Разработка иммуноферментных тест-систем для выявления антител к рота- и коронавирусам крупного рогатого скота

Скитович, Галина Сергеевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Разработка иммуноферментных тест-систем для выявления антител к рота- и коронавирусам крупного рогатого скота
ВАК РФ 03.02.02, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Разработка иммуноферментных тест-систем для выявления антител к рота- и коронавирусам крупного рогатого скота"

На правах рукописи

СКИТОВИЧ Галина Сергеевна

РАЗРАБОТКА ИММУНОФЕРМЕНТНЫХ ТЕСТ-СИСТЕМ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ АНТИТЕЛ К РОТА- И КОРОНАВИРУСАМ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА

03.02.02 «Вирусология»

1 3 ПЕК 2012

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Владимир - 2012

005056884

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Федеральный центр охраны здоровья животных» (ФГБУ «ВНИИЗЖ»), г. Владимир

Научный руководитель -

кандидат биологических наук, доцент (ФГБУ «ВНИИЗЖ») Прохватилова Лариса Борисовна

Официальные оппоненты: Диев Вячеслав Иванович, доктор

ветеринарных наук, профессор (ФГБУ «ВНИИЗЖ»), г. Владимир

Ведущая организация - Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии имени Я.Р. Коваленко, г. Москва.

Защита диссертации состоится «\3» рлье&М-*. 2012 г. в 12 —часов на заседании совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д 220.015.01 при ФГБУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» по адресу: 600901, г. Владимир, мкр. Юрьевец.

С диссертацией и авторефератом можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» и на сайте ЬМр//\у\у\у.агпаЬ.га.

Автореферат разослан «16» ноября 2012 г.

Ученый секретарь совета по защите докторских и кандидатских диссер-—"

Виткова Ольга Николаевна, кандидат ветеринарных наук (ФГБУ «ЦНМВЛ»), г. Москва

доктор биологических наук

ФГБУ «ВНИИЗЖ»

А.П. Пономарев

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

1.1. Актуальность темы. На протяжении многих лет животноводство всех стран мира, в том числе и России, несёт значительные экономические потери от желудочно-кишечных болезней новорожденных телят. В основе сложившейся неблагоприятной ситуации лежит целый ряд факторов, из которых наиболее важными являются: содержание большого поголовья скота на ограниченном пространстве, возникновение стрессов, усложнение микробного и вирусного пейзажа в хозяйствах и комплексах, снижение иммунитета. В этих условиях нередко возникают и быстро распространяются инфекционные болезни, проявляющиеся в виде энтеритов животных.

Рота- и коронавирусьг (РВ, КВ) - занимают одно из ведущих мест в патологии желудочно-кишечного тракта новорожденных телят [1, 11].

Величина экономического ущерба при этих заболеваниях значительна и складывается из падежа телят, снижения мясной и молочной продуктивности, уменьшения привесов, выбраковки животных. Проведение своевременной и точной лабораторной диагностики является важным фактором в борьбе с этими инфекциями [13, 14].

В настоящее время при лабораторном исследовании рота-, коронавирусных инфекций широко использутся метод иммуноферментного анализа (ИФА). Быстрота получения результатов, воспроизводимость и автоматизированный учет реакции, возможность стандартизации условий постановки анализа делают этот метод наиболее эффективным и выгодным для массовых серологических исследований.

1.2. Степень разработанности проблемы. Вопросам разработки и усовершенствования тест-систем ИФА для выявления антител к РВ и КВ посвящены работы ряда зарубежных авторов [5, 6]. Широкое распространение получили модификации ИФА на основе ELISA. Losonsky G.A. с сотр. (1990) разработали ELISA для определения уровня IgA и IgG, так как данные иммуноглобулины не передаются от матери, а вырабатываются в ответ на попадание ротавируса в организм, что дает возможность говорить о наличии

заболевания у новорожденных телят, обладающих пассивно приобретенным иммунитетом в качестве IgG [8]. Lecce J.G. и сотр. (1982), Agrawal D.K. и сотр. (2002) методом непрямого ИФА (н-ИФА) определяли антиротавирусные антитела в молоке и молозиве коров, а также проводили оценку уровня колостральных антител у новорожденных телят с целью оценки иммунного статуса организма телят и изучения эпизоотической ситуации [4, 7]. В работе Myers L.L. и сотр. (1982) показана зависимость титров молозивных антител и антител в молоке коров от вакцинации живой модифицированной вакциной против рота-, коронавирусной инфекций КРС [9].

Многими зарубежными коммерческими фирмами (INGENAZA, 1DEXX, Cypress, Bio X и др.) предложены тест-системы на основе н-ИФА для определения антител к РВ и KB в сыворотках крови при исследовании их в одном разведении. Поскольку данные наборы не всегда доступны, актуальным является создание отечественных тест-систем.

1.3. Цель и задачи исследований. Цель данной работы состояла в разработке диагностических тест-систем на основе подготовленных штаммов рота-, коронавирусов КРС для выявления антител к ним при проведении серологических исследований. Для осуществления поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1) выделить и адаптировать полевые изоляты РВ КРС, циркулирующие на территории РФ, в культуре клеток;

2) изучить иммунобиологические свойства выделенных изолятов РВ КРС для возможного использования в качестве производственных штаммов;

3) отработать методы получения высокоочищенных концентрированных препаратов антигенов РВ и KB;

4) разработать тест-системы на основе н-ИФА для определения антител к рота-, коронавирусам в сыворотках крови КРС методом одного разведения;

5) с помощью разработанных тест-систем провести исследования иммунного статуса поголовья КРС в хозяйствах РФ.

1.4. Научная новизна исследований. Выделен и адаптирован к культуре клеток новый штамм РВ КРС «ТЕ87-ДЕП», на который получен патент на изобретение. Разработаны отечественные тест-системы ИФА с применением в качестве антигенов штаммов РВ и КВ, выделенных из хозяйств РФ, для выявления и количественной оценки специфических антител к ним при тестировании сывороток крови в одном разведении.

1.5. Практическая значимость работы. Для практического применения разработаны и утверждены директором ФГБУ «ВНИИЗЖ» 5 методик и методических рекомендаций, которые используются в лабораторной практике.

1.6. Соответствие диссертации паспорту научной специальности. В диссертации приведены результаты исследований по выделению, изучению биологических свойств штаммов ротавируса КРС, разработке методов выявления антител к рота-, коронавирусной инфекциям КРС, их применению для изучения иммунного статуса поголовья КРС и оценки эпизоотической ситуации в хозяйствах, что соответствует пунктам 2, 3, 6, 7, 10 паспорта специальности 03.02.02. «Вирусология».

1.7. Апробация результатов работы. Материалы диссертации доложены и опубликованы в материалах Международных научно-практических конференций, посвященных 45-летию ФГБУ «ВНИИЗЖ» (Владимир, 2003 г.), 50-летию ФГБУ «ВНИИЗЖ» (Владимир, 2008 г.), в материалах конференции «Актуальные проблемы инфекционной патологии ветеринарной медицины (исследования молодых учёных)» (г. Покров Владимирской области, 2009 г., ГНУ ВНИИВВиМ), а также на заседаниях ученого совета ФГБУ «ВНИИЗЖ» в 2008-2010 гг.

1.8. Публикации научных исследований. По теме диссертационной работы опубликовано 8 научных статей, в том числе 4 работы в изданиях, рекомендованных ВАК Министерства образования и науки РФ.

1.9. Основные положения, выносимые на защиту.

- Выделение РВ КРС из проб патологического материала в перевиваемой

культуре клеток;

- получение диагностических препаратов антигенов РВ и KB КРС;

- использование разработанных тест-систем на основе н-ИФА для выявления и определения уровня антител к РВ и KB КРС при тестировании сывороток в одном разведении;

- результаты их применения для серологического исследования сывороток крови КРС, поступивших в ФГБУ «ВНИИЗЖ» в период 20072011 гг.

1.10. Структура н объем работы. Диссертация изложена на 133 страницах, проиллюстрирована 22 таблицами и 15 рисунками. Список литературы включает 187 источников, в том числе 159 — иностранных.

Исследования по диссертационной работе выполнены в 1998-2011 гг. в лаборатории диагностики вирусных болезней КРС и свиней ФГБУ «ВНИИЗЖ», г. Владимир.

1.11. Личный вклад соискателя. Основной объем исследований проведен автором самостоятельно. Отдельные этапы работы выполнены совместно с к.б.н. Дороненковой Г.Н., к.б.н. Бьядовской О.П., д.б.н. Пономаревым А.П., к.б.н. Чупиным С.А., за что автор выражает им искреннюю благодарность.

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1. Материалы

Вирусы. Производственный штамм KB КРС "ВНИИЗЖ-ДЕП". Депонирован в коллекции «Всероссийского государственного центра качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов», патент № 2268937. Референтный штамм «NCDV» (Nebraska calf diarrheal virus). Получен из Nat. Vet. Services Laboratories, США. Полевые изоляты РВ КРС: «Собинка/10/99/B»; «Меленки»; «Юрьев/03/00». Изоляты были выделены из содержимого кишечников больных телят в 1999-2000 гг.

Культуры клеток. Были использованы следующие перевиваемые линии культур клеток: МДВК (почки эмбриона коровы); Mark-145 (почки эмбриона макаки-резус, клон клеток МА-104); Vero (почки африканской зеленой

мартышки); КГ-91 (гонады козы); ПТ (почки теленка); РК-15 (почки поросенка). Культуры клеток в виде готового монослоя получали из отдела культивирования клеток (ФГБУ «ВНИИЗЖ»).

Животные. Для получения специфических гипериммунных сывороток в качестве доноров использовали клинически здоровых лабораторных животных: кроликов, массой 2 - 2,5 кг и морских свинок, массой 0,4 - 0,5 кг.

Тест-снстемы на основе ИФА. В работе использовали набор для выявления антител к РВ КРС в н-ИФА INGEZIM ROTAVIRUS (Ingenasa, Испания) и набор для выявления антител к KB КРС в конкурентном варианте ИФА (Cypress, Бельгия) в соответствии к инструкциями к набору.

2.2. Методы

Выделение РВ КРС в перевиваемой культуре клеток. Материалом для выделения РВ КРС являлись пробы фекалий и тканей кишечника больных или павших телят, которые взвешивали в чашках Петри и тщательно измельчали в фарфоровых ступках с кварцевым песком. Из измельченного материала готовили 10—20%-ную суспензию на среде Игла (рН 7,5-8,0), которую двукратно замораживали-оттаивали, после чего центрифугировали при 1000 g. Для дальнейшей работы отбирали надосадок. К полученной смеси добавляли гентамицин в концентрации 50 мкг/см3. Затем фильтровали через нитроцеллюлозные фильтры с диаметром пор 45 мкм. Полученную суспензию использовали для заражения культур клеток.

Определение титра инфекционностн РВ КРС. Инфекционную активность РВ КРС определяли методом последовательных десятикратных разведений в монослое клеток Mark-145 в пенициллиновых флаконах. Положительной реакцией считали наличие цитопатогенного действия (ЦПД) вируса. Титр инфекционностн (lg ТЦД5о/см3) рассчитывали по методу Рида и Менча.

Выделение вирусной РНК. Суммарную РНК из культуральной вируссодержащей суспензии выделяли по методу Грибанова О.Г. [3].

Электрофорез в агарозном геле. 10 мкл пробы, содержащей выделенную РНК, смешивали с 1 мкл буфера для нанесения проб и вносили в лунки 2% агарозного геля. Электрофорез проводили при силе тока 50 мА в течение 15-20 мин.

Концентрирование РВ КРС. Вирусную суспензию очищали от клеточного детрита низкоскоростным центрифугированием с хлороформом и осаждали вирусные белки ПЭГом с молекулярной массой 6000 Д. Полученный после низкоскоростного центрифугирования осадок растворяли в буферном растворе TNE (50 mM Tris НС1, рН 7,5; 150 mM NaCl, 5 тМ ЭДТА, рН 7,4) в соотношении 1:20 и подслаивали 30% сахарозу. Осадок разводили в буферном растворе TNE (в соотношении 1:100 от исходного объема).

Определение концентрации белка. Количественное определение белка осуществляли на спектрофотометре "Shimadzu" по методу Варбурга и Христиана при длине волны 260 нм и 280 нм [2].

Электронная микроскопия. Электронно-микроскопические исследования проводили методом негативного контрастирования при увеличении х160000 (исследование проведено совместно с д.б.н. А.П. Пономаревым).

Получение гипериммунной сыворотки. Очищенный и концентрированный препарат вируса смешивали с масляным неполным адъювантом Фрейнда в соотношении 1:1, получая водно-масляную эмульсию. Подготовленный препарат вводили кроликам подкожно в область спины в 4 точки в объеме 1-2 мл дважды с интервалом в 28 суток. Морских свинок также иммунизировали подкожно в области спины в объеме 0,3 мл с интервалом 28 суток. Пробы крови у кроликов и морских свинок отбирали до иммунизации и через 28 суток после каждой иммунизации.

Реакция нейтрализации. Титр вируснейтрализующих антител определяли в реакции нейтрализации (РН), используя культуру клеток Mark-145 по общепринятой методике с разведением исследуемых сывороток и постоянной дозой вируса (200 ТЦД5о/шз).

Выявление антител к РВ и KB КРС в н-ИФА. Очищенные и концентрированные антигены РВ и KB в КББ сорбировали в лунках полистироловых планшетов и инкубировали в течение 18 часов при 4°С. После блокирования 1% раствором лошадиной сыворотки вносили контрольные и исследуемые пробы в рабочем разведении. Связавшиеся антитела определяли добавлением иммунопероксидазных препаратов антибычьих антител. В качестве хромогена использовали субстрат АБТС. Результат учитывали, регистрируя оптическую плотность (ОП) при длине волны 405 нм. Титр антител в испытуемых пробах определяли по уравнению линейной регрессии: lg Т = А + В • lg S/P, а также по формуле расчета процента позитивности (ПП): ПП= ((ИС - КО) / (КП - КО)) х 100% , где ИС - оптическая плотность исследуемой сыворотки, КО — оптическая плотность для отрицательного контроля, КП - оптическая плотность для положительного контроля.

Статистический анализ материалов. Учет результатов непрямого варианта ИФА и анализ полученных данных проводили с использованием компьютерной программы «СИНКО-ИФА» (ФГБУ «ВНИИЗЖ», свидетельство о регистрации № 2000611338). Для статистической обработки данных ИФА использовали компьютерную программу Statistika: Basic Statistics and Tables, версия 4.3 (Stat.Soft, inc., 1993).

2.3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ 2.3.1. Получение диагностического антигена РВ КРС. При анализе патологического материала, поступившего на исследование в лабораторию из хозяйств Владимирской области, где отмечены вспышки заболеваний с диарейным синдромом, при использовании ПЦР были выявлены три изолята РВ КРС, обозначенные как «Меленки», «Собинка/10/99/B», «Юрьев/03/00», относящиеся к типам G8P7, G10P11 и G6P5, соответственно. После проведения трех последовательных пассажей в монослойных культурах клеток выявили, что для изолятов «Меленки» и «Юрьев/03/00» чувствительной культурой клеток является МДВК, а для изолята «Собинка/10/99/B» — Mark-145. Всего на данных культурах было проведено по 10 пассажей (табл. 1).

Таблица 1

Основные характеристики изолятов PB КРС в процессе

адаптации к перевиваемым культурам клеток (п=5)

Изоляты РВ КРС

№ «Меленки» «Юрьев/03/00» «Собин ка/10/99/В »

Пас- Культура клеток МДВК Культура клеток Mark-145

сажа Время Титр, Время Титр, Время Титр,

инкубир.,ч IgTUZWcMS инкубир.,ч lgTLUV„3 инкубир., ч 1вТЦД«/„,з

1 - HT* 168 HT 168 HT

2 - HT 168 HT 168 HT

3 120 4,50±0,08 168 1,75 ±0,11 168 2,25 ± 0,09

4 96 5,00±0,07 144 3,75 ±0,14 120 2,75 ± 0,06

5 96 5,25±0,01 144 2,75 ± 0,07 120 3,25 ±0,15

6 72 6,25±0,10 120 4,25 ± 0,09 120 3,5 ±0,16

7 72 6,50±0,07 120 5,00 ±0,14 96 4,5 ± 0,07

8 48 7,25±0,10 96 5,25 ± 0,09 96 5,0 ± 0,05

9 48 7,50±0,06 96 5,25 ± 0,03 96 6,25 ± 0,09

10 48 6,75±0,09 96 6,00 ± 0,08 96 5,25 ± 0,05

*НТ- не тестировали

Для идентификации РВ в процессе выделения в культуре клеток был использован метод электрофореза геномной РНК. Результаты этих исследований на примере изолята «Меленки» РВ КРС представлены на рис. 1.

Под действием электрического поля сегментированная РНК ротавируса мигрирует в соответствии со своей электрофоре™ческой подвижностью и выглядит на электрофореграмме (рис. 1а) в виде 8 полос разной интенсивности. Между тем, картина, получающаяся при электрофорезе РНК из незараженной РВ культуры клеток, существенно отличается от профиля миграции РНК РВ (рис. 16) (исследования проведены совместно с к.б.н. С. А. Чупиным).

а 6

Рис. 1 Электрофореграмма РНК а - РНК РВ изолята «Меленки», выделенная из опыта на культуре клеток

МДВК (цифрами обозначены сегменты ротавирусной РНК 1-11); б - клеточная РНК из незараженной РВ культуры клеток МДВК. Все пробы наносили на стартовую линию в количестве 10 мкл.

Таким образом, профиль миграции геномных сегментов РНК позволяет безошибочно идентифицировать РВ и тем самым подтверждать специфичность ЦПД. Геномная РНК РВ выявлялась с помощью электрофореза в 5-10 пассажах.

При подборе условий культивирования на примере изолята «Меленки» максимальное накопление вируса (6,5 ^ ТЦД50/Смз) отмечено через 48 ч инкубирования при заражении 3 — 4-суточного монослоя при множественности заражения 0,01 ТЦД5о/клетка> предварительной обработке трипсином в дозе 33 мкг/мл и при содержании трипсина в поддерживающей среде в конечной концентрации 1 мкг/мл.

На выделенные изоляты РВ КРС и референтный штамм «МСЭУ» РВ КРС получены гипериммунные специфические сыворотки. Отбор проб проводили до и через 28 суток после каждой иммунизации, сыворотку исследовали в ИФА и РН (табл. 2). На 28 день после иммунизации против всех испытуемых изолятов и штамма «ЫСПУ» в сыворотках крови кроликов образовались специфические вируснейтрализующие антитела. Максимального значения титры антител достигли на 28 день после третьей иммунизации.

Таблица 2

Активность сывороток крови кроликов, иммунизированных изолятамн и

штаммом «ГЧСОУ» ротавируса КРС (М±м), в РН и ИФА _(п=3)

Изоляты и штаммы Средние титры антител к ротавирусу КРС, 1ор2

I иммунизация 11 иммунизация III иммунизация

ИФА РН ИФА РН ИФА РН

«Меленки» 9±| 3,25±0,43 17±1 5,43±0,32 19±1 6,48±0,18

«Юрьев» 7±1 2,75±0,38 13±1 4,23±0,46 15±1 5,54±0,42

«Собинка» 7±1 2,58±0,41 11±1 3,86±0,24 13±1 4,26±0,53

«1ЧСОУ» 9±1 3,88±0,34 15±1 5,21 ±0,28 19±1 6,12±0,44

С целью выбора производственного штамма специфические сыворотки крови кроликов были исследованы в перекрестной РН, в которой в качестве меры «расхождения» гомо- и гетерологичных реакций используется индекс Архетти и Хорсфала [10], численно соответствующий величине отношения гетерологичного оценочного показателя к гомологичному г = х^ /хьот- Значение г рассматривается как количественная характеристика антигенного родства исследуемых штаммов вируса. Индекс Я = х г2 — является показателем

двухсторонней родственности антигенов. Выявляется значительное различие между референтным штаммом «МСОУ» и изолятами в титрах между гомо- и гетерологичными сыворотками крови, что подтверждает их принадлежность к различным серотипам (табл. 3).

Таблица 3

Внрусиейтралнзующая активность гипериммунных сывороток крови _кроликов в перекрестной РН_

Специфическая сыворотка против изолятов Титр антител против изолятов

«Меленки» «Юрьев/03/00» «Собинка/10/99/В» «МСОУ»

«Меленки» (С8Р7)' 14548,92 НИ НИ 5,1

«Юрьев/ОЗ/ОО» (С6Р1) 22,62 3050,3 НИ 255,9

«Собннка/10/99/В» (010Р11) 11,3 НИ 2894,1 15,9

«ЫС0У»(С6Р1) 7,9 2,8 1,4 5379,6

1 - серотипы изолятов ротавируса КРС;

2 - за титр антител в РН принимали величину обратную разведению; НИ - не исследовалось.

На основании полученных данных вычислили степень антигенного родства (Я) исследуемых изолятов РВ КРС с референтным штаммом «ЫСБУ» (таблица 4).

Таблица 4

Степень антигенного родства выделенных изолятов ротавируса КРС

с референтным штаммом «1УСРУ» в РН

Специфическая сыворотка против изолятов и штамма «ЫСОУ» Вирусы (11%)

«1МСОУ» «Меленки» «Собинка/Ю/99/В» «Юрьев/03/00»

«ЫСОУ» 100 14,4 23,0 52,0

«Меленки» 14,4 100 НИ НИ

«Собинка/10/99/В» 23,0 НИ 100 ни

«Юрьев/03/00» 52,0 НИ НИ 100

Примечание: НИ - не исследовалось.

Все исследуемые изоляты обладали антигенным родством по отношению к референтному штамму «МСЭУ». Наиболее близок к референтному штамму «МСЭУ» в антигеном отношении изолят «Юрьев/03/00» (11=52%). Это объясняется тем, что данный изолят и штамм «ТМСОУ» относятся к одному в серотипу (06). Изоляту «Меленки» присущ самый низкий уровень родства с референтным штаммом «1МСОУ» - 14,4%, что позволило рекомендовать данный изолят для использования в качестве диагностического антигена и

депонировать во Всероссийской государственной коллекции микроорганизмов ФГБУ «ВГНКИ» под названием «ТЕ87 - ДЕП», патент № 2258738.

С целью получения препаратов РВ КРС, пригодных для использования в ИФА, очистке и концентрированию подвергали штамм «ТЕ87-ДЕП» РВ КРС, репродуцированный в культуре клеток МДВК, инфекционная активность которого на уровне 9 пассажа составила 6,75-7,0 lg ТЦД5(/сч3. Концентрирование вирусных препаратов проводили тремя способами:

А. Вируссодержащую суспензию шуттелировали с 20% хлороформа в течение 10 мин, и полученную эмульсию осветляли низкоскоростным центрифугированием при 3500 g в течение 30 мин при температуре 4 С. К осветленной вирусной суспензии добавляли ПЭГ-6000 и NaCl до конечной концентрации 7% и 0,3 М, соответственно. Инкубировали в течение 16-18 ч при температуре 4°С. Вирусный материал центрифугировали при 7000 g в течение 30 мин при 4°С. Полученный осадок ресуспендировали буферным раствором TNE в 1/20 от исходного объема вирусной суспензии, наслаивали на 30%-ный раствор сахарозы, приготовленном на TNE и центрифугировали в течение 80 мин при 70000 g. Полученный осадок ресуспендировали в TNE в 1/100 от исходного объема вирусной суспензии.

B. Приготовление вирусного концентрата проводили аналогичным способом, но вместо буферного раствора TNE использовали буферный раствор TNC (50 mM Tris НС1, рН 7,5; 150 mM NaCl, 10 mM СаС12).

C. Вируссодержащую суспензию шуттелировали с 7% хлороформа, в течение 5 мин, и полученную эмульсию осветляли низкоскоростным центрифугированием при 700 g в течение 10 мин при температуре 4 С. К осветленной вирусной суспензии добавляли ПЭГ-6000 и NaCl до конечной концентрации 7% и 0,3 М, соответственно и инкубировали в течение 16-18 ч при температуре 4 С. Центрифугировали при 6000 g в течение 30 мин при 4 С. Полученный осадок ресуспендировали в буферном растворе ФБР (20 мМ КН2Р04, 20мМ NaHPO^, рН 7,2 - 7,4) (1/20 исходного объема) и наслаивали на 30%-ный раствор сахарозы, на буферном растворе ФБР и центрифугировали

при 55000 g в течение 80 мин. Осадок ресуспендировали в буферном растворе ФБР в 1/100 от исходного объема вирусной суспензии.

Инфекционная активность полученных препаратов ротавируса составила 6,25-7,00 lg ТЦЦ50/см3, 8,00-8,25 lg ТЦД50/с„з, 7,00-7,25 lg ТЦЦ50/см3 - при использовании буферных растворов TNE, TNC и ФБР, соответственно.

Исследования концентрированных препаратов в ИФА показывают, что все препараты обладали практически одинаковой антигенной активностью (911 Iog2). Вероятно, это объясняется тем, что основным антигеном, детектируемым при исследовании в ИФА, является белок внутреннего капсида VP6, который преобладает по массе среди всех белков в вирионе ротавируса.

При трехкратном введении концентрированных антигенов РВ КРС, приготовленных на буферных растворах TNE, TNC и ФБР, были получены гипериммунные сыворотки на кроликах с титром в РН 8-9 log2, 12-13 log2 и 1112 log2, соответственно. Титры сывороток, полученных на все антигены, при исследовании в н-ИФА составили 17-18 log2.

Исследования концентратов с помощью электрофореза в ПААГ позволили установить, что посторонние белки в препаратах отсутствуют. Во всех препаратах присутствовали белки с молекулярной массой 125, 94, 88 и 41 кД, что соответствует ротавирусным белкам VP1, VP2, VP3 и VP6, а в препаратах, приготовленных на буферных растворах TNC и ФБР, кроме того, наблюдались белки с молекулярной массой 60, 38 и 28 кД, что соответствует белкам ротавируса VP5, VP7 и VP8.

Концентрация белка в концентрированных препаратах, приготовленных на буферных растворах TNE, TNC и ФБР составила 0,556 мг/мл, 1,74 мг/мл, 0,750 мг/мл, соответственно.

По данным ЭМ клеточных и других примесных компонентов в препаратах практически не содержалось (рис. 2). Концентраты характеризовались высоким содержанием ротавирусных вирионов. В препарате, приготовленном на буферном растворе TNE, вирусные скопления

практически полностью состояли из однокапсидных вирионов, наряду с которыми в препарате присутствовали «пустые» капсиды. В приготовленном на буферном растворе ТЫС препарате превалировали двухкапсидные вирионы с внешним капсидом в виде тонкого ободка, окружающего частицы. Часть вирионов, содержащихся в препаратах, приготовленных с использованием буферного раствора ФБР, также была лишена внешнего капсидного слоя.

А Б В

Рис. 2 Концентрированные препараты ротавируса КРС.

A. Препарат, приготовленный с использованием буферного раствора TNE. Б. Препарат, приготовленный с использованием буферного раствора TNC.

B. Препарат, приготовленный с использованием буферного раствора ФБР.

Таким образом, в результате проведенных работ получили очищенные и концентрированные препараты ротавируса КРС, которые могут быть использованы в качестве антигена в ИФА, а также для получения специфических гипериммунных сывороток при диагностике ротавирусной инфекции.

3.2. Получение диагностического антигена КВ КРС. Штамм «ВНИИЗЖ-ДЕП» коронавируса КРС, адаптированный к перевиваемой монослойной культуре клеток RBT (почка теленка), для исследовательских работ был любезно предоставлен доктором ветеринарных наук, профессором Мищенко В.А. (Лаборатория болезней КРС, ФГБУ «ВНИИЗЖ»),

Для получения антигена КВ КРС использовали метод осаждения ПЭГом в присутствии NaCI с дальнейшим низкоскоростным центрифугированием очисткой через мембрану «millipor» с диаметром пор 0,45 мкм. Дальнейшее концентрирование осуществляли методом ультрафильтрации на установке типа

ФМ-02-1000 с использованием полупроницаемой мембраны УАМ-450 с диаметром пор 50 нм. В результате был получен 200х кратный концентрат KB КРС, который был использован в дальнейшей работе. Активность полученного антигена в ИФА составила 1:800.

3.3. Разработка н-ИФА для выявления антител к РВ КРС при исследовании сывороток крови в одном разведении. Разработка метода включала в себя определение оптимального разведения сыворотки, допустимых величин оптических плотностей (ОП) контрольных сывороток и позитивно-негативного порога (ПНП).

Для преобразования значения ОП, измеренной в отдельном разведении сыворотки в титр антител применяли метод регрессионного анализа. При определении оптимального разведения сыворотки предварительно в н-ИФА методом последовательных разведений тестировали пробы с различным уровнем антител к РВ (246 сывороток). Для разведений 1:80, 1:160 и 1:320 вычисляли значения S/P по формуле S/P = (ИС - КО) / (КП - КО), где ИС -оптическая плотность исследуемой сыворотки, КО - оптическая плотность для отрицательного контроля, КП — оптическая плотность для положительного контроля. Далее рассчитывали коэффициент корреляции (R) и строили график регрессии для каждого разведения. Наиболее высокий коэффициент корреляции (г=0,9326) получили в разведении 1:160. Найти значение титра можно по калибровочной кривой (рис. 3). Уравнение линейной регрессии числового значения титров, исходя из значений оптической плотности, имело вид: IgT = 2,6453 + 1,8750 Ig S/P. При определении допустимых величин оптической плотности контрольных сывороток в разведении 1:160, было показано, что наиболее приемлемыми значениями являются: для положительного контроля - от 0,388 до 0,720 o.e., для отрицательного контроля -от 0,064 до 0,170 o.e.

ПНП реакции рассчитали по методу D.B. Snyder [12]. Сумма среднего значения S/P и двух стандартных отклонений явилась верхней границей отрицательных, а сумма среднего и трех стандартных отклонений — нижней

границей положительных значений. Было протестировано 80 заведомо отрицательных сывороток крови, для которых рассчитывали среднее значение S/P сывороток (0,335), и стандартное отклонение (0,045).

LG160:LGT г = 0,9326 LGT - 2,6453+1,875*х

3.6

3 4 м о о о

3,2

О <Х> О <D (£ СФ CD С

3,0

2,8 ахдхшюхяюросо

О 2,6

2,4

2 2 OOCCXD <l CP О»»« lllim

2,0

roico; гтттуят, о

1.8

1.6

-0,299 -0,147 0,009 0,152 0,296 0,452 0,632

-0,226 -0,060 0,079 0,224 0,374 0,523

LG160

Рис. 3. Зависимость lg Т (титра) от lg S/P для разведения сыворотки 1:160

Для определения пороговых титров значения S/P, полученные при определении ПНП реакции, подставляем в уравнение линейной регрессии: ]gTOTp= 2,6453+1,8750* lg(0,335+0,090); Тотр =88. lgTnoJ1 = 2,6453+1,8750* lg(0,335+0,135); Тпол =107. С учётом того, что ошибка метода находится в пределах одного разведения, т.е. Т/2<Т<2Т, получили пороговые значения титров антител: если величина Т < 88, то результат отрицательный; если величина 88 < Т < 214, то результат сомнительный; если величина Т > 214, то результат положительный.

В случае, когда качественную сторону результатов реакции определяют по значению величины (S/P), получаем: для отрицательного результата (S/P)<0,45; для положительного результата (S/P)>0,60; для сомнительного результата 0,45<(S/P)<0,60.

Результаты, полученные с помощью разработанного нами метода сравнили с результатами, полученные при использовании набора Ingezim rotavirus (INGENASA, Испания, Se=l, Sp=l). Исследовали сыворотки крови КРС с различным уровнем антител к РВ в количестве 61 пробы. Результаты тестирования не совпадали с набором Ingezim rotavirus в двух случаях.

Относительные чувствительность и специфичность разработанного ИФА составили 95,3% и 94,4%, соответственно, совпадаемость результатов 95,1%.

3.4. Разработка непрямого варианта ИФА для выявления антител к KB КРС при исследовании сывороток крови в одном разведении.

Разработку метода проводили аналогично как для РВ КРС. Предварительно в н-ИФА методом последовательных разведений тестировали пробы с различным уровнем антител к KB КРС(174 сыворотки). Затем для разведений 1:80, 1:160 и 1:320 вычисляли значения S/P по формуле S/P = (ИС - КО) / (КП - КО). Далее рассчитывали коэффициент корреляции (R) и строили кривую регрессии для каждого разведения.

Наиболее высокий коэффициент корреляции (г=0,9029) получили в разведении 1:160. Значение титра находили по калибровочной кривой (рис. 4). Уравнение линейной регрессии числового значения титров, исходя из значений оптической плотности, имело вид: lgT=2,731 l+l,3899*lgS/P.

3,6

3.4

3.2

3.0

2.8

а 2.6

2.4

2.2

2.0

1.8

1.6 -0.8

Рис. 4. Зависимость Ig Т (титра) от lg S/P для разведения сыворотки 1:160

При определении допустимых величин ОП контрольных сывороток в разведении 1:160, было показано, что наиболее приемлемыми значениями являются: для положительного контроля - от 0,400 до 0,846 o.e., для отрицательного контроля - от 0,076 до 0,194 o.e.

ПНП реакции рассчитали по методу D.B. Snyder [12]. Тестировали 70 сывороток крови, не имеющих антител к KB КРС. Рассчитывали среднее значение S/P сывороток (0,098), прибавляя удвоенное стандартное отклонение

LG160:LGT г« 0,9029 LgT-2,7311+1,3899'х

-0.6 -0.4 -0.2 0,0 0.2 0.4 0,6

Lg160

(0,057). ПНП, полученный в виде прямой, отражал верхнюю границу отрицательных значений (0,220), a S/P, соответствующая наименьшему положительному значению, равна 0,440.

Для определения пороговых титров подставляем значения S/P, полученных при определении ПНП реакции в уравнение линейной регрессии: lgT0Tp= 2,7311+1,3899* lg(0,098+0,114); Тотр =62. ^Тпол= 2,7311+1,3899* lg(0.098+0.171); ТПШ1 =86.

С учётом того, что ошибка метода находится в пределах одного разведения, т.е. Т/2<Т<2Т, пороговые значения титров антител, полученные на основе статистического анализа: если величина Т<62, то результат отрицательный; если величина 62<Т<72, то результат сомнительный; если величина Т> 172, то результат положительный.

В случае, когда качественную сторону результатов реакции определяют по значению величины (S/P), получаем: для отрицательного результата (S/P)<0,22; для положительного результата (S/P)>0,44; для сомнительного результата 0,22<(S/P)<0,44.

Сравнение полученных нами результатов с данными исследования с помощью набора Cypress Coronavirus (Cypress Diagnostics, Belgium, Se=l, Sp=l) показало, что при тестировании 80 сывороток крови КРС с различным уровнем антител к KB, результаты тестирования совпадали с набором Cypress Coronavirus в 98,7% случаев. Относительные чувствительность и специфичность разработанного ИФА составили 100% и 94,4%, соответственно.

3.5. Исследование сывороток крови КРС, поступивших на анализ в ФГБУ «ВНИИЗЖ» на наличие антител к рота-, коронавнрусам КРС. За период 2007-2011 гг. с использованием разработанных диагностических тест-систем проведено исследование 2495 полевых образцов сывороток крови КРС на наличие антител к РВ КРС, из которых 43,1% (1075 животных) были серопозитивными к возбудителю ротавирусной инфекции, а исследования 1344 проб сыворотки крови КРС, поступивших из хозяйств РФ, на наличие антител к

КВ КРС показали, что 67,7% (910 животных) были серопозитивными к возбудителю коронавирусной инфекции.

При анализе частоты встречаемости антител к РВ и КВ в сыворотках крови КРС, были исследованы 300 сывороток крови КРС различных половозрастных групп из 14 хозяйств 6 областей, относящихся к 4 федеральным округам РФ, не проводивших вакцинацию против данных заболеваний. Все сыворотки крови были исследованы одновременно на обе инфекции. Результаты представлены на рис. 5.

Рис. 5. Сыворотки крови из хозяйств, не проводивших вакцинацию против рота- и коронавирусов КРС. 1 — пробы, содержащие антитела только к коронавирусу; 2 - пробы, содержащие антитела только к ротавирусу; 3 — пробы, содержащие антитела к рота- и к коронавирусам; 4 - пробы, не содержащие специфических антител к рота- и коронавирусам.

3.6. Изучение гуморального иммунитета к рота- и коронавирусам с применением разработанных тест-систем. Исследованы пробы сывороток крови КРС, присланные в 2007-2011 гг. из 20 хозяйств РФ, относящихся к 4 федеральным округам РФ, не проводящих вакцинацию против рота-, коронавирусной инфекций. Все пробы были разделены по возрастным группам: коровы, нетели, телята различных возрастов и новорожденные телята, не получавшие молозиво (табл. 5).

Полученные данные подтвердили результаты проведенных ранее исследований о том, что к трехнедельному возрасту у телят полностью исчезают материнские антитела к РВ и КВ, уровень которых в суточном возрасте был на максимальном уровне. До пятой недели антитела отсутствуют, затем начинается их постепенный прирост. Анализ результатов выявил наличие общей тенденции к нарастанию титров антител к 90 дням.

Таблица 5

Результаты н-ИФА по выявлению антител к РВ и КВ в сыворотках крови _ животных КРС разного возраста, (п=320)_

Хар-ка Ротавирус КРС Коронавирус КРС

группы Кол-во В том числе, Среднее Кол-во В том числе, Среднее

проб серопознтивных значение проб серопознтивных значение

проб % S/P проб % S/P

Коровы 71 56 78,0 0,93 ± 0,63 65 51 78,5 0,84 ± 0,39

Нетели 78 35 44,8 0,71 ±0,39 80 35 43,7 0,62 ± 0,45

Телята 3-6 мес. 31 9 29,1 0,64 ± 0,45 51 32 62,7 0,53 ± 0,26

Телята 1 -3 мес. 27 3 11,1 0,32 ±0,15 34 5 14,7 0,29 ±0,15

Телята 14-30 дн. 23 5 21,7 0,38 ±0,18 15 2 13,3 0,24 ±0,18

Телята 5-10 дн. 36 11 30,6 0,62 ± 0,38 26 8 30,7 0,52 ± 0,39

Телята 1-5 дн. 30 14 46,7 0,68 ± 0,33 21 12 42,8 0,62 ± 0,32

Новорожденные 24 0 0 0,16 ± 0,10 28 0 0 0,10 ±0,05

3.7. Оценка антигенной активности вакцин против РВ производства ФГБУ «ВНИИЗЖ». Изучение иммунобиологических свойств, антигенной активности и проведение технологического контроля на различных этапах производства вакцин, предполагает определение уровня специфических антител в сыворотках крови лабораторных животных (в частности, кроликов). Наиболее оптимальным методом, который может быть использован для оценки уровня специфических антител в сыворотках крови, является н-ИФА. Разработанная нами тест-система по определению антител к РВ в сыворотках крови КРС была модифицирована и оптимизирована в «Методические рекомендации по выявлению антител к ротавирусу крупного рогатого скота в сыворотках крови лабораторных животных в непрямом варианте иммуноферментного анализа». Результаты контроля различных серий инактивированных вакцин против РВ КРС в период 2010-2011 годов в н-ИФА имеют выраженную специфичность и совпадают с результатами, полученными с помощью коммерческого теста INGEZIM ROTAVIRUS (Ingenasa, Испания) и РН.

4. Выводы

1. Выделены и адаптированы к перевиваемой культуре клеток три полевых изолята ротавируса КРС от больных телят, изучены биологические

свойства выделенных изолятов, подготовлен производственный штамм ротавируса КРС.

2. Штамм ротавируса КРС «ТЕ87-ДЕП» депонирован в коллекции штаммов микроорганизмов ФГБУ «ВГНКИ» и рекомендован для использования при разработке и изготовлении средств диагностики ротавирусной инфекции КРС.

3. Для получения специфических антигенов отработан способ очистки и концентрирования ротавируса КРС хлороформом и ультрацентрифугированием путем наслаивания на 30%-ный раствор сахарозы.

4. Разработанная методика определения титра антител к ротавирусу в сыворотках крови КРС в непрямом варианте ИФА при тестировании проб в одной разведении является воспроизводимой, показала достаточно высокий уровень относительной чувствительности (95,3%) и относительной специфичности (94,4%) и может быть использована для проведения серологических исследований в хозяйствах.

5. Разработанная методика выявления антител к коронавирусу в сыворотках крови КРС в непрямом варианте ИФА при тестировании проб в одном разведении является воспроизводимой. Она показала уровень относительной чувствительности (100%) и относительной специфичности (94,4%) и может использоваться для проведения серологических исследований в хозяйствах.

6. Исследования 2466 проб сыворотки крови КРС, поступивших из 32 регионов РФ, на наличие антител к ротавирусам показали, что 43,1% были серопозитивными к возбудителю ротавирусной инфекции, а исследования 1344 проб сыворотки крови КРС, поступивших из 27 регионов РФ, на наличие антител к коронавирусам показали, что 67,7% были серопозитивными к возбудителю коронавирусной инфекции. Полученные результаты свидетельствуют о широком распространении

этих болезней среди КРС и о необходимости выявления их с помощью разработанных диагностических методов.

5. Практические предложения На основании результатов экспериментальных исследований по теме диссертации для практического использования предлагаются:

Производственный штамм ротавируса КРС (Патент 2258738 Российская Федерация, МПК -7 C12N 7/00 Штамм № "ТЕ87" Rotavirus крупного рогатого скота серотипов G8P7 для изготовления диагностических препаратов / 2258738, П. К. Аянот, Г. Н. Дороненкова, Л. Б. Прохватилова, С.А. Чупин, А.П. Пономарев, A.M. Тимина, Г.С. Скитович; ФГБУ "ВНИИЗЖ". - № 2003136945/13; Заявл. 24.12.2003; Опубл. 20.08.2005, Бюл. № 23) для изготовления средств диагностики ротавирусной инфекции КРС;

«Методика концентрирования и очистки ротавируса крупного рогатого скота» (ФГБУ «ВНИИЗЖ», 2002 г.);

«Методика определения титра антител к коронавирусу в сыворотках крови крупного рогатого скота иммуноферментным методом» (ФГБУ «ВНИИЗЖ», 2007 г.);

«Методика выявления антител к ротавирусу крупного рогатого скота в непрямом варианте иммуноферментного анализа при тестировании проб в одном разведении» (ФГБУ «ВНИИЗЖ», 2007 г.);

«Методические рекомендации по выялению антител к коронавирусу КРС в непрямом варианте иммуноферментного анализа при тестировании проб сывороток крови в одном разведении» (ФГБУ «ВНИИЗЖ», 2010 г.);

«Методические рекомендации по выявлению антител к ротавирусу крупного рогатого скота в сыворотках крови лабораторных животных в непрямом варианте иммуноферментного анализа» (ФГБУ «ВНИИЗЖ», 2010 г.).

Разработанные методические рекомендации используются в лабораторной практике при проведении исследований сывороток крови.

6. Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Оптимизация условий очистки и концентрирования ротавируса крупного рогатого скота / С.А. Чупин, Г.С. Скнтович, Г.Н. Дороненкова и др. // Актуальные проблемы инфекционной патологии жив-х : Матер. Междунар. науч. конф., посвященной 45-летию ФГУ «ВНИИЗЖ». - Владимир, 2003. -С. 446-450.

2. Выделение и характеристика изолятов ротавируса крупного рогатого скота / Г.С. Скнтович, Г.Н. Дороненкова, С.А. Чупин, Л.Б. Прохватилова // Ветеринарная патология. - 2006. - №4 - С. 170-172.

3. Электронно-микроскопические исследования особенностей строения вирионов ротавируса крупного рогатого скота / А.П. Пономарев, Г.С. Скнтович, Г.Н. Дороненкова и др. // Вестник РАСХН. - 2005. - №4. - С.

40-42.

4. Разработка непрямого варианта иммуноферментного анализа для определения антител к ротавирусу в сыворотках крови крупного рогатого скота методом одного разведения / Г.С. Скнтович, О.П. Бьядовская, Л.Б. Прохватилова // Ветеринарная патология. - 2007. - №4(23). — С. 45-48.

5. Методические указания по выявлению антител к ротавирусу крупного рогатого скота в непрямом варианте иммуноферментного анализа при тестировании проб в одном разведении / Г.С. Скнтович, О.П. Бьядовская, Л.Б. Прохватилова // Методические указания по диагностике заболеваний с.-х. жив-х и птиц с использованием серологических реакций. Часть 2 (ФГУ «ВНИИЗЖ). - Владимир, 2008. - С. 35-41.

6. Методические указания по определению титра антител к коронавирусу в сыворотках крови крупного рогатого скота иммуноферментным методом / Г.С. Скнтович, О.П. Бьядовская, Л.Б. Прохватилова // Методические указания по диагностике заболеваний с.-х. жив-х и птиц с использованием серологических реакций. Часть 2 (ФГУ «ВНИИЗЖ). - Владимир, 2008. - С.

41-47.

7. Иммунобиологическая характеристика изолята ротавируса крупного рогатого скота / О.Н. Окулова, С.А.Чупин, Г.С. Скитович, В.А. Мищенко // Рос. вет. журн. с.-х. животных. Спец. вып., посвящ. 50-летию ФГУ «ВНИИЗЖ». - 2008. - Сент. - С. 39-40.

8. Непрямой вариант иммуноферментного анализа для выявления антител к коронавирусу в сыворотках крови крупного рогатого скота методом одного разведения / Г.С. Скитович, О.Г. Андреева, Л.Б. Прохватилова // Актуал. пробл. инфекц. патологии вет. медицины: материалы Междунар. науч,-практ. конф. - Покров, 2009. - С. 106-110.

7. Список литературы

1. Вирусные гастроэнтериты смешанной этиологии и их профилактика / А.И. Собко, Ф.С. Вабишевич, В.Н. Ткацкая [и др.] // Вопросы вет. вирусологии, микробиологии и эпизоотологии: материалы науч. конф. - Покров, 1992. -4.1. - С.154-155.

2. Практическая химия белка / под ред. А.Дабре. - М.: Мир, 1989. - 623с.

3. Простой метод выделения и очистки РНК / О.Г. Грибанов, А.В. Щербаков, Н.А. Перевозчикова [и др.] // Биоорганическая химия. - 1997. - Т.23,№9. -С. 763-765.

4. Agrawal D.K., Singh N.P., Chauhan R.S. Colostral antibodies against rotavirus infection in neonatal calves // J. Immunology and Immunopathology. - 2002. -Vol.4.-P. 107-109.

5. Development, Characterization, and Diagnostic Applications of Monoclonal Antibodies against Bovine Rotavirus / Y. Al-Yousif, F. Al-Majhdi, C. Chard-Bergstrom [et al.] // Clin. Diagn. Lab. Immunol. - 2000. - Vol. 7, №2. - P.288-292.

6. Development of monoclonal antibody ELISA for simultaneous detection of bovine coronavirus, rotavirus serogroup A, and Escherichia coli K99 antigen in feces of calves / C.J. Thorns, M.M. Bell, D. Chasey, J. Chesham // Am. J. Vet. Res. - 1992,-Vol. 53, №1,-P. 36-43.

7. Lecce J.G., King M.W. Rotavirue antibodies in cow's milk // Canad. J. Сотр. Med. - 1982. - Vol. 46, № 4. - P. 434 - 436.

8. Losonsky G.A., Reymann M. The immune response in primary asymptomatic and symptomatic rotavirus infection in newborn infants // J. Infect. Dis. - 1990. -Vol. 161.-P. 330-332.

9. Myers L.L., Snodgrass D.R. Colostral and milk antibody titres in cows viccinated with a modified live-rotavirus-coronavirus vaccine // J. Am. Vet. Med. Assos. - 1982. - Vol. 181.- P.486-488.

10. Persistent antigenic variation of influenza A viruses, after incomplete neutralization in vivo with heterologie immune serum / G. Archetti, L. Franc, F.L. Horsfall // J. Exp. Ved. - 1950. - №5. - P. 441-462.

11. Prevalence of bovine group A rotavirus shedding among dairy calves in Ohio / A. Lucchelli, S.E. Lance, P.B. Bartlett [et al.] // Am. J. Vet. Res. - 1992. - Vol. 53.-P. 169-174.

12. Rapid serorogical profiling by enzyme-linked immunosorbent assay. 2. Comparison of computation methods for measuring antibody titers in a single serum dilution / D.B. Snyder, W.W. Marquardt, E.T. Mallison [et al.] // Avian Diseases. - 1982. - V.27, №2. - P. 474-484.

13. Rotavirus and coronavirus prevalence in healthy calves and calves with diarrhea / S.O. Gumusova, Z. Yazici, H. Albayrak // Medycynica Weterynaryjna. - 2007. -Vol. 63.-P. 6-64.

14. Steele A.D., Geyer A. Gerdes G.H. Rotavirus infections // Infectious diseases of Livestock / eds: J.A.W. Coetzer, R.C. Tustin - Oxford University Press, Southern Africa, 2004. - P. 1256-1264.

Список обозначений и сокращений

АБТС — 2,2'-азино-ди[3-этил]бензотиазолинсульфоновая кислота ИФА- иммуноферментный анализ КББ — карбонатно-бикарбонатный буфер KB - коронавирус

КО - оптическая плотность отрицательной контрольной сыворотки КП - оптическая плотность положительной контрольной сыворотки КРС - крупный рогатый скот

МДВК - перевиваемая линия культуры клеток почки эмбриона коровы

Н-ИФА- непрямой вариант иммуноферментного анализа

ОП — оптическая плотность

ГТНГТ - позитивно-негативный порог

ПЦР - полимеразная цепная реакция

ПЭГ - полиэтиленгликоль

РВ - ротавирус

РН — реакция нейтрализации

ЦПД - цитопатическое действие

ЭМ - электронная микроскопия

Mark-145 - перевиваемая линия культуры клеток почки эмбриона макаки-резус Se - относительная чувствительность тест-системы Sp— относительная специфичность тест-системы

Подписано в печать 1 б ноября 2012 Формат 60x90/16. Усл. печ. л. 1. Тираж 80 экз. Полиграфическая база ФГБУ «Федеральный центр охраны здоровья животных»

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Скитович, Галина Сергеевна

ВВЕДЕНИЕ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Характеристика семейства Ыеоутс1ае.

1.1.1. Основные свойства ротавирусов.

1.1.1.1. Структура вириона и физико-химические свойства.

1.1.1.2. Структура генома и протеины.

1.1.1.3. Репликация вирусного генома.

1.1.2. Патогенез и эпизоотология.

1.1.3. Выделение в культуре клеток.

1.1.4. Особенности иммунитета при ротавирусной инфекции.

1.1.5. Диагностика ротавирусной инфекции крупного рогатого скота.

1.2. Характеристика семейства Согопаушс1ае.

1.2.1. Структура вириона и физико-химические свойства.

1.2.2. Патогенез и эпизоотология.

1.2.3. Особенности иммунитета при коронавирусной инфекции.

1.2.4. Диагностика коронавирусной инфекции крупного рогатого скота.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Разработка иммуноферментных тест-систем для выявления антител к рота- и коронавирусам крупного рогатого скота"

Актуальность темы. На протяжении многих лет животноводство всех стран мира, в том числе и России, несёт значительные экономические потери от желудочно-кишечных болезней новорожденных телят. В основе сложившейся неблагоприятной ситуации лежит целый ряд неспецифических факторов, среди которых наиболее важными являются содержание большого поголовья скота на ограниченном пространстве, ограничение двигательной активности у животных, возникновение стрессов, усложнение микробного и вирусного пейзажа в хозяйствах и комплексах, снижение иммунитета. В этих условиях, особенно при нарушении санитарно-гигиенических норм, несвоевременной выпойки молозива телятам, а также при отсутствии на станциях искусственного осеменения должного контроля на возможную контаминацию спермы вирусами, нередко возникают и быстро распространяются инфекционные болезни, проявляющиеся в виде энтеритов животных.

Известны этиологические агенты, вызывающие кишечные болезни у КРС, как вирусной: рота-, коронавирусы; так и не вирусной природы: E.coli, Salmonella species, Clostridium perferingens, Cryptosporidium, Coccidia и др. [30,34, 46, 80, 99, 138, 155].

Рота- , коронавирусы - занимают одно из ведущих мест в патологии желудочно-кишечного тракта новорожденных телят. Так, зачастую, в 60 — 100% случаев при заболевании телят диареей, выделяют ротавирус, коронавирус или их ассоциацию [3, 7, 40, 70, 72]. Данные вирусы широко распространены во всём мире, в том числе и в нашей стране [48, 120, 177].

Величина экономического ущерба при этих заболеваниях значительна и складывается из падежа телят, снижения мясной и молочной продуктивности, уменьшения привесов, выбраковки животных, убытка от абортов и бесплодия. Проведение своевременной и точной лабораторной диагностики является важным фактором в борьбе с данными заболеваниями.

Лабораторное исследование рота-, коронавирусных инфекций включает традиционные методы ранней и ретроспективной диагностики, к которым относятся реакции диффузной преципитации (РДП), гемагглютинации (РГА), торможения агглютинации (РТГА). Однако при всех своих преимуществах (простота постановки, непродолжительность по времени), они отличаются субъективностью оценки, часто дают ложноположительные результаты. Поэтому в настоящее время широкое распространение получил метод имму но ферментного анализа (ИФА). Быстрота получения результатов, воспроизводимость и автоматизированный учет результатов реакции, возможность стандартизации условий постановки анализа делают этот метод наиболее эффективным, удобным, экономичным и выгодным для массовых серологических исследований. Многими зарубежными коммерческими фирмами (INGENAZA, IDEXX, Cypress, Bio X и др.) предложены тест-системы на основе непрямого варианта ИФА для определения антител к рота- и коронавирусам в сыворотках крови при исследовании сывороток в одном разведении. Поскольку данные наборы не всегда доступны, актуальным является создание отечественных тест-систем для выявления антител к рота-, коронавирусам иммуноферментным методом.

Цель н задачи исследований. Целыо настоящего исследования являлась разработка диагностических тест-систем на основе подготовленных штаммов рота-, коронавирусов крупного рогатого скота для выявления антител к ним при проведении серологических исследований.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1) выделить и адаптировать полевые изоляты ротавируса КРС, циркулирующие на территории РФ, в культуре клеток;

2) изучить иммунобиологические свойства выделенных изолятов ротавируса

ICPC для возможного использования в качестве производственных штаммов;

3) отработать методы получения высокоочищенных концентрированных препаратов антигенов рота-, коронавирусов;

4) разработать тест-системы на основе непрямого варианта ИФА для определения антител к рота-, коронавирусам в сыворотках крови КРС методом одного разведения;

5) с помощью разработанных тест-систем провести исследования иммунного статуса поголовья крупного рогатого скота.

Научная новизна. Выделен и адаптирован к культуре клеток новый штамм ротавируса КРС «ТЕ87-ДЕП», на который получен патент на изобретение № 2258738.

Разработаны отечественные иммуноферментные тест-системы с применением в качестве антигенов штаммов рота- и коронавирусов, выделенных из хозяйств РФ, для выявления и количественной оценки специфических антител к ним при тестировании сывороток крови в одном разведении. Метод учета результатов тестирования предусматривает определение титра антител по уравнению регрессионной зависимости, осуществляемое автоматически с использованием компьютерной программы для регистрации, обработки, хранения результатов иммуноферментного анализа в ветеринарии «Синко-ИФА», разработанной во ВНИИЗЖ (ФГБУ «ВНИИЗЖ», свидетельство о регистрации №2000611338).

С помощью разработанных иммуноферментных тест-систем проведены исследования по распространению рота-, коронавирусной инфекций за 2007 - 2011гг. с анализом результатов серологического скрининга хозяйств из различных регионов РФ.

Практическая значимость. Для практического применения разработаны, одобрены ученым советом и утверждены директором ФГБУ «ВНИИЗЖ» следующие методики и методические рекомендации, которые используются в лабораторной практике:

Методика концентрирования и очистки ротавируса крупного рогатого скота»;

Методика выявления антител к ротавирусу крупного рогатого скота в непрямом варианте иммуноферментного анализа при тестировании проб в одном разведении»;

Методика определения титра антител к коронавирусу в сыворотках крови КРС иммуноферментным методом»;

Методические рекомендации по выявлению антител к коронавирусу крупного рогатого скота в непрямом варианте иммуноферментного анализа при тестировании проб сывороток крови в одном разведении»;

Методические рекомендации по выявлению антител к ротавирусу крупного рогатого скота в сыворотках крови лабораторных животных в непрямом варианте иммуноферментного анализа».

Основные положения, выносимые на защиту:

- Выделение ротавируса КРС из проб патологического материала в перевиваемой культуре клеток, получение диагностического препарата антигена ротавируса КРС;

- тест-система на основе непрямого варианта ИФА для выявления и определения уровня антител к ротавирусу КРС при тестировании сывороток в одном разведении;

- тест-система на основе непрямого варианта ИФА для выявления и определения уровня антител к коронавирусу КРС при тестировании сывороток в одном разведении;

- результаты серологического исследования сывороток крови КРС, поступивших в ФГБУ «ВНИИЗЖ» в период 2007-2011 гг., с использованием разработанных тест-систем.

Публикации. По теме диссертационной работы опубликовано 8 научных статей, в том числе 4 работы в изданиях, рекомендованных ВАК Министерства образования и науки РФ.

Апробация работы. Результаты исследований по теме диссертации доложены и опубликованы в материалах Международных научно-практических конференций, посвященных 45-летию ФГУ «ВНИИЗЖ»

Владимир, 2003г.), 50-летию ФГУ «ВНИИЗЖ» (Владимир, 2008г.), в материалах конференции «Актуальные проблемы инфекционной патологии ветеринарной медицины (исследования молодых учёных)» (г. Покров Владимирской области, 2009 г., ГНУ ВНИИВВиМ), а также на заседаниях ученого совета ФГУ «ВНИИЗЖ» в 2008-2010 гг.

Личный вклад соискателя. Диссертационная работа выполнена автором самостоятельно. Отдельные этапы работы выполнены совместно с к.б.н. Дороненковой Г.Н., к.б.н. Бьядовской О.П., к.б.н. Чупиным С.А., д.б.н. Пономаревым А.П.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 133 страницах и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, собственные исследования: материалы и методы, результаты собственных исследований, их обсуждение, выводы, практические предложения и приложения. Список литературы включает 187 источников, в том числе 28 источников на русском языке и 159 источника зарубежных. Работа иллюстрирована 22 таблицами и 15 рисунками.

Заключение Диссертация по теме "Вирусология", Скитович, Галина Сергеевна

5. ВЫВОДЫ

1. Выделены и адаптированы к перевиваемой культуре клеток три полевых изолята ротавируса КРС от больных телят, изучены биологические свойства выделенных изолятов, подготовлен производственный штамм ротавируса КРС.

2. Штамм ротавируса КРС «ТЕ87-ДЕП» депонирован в коллекции штаммов микроорганизмов ФГБУ ВГНКИ и рекомендован для использования при разработке и изготовлении средств диагностики ротавирусной инфекции КРС.

6. Исследования 2495 проб сыворотки крови КРС, поступивших из 32 регионов РФ, на наличие антител к ротавирусам показали, что 43,1% были серопозитивными к возбудителю ротавирусной инфекции, а исследования 1344 проб сыворотки крови КРС, поступивших из 27 регионов РФ, на наличие антител к коронавирусам показали, что 67,7% были серопозитивными к возбудителю коронавирусной инфекции. Полученные результаты свидетельствуют о широком распространении этих болезней среди КРС и о необходимости выявления их с помощью разработанных диагностических методов.

6. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Результаты проведенных исследований явились основанием для следующих документов:

1. Патент 2258738 Российская Федерация, МПК -7 C12N 7/00 Штамм № "ТЕ87" Rotavirus крупного рогатого скота серотипов G8P7 для изготовления диагностических препаратов / 2258738, П. К. Аянот, Г. Н. Дороненкова, JI. Б. Прохватилова, С.А. Чупин, А.П. Пономарев, A.M. Тимипа, Г.С. Скитович; ФГУ "ВНИИЗЖ". - № 2003136945/13; Заявл. 24.12.2003; Опубл. 20.08.2005, Бюл. № 23.

2. Методика концентрирования и очистки ротавируса крупного рогатого скота / Г.С. Скитович, Л.Б. Прохватилова , Г.Н. Дороненкова, С.А. Чупин и др. ; ФГУ "ВНИИЗЖ". - Владимир, 2002. - 7 с.

3. Методика определения титра антител к коронавирусу в сыворотках крови крупного рогатого скота иммуноферментным методом / Г. С. Скитович, О.П. Бьядовская, В.В. Думова, Л.Б. Прохватилова ; ФГУ "ВНИИЗЖ". - Владимир, 2007. - 10 с.

4. Методика выявления антител к ротавирусу крупного рогатого скота в непрямом варианте иммуноферментного анализа при тестировании проб в одном разведении / Г. С. Скитович, О. П. Бьядовская, Л. Б. Прохватилова; ФГУ "ВНИИЗЖ". - Владимир, 2007. - 8 с.

5. Методические рекомендации по выялению антител к коронавирусу КРС в непрямом варианте иммуноферментного анализа при тестировании проб сывороток крови в одном разведении / Г. С. Скитович, О.П. Бьядовская, О.Г. Андреева [и др.] ; ФГУ "ВНИИЗЖ". -Владимир, 2010. - 14 с.

6. Методические рекомендации по выявлению антител к ротавирусу крупного рогатого скота в сыворотках крови лабораторных животных в непрямом варианте иммуноферментного анализа / Г. С. Скитович, О. П. Бьядовская, C.B. Левченко, Л. Б. Прохватилова; ФГУ "ВНИИЗЖ". -Владимир, 2010.- 9с.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Скитович, Галина Сергеевна, Владимир

1. Асташенко Н.Ж. Антигенные и иммуногенные свойства ротавируса крупного рогатого скота: дис. . .канд. вет. наук. М., 1985. - 20 с.

2. Ашмарин И.П., Васильев H.H., Амбросов В.А. Быстрые методы статистической обработки и планирование экспериментов. Л.: Изд-во Ленингр. ун-та, 1974. - 76 с.

3. Вирусные гастроэнтериты смешанной этиологии и их профилактика / А.И. Собко, Ф.С. Вабишевич, В.Н. Ткацкая и др. // Вопросы вет. вирусологии, микробиологии и эпизоотологии: материалы науч. конф. -Покров, 1992.-4.1.-С. 154-155.

4. Гуненков В.В., Халенев Г.А., Сюрин В.Н. Вирусные и хламидиозные респираторные и кишечные инфекции крупного рогатого скота // Итоги науки и техники ВИНИТИ АН СССР. Животноводство и ветеринария. -М., 1975. Т.8. - С. 106- 108.

5. Исследование ротавирусов методами электронной микроскопии и электрофореза РНК в полиакриламидном геле / В.И. Хаустов, Ю.А. Казачков, М.Б. Королев, J1.A. Шекоян // Вопросы вирусологии 1988. -№6.-С. 743-745.

6. Коромыслов Г.Ф. Диареи телят, обусловленные вирусами // Итоги науки и техники. ВИНИТИ АН СССР. Животноводство и ветеринария. -Москва, 1980.-Т.13. С. 7-31.

7. Коронавирусные инфекции животных / И.Ф. Вишняков, H.A. Лагуткин, A.A. Стрижаков и др. Покров, 1997. - 69 с.

8. Культивирование и обнаружение коронавируса в культуре клеток / Н.Л. Соколова, И.Т. Сатторов, B.C. Авилов // Бюл. ВИЭВ. М., 1983.-Вып. 49. - С. 46-48.

9. Культивирование ротавируса возбудителя неонатальной диареи телят / Н.М. Стрижаченко, Ы.А. Граевская, Н.Л. Соколова и др. // Ветеринария. - 1970. - №10. - С. 68-70.

10. Мникова Л. А., Гоголев М. М., Ишкова Т. А. Иммуноферментная тест-система для идентификации рота- и коронавирусного антигена, антигена диареи крупного рогатого скота. // С.-Х. биология- 2000.-№6.-С. 117-119.

11. Пантелеев Ю.В., Буслаева Г.П., Соколова Н.Л. Морфогенез ротавируса телят в культуре клеток почки эмбриона коровы с добавлением трипсина // Проблемы молекулярной биологии и патологии с.-х. животных: сб. науч. тр. MBA. -М., 1982. С. 31-38.

12. Практическая химия белка / под ред. А.Дабре. М.: Мир, 1989. - 623с.

13. Применение ПЦР для определения Р-типов ротавирусов КРС / С.А. Чупин, В.А. Кудрявцев, Г.Н. Дороненкова, П.К. Аянот // Актуальные проблемы патологии свиней, крупного и мелкого рогатого скота: материалы конф. молодых ученых. Владимир, 2002. - С. 106-113.

14. Простой метод выделения и очистки РНК / О.Г. Грибанов, A.B. Щербаков, H.A. Перевозчикова и др. // Биоорганическая химия. -1997. Т.23,№9. - С. 763-765.

15. Рамишвили Л.Г., Маглакедзе Д. А., Лобадзе Т.Н. Выделение ротавируса собак и изучение его иммунобиологических свойств // Молекулярная генетика микробиология и вирусология. 2001. - №2. -С. 521-523.

16. Репродукция и индикация ротавируса крупного рогатого скота / М.М. Гоголев, Н.И. Матюгина, Л.А. Мникова, М.Т. Гололобова // Бюл. ВИЭВ, М, 1983.-Вып. 49.-С. 49-53.

17. Самойлов П.П. Экспериментальное изучение репродукции ротавируса телят в культуре клеток: автореф. дис. .канд. вет. наук. М., 1982. — 20 с.

18. Сатторов И.Т. Методы культивирования и индикация коронавируса КРС: автореферат дис. .канд. вет.наук. -М., 1984. 15 с.

19. Серийное пассирование ротавируса крупного рогатого скота в гетерологичной культуре клеток / Л.Г. Рамишвили, Г.Г. Рухадзе, Е.А. Непоклонов и др. // Вопросы вирусологии. 1991. - №6. - С.521-523.

20. Скибицкий В.Г., Проценко О.Г. Серологическое обследование КРС на наличие противоротавирусных антител // Профилактика и меры борьбы с болезнями молодняка с.-х. животных: тез. докл. науч.-произв. конф.-Минск, 1990.-С. 10.

21. Соколова Н.Л. Коронавирусный энтерит новорожденных телят (обзор). М.: ВАСХНИЛ, 1990. - 60 с.

22. Соколова Н.Л., Сатторов И.Т., Мникова Л.А. Коронавирус — возбудитель диареи новорожденных телят // Ветеринария. 1982. - № 11.-С. 26-27.

23. Сюрин В.Н., Белоусова Р.В., Фомина Н.В. Ветеринарная вирусология. 2-е изд. - М. : Агропромиздат, 1991. - 431 с.

24. Хараламбиев Х.Е., Белчес Д. Колибактериални и вирусни ентерити прителетата. София, 1980. - 128 с.

25. Эффективность различных адъювантов при получении диагностических сывороток / В.А. Мищенко, А.И. Дудников, М.А. Базаров и др. // Вирусные и микробные болезни животных: сб. науч. тр. Владимир, 1995. - С. 149-152.

26. Acres S.D., Babiuk L.A. Studies on rotaviral antibody in bovine serum and lacteal secretions, using radioimmunoassay // J. Am. Vet. Med. Assoc. -1978.-Vol. 173.-P. 555-559.

27. Acres S.D., Saunders J.R., Radostits O.M. Acute undifferentiated neonatal diarrhea of beef calves: The prevalence of enterotoxigenic E.coli, reo-like (rota) virus and other enteropathogens in cow-calf herds // Can. Vet. J. -1977.-Vol. 18.-P. 113-121.

28. A field trial to test the efficacy of a combined rotavirus-coronavirus/E. coli vaccine in dairy cattle / D. Waltner-Toews, S.W. Martin, A.H. Meek, I. McMillan // Proc. 4th Int. Symp. Neonatal diarrhoea. 1983. - P. 456-483.

29. Age-dependent diarrhea induced by a rotaviral nonstructural glycoprotein / J.M. Ball, P. Tian, C.Q.Y. Zeng et al. // Science. 1996. - Vol. 272. - P. 101-104.

30. Agrawal D.K., Singh N.P., Chauhan R.S. Colostral antibodies against rotavirus infection in neonatal calves // J. Immunology and Immunopathology. 2002. - Vol. 4. - P. 107-109.

31. Almeida J.D., Craig C.R., Hall Т.Е. Multiple viruses present in the faeces of a scouring calf//Vet. Rec. 1978. - Vol. 102.-P. 170-171.

32. A longitudinal study of bovine coronavirus enteric and respiratory infections in dairy calves in two herds in Ohio / R.A. Heckert, LJ. Saif, K.H. Hoblet, A.G. Agnes // Vet. Microbiol. 1990. - Vol. 22. - P. 187-201.

33. Antigenic and biological relationships between human coronavirus OC43 and neonatal calf diarrhoea coronavirus / G. Ge ma, P.M. С ereda, M.G. Revello // J. Gen. Virol. 1981.-Vol. 54, №1.-P. 91-102.

34. Antigenic relationships among some animal rotaviruses: virus neutralization in vitro and crossprotection in piglets / S.K. Gaul, T.F. Simpson, G.N. Woode et al. // J. Clin. Microbiol. 1982. - Vol. 16. - P. 495-503.

35. Antigenic relationships among some bovine rotaviruses: serum neutralization and cross-protection in gnotobiotic calves / G.N. Woode, N.E. Kelso, T.F. Simpson // J. Clin. Microbiol. 1983. - Vol. 18. - P. 358 - 364.

36. A survey of G6 and G10 serotypes of group A bovine rotaviruses from diarrheic beef and dairy calves using monoclonal antibodies in ELISA / S.Y. Lucchelli, M.K. Kang, A.V. Jayasekera et al. // J. Vet. Diagn. Invest. -1994.-Vol. 6.-P. 175-181.

37. Bachmann P.A. Viral gastroenteritis in calves // Modem Veterinary Practice. 1983. - Vol. 64, №7. - P. 559 - 565.

38. Bade H., Stegemann H. Rapid method of extraction of antibodies from hen egg yolk//J. Immunol. Methods. 1984. -V. 72. - P. 421-426.

39. Beards G.M.F. Polymorphism of genomic RNAs within rotavirus serotypes and subgroups // Arch. Virol. 1982. - Vol. 74. - P. 65-70.

40. Berg L.A. Pathologist's view of the scouring calf //N.D.Farm. Ree. 1981. - Vol. 30, №4. - P. 10-12.

41. Bovine enteric Coronavirus structure and studied by a freez-drying technique / A. Roseto, P. Bobulesco, L. Laporte et al. // J. Gen. Virol. -1982.-Vol. 63.-P. 241-245.

42. Bovine Virusdiarrhoe (BVD) und Mucosal Disease (MD): eine Ubersicht / W. Hochsteiner, K. Mostl, S. Franz et al. // Mschr. Wien. Tierarztl. 2002. -Vol. 89.-P. 270-280.

43. Bridger J.C. A definition of bovine rotavirus virulence // J. Gen. Virol. -1994. Vol. 75. - P. 2807-2812.

44. Bridger J.C., Wood G.N., Meyling A. Isolation of coronaviruses from neonatal calf diarrhoea in Great Britain and Denmark // Vet. Microbiol. -1978. Vol. 3. - P. 101-113.

45. Bridger J.C., Woode G.N. Neonatal calf diarrhoea: identification of a reovirus-like (rotavirus) agents in faeces by immunofluorescense and immune electron microscopy // British Vet. J. 1975. - Vol. 131. - P. 528535.

46. Calf diarrhea (scours): reproduced with a virus from a field outbreak / C.A. Mebus, N.R. Underdahl, M.B. Rhodes, M.J. Twiehaus // Univ. Nebraska Res. Bull. 1969. - Vol. 233. - P. 1-16.

47. Calfhood coronavirus enterocolitis: Aclue to the etiology of winter dysentery / H.J. Kruiningen, L.H. Khairallah, V.G. Sarsvevylls et al. // Vet. Pathol. 1987. - Vol. 24, №6. - P. 564-567.

48. Cell culture adaptation and propagation of a reovirus-like agent of calf diarrhea from a field outbreak in Nebraska / A.L. Fernelius, A.E. Ritchie, L.G. Classick et al. // Arch. ges. Virusforschung. 1972. - Bd. 37. - S. 114130.

49. Characterization of field strains of group A bovine rotaviruses by using polymerase chain reaction-generated G and P type-specific cDNA probes / A.V. Parwani, H.A. Hussein, B.I. Rosen et al/. 111. Clin. Microbiol. 1993. -Vol. 3.,-P. 2010-2015.

50. Characterization of virus-like particles produced by the expression of rotavirus capsid proteins in insect cells / S.E. Crawford, M. Labbe, J. Cohen et al. // J. Virol. 1994. - Vol. 68. - P. 5945-5952.

51. Chauhan R.S., Singh N.P. Detection of rotavirus in experimentally infected calves using immunoperoxidase technique // Indian J. Animal Sciences. -1999.-Vol. 69.-P. 239-291.

52. Chauhan R.S., Singh N.P. Demonstration of antirotavirus antibody producing cells in intestine of calves using immunoperoxidase technique // J. Immunology and Immunopathology. 2001. - Vol. 3. - P. 41—44.

53. Chronic shedding of bovine enteric coronavirus antigen-antibody complexes by clinically normal cows / C.F. Crouch, H.B. Ohmann, T.C. Wattes et al. // J. Gen. Virol. 1985. - Vol. 66. - P. 1489-1500.

54. Colostral antibodies against rotavirus infection in neonatal calves / D.K. Agrawal, N.P. Singh, R.S. Chauhan // J. Immun. Immunop. 2002. - Vol. 4. - P. 107-109.

55. Comparative analysis of innate immune responses following infection of newborn calves with bovine rotavirus and bovine coronavirus / P. Aich, H.L. Wilson, R.S. Kaushik et al. // J. Gen. Virol. 2007. - Vol. 88. P. 27492761.

56. Comparative studies of the antigenic polipeptide species VP4, VP6 and VP7 of three strains of bovine rotavirus / S. Zhen, G. Woode, D. Melengy, R.F. Ramig // J. Clin. Microbiol. 1989. - Sept. - P. 1939-1945.

57. Comparison of rotavirus immunoglobulin A coproconversion with other indices of rotavirus infection in a longitudinal study in childhood / B.S. Coulson, K. Grimwood, P.J. Masendycz et al. // J. Clin. Microbiol. 1990. -Vol. 28.-P. 1367-1374.

58. Comparison of serum and mucosal antibody responses following severe acute rotavirus gastroenteritis in young children / K. Grimwood, J.C. Lund, B.S. Coulson et al. // J. Clin. Microbiol. 1988. - Vol. 26. - P. 732-738.

59. Coulson B.S., Kirkwood C. Relation of VP7 amino acid sequence to monoclonal antibody neutralization of rotavirus and rotavirus monotype // J. Virol. 1991.-Vol. 65.-P. 5968-5974.

60. Coulson B.S., Masendycz P.J. Measurement of rotavirus-neutralizing coproantibody in children by fluorescent focus reduction assay // J. Clin. Microbiol. 1990. - Vol. 28. - P. 1652-1654.

61. Crouch C.F., Oliver S., Francis M.J. Serological, colostral and milk responses of cows vaccinated with a single dose of a combined vaccine against rotavirus, coronavirus and Escherichia coli F5 (K99) // Vet. Rec. -2001.-Vol. 28 №4.-P. 105-108.

62. Dea S., Roy R.S., Begin M.E. Bovine coronavirus isolation and cultivation in continuous cell lines // Am. J. Vet. Res. 1980. - Vol. 41. - P. 30-38.

63. Desselberger U., McCrae M.A. The rotavirus genome. Rotaviruses / ed. by R.F. Ramig. Berlin: Springer-Verlag, 1994. - P. 31-66.

64. Detection of enteropathogenic viruses in paraffin embedded intestinal tissue of calves by immunoperoxidase / G.A. Hall, K.R. Parsons, D.J. Reynolds, J.I-I. Morgan // J. Med. Microbiology. 1985. - Vol. 19. - P. 14-16.

65. Detection of rotavirus and coronavirus shedding in two beef cow herds in Idaho / M.S. Bulgin, A.C.S. Ward, D.P. Barrett et al. // Can. Vet. J. 1989. -Vol. 30.-P. 235-239.

66. Development, Characterization, and Diagnostic Applications of Monoclonal Antibodies against Bovine Rotavirus / Y. Al-Yousif, F. Al-Majhdi, C. Chard-Bergstrom et al. // Clin. Diagn. Lab. Immunol. 2000. -Vol. 7, №2. - P.288-292.

67. Diarrhoea in dairy calves reduced by feeding colostrum from cows vaccinated with rotavirus / D.R. Snodgrass, J. Stewart, J. Taylor et al. // Res. Vet. Sci. 1982. - Vol. 32. -P.70-73.

68. Distribution of G (VP7) and P (VP4) genotypes in buffalo group A rotaviruses isolated in Southern Italy / G. Pisanelli, V. Martella, U. Pagnini et al. // Vet. Microbiol. 2005. - Vol. 110. - P. 1-6.

69. Doughri A.M., Storz J. Light and ultrastructural pathologic changes in intestinal coronavirus infection of newborn calves // Zentzbl. Vetmed. -1977. Vol. 24, №5. - P. 267-386.

70. Durham P.J.K. Rotavirus and coronavirus induced diarrhoea in Zealand cattle // 47 Session Generate du Comite de O.I.E., Paris, 2 1-26 mai, 1979.- Rapport 106. P. 9.

71. Electropherotype heterogeneity within serotypes of human rotavirus strains circulating in Italy / G. Gerna, S. Arista, N. Passarani et al. // Arch. Virol.- 1987.-Vol. 95.-P. 129-135.

72. Ellis G.R., Daniels E. Comparison of direct electron microscopy and enzyme immunoassay for the detection of rotaviruses in calves, lambs, piglets and foals//Australian Vet. J. 1988.-Vol. 65.-P. 133-135.

73. England L.I. Viruses associated with neonatal diarrhea of calves // Vet. Med. Small Anim. Clin. 1977. - Vol. 72, №5. - P. 925 - 927.

74. Epizootic diarrhoea of adult cattle assocoated with a coronavirus-like agent / E. Takahashi, J. Inaba, K. Sato et al. // Vet. Microbiol. 1980. - Vol. 5. -P. 151 -154.

75. Espejo R.T., Lopez S., Arias C. Structural polypeptides of simian rotavirus SA11 and the effect of trypsin//J. Virol. 1981. - Vol. 37. - P. 156-160.

76. Estes M.K., Graham D.Y., Dimitrov D.H. The molecular epidemiology of rotavirus gastroenteritis // Prog. Med. Virol. 1984. - Vol. 29. - P. 1-22.

77. Estes M.K. Rotaviruses and their replication // Fields Virology / Ed. by B.N. Fields, D.M. Knipe, P.M. Howley. 3rd ed. - Philadelphia, 1996. - P. 1625-1655.

78. Estes M.K. Rotaviruses and their replication // Fields Virology / Ed. by D.M. Knipe, P.M. Howley et al. 4th ed. - Philadelphia, 2001. - P. 17471785.

79. Estes M.K. The rotavirus NSP4 enterotoxin: current status and challenges // Elsevier Science, Amsterdam, Netherlands, 2003. P. 207-224.

80. Evaluation of immune response to bovine rotavirus following oral and intraperitoneal inoculation in mice / R. Rathi, S.K. Kadian, B. Khurana et al. // Indian J. Experimental Biology. 2007. - Vol. 45. - P. 212-216.

81. Evaluation of recombinant BCG expressing rotavirus VP6 as an anti-rotavirus vaccine / M. Dennehy, W. Bourn, D. Steele // Vaccine. 2007. -Vol. 25.-P. 3646-3657.

82. Experimentally induced coronavirus infections in calves: viral replication in the respiratory and intestinal tracts / L.J. Saif, D.R. Redman, P.D. Moorhead, K.L. Theil // Am. J. Vet. Res. 1986. - Vol. 47. - P. 1426-1432.

83. G and P genotypes of group A rotavirus strains circulating in calves in Brazil, 1996-1999 / A.F. Alfieri, A.A. Alfieri, M.A. Barreiros et al. // Vet. Microbiol. 2004. - Vol. 99. - P. 167-173.

84. Gill H., Prasad J. Probiotics, immunomodulation, and health benefits // Adv. Eperim. and Med. Biol. 2008. - Vol. 606. - P. 423-454.

85. Greenberg H.B., Clark H.F., Offit P.A. Rotavirus pathology and pathophysiology // Rotaviruses / ed. R.F. Ramig. - Berlin-Heidelberg, 1994.-P. 256-283.

86. Group A rotavirus in calves in Minas Gerais State, Brazil / E.F. Barbosa, H.C.P. Figueiredo, A.M. Garcia et al. // Ciencia Rural. 1998. - Vol. 28. -P. 435-439.

87. Heckert R.A., Saif L.J., Myers G.W. Mucosal and systemic isotype-specific antibody responses to bovine coronavirus structural proteins in naturally infected dairy calves // Am. J. Vet. Res. 1991. - Vol. 52. - P.852-857.

88. Herrmann J.E. DNA vaccines against enteric infections // Vaccine. 2006. -Vol. 24.-P. 3705-3708.

89. Hogue B.G., B. King, D.A. Brian. Antigenic relations-hips amond proteins of bovine coronavirus OC43 and mouse hepatitis coronavirus A59 // J. Virology. 1984. Vol. 51, №2. -P. 384-388.

90. Holland R.E. Some infectious causes of diarrhea in young farm animals // Clinical Microbiological Reviews. 1990. - Vol. 3. - P. 345-375.

91. Identification of the catalytic sites of a papain-like cysteine proteinase of murine coronavirus / S.C. Baker, K. Yokomori, S. Dong et al. // Virology.- 1993. Vol. 67, №10. - P. 6056-6063.

92. Kaye H.S., Yasbrough W.B., Reed C.J. Calf diarrhoea coronavirus // Lancet.- 1975.-Vol. 11.-P. 509-511.

93. Kohara J., H. Tsunemitsu Correlation between maternal serum antibodies and protection against bovine rotavirus diarrhea in calves // J. Vet. Med. Science. 2000. - Vol. 62. - P. 219-221.

94. Komoto S., Sasaki J., Taniguchi K. Reverse genetics system for introduction of site-specific mutations into the double-stranded RNA genome of infectious rotavirus // Proc. Nat. Acad, of Sci. USA. 2006. - Vol. 103. - P. 4646-4651.

95. Lactogenic antibody responses in cows vaccinated with recombinant bovine rotavirus-like particles (VLPs) of two serotypes or inactivated bovinerotavirus vaccines / Y. Kim, P.R. Nielsen, D. Hodgins et al. // Vaccine. -2002a.-Vol. 20.-P. 1248-1258.

96. Langpap T.J., Bergeland M.E., Reed D.E. Coronaviral enteritis of young calves: virologic and pathologic findings in naturally occurring infections // Am. J. Vet. Rec. 1979. - Vol. 40, №10. - P. 1476 - 1478.

97. Lawton J.A., Estes M.K., Prasad B.V. Comparative structural analysis of transcriptionally competent and incompetent rotavirus-antibody complexes // Proc. Nat. Acad, of Sci. USA. 1999. - Vol. 96. - P. 5428-5433.

98. Lawton J.A., Estes M.K., Prasad B.V. Mechanism of genome transcription in segmented dsRNA viruses // Adv. Virus Res. 2000. - Vol. 55. - P. 185229.

99. Lecce J.G., King M.W. Rotavirue antibodies in cow's milk // Canad. J. Comp. Med. 1982. - Vol. 46, № 4. - P. 434 - 436.

100. Lewis L.D., Phillips R.W. Pathophysiologic changes due to coronavirus-induced diarrhea in the calf // J. Am. Vet. Med. Assoc. 1978. - Vol. 173. -P. 636 - 642.

101. Light and electron microscopic studies of the changes in the intestinal mucosa of gnobiotic calves infected with a wild rotavirus / H.C. Dubourguier, O. Mandard, M. Contrepois, P. Gouct // Ann. Virol. 1982. -Vol. 132, №2.-P. 217-227.

102. Localization of VP4 neutralization sites in rotavirus by three-dimensional cryo-electron microscopy / B.V.V. Prasad, J. W. Burns, E. Marietta et al. // Nature. 1990. - Vol. 343. - P. 476-479.

103. Losonsky G.A., Reymann M. The immune response in primary asymptomatic and symptomatic rotavirus infection in newborn infants // J. Infect. Dis. 1990. - Vol. 161. - P. 330-332.

104. Maass D.R., Atkinson P.H. Rotavirus proteins VP7, NS28, and VP4 form oligomeric structures // J. Virol. 1990. - Vol.64, N6. - P. 2632-2641.

105. Massip A. La diarrhee du vean: consideration physiopathologiques et notions de rehydratation. I. Consideration physiopathologiques // Ann. Med. Vet. 1976. - Vol. 120. - P. 9-26.

106. Matsuno S., Inouye S. Purification of an outer capsid glycoprotein of neonatal calf diarrhea virus and preparation of its antisera // Infect. Immun. -1983.-Vol.39.-P. 155-158.

107. McClurkin A.W. Probable role of viruses in calf hood diseases // J. Dairy Science. 1976. - Vol. 60, №2. - P. 278 - 282.

108. McNulty M.S., Curran W.L., McFerran J.B. The morphogenesis of a cytopathic bovine rotavirus in Madin-Darby bovine kidney cells // J. Gen. Virol. 1976. - Vol. 33. - P. 503-508.

109. Mebus C.A., Wyatt R.G., Kapikian A.Z. Intestinal lesions induced in gnotobiotic calves by the virus of human infantile gastroenteritis // Vet. Pathol. 1977. - Vol. 14. - P. 273-282.

110. Meyling A. Occurrence of rota- and corona-virus infections in calves in Denmark. Experimental infection of calves with isolamed agents // 47 Session Generale du Comite de O. I. E., Paris, 21 -26 May, 1979. Raport № 106.

111. Middleton P.J. Pathogenesis of rotavirus infection // J. Am. Vet. Med. Assoc. 1978. - Vol. 173. - P. 544-546.

112. Molecular characterization and analysis of bovine rotavirus strains circulating in Ireland 2002-2004 /N. Reidy, G. Lennon, S. Fanning et al. // Vet. Microbiol. 2006. - Vol. 117. - P. 242-247.

113. Molecular characterization of bovine rotavirus circulating in beef and dairy herds in Argentina during a 10-year period (1994—2003) / L. Garaicoechea, K. Bok, L.R. Jones et al. // Vet. Microbiol. 2006. - Vol. 118. - P. 1-11.

114. Mostl K., Burki F. Ursachliche Beteiligung boviner Coronaviren an respiratorischen Krankheitsausbruchen bei Kalbern und pathogenetischimmunologische Überlegungen hierzu // Tierarztl. Umschau. 1988.-Bd. 95,№1.-S. 19-22.

115. Mucosal immune responses following oral immunization with rotavirus antigens encapsulated in alginate microspheres / B. Kim, T. Bowersock, P. Griebel et al. // J. Controlled Release. 2002b. - Vol. 85. - P. 191-202.

116. Mullaney T.P., Newman L.E., Whitehair C.K. Hummoral immune respose of the bovine fetus to in utero vaccination with attenuated bovine Coronavirus // Am. J. Vet. Res. 1988. - Vol. 49. - P. 156-159.

117. Myers L.L., Snodgrass D.R. Colostral and milk antibody titres in cows viccinated with a modified live-rotavirus-coronavirus vaccine // J. Am. Vet. Med. Assos. 1982. - Vol. 181.- P.486-488.

118. Nasal immunization of mice with a rotavirus DNA vaccine that induces protective intestinal IgA antibodies / A. Garcia-Diaz, P. Lopez-Andujar, J. Rodriguez Diaz et al. // Vaccine. 2004. - Vol. 23. - P. 489-498.

119. Neonatal calf diarhea induced bu a coronavirus-like agent / Mebus C.A. et al. // Vet. Pathol. 1973. - Vol. Ic, №1. - P. 45 - 64.

120. Neonatal calf diarrhea: purification and electron microscopy of a coronavirus-like agent / E.L. Stair, M.B. Rhodes, R.G. White, C.A. Mebus // Am. J. Vet. Ree. 1972. - Vol. 33. - P.l 147-1156.

121. Novel porcine rotavirus of genotype P27. shares new phylogenetic lineage with G2 porcine rotavirus strain / P. Khamrin, N. Maneekarn, S. Peerakome [et al.] // Virology. 2007. - Vol. 361. - P. 243-252.

122. Oral administration of specific egg Volk antibodies to prevent diarrhoea in newborn calves enteropathogen dependent effects / M.H. Erhart, K. Doll,

123. U. Losch, M. Stangassinger // Proc. 19 World Buiatrics Congress. -Edinburgh, 1996.-Vol. 1.-P. 121-124.

124. Palombo E.A. Genetic analysis of Group A rotaviruses: evidence for interspecies transmission of rotavirus genes // Virus Genes. 2002. - Vol. 24. - P. 11-20.

125. Passive immunity in calf rotavirus infections: material vaccination increases and prolongs immunoglobulin G1 antibody secretion in milk / D.R. Snodgrass, K.L. Fahey, P.W. Wells et al. // Infec. Immun. 1980. - Vol. 28.-P. 344-349.

126. Pathogenic relationships of rotavirus, Escherichia coli, and other agents in mixed infections in calves / H.W. Moon, A.W. McClurkin, R.E. Isaacson et al. // J. Am. Vet. Med. Assoc. 1978. - Vol. 173. - P. 577-583.

127. Pathology of neonatal calf diarrhoea induced by a reo-like virus / C.A. Mebus, E.L. Stair, N.R. Underdahl, M.J. Twiehaus // Vet. Pathol. — 1971. — Vol. 8.-P. 490-505.

128. Paul P.S., Lyoo Y.S. Immunogens of rotaviruses // Vet. Microbiol. 1993. -Vol. 37.-P. 299-317.

129. Pearson G.R., Logan E.F. The Pathology of neonatal enteritis in calves with observations on E. coli, rotavirus and Cryptosporidium // Ann. Res. Vet. -1983. Vol. 14, № 4. - P. 422-426.

130. Persistent antigenic variation of influenza A viruses, after incomplete neutralization in vivo with heterologie immune serum / G. Archetti, L. Franc, F.L. Horsfall // J. Exp. Ved. 1950. - №5. - P. 441-462.

131. Prevalence of bovine group A rotavirus shedding among dairy calves in Ohio / A. Lucchelli, S.E. Lance, P.B. Bartlett et al. // Am. J. Vet. Res. -1992.-Vol. 53.-P. 169-174.

132. Prevalence of group A and group B rotaviruses in the feces of neonatal dairy calves from California / J. Chinsangaram, C.E. Schore, W. Guterbock et al. // Comp. Immun. and Microb. 1995. - Vol. 18. - P. 93-103.

133. Properties of a coronavirus isolated from a cow with epizootic diarrhea / H. Akashi, Y. Inaba, Y. Miura et al. // Vet. Microbiol. 1980. - Vol. 5. - P. 265 -276.

134. Prophylaxis of neonatal diarrhoea in dairy calves using egg yolk immunoglobulins (IgY) / G.N. Bilbao, P.A. Chacana, A. Mendiburu et al. // Revue Medicinica Veterinaria Buenos Aires. 2006. - Vol. 87. - P. 135— 139.

135. Protective effects of orally administered immunoglobulins against experimental calf diarrhea / T. Murakami, N. Hirano, A. Inque et al. // Japanese J. Vet. Sc. 1986. - Vol. 48. - P. 237-245.

136. Ramadass P., Parthiban M., Thiagarajan V. Development of single serum dilution ELISA for detection of infectious bursal disease virus antibodies // Vet. Arhiv. 2008. - Vol. 78, №1. - P. 23-30.

137. Rapid detection of bovine rotavirus with semi-nested RT-PCR assay / J.J. Luan, S.H. Yang, W.J. Zhang et al. // Chinese J. Zoonoses. 2006. - Vol. 22.-P. 671-673.

138. Reactivities of serotyping monoclonal antibodies with culture-adapted human rotaviruses / R.L. Ward, M.M. McNeal, J.D. Clemens et al. // J. Clin. Microbiol. 1991. - Vol. 29. - P. 449-456.

139. Relation between viruses from acute gastroenteritis of children and new born calves / T.H. Flewett, A.S. Bryden, H.A. Savies et al. // Lancet. 1974. -Vol. 2.-P. 61-63.

140. Reovirus-like agent (rotavirus) associated with neonatal calf gastroenteritis in France / R.J. Scherrer, R.L. Cohen, S. Haridon et al. // Ann. Rech. Vet. -1976.-Vol. 7. P. 25-31.

141. Rodak L., Babiuk L.A., Acres S.D. Detection by radioimmunoassay and enzymelinked immunosorbent assay of coronavirus antibodies in bovine serum and lacteal secretions // J. Clin. Microbiol. 1982. - Vol. 16. - P. 3440.

142. Rotavirus and coronavirus prevalence in healthy calves and calves with diarrhea / S.O. Gumusova, Z. Yazici, H. Albayrak // Medycynica Weterynaryjna. 2007. - Vol. 63. - P. 6 -64.

143. Rotavirus infections in calves: efficacy of oral vaccination in endemically infected herds / P.W. Leeuw, D.J. Ellens, F.P. Talmon et al. // Res. Vet. Sci. 1980. - Vol. 29. - P. 142-147.

144. Rotavirus isolation and cultivation in the presence of trypsin / L. A. Babiuk, K.A. Mohammed, L. Spence et al. // J. Clin. Microbiol. 1977. - Vol. 6. -P. 610-617.

145. Rotavirus is released from the apical surface of cultured human intestinal cells through nonconventional vesicular transport that bypasses the Golgi apparatus / N. Jourdan, M. Maurice, D. Delautier // J. Virol. 1997. - Vol. 71. - P. 8268-8278.

146. Rotavirus serotypes 6 and 10 predominate in cattle / D.R. Snodgrass, T. Fitzgerald, I. Campbell et al. // J. Clin. Microbiol. 1990. - Vol. 28. -P.504 - 507.

147. Rotavirus Spike Protein VP4 Is Present at the Plasma Membrane and Is Associated with Microtubules in Infected Cells / M. Nejmeddine, G. Trugnan, C. Sapin // J. Virol. 2000. - Vol. 74, №7. - P. 3313-3320.

148. Rotaviruses in human and veterinary medicine / B. Dodet, E. Heseltine, C. Mary et al. // Sante. 1997. - Vol. 7. - P. 195-199.

149. Saif L.J. Development of nasal, fecal and serum isotype-specific antibodies in calves challenged with bovine Coronavirus or rotavirus // Vet. Immunol. Immunopathol. 1987. - Vol. 17. - P. 425-439.

150. Saif, L.J., Fernandez, F.M. Group A rotavirus veterinary vaccines // J. Infec. Dis. 1996.-Vol. 174.-P. 98-106.

151. Saif L.J. Passive immunity to Coronavirus and rotavirus infections in swine and cattle: enhancement by maternal vaccination // Infectious Diarrhoea in the Joung / ed. by S. Tzipori et al.. Amsterdam, 1985. - P. 456-467.

152. Schirrmeier H., Heinrich H.-W. Der Einsatz der Immunofluoreszentechnik fur die Diagnostik der Rotavirusinfektion des Kalbes // Arch. exp. Veterinarmed. 1981. - Bd. 35, № 2. - S. 187- 188.

153. Shahrabadi M.S., Lee P.W.K. Bovine rotavirus maturation is a calcium-dependent process // Virology. 1986. - Vol. 152. - P. 298-307.

154. Sharpee R.L., Mebus C.A., Bass E.P. Characterization of a calf diarrheal Coronavirus//Am. J. Vet. Res. 1976. - Vol. 37. - P. 1031-1041.

155. Steele A.D., Geyer A. Gerdes G.H. Rotavirus infections // Infectious diseases of Livestock / eds: J.A.W. Coetzer, R.C. Tustin Oxford University Press, Southern Africa, 2004. - P. 1256-1264.

156. Studius on the Relationship betweem coronaviruses from the intestinal and respiratory tract of calvies / D.I. Reynolds, T.G. Debney, G.A. Hall et al. // Arch. Virol. 1985.-Vol. 85, № 1-2.-P. 71-83.

157. Subunit rotavirus vaccine administered parenterally to rabbits induces active protective immunity / M. Ciariet, S.E. Crawford, C. Barone et al. // J. Virol. 1998. - Vol. 72. - P. 9233-9246.

158. Systemic and mucosal immune responses to rhesus rotavirus vaccine MMU 18006 / G.A. Losonsky, M.B. Rennels, Y. Lim et al. // Pediatr Infect. Dis. J. 1988. - Vol. 7. - P. 388-393.

159. The effect of trypsin on the growth of rotavirus / J.D. Almeida, T. Hall, J.E. Babatvala et al. //J. Gen. Virol. 1978. - Vol.40. - P. 213-218.

160. The efficacy of colostrum from cows vaccinated with rotavirus in protecting calves to experimentally induced rotavirus infection / G. Castrucci, F. Frigeri, M. Ferrari et al. // Comp. Immun. and Microb. 1984a. - Vol. 7. -P. 11-18.

161. The protection of newborn calves against experimental rotavirus infection by feeding mammary secretions from vaccinated cows // G. Castrucci, F. Frigeri, M. Ferrari et al. Microbiologica. - 1988a. - Vol. 11. - P. 379385.

162. Theil K.W., Bohe E.H., Cross R.F. Pathogenesis of porcine rotaviral infection in experimentaly inoculated gnotobiotic pigs // Amer. J. Vet. Res. 1978. - Vol. 39, №2. - P. 213-220.

163. Theodoridis A., Prosesky L., Els H. The isolation and cultivation of calv rotavirus in the Republic of South Africa // J. Vet. Rus. 1979. - Vol. 46, № 2.-P. 65-69.

164. Three-dimensional structure of rotavirus / B.V. Prasad, G.J. Wang, J.P. Clerx, W. Chiu //J. Mol. Biol. 1988. - Vol. 199. - P. 269-275.

165. Three-dimensional structure of the rotavirus haemagglutinin VP4 by cryo-electron microscopy and difference map analysis / M. Yeager, A. Berriman, T.S. Baker, A.R. Bellamy // The EMBO J. 1994. - Vol. 13, N5. - P. 10111018.

166. Welch A., Thompson T.L. Physicochemical characterization of a neonatal calf diarrhea virus // Can. J. Compr. Med. 1973. - Vol. 37. - P. 295-301.

167. Winter dysentery in adult dairy cattle / A. I. Fleetwood, S. Edwards, P.W. Foxell, C.I. Thorns // Vet.Rec. 1989. - Vol. 125, №22. - P. 553-554.

168. Winter dysentery in adult dairy cattle: detection of Coronavirus in the faeces / L.J. Saif, D.K. Redman, K.V. Brock // Vet. Ree. 1988. - Vol. 123, №11. -P. 300-301.

169. Woode G.N., Bridger J.C. Viral enteritis of calves // Vet. Ree. 1975. -Vol. 96.-P. 85-88.

170. Woode G.N. Epizootology of bovine rotavirus infection // Vet. Ree. 1978. -Vol. 103.-P. 44-46.

171. Woode G.N., Jones J., Bridger J. Levels of colostral antibodies against neonatal calf diaahoea virus // Vet. Ree. 1975. - Vol. 97. - P. 148-149.

Информация о работе

Скитович, Галина Сергеевна
кандидата биологических наук
Владимир, 2012
ВАК 03.02.02

Диссертация

Разработка иммуноферментных тест-систем для выявления антител к рота- и коронавирусам крупного рогатого скота - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы