlP[8]-l-(3).
Варианты ротавируса генотипа NSP4-B типов G3P[8]-2 (88-й и 87-й ЭФ-типы РНК) и G4P[9]-(90), а также необычный вариант G3P[9]-(10)-NSP4-C группируются со штаммами из Тайваня и Китая.
Штаммы G3P[6]-(19) и G3P[9]-(68) подгруппы SGI с ЭФ-типом РНК, характеризующимся широким разбегом 5-6 сегмента РНК в ПААГ, что характерно для ротавирусов крупного рогатого скота, составили субкластер в кластере DS-1 подобных штаммов. Ротавирусы G2P[4]-NSP4-A типа, выделенные на территориях различных стран и континентов, в том числе и на территории России, образовали самостоятельную группу близкородственных штаммов, что свидетельствует об устойчивости данной генетической комбинации серотипа и генотипа.
Проведен филогенетический анализ ротавирусов человека и штаммов ротавирусов животных, представленных в базе данных GenBank. Установлено, что основная масса изучаемых вариантов ротавируса, образует самостоятельный геномный кластер «истинных» ротавирусов человека, включающий штаммы типов G1P[8]-1, GlP[8]-2, G3P[8]-2 и G4P[8]-2 (Wa-геногруппа). Эта группа штаммов РВ человека по последовательности гена NSP4 близка к ротавирусам свиней Идентичность нуклеотидных последовательностей составила 87,7-91%. Изоляты ротавируса человека G3P[6]/NSP4-A и G3P[9]/NSP4-A, принадлежащие, геногруппе DS-1, кластеризовались со штаммами ротавируса крупного рогатого скота. Идентичность нуклеотидных последовательностей составила 90,4-90,8%. По всей вероятности данные штаммы ротавируса или их предки являются реассортантами с ротавирусами крупного рогатого скота и приобрели от них ген NSP4.
Изолят ротавируса G3P[9]/NSP4-C, имеющий ЭФ-тип РНК, характерный для геногруппы Аи-1, оказался в кластере, формируемом ротавирусами кошек. Уровень гомологии нуклеотидных последовательностей составил 97,5%. Данный вариант вируса может являться реассортантом между ротавирусами кошек и человека, возникшим вследствие трансмиссии генов.
Таким образом, в результате проведенной работы впервые установлена нуклеотидная последовательность гена NSP4 российских (Нижний Новгород) изолятов ротавирусов группы А разных G[P] типов и показана вариабельность по гену NSP4. Выявлено филогенетическое родство российских изолятов ротавируса группы А человека с ротавирусами, выделенными на территориях других стран, и с ротавирусами животных.
Выраженность диареи при инфицировании различными геновариантами ротавирусов, возможно, объясняется молекулярно-биологическими свойствами энтеротоксина NSP4. Экспрессия NSP4 в бактериальной векторной системе может служить моделью для оценки токсических свойств на основе способности NSP4 перфорировать мембраны бактериальных клеток.
Для получения экспрессии NSP4 в клетках E.coli необходимо было получить кДНК открытой рамки считывания (ОРС) гена энтеротоксина. С этой целью на основе сравнительного анализа 42-х нуклеотидных последовательностей NSP4 разных генотипов, были сконструированы собственные версии праймеров для амплификации ОРС гена NSP4, удовлетворяющие условиям клонирования: NSP4-F(OPC) 33-[5'-TGCggACATATggATAAgCTTgCCgACCTC-3']-64 н.о., NSP4-R(OPC) 549-[5 -TCAACCTCgAgCATKgATgCAgTCACTTC-3 >577 н.о.
Так как целью работы являлось получение векторной системы для экспрессии ОРС, при конструировании праймеров в их последовательности были внесены сайты узнавания для эндонуклеаз рестрикции Ndel (cat atg внесен в прямой праймер), Xhol (ctc gag внесен в обратный праймер), что необходимо для корректной ориентации вставки последовательности ОРС NSP4 при постановке ее под экспрессию.
Регион 5'-концевого участка последовательности, соответствующего области прямого праймера, представляет собой консервативный участок, что и определило выбор праймера. Нуклеотидные замены в регионе 3'-концевого участка последовательности, соответствующего области обратного праймера, определили необходимость введения вырожденных оснований (К - G/T). Сконструированные нами праймеры, NSP4-F (ОРС) и NSP4-R (ОРС), фланкируют фрагмент гена NSP4 размером 544 н.о., расположенный с 33 по 577 н.о. Температура отжига праймеров, выбранная с использованием программы «OLIGO 4.0» (США), составила 55°С. Теоретически подобранные условия проведения ПЦР и специфичность сконструированных праймеров экспериментально апробованы в реакции, где в качестве матрицы для амплификации открытой рамки считывания гена NSP4 служила полноразмерная кДНК энтеротоксина ротавирусов человека. ПЦР осуществляли в режиме: 94 °С-3 мин; (94 °С-10 с, 55 °С-10 с, 72 °С-10 с)х42; 72 °С - 5 мин.
С использованием разработанной нами методики синтезированы последовательности ОРС гена NSP4 ротавируса геновариантов GlP[8]-2-NSP4-В, G3P[9]-NSP4-C, выделенных от детей с гастроэнтеритом и G9P[6]-NSP4-A типа, выделенного от новорожденного с бессимптомной формой инфекции. Для экспрессии ОРС гена NSP4 перечисленных изолятов ротавируса в клетках E.coli штамма BL21(DE3) codon plus выбран вектор pET22b+, обладающий сильным промотором гена 10 фага Т7, подходящей для вставки емкостью и простотой селекции. В результате генетических манипуляций получена кольцевая форма рекомбинантной ДНК, содержащая вставку последовательности ОРС гена NSP4, и пригодная для трансформации.
Компетентные клетки E.coli BL21(DE3) codon plus трансформировали полученными рекомбинантными плазмидами и индуцировали ИПТГ. В качестве контроля использовали клетки, трансформированные плазмидой рЕТ22Ь без вставки гена NSP4. Контроль экспрессии NSP4 проведен методом электрофореза в полиакриламидном геле, где показано присутствие искомого белка в бактериальной культуре после индукции экспрессии.
После индукции экспрессии NSP4 была проведена серия замеров оптической плотности трансформированных бактериальных культур, результаты которой показали нарушение способности E.coli к наращиванию биомассы. NSP4-C геноварианта ротавируса G3P[9] типа, близкородственного ротавирусам кошек, при экспрессии в модельной системе E.coli вызывал угнетение роста бактериальной культуры. Приобретение генов ротавируса кошек не снизило вирулентность исследуемого изолята для человека.
NSP4-B эпидемически значимого варианта ротавируса GlP[8]-2 типа, вызывающего гастроэнтерит, характеризующийся интенсивным диарейным синдромом и высокой частотой госпитализаций, проявил одинаковую способность нарушать рост бактериальной культуры наряду с NSP4 генотипов А и С.
NSP4-A ротавируса генотипа G9P[6], выделенного от новорожденного с бессимптомной формой инфекции, при экспрессии в клетках E.coli NSP4-G9P[6] вызывал угнетение роста бактериальной культуры, подобно ротавирусам генотипов GlP[8]-2-NSP4-B и G3P[9]-NSP4-C, вызделенных от детей с гастроэнтеритом.
Таким образом, установлено, что NSP4 разных генотипов ротавирусов, обнаруженных у детей с симптоматической и бессимптомной формой инфекции, при экспрессии в клетках E.coli характеризуются эффектом торможения роста бактериальной культуры, что свидетельствует об их сходных мембранодестабилизирующих свойствах. Эти результаты могут свидетельствовать, что бессимптомное течение ротавирусной инфекции, вероятно, обусловлено не молекулярно-биологическими свойствами вирусного энтеротоксина NSP4, а иными факторами вирусной природы, либо факторами организма хозяина.
С целью подтверждения отсутствия связи молекулярно-биологических свойств NSP4 разных генотипов с выраженностью диарейного синдрома у инфицированных ротавирусами детей проведен сравнительный анализ аминокислотных последовательностей NSP4 исследуемых изолятов ротавируса в регионах трансмембранного и цитоплазматического доменов белковой молекулы.
Обнаружено, что и в цитоплазматической части, и в трансмембранном регионе молекулы NSP4 имеются специфичные, свойственные определенному NSP4-reHO'rany, замены. Однако уникальных аминокислотных замен в последовательности NSP4 у варианта вируса, выделенного от детей с бессимптомной формой инфекции, которые отсутствовали бы у изолятов ротавируса, выделенных от детей с гастроэнтеритом, обнаружено не было.
Суммируя все вышесказанное, можно заключить, что разработанная нами методика ПЦР с использованием сконструированных праймеров явилась методической базой для изучения первичной структуры гена NSP4 у различных штаммов ротавируса человека, актуальных для территории России. С использованием оптимизированной методики синтезированы кДНК полноразмерного гена NSP4 и его открытой рамки считывания ротавирусов группы А человека. Впервые показана принадлежность российских изолятов ротавирусов к трем из 11-ти известных Ы8Р4-генотипов - А (Е2), В (Е1), С (ЕЗ), с доминированием штаммов, относящихся к генотипу NSP4-B. Подтверждено существование корелляции между УР6-субгруппой и NSP4-reHoranoM ротавируса. Проведенный на основе последовательности гена NSP4 сравнительный анализ, выявил филогенетическое родство ротавирусов типа G1P[8] со штаммами из Скандинавских стран, a G3 серотипа - со штаммами из стран Юго-Восточной Азии. Установлено, что изоляты ротавируса G1-, G3-, G4- и Р[8] типов являются близкородственными ротавирусам свиней, G3P[6]-, G3P[9]- и G2P[4] типов ротавирусам крупного рогатого скота и G3P[9] типа ротавирусам кошек. Эти данные свидетельствуют об эволюционных связях между ротавирусами человека и животных. Созданы генетические конструкции pET22b-NSP4-GlP[8]-2, pET22b-NSP4-G3P[9], pET22b-G9P[6], содержащие открытую рамку считывания гена NSP4. Получена экспрессия NSP4 в составе рекомбинантных плазмид в бактериальной культуре E.coli шт.ВЬ21 (DE3 )codon plus. Присутствие NSP4 в культуре E.coli после индукции экспрессии подтверждено методом элетрофореза в полиакриламидном геле. Установлено, что экспрессия NSP4 исследуемых изолятов ротавируса, выделенных от детей с симптоматической и бессимптомной формой инфекции, характеризовалась эффектом торможения роста бактериальной культуры, что свидетельствует о сходных мембранодестабилизирующих свойствах NSP4 разных генотипов ротавируса. Обнаруженные замены аминокислот в трансмембранном и цитоплазматическом доменах белковой молекулы NSP4 исследуемых изолятов ротавируса были генотипспецифическими и не влияли на способность энтеротоксина перфорировать мембраны клеток E.coli.
Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Пономарева, Наталья Вячеславовна, Нижний Новгород
1. Добротина Н.А., Ежова Г.П. Принципы стандартизации и унификации биохимических исследований. Учебное пособие // Горький, 1986. — 111 с.
2. Заварзин А.А., Строева О.Г. Сравнительная гистология // Изд-во С.-Пб. Ун-тета. 2000. - 520 с.
3. Мазанкова JI.H., Боровик Т.Э., Рославцева Е.А. Осмотическая диарея у детей и принципы патогенетического лечения // Вопросы современной педиатрии. 2003. - Т.2, N 4. - С. 47-53.
4. Малов В.А., Горобченко А.Н., Городнова Е.А. // Лечащий врач. -2002.-N 11.-С. 54-58.
5. Новикова Н.А., Анцупова А.С., Епифанова Н.В., Альтова Е.Е. Электрофоретический анализ геномной РНК ротавирусов человека // Молекул, генетика. 1989. -N 5. - С.45-49.
6. Новикова Н.А., Епифанова Н.В., Альтова Е.Е. и др. Электрофоретипирование ротавирусов при клинико-эпидемиологическом изучении инфекции // Микробиология. 1992. - N 2. - С. 31-34.
7. Новикова Н.А., Епифанова Н.В., Романова Т.В. и др. Ротавирусный гастроэнтерит. Противоэпидемические мероприятия: Пособие для врачей // Н.Новгород, 1998. 16 с.
8. Новикова Н.А., Голицына Л.Н., Епифанова Н.В., Федорова О.Ф., Луковникова Л.Б. Способ выделения РНК кишечных вирусов для анализа методом обратной транскрипции/полимеразной цепной реакции. Патент на изобретение № 2313792, приоритет от 10 апреля 2006 года.
9. Новикова Н.А., Федорова О.Ф., Епифанова Н.В., Чупрова А.Б. GP. типы ротавируса группы А и их распространение в Нижнем Новгороде и Дзержинске в 1997-2005 гг. // Вопр. Вирусол. 2007. -N 3. - С. 19-23.
10. Федорова О.Ф. Идентификация, молекулярно-биологическая характеристика и анализ циркуляции ротавирусов разных GP. типов: Автореф дис. канд. биол. наук. Н.Новгород, 2006. - С. 102-104.
11. Ющук Н.Д., Бродов М.Е. Острые кишечные инфекции: диагностика илечение // М.: Медицина. 2001. - 304 с.
12. Angel J., Franco М.А., Greenberg H.B. Rotavirus vaccines: recent developments and future considerations // Nature Reviews Microbiology. — 2007. — Vol. 5.-P. 529-539.
13. Arroyo J., Boceta M, Gonzalez ME, Michel M et al. Membrane permeabilization by different regions of the human immunodeficiency virus type 1 transmembrane glycoprotein gp41 // J. Virol. 1995. - Vol. 69, N 7. - P. 4095-4102.
14. Au K.S., Chan W.K,. Burns J.W, Estes M.K. Receptor activityof rotavirus nonstructural glycoprotein NS28 // J. Virol. 1989. Vol. 63. - P. 4553-4562.
15. Au K.-S., Mattion N.M, Estes M.K. A subviral particle binding domain on the rotavirus nonstructural glycoprotein NS28 // J. Virol. -1993. Vol. 194. - P. 665673.
16. Ball J.M., Tian P., Zeng C.Q., Morris A.P. et al. Age-dependent diarrhea induced by a rotaviral nonstructural glycoprotein. // Science. 1996. - Vol. 272. - P. 101-104.
17. Banyai K., Bogdan A., Domonkos G. et al. Genetic diversity and zoonotic potential of human rotavirus strains, 2003-2006, Hungary // J. Med. Virol. 2009. -Vol. 81, N2.-P. 362-370.
18. Berkova Z., Crawford S.E., Blutt S.E., Morris A.P. et al. Expression of Rotavirus NSP4 Alters the Actin Network: Organization through the Actin Remodeling Protein Cofilin // J. Virol. 2007. - Vol.81, N 7. - P.3545-3553.
19. Boshuizen J.A., Rossen J.W., Sitaram C.K. et al. Rotavirus enterotoxin NSP4 binds to the sxtracellular matrix proteins lamilin-beta3 and fibronectin // J. Virol. -2004. Vol. 78, N 18. - P. 10045-10053.
20. Both G.W., Bellamy A.R., Mitchell D.B. Rotavirus protein structure and function // Curr. Top. Microbiol. Immunol. 1994. - Vol. 185. - P. 67-105.
21. Bowman G.D., Nodelman I.M., Levy O. et al. Crystal structure of the oligomerization domain of NSP4 from rotavirus reveals a core metal-binding site // J. Mol. Biol. -2000.-Vol. 304. -P.861-871.
22. Bozdayi G., Dogan В., Dalgic B. et al. Diversity of human rotavirus G9 among children in Turkey // J. Med. Virol. 2008. - Vol. 80, N 4. - P. 733-740.
23. Browne E.P., Bellamy A.R., Taylor J.A. MeMbrane-destabilizing activity of rotavirus NSP4 is mediated by a membrane-proximal amphipathic domain // J. Gen. Virol.-2000.-Vol. 81,N8.-P. 1955-1959.
24. Brunet J.P., Cotte-Laffitte J., Linxe C. et al. Rotavirus infection induces an increase in intracellular calcium concentration in human intestinal epithelial cells: role in microvillar actin alteration // J. Virol. 2000. - Vol. 74. - P. 2323-2332.
25. Bugarcic A., Taylor J.A. Rotavirus nonstructural glycoprotein NSP4 is secreted from the apical surfaces of polarized epithelial cells // J. Virol. 2006. — Vol. 80. - P.12343-12349.
26. Casola A., Estes M.K, Crawford S.E. et al. Rotavirus infection of cultured intestinal epitelial cells induces secretion of CXC and CC chemockines // Gastroenterology. 1998. - Vol. 114, N 5. - P. 947-955.
27. Chan W.K., Au K.S., Estes, M.K. Topology of the simian rotavirus nonstructural glycoproteins (NS28) in the endoplasmic reticulum membrane // J. Virol.-1988.-Vol.164.-P. 435-442.
28. Chemello M.E., Aristimuno O.C., Michelangeli F., Ruiz M.C. Requirement for vacuolar H+-ATPase activity and Ca2+ gradient during entry of rotavirus into MA104 cells // J. Virol. 2002. - Vol.761. - P. 3083-3087.
29. Chen D., Luongo C.L., Nibert M.L., Patton J.T. Rotavirus open cores catalyze 5'-capping and methylation of exogenous RNA: evidence that VP3 is a methyltransferase // J. Virol. 1999. - Vol. 265. - P.120-130.
30. Ciarlet M., Estes M.K. Human and most animal rotavirus strains do not require the presence of sialic acid on the cell surface for efficient infectivity //
31. J. Gen. Virol. 1999. -Vol. 80. - P. 943-948.
32. Ciarlet M.F., Liprandi F., Conner M.E., Estes M.K. Species specificity and interspecies relatedness of NSP4 genetic groups by comparative NSP4 sequence analyses of animal rotaviruses // Arch. Virol. 2000. - Vol. 145. - P. 371-383.
33. Ciarlet M., Crawford S.E., Estes M.K. Differential Infection of Polarized Epithelial Cell Lines by Sialic Acid-Dependent and Sialic Acid-Independent Rotavirus Strains // J. Virol. 2001. Vol. 75, N23. - P. 11834-11850.
34. Cook J.P., McCrae M.A. Sequence analysis of the guanylyltransferase (VP3) of group A rotaviruses // J. Gen. Virol. 2004. - Vol.85, N 4. - P. 929-932.
35. Costa M., Furness J.B., Cuello A.C. et al. Neurons with 5-hydroxytryptamine-like immunoreactivity in the enteric nervous system: their visualization and reactions to drug treatment // Neuroscience. 1982. Vol. 7, N2. -P.351-363.
36. Crawford S.E., Labbe M., Cohen J., Burroughs M.H. et al. Characterization of virus-like particles produced by the expression of rotavirus capsid proteins in insect cells // J. Virol. -1994. Vol.68. -P.5945-5922.
37. Cunliffe N.A., Gondwe J.S., Graham S.M. et al. Rotavirus strain diversity in Blantyre, Malawi from 1997 to 1999 // J. Clin. Microbiol. 2001. - Vol. 39, N 3.41. P. 836-843.
38. Cunliffe N.A., Breses J.S., Gentsch J.R. et al. The expanding diversity of rotaviruses // Lancet. 2002. - Vol. 359. - P. 640-641.
39. Deepa R., Durga Rao C., Suguna K. Structure of the extended diarrhea-inducing domain of rotavirus enterotoxigenic protein NSP4 // Arch. Virol. 2007. -Vol. 152, N5 — P.847-859.
40. Denisova E., Dowling W., LaMonica R. Et al. Rotavirus capsid protein VP5*permeabilizes membranes // J.Virol. 1999. - Vol. 73, N 4. - P. 3147-3153.
41. Diaz Y., Chemello M.E., Pena F., et al. Expression of nonstructural rotavirus protein NSP4 mimics Ca2+ homeostasis changes induced by rotavirus infection in cultured cells //J. Virol. -2008. Vol.82, N 22. - P. 11331-11343.
42. Dowling W., Denisova E., LaMonica R., Mackow E.R. Selective membrane permeabilization by the rotavirus VP5* protein is abrogated by mutations in an internal hydrophobic domain // J. Virol. 2000. - Vol. 74. - P. 6368-6376.
43. Ebert E. Human intestinal intraepithelial lymphocyres have potent chemotactic activity // Gastroenterol. 1995. - Vol. 109. - P.l 154-1159.
44. El-Attar L., Dhaliwal W., Howard C.R., Bridger J.C. Rotavirus cross-species pathogenicity: molecular characterization of a bovine rotavirus pathogenic for pigs // J. Virol. 2001. - Vol. 291. - P. 172-182.
45. Epand R.M., Shai Y., Segrest J.P. et al. Mechanisms for the modulation of membrane bilayer properties by amphipathic helical peptides // Biopolymers. 1995. -Vol. 37, №5. -P. 319-338.
46. Estes M.K., Graham D.Y., Mason B.B. Proteolytic enhancement of rotavirus infectivity: molecular mechanism // J. Virol. -1981. Vol 39. - P. 879-888.
47. Estes M.K., Cohen J. Rotavirus gene structure and function // Microbiological Reviews. 1989. - Vol. 53, N 4. - P. 410-449.
48. Estes M.K. Rotaviruses and their replication. In Fields B.N., Knipe D.N., Howley P.M. et al. Fields virology, Raven Press, New York, 1996. P. 1625-1655.
49. Estes M. K. Rotaviruses and their replication. In Fields B.N. Knipe D.N., Howley P.M., Griffin D.E. et al. Virology, Philadelphia, 2001. P. 1747-1785.
50. Espejo R.T, Lopez S., Arias C.F. Structural polypeptides of simian rotavirus SA11 and effect of trypsin // J. Virol. 1981. - Vol.37, N1. - P. 156-160.
51. Field M. Intestinal ion transport and the pathophysiology of diarrhea // J. Clin. Invest. 2003. - Vol. 111, N7. - P. 931-943.
52. Fischer W.B., Sansom M.S. Viral ion channels: structure and function // Biochim. Biophys. Acta. -2002. Vol.1561, N1. - P. 27-45.
53. Fleming F.E., Graham K.L., Taniguchi K. et al. Rotavirus-neutralizing antibodies inhibit virus binding to integrins alpha 2 beta 1 and alpha 4 beta 1 // J. Arch. Virol. 2007. - Vol. 152, N6. - P. 1087-1101.
54. Flewett Т.Н., Woode G.N. The rotaviruses. Brief review // Arch. Virol. — 1978.- Vol.57, Nl.P.1-23.
55. Flores J., Perez I., White L. Genetic relatedness among human rotaviruses as determined by RNA hibridization // Infect, and Immun. 1982. - Vol. 37, N2. - P. 648-655.
56. Furness J.B, Costa M. Types of nerves in the enteric nervous system. // Neuroscience. 1980. - Vol.5, N1. - P. 1-20.
57. Furness J.B, Costa M., Franco R., Llewellyn-Smith I.J. Neuronal peptides in the intestine: distribution and possible functions // Adv Biochem Psychopharmacol. 1980. -Vol. 22. P. 601-617.
58. Gentsch J.R, Laird A.R, Bielfelt B. Et al. Serotype diversity and reassortment between human and animal rotavirus strains: implications for rotavirus vaccine programs // J. Infect. Dis. 2005. - Vol. 192. - P.146-159.
59. Gerna G., Sarasini A., Matteo A. et al. Serotype 3 human rotavirus strains with subgroup I specificity // J. Clin. Microbiol. 1990. - Vol. 26, №6. - P. 13421347.
60. Glass R.I., Bresee J.S., Turcios R. et al. Rotavirus vaccines: targeting the developing world // J. Infect Dis. 2005. Vol.192. - P. 160-166.
61. Gonzalez R.A, Torres-Vega M.A, Lopez S, Arias CF. In vivo interactions among rotavirus nonstructural proteins // Arch. Virol. 1998. Vol.143, N5. - P.981-996.
62. Gonzalez M.E., Carrasco L. 2003. Viroporins // FEBS Lett. 2003. - Vol. 552, N1.-P. 28-34.
63. Gouvea V., Glass R., Wood P. Polymerase chain reaction amplification and typing of rotavirus nucleic acid from stool specimens // J. Clin. Microbiol. 1990. -Vol. 28, N 2. - P. 276-282.
64. Graham K.L., Takada Y., Coulson B.S. Rotavirus spike protein VP5* binds alpha2betal integrin on the cell surface and competes with virus for cell binding and infectivity//J. Gen. Virol.-2006. Vol. 87, N 5. -P.1275-1283.
65. Guerrero C.A., Mendez E., Zarate S. et al. Integrin ovp3 mediates rotavirus cell entry // PNAS USA. 2000. - Vol. 97. - P. 14644-14649.
66. Guerrero C.A., Zarate S., Corkidi G. et al. Biochemical characterization of rotavirus receptors in MAI 04 cells // J. Virol. 2000. - Vol.74. - P.9362-9371.
67. Halaihel N., Lievin V., Alvarado E., Vasseur M. Rotavirus infection impairs intestinal brush-border membrane Na+-solute cotransport activities in young rabbits // J. Physiol. 2000. - Vol.279, N3. - P. 587-596.
68. Halaihel N., Lievin V., Ball J.M. et al. Direct inhibitory effect of rotavirus NSP4(114-135) peptide jn the Na+-D-glucose symporter of rabbit inyestinal brush border membrane // J. Virol. 2000. - Vol. 74, N20. - P.9464-9470.
69. Hewish M., Takada Y., Coulson B. Integrins (X2pi and 0401) can mediate SA11 rotavirus attachment and entry into cells // J. Virol. -2000. Vol. 74. -P.228-236.
70. Horie Y., Masamune O., Nakagomi O. Three major alleles of rotavirus NSP4 proteins identified by sequence analysis // J. Gen. Virol. -1997. -Vol. 78. P. 2341-2346.
71. Hornaidan F.R., Torres A., Donowitz M., Sharp G.W.G. Electrolyte transport in piglets infected with transmissible gastroenteritis virus. Stimulation by verapamil and clonidine // Gastroenterol. 1991. - Vol.101. - P. 895-901.
72. Huang H., Schroeder F., Zeng C. et al. Membrane interactions of a novel viral enterotoxin: rotavirus nonstructural glycoprotein NSP4 // Biochem. 2001. -Vol. 40, N13. - P.4169-80.
73. Huang H., Schroeder F., Estes M.K. et al. The intaraction(s) of rotavirus NSP4 C-terminal peptides with model membranes //. J. Biochemical Society. 2004. -Vol. 380, N 3. P.723-733.
74. Iturriza-Gomara M., Wong C., Blome S .et al. Molecular characterization of VP6 genes of human rotavirus isolates: correlation of genogroups with subgroups andevidence of independent segregation // J. Virol. 2002. — Vol. 76, № 13. - P. 65966601.
75. Iturriza-Gomara M., Anderton E., Kang G. Evidens for genetic linkage between the gene segments encoding NSP4 and VP6 proteins in common and reassortant human rotavirus strains. // J. Clin. Microbiol. 2003. - V.41, N8. - P.3566-3573.
76. Iturriza-Gomara M., Kang G., Gray J. Rotavirus genotyping keeping up with an evolving population of human rotaviruses // J. Clin Virol. — 2004. — Vol. 31. -P. 259-265.
77. Jayaram H., Estes M.K., Prasad V. Emerging themes in rotavirus cell entry, genome organization, transcription and replication // Virus Research. 2004. - Vol. 101.-P. 67-81.
78. Jolly C.L., Beisner B.M., Holmes I.H. Rotavirus infection of MAI 04 cells is inhibited by Ricinus lectin and separately expressed single binding domains // J. Virol. 2000. - Vol. 275. - P.89-97.
79. Kagnoff M.F., Eckmann L. Epithelial cells as sensors for microbial infection // J. Clin. Invest. 1997. - Vol. 100. -P. 6-10.
80. Kalica A.R., Greenberg H.B., Espejo R.T. Distinctive ribonucleic acid pattern of human rotavirus subgroup I and II // Infect. Immunol. 1981. - V. 33, N 3. - P. 958-961.
81. Khamrin P., Maneekarn N., Peerakome S. et al. Novel porcine rotavirus of genotype P27. shares new phylogenetic lineage with G2 porcine rotavirus strain // J.Virol. -2007. Vol. 361. - P. 243-252.
82. Kirkup A.J., Brundsen A.M., Grundy D. Receptors and transmission in the brain-gut axis: potential for novel therapies // J. Physiol. 2001. - Vol. 280. - P. 787794.
83. Kirkwood C.D., Coulson B.S., Bishop R.F. G3P2 rotaviruses causing diarrhoeal disease in neonates differ in VP4, VP7 and NSP4 sequence from G3P2 strains causing asymptomatic neonatal infection // Arch. Virol. 1996. - Vol. 141, N9. -P.1661-1676.
84. Kombo L.A., Gerber M.A., Pickering L.K. et al. Intussusception, infection, and immunization: summary of a workshop on rotavirus // Pediatrics. 2001. - Vol. 108,N2.-P. 37.
85. Kumar S., Tamura K., Nei M. MEGA3: Integrated software for Molecular Evolutionary Genetics Analysis and sequence alignment // Briefings in Bioinformatics. -2004.-№5.-P. 150-163.
86. Kutzuzawa Т., Konno Т., Suzuki H. et al. Two distinct electrophoretic migration patters of RNA segments of human rotaviruses prevalent in Japan in relation the their serotypes // Microbiol. Immunol. 1982. - Vol. 26, N 3. - P. 271-273.
87. Laemmli U.K. Cleavage of structure proteins during the assembly of bacteriophage T4 // Nature. 1970. - Vol. 227. - P. 680-685.
88. Lin S.L., Tian, P. Detailed computational analysis of a comprehensive set of group A rotavirus NSP4 proteins // J. Virus Genes. 2003. - Vol. 26. - P. 271-282.
89. Londrigan S., Hewish M., Thompson M. et al. Growth of rotaviruses in continuous human and monkey cell lines that vary in their expression of integrins // J. Gen. Virol. 2000. - Vol. 81, N 9. -P.2203-2213.
90. Londrigan S.L., Graham K.L., Takada Y. et al. Monkey rotavirus binding to alpha2betal integrin requires the alpha2 I domain and is facilitated by the homologous betal subunit //. J. Virol. 2003. -Vol. 77, N17. - P.9486-94501.
91. Lorrot M., Vasseur M. How do the rotavirus NSP4 and bacterial enterotoxins lead differently to diarrhea? // J. Virol. 2007. - Vol. 4, №31.- P. 1-6.
92. Lundgren O., Timar-Peregrin A., Persson K. et al. Role of the enteric nervous system in the fluid and electrolyte secretion of rotavirus diarrhea // Science. 2000. -Vol. 287. -P.491-495.
93. Lungren O., Svensson 1: Pathogenesis of rotavirus diarrhea // Microbes Infect. 2001. - Vol. 3, N13. - P. 1145-1156.
94. Malik J., Gupta S.K., Bhatnagar S. et al. Evaluation of IFN-gamma response to rotavirus and non-structural protein NSP4 of rotavirus in children following severe rotavirus diarrhea // J. Clin. Virol. 2008. - Vol. 43, N2. -P.202-206
95. Martella V., Ciarlet M., Camarda A. et al. Molecular characterization of the VP4, VP6, VP7, and NSP4 genes of lapine rotaviruses identified in Italy: emergence of a novel VP4 genotype // J. Virol. 2003. - Vol. 314. - P. 358-370.
96. Martella V., Ciarlet M., Banyai K. et al. Identification of group A porcine rotavirus strains bearing a novel VP4 (P) genotype in Italian swine herds // J. Clin. Microbiol. 2007. - Vol. 45. - P. 577-580.
97. Maunula L., von Bonsdorff C-H. Frequent reassortments may explanin the genetic heterogeneity of rotaviruses: analysis of Finnish rotavirus strains // J. of Virology. 2002. - Vol.76, N 23. - P. 11793-11800.
98. Michelangeli F., Liprandi F., Chemello M.E. et al. Selective depletion of stored calcium by thapsigargin blocks rotavirus maturation but not the cytopathic effect // J. Virol. 1995. - Vol. 69. - P. 3838-3847.
99. Mirazimi A., Nilsson M., Svensson L. The molecular chaperone calnexin interacts with the NSP4 of rotavirus in vivo and in vitro // J. Virol. 1998. - Vol. 72, N 11. - P.8705-8709.
100. Mirazami A., Magnusson K.E, Svensson L. A citoplasmic region of the NSP4 enterotoxin of rotavirus is involved in retention in the endoplasmic reticulum // J. Gen. Virol. -2003. Vol. 84, N 4. - P. 875-883.
101. Mohan K.V., Dermody T.S., Atreya C.D. Mutations selected in rota virus enterotoxin NSp4 depend on the context of its expression // J.Virol. 2000. - Vol. 275.-P. 125-132.
102. Mori Y., Borgan M.A., Ito N. et al. Sequential analysis of nonstructural protein NSP4s derived from group A avian rotaviruses // Virus Res. 2002. Vol. 89. -P. 145-151.
103. Morris A.P., Scott J.K., Ball J.M. et al. NSP4 elicits age-dependent diarrhea and Ca2+ mediated I— influx into intestinal crypts of CF mice // J. Physiol. 1999. — Vol. 277.-P. 431-444.
104. Morris A.P., Estes M.K. Microbes and microbial toxins: paradigms for microbial mucosal interactions VIIL Pathological consequences of rotavirus infection and its enterotoxin // J. Physiol. 2001. - Vol. 280. - P.l -6.
105. Nakagomi O., Nakagomi Т., Hoshino Y. et al. L Genetic analysis of a human rotavirus that belongs to subgroup I but has an RNA pattern typical of subgroup II human rotavirus // Clin. Microbiol. 1987. - Vol. 25, N 7. - P. 11591164.
106. Nakagomi Т., Nakagomi O. RNA-RNA hybridization identifies a human rotavirus that is genetically related to feline rotavirus // J. Virol. 1989. - Vol.63, N 3. -P.1431-1434.i
107. Nakagomi O., Isegawa Y., Ueda S., Flores J. Two distinct clusterings of the VP8* gene of rotaviruses possessing the AU-1 gene 4 allele // Microbiol Immunol. -1993. Vol.37, N10. - P.817-820.
108. Newton K., Meyer J.C., Bellamy A.R. et al. Rotavirus nonstructural glycoprotein NSP4 alters plasma membrane permeability in mammalian cells // J. Virol. 1997. - Vol.71. - P. 9458-9465.
109. Obert G., Peiffer I., Servin A.L. Rotavirus-induced structural and functional alterations in tight junctions of polarized intestinal Caco-2 cell monolayers // J. Virol. 2000.-Vol.74.-P. 4645-4651.
110. O'Brien J.A., Taylor J.A., Bellamy A.R. Probing the structure of rotavirus NSP4: a short sequence at the extreme С terminus mediates binding to the inner capsid particle // J. Virol. 2000. - Vol. 74, N 11. - P. 5388-5394.
111. O'Ryan M.L., Hermosilla G., Osorio G. Rotavirus vaccines for the developing world // Curr. Opin. Infect. Dis. 2009. - Vol.22, N5. - P. 483-489.
112. Ока Т., Nakagomi Т., Nakagomi О. A lack of consistent amino acid substitutions in NSP4 between rotaviruses derived from diarrheal and asymptomatically infected kittens // J. Microbio.l Immunol. — 2001. Vol.45. - P. 173-177.
113. Pager C.T., Alexander J. J., Steele A.D. South African G4P6. asymptomatic and symptomatic neonatal rotavirus strains differ in their NSP4, VP8*, and VP7 genes // J. Med. Virol. 2000. - Vol.62, N2. - P. 208-16.
114. Parr R.D, Storey S.M, Mitchell D.M. et al. The rotavirus enterotoxin NSP4 directly interacts with the caveolar structural protein caveolin-1 // J. Virol. 2006. — Vol. 80, N 6. - P.2842-2854.
115. Pesavento J.B., Lawton J.A., Estes M.E., Venkataram Prasad B.V. The reversible condensation and expansion of the rotavirus genome // Proc Natl Acad Sci USA. -2001. Vol. 98, N4. - P. 1381-1386.
116. Poruchynsky M.S., Maass D.R., Atkinson P.H. Calcium depletion blocks the maturation of rotavirus by altering the oligomerization of virus-encoded proteins in the ER // J. Cell Biol. 1991. - Vol. 114, N4. - P. 651-656.
117. Prasad B.V., Marietta E., Estes M.K., Chiu W. Localization of VP4 neutralization sites in rotavirus by threedimensional cryo-electron microscopy // Nature. 1990. - Vol. 343, N 6257. - P. 476-479.
118. Rahman M., Matthijnssens J., Goegebuer T. et al. Predominance of rotavirus G9 genotype in children hospitalized for rotavirus gastroenteritis in Belgium during 1999-2003 // J. Clin. Virol. 2005. - Vol. 33, N1. - P. 1-6.
119. Rahman M., Matthijnssens J., Yang X. et al. Evolutionary history and global spread of the emerging G12 human rotaviruses // J. Virol. 2007. -Vol. 81. -P. 2382-2390.
120. Rainsford E.W., McCrae M.A. Characterization of the NSP6 protein product of rotavirus gene 11 // Virus Res. 2007. - Vol. 130, N1-2. - P. 193-201.
121. Rajasekaran D., Sastri N.P., Marathahalli J.R. et al. The flexible С terminus of the rotavirus non-structural protein NSP4 is an important determinant of its biological properties // J. Gen. Virol. 2008. - Vol. 89, N 6. - P.1485-1496.
122. Ramig R.F. Pathogenesis of intestinal and systemic rotavirus infection // J. Virol.-2004.-Vol. 78, N19.-P. 10213-10220.
123. Rodriguez-Diaz J., Banasaz M., Istrate C. et al. Role of nitric oxide during rotavirus infection // J. Med. Virol. 2006. - Vol. 78, N7. - P.979-985.
124. Ruiz M.C., Cohen J., Michelangeli F. Role of Ca2+ in the replication and pathogenesis of rotavirus and other viral infections // Cell Calcium. 2000. -Vol. 28, N3.-P. 137-149.
125. Santos N., Hoshino Y. Global distribution of rotavirus serotypes/genotypes and its implication for the development and implimentation of an effective rotavirus vaccine // Rev. Med. Virol. 2005. - Vol. 15. - P. 29-56.
126. Seo N.S., Zeng C.Q., Hyser J.M. et al. Inaugural article: integrins alpha 1 beta 1 and alpha2betal are receptors for the rotavirus enterotoxin // Proc Natl AcadSciUS A. -2008.-Vol. 105, N26.-P.8811-8.
127. Shahrabadi M.S., Babiuk L.A., Lee P.W.K. Further analysis of the role of calcium in rotavirus morphogenesis // J. Virol. 1987. Vol. 158. - P. 103-111.
128. Shaw R.D., Fong K.J., Losonsky G.A. et all. Epitope-specific immune responses to rotavirus vaccination // J. Gastroenterol. 1987. - Vol. 93. - P. 941-950.
129. Shirley J.A., Beards G.M., Thouless M.E., Flewett Т.Н. The influence of divalent cations on the stability of human rotavirus // Arch. Virol. 1981. - Vol. 67, Nl.-P.l-9.
130. Song X.F., Hao Y. Adaptive evolution of rotavirus VP7 and NSP4 genes in different species // Comput. Biol. Chem. 2009. - Vol. 33, N4. - P.344-349.
131. Stupka J.A., Parra G.I., Gomez J., Arbiza J. Detection of human rotavirus G9P8. strains circulating in Argentina: phylogenetic analysis of VP7 and NSP4 genes // J. Med. Virol. 2007. - Vol.79, N6. - P. 838-842.
132. Svensson L., Uhnoo I., Grandien M., Wodell G. Molecular epidemiology of rotavirus infection in Uppsala, Sweden, 1981: disapperence of a predominant electropherotype // J. Med. Virol. 1986. - Vol. 18, N2. - P. 101-111.
133. Svensson L., Sheshberadaran H., Vene S. et al. Serum antibody responses to individual polypeptides in human rotavirus infections // J. Virol. 1987. - Vol. 68. -P. 643-651.
134. Tafazoli F., Zeng C.Q., Estes M.K. et al. NSP4 enterotoxin of rotavirus induces paracellular leakage in polarized epithelial cells // J. Virol. 2001. - Vol. 75, N3. - P.1540-1546.
135. Taylor J.A., O'Brien J.A., Lord V.J. et al. The RER-localized rotavirus intracellular receptor: a truncated purified soluble form is multivalent and binds vims particles // J. Virol. 1993. - Vol.194, N2. - P.807-814.
136. Tian P., Estes M.K., Hu Y. et al. The rotavirus nonstructural glycoprotein NSP4 mobilizes Ca2+ from the endoplasmic reticulum // J. Virol. 1995. - Vol. 69, N9. - P.5763-5772.
137. Tian P., Ball J.M., Zeng C.Q.-Y., Estes M.K. The rotavirus nonstructural glycoprotein NSP4 possesses membrane destabilization activity // J. Virol. -1996. -Vol. 70.-P. 6973-6981.
138. Tian P., Ottaiano A., Reilly P.A. et al. The authentic sequence of rotavirus SA11 nonstructural protein NSP4 // Virus Res. 2000. - Vol. 66, N2. - P. 117-122.
139. Ushijima H., Koike H., Mukoyama A. et al. Detection and serotyping of rotaviruses in stool specimens by using reverse transcription and polymerase chain reaction amplification // J. Med. Virol. 1992. - Vol. 38, N 4. - P. 292-297.
140. Ward R.L., Mason B.B., Bernstein D.I. et al. Attenuation of a human rotavirus vaccine candidate did not correlate with mutations in the NSP4 protein gene // J. Virol. 1997. - Vol.71, N8. - P.6267-6270.
141. Zarate S., Espinosa R., Romero P. et al. The VP5 domain of VP4 can mediate attachment of rotaviruses to cells // J. Virol. 2000. - Vol.74, N 2. - P.593-599.ч\л
142. Zhang М., Zeng C.Q.-Y., Dong Y. et al. Mutations in Rotavirus Nonstructural Glycoprotein NSP4 Are Associated with Altered Virus Virulence // J. Virol. 1998. - Vol. 72, N 5. - P. 3666-3672.
143. Zhang M., Zeng C.Q.-Y., Morris A.P., Estes M.K. A functional NSP4 enterotoxin peptide secreted from rotavirus-infected cells // J.Virol. -2000. -Vol.74, N. 24.-P. 11663-11670.
- Пономарева, Наталья Вячеславовна
- кандидата биологических наук
- Нижний Новгород, 2010
- ВАК 03.01.04
- Идентификация, молекулярно-биологическая характеристика и анализ циркуляции ротавирусов разных G[P] типов
- Генетические и антигенные варианты ротавируса человека, циркулирующие на Европейской территории России
- Молекулярно-генетическая характеристика ротавирусов, циркулирующих в Новосибирске у детей раннего возраста
- Изучение экспрессии генов VP7 ротавируса свиней и секретируемой щелочной фосфатазы в составе геномов ремомбинантных аденовирусов
- Разработка иммуноферментных тест-систем для выявления антител к рота- и коронавирусам крупного рогатого скота