Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

кДНК-гибридизационные зонды для идентификации рота- и коронавирусов крупного рогатого скота

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "кДНК-гибридизационные зонды для идентификации рота- и коронавирусов крупного рогатого скота"

' ВСЕРОССИЙСКИЙ НАУЧГОЧЯЗйЭДОВАТЕШйСИЙ ШСТИТУТ ЭКСЛТШМЕНТМЬНОЙ ВЕТЕРИНАРИИ имени Я.Р.КОВАЛЕНКО

российской акадзйм сепь-скохозяйственшх наук

На отавах рукописи

ГРАЩУК ВЛАДИМИР НИКОЛАЕВА

кДНК- ГИБКЭДгаЩЮНЯЫЕ ЗОНДЫ ДЛЯ ЙДЕЕГЯШШЩ РОТА- И КОРОНАВИРУСОЗ КРУШОГО РОГАТОГО СКОТА

03.00.23 - 6лотэ2еолог2я

Авто р..е фара? диссертации на ссискашв ученей степени кандидата блологических наук

/

Москва - 1952

Работа шшинзца в лаборатории ьгалвку-яярной биологии и биохимии Всероссийского научно-исследовательского института экспериментальной ветеринарии имени Я.Р.Ковалешсо и лаборатории биосинтеза нунгзиновых кислот Института молекулярной биологии имени В.А.Эиггльгардта Российской Академии Наук. ••'

Научный руководитель

Завздукций лабораторией молекулярной йшяопи .и йиохимии БИЗВ, академик РАСХН, профессор Г.ОЛСорсиыевив.

Официальные оппоненты:

Доктор ватершарякх наук, профессор Б.Т.Орлпзжшг (Всероссийский научно - исследовательский -институт егсяэрзмэнтэльнсй ветэркнарии км. Я.Р.Коваленко).

Кандидат бжисопгчегаих наук В.А.Крягзский (Институт биологии развития км. Н„К.Кольдова). .

Вздущеэ учриздапив - .Московская вэторжнарная зквдзкия ин&ек К.И.Скрябина.

Бадкта состоится " Т932 г. в

" часов на заседании специализированного совета К,020.28.01 по заадте дасоерта'ДЕй на соискаыза ученой степени,кандидата тук при ВсероссиЁгаам научно-исслэдозательскам зистиуте "экслэрайи-талъной зеуеринзриа иаени -Я.Р.Коваленко по адресу; 109472, Москва, Кузьминки, ВИЭВ. ■ . .

С диссэртадЕЗй. могло ознакомиться в йиСлаотекз В1Ш.

Автореферат разослан " " " 1932 г. •

Гчегий секретарь сЕег^ашапровгпного совета, кандидат ветергнарпих наук

ФЛ'.Тере^г.з.

pocp;"4';^';'-!

■ .Aff ! ^ SiibiiliO '{£ЛЛ

¡Л:.-.. f

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы: Одной из главных: пратан гибели молодняка сельскохозяйственных яиеотеых з посгаагальшЯ период является сстрыэ гастроэнтериты, вызываемые бактериальной инфекцией или зктеропатогенными вирусами (Vaniei* R. et al., 1983). Среда нрэдЬтавителей семейств энтеропатогенных Еирусоз рота- и коронэвирусы составляют основную группу возбудителей инфекционных гастроэнтеритов (Holces I.H., et al., 1983; Estes IT.К. st al., 1933; Spaan ïï. et al., 1988). По данным КеЪча С.A. et. al. (1969), легальность для новорожденных телят при ротавярусном гастроэнтерите варьирует от 15 до ËCZ. Исследованиями House J.А. (1978) было установлено, что каядай четвертый случай i-ибели телят от небзктериального гастроэнтерита происходят по причине коронавирусной ивфекцзн. :

Для диагностики рота-, и ко'роневирусных инфекций применяются рзс^пзкэ метода: изоляция вирусов в культурах клеток, серологические, пря>.-:зя и иммуяозлектронная ' микроскопия и -злек^схоз'рзз в по-мгкрилачшдном геле (Букринская А.Г.. 1986; Горбачев S.H. и соав., ISS9).'

Однако, кзтодн изоляции рота- (3R7) .н коршавируса (вот) отупкего рогатого • скота являются достаточно, трудоемкими и занитавт большое количество времени; метода электронной микроскопии - технически слоены и малопригодны дня проведения глассового анализа образцов (baporta I. et al., 1ЭТ9; Sharpee R.L. et al., 1979; Chasey 3. & Lucas li'.A., 1977; Prasad B.V.Y. et al., 1988). Метод г лбк7т«Т.орл ткче оного исследования вирусных нрт.лйшошг кислот в эгарозных и полиакрилсмиднах гелях широко применяется »при изучении вариабельности вирусного генома и для электрсфореиш^хрования различных штаммов ротавяруссв (Rodger s.M. qt al., 1977; LToCrae M. A. et al,. 1932).

Дчя здэнткзжезцаи гггогочкетавннх штакмоя рота- и корона-ьчрусоз используются те:«:э традиционные сзрологлчзские метода -рвак7.*^я Езйтразизгцин, тормоаэшя гагантлгкпгн&ЦЕИ, связывания кэжхгекентэ и тг^Еог^аргззтаый анализ (Гоголзв К.М., КорэшслоЕ Г'.й.. ISS4; 1938). Дальнейшему распространению этих катодов в спрбД9ЛЭ5Е0й стешет препятствует ан&чигельпая вариабельность поверхностных глнксггротзиноЕ рота- и корозавкрусоз, обусловленная ВКТ1БНЫ2ЛИ Пр0ЦЭСС2МИ ГвЕЭТНЧЗСКОЙ рэкокбнкашзд их РНК (Paultaer-Yalle G.?. et al-. 1932; Hundley F. et al., 1937; Spaan

w. et al., 1983). По этой же причине существупцио на сегодняшний день вакцинные препараты не в полной степени обеспечивают надеквуи защиту к-шотвях от рота- и коронавирусшго возбудителей. В связи с этих возникает необходимость создания эффективной гзнно-инкенершй вакциш ( îiidtbsen к...et al-, 1985; Ofiit p. ai al., 1936; Estes K.K. et al., 1987; Spaan W. et al., 1988 ), a также разработки новых методов диагностики рота- и короназярусной инфекции, основанных на достижениях современных методов молекулярной бислогяз и биотехнологии. Таким перспективным диагностическим методом является метод молекулярных гибридизацкошссс зоддов.

- Этот метод основан на гибридизации тем или иным способом меченого зонда с нуклеиновыми кислотами- вирусов, про- или эукариот, обусловленной компдеыэнтарностью спэшйичоской кукдеота/5»ой последовательности зонда и уникальной последовательности нуклеиновой кислота Сиолсгкческого объекта. Учптнейя определенную консервативность конкретного участка генома, несущего голнуа информацию о характерном для данного рода вирусов белке (например, Бирусоспвпифачзской.РНК-пожтаврзва рота-елк коронавжрусэз)» представляется во.зыожнш разработать х'ибриди-зацконккй зонд для обнаружения всех представителей етого рода (Cohen .J. et al-, 1934; Estes Ы.К. et al., 19S4). Использование ке в качестве юлпекулярного зокда последователкюстей генов, кодарущзх поверхностные вирусные протеши, предоставляет реальную возкозеостъ для дифференциальной вданткфикацаи рота- и коронавкрусБнх eïeï»3.îgb, относящихся к рвззшчннзя оеротнпвм (Riohardsou К.A. at al., 1У64; Potter ¿.A. ot al.. 1987," Kaiiagomi T., Kakagcra.1 О.., 1989).

Несомненно, что комплексная задача ввдэдзтая последовательностей генов, кодируших впдо- или тжгоспэцЕфичосккэ антигены ротЕ- и короназируса КРС; их ияшфпсацэи в составе генетических векторов, продуктивного синтеза вирусных анткгонов з экспрэсскрунда векторах с -целью последувцей разработка гв&но-мнйенэрнй вакцины долина резаться поэтапно путем:

(I) колэкулярааго emsesa - нДГЕ— вирусных последовательностей

(II) получения представительной библиотеки- вирусных гонов п каком-либо фаговом вектора, (III) выбора педходлгак для разработки дязгностсчвского генда фаговых :словоз, (IY) перзклоыироБагая ажшйзпдрованшх вирусных последовательностей в шшзмидшй вектор с тюслэдуяцак их клонЕровашэм в составе

зкспрессярущах векторов.

Цель и задачи исследований.

Целью настоящих исследований являлось конструирование специфического гиСридизациснлого зонда для идентификации коронавируса крупного рогатого скота, осуществляемое путем молекулярного синтеза кДНК на матрице геномной ГШ штамма КЛ 2 коронавируса КРС, а тзкке клонирование. синтезированных кДНК в фаговом векторе Я gt ю ив экспрессярущем плзгмвдном векторе PGEM4-Z. Кроме того, предусматривалась, paspaöcrcta гибридиза-циошюго ротавирусного зонда на основе рекогйшннтной плазмиды рБКТ.об.; отработка оптимальных условий проведения дот-гибрлдизационного анализа, используемого для идентафикации рота-к коронавярусов КРС, а также -сравнение его с другими методами обнаружения этш; вирусов.

Для достижения поставленной цели в процессе работы необходимо бшга решить следующие задача:

1. Провести электрофореткческое исследование РНК выделенных в различных регионах страны штаммов и нолевых изолятов ротавируса КРС для послэдухдего подтверздэния результатов дот-гзбрздязационного анализа..

2. Получить кДНК- ротавируенкй зонд и отработать условия достижения максимальной чувствительности и споцв^ечеости ДКК-РНК гибрадизаижшногс анализа, используя образцу выделенных ротавирусгах РЕК.

3. Осуществить колэкуляршй синтез гЛНК коронаняруса крушого рогатого скота; прсЕести молекулярное клсшировшие последовательностей корэнавируеной кДНК в фаговом,- Еэнторэ.. Л. st юн пераклочировать их в вксдрессиругщиа вектор, pGH54-2. .

4. Отобрать рекокбшантннй клон, содержащий. гйШК- последовательность, подходящ?» для конструирования специфического коронавнруезого ГЕбрддЕзащганногс зонда. '

Ь. Отработать дот- гибридкзацдонвий метод ебнеруиения РНК кортнавируса KFC в культуральном п- фэкапънсн материале с есшользсзэниэл сконструированного молекулярного гсада.

Научная нс-злина работа. Впервые в стрзза осуществлен молекулярный синтез кДНК' на матрице геномной Ж эта1.®« КЛ 2 licpoHöBcpyca KFC. Получена- кДКК- библиотека ксрсиэвврусных гзноз в фгге А. gt "О, а такта их клэиотека в клетках s.ccii. Разработан ггбрядизационный зонд для идентификации коронавируса КТО, имеющей

протяженность 2.7 тысяч нуклэотидных пар (т.н.п.) и содержащий кДНК- последовательности коронавирусных генов, кодирующих структурные: к- иуклеокапсидный и к- мембранный, а также неструктурный 9.5 кД вирусный прстеиЕы.

Проведено электрофоре типирозание РНК 8 штаммов и 1Э изолятов ротавкруса КРС, выделенных в различных регионах страны; предложен кДНК- гибридизационный зонд для обнаружения ротавирусов у КРС. С использованная разработанных кДНК- зондов показана высокая эффективность применения дот- гибридизационного метода для независимого оСнаружэняя в фекальном . матэриале рота- и коронавирусов КРС.

Практическое значение •работа. Предложен .экспресс- метод

электрофорапшировалия РНК в микропластинах полиакриламидного геля, используемый: для сравнительного анализа и дифференциации различных изолятов я штаммов ротанируса у КРС. Отработаны условия ДНК-РНК дот- табридЕзациснного анализа, рекомендуемого для точной идентификации а надежной дифференциации- рота- к коронавирусов у КРС при смешанной форма инфекции. .-

Используеше для агяхлийкации коронавирусных кДНК рекомбинантнке фаги и плазщды является.-основой для получения продуктивной экспрессии генов коронавирусных протеинов в юютках E.coli.

Материалы диссертационной работы вошли в подготовленные "Методические рекомендации по идентифякаигк ротавирусов методом РНК-ДНК гибридизацин", одобренные Ученым, советом ЕМЗЗ от 07.12.90 и, экспертной комиссией по биотехнологии отделешя ветеринарной медицины ВАСХШй от 11.12.1990.- Методические рекомендации предназначены для ' использования. - в практике и научно-исследовательской работе. •

Апробация результатов исследований. Материала диссертационной работы получили положительнуи, оценку на научной конференции молодых ученых ВИЭВ "Цроблемы ветеринарной биотехнологии и инфекционной патологии еевотшх" . IS87 и 1988 гг., использованы в докладах на заседании Секции биахикии с.-х. животных Всесоюзного биохимического общества (IS88 г.),. на- заседании Ученого совета ВИЭЗ (1983 г.), на научно-методическом се/йшзре.по биотехнологии (1989 г.) и скшозаумэ, посвявднном вопросам иммунологической диагностики и внунопрофилактики вирусов животных (Грейфсвальд, Германия, 1989).

Публикации. Основные положения диссертации опубликованы в 3 научных работах.

Объем работа.. . материалы диссертации изложены на 160 страницах- машинописного-текста и состоят из следующих разделов: введения, . обзора^ литературы,- - результатов собственных исследований, обсуждения полученЕых результатов, внводов, списка литературы а приложения. Материалы диссертации иллвстрированы 13 рисункаш и 4 таблицами. Список цитируемой ' литературы содернит 30 работ отечественных и ISO иностранЕнх авторов.

II. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1. Материала и штоды исследозаннй

Рзбота выполнена в лаборатория молекулярной биологии и биохимии ВКЭВ е лаборатории биосинтеза нуклеиновых кислот 1MB АН СССГ. Зараженные штаммами FM I рота- и КЛ 2 коронавируса КРС перевиваемые культуры клеток почки теленка (Ш)ВК) и легкого смбриояов короЕЫ (ЛЭК), а также образцы укатай от больных животных с сигитомокоиплвксом диарея был предоставлен нам сотрудниками лаборатории эпизоотологии, диагностики и. профилактики зкелудочпо- кишечшх болезней КРС (ВИЗВ) Н.К.. Иатагиной и Н.Л. Соколовой.

Конц&нзрзрованке вирусного материала осуществляли методом тантэнцкальной йшьтрацЕИ с использование»,; системы Minitan Ultrafiltration ("Milipore", СЖ) и ультрацентри^гированием.

Для прозод52ия генно-пнгззэрных работ по конструированш) зондов использсбзли илазгазды pBR 322, pGEH4-z и фаговый вектор A. gt ю, а в качестве хозязв - бактериальные нтаммы нв 101, EH 50,, Ш 514 И КН 1061 E.coli. -.

При вцрагщвгнаи бактериальных культур использовали среду ьв, при высезе бактериофага - агаризовсннув срэду те и буфэр su. Идентифпкасет ренокбиназтных блякек . бактериофага осуществляли методом гибр^гдЕзсцки с радиоактивно-меченой норонавирусной РНК, река.1бига£^ГЕ1С ¿слоны пгявлаяг на чаагсах, с нгаризованной ьв, ссдзрдсЕОй по 7 tóM селективного гистогимическогс красителя s-gal ( 5-cpraío—1-хл0р0-3-ЗЕД0лш1-р-галакт0згд ) и индуктора . 1ао-промоторз хгте ( 7-ьзопро1ЫЛ-1-тпе-р-1>-галаятозцд ), а такке 75 мяг/мл ампшдапша.

Плазмидиуз ДНК выделя-ки методом щелочного лсиса ( Birnboin п.с. t Doly J.А., 1979 ). Электрофорез ДНК, извлечение ДНК из

легкоплавкой агарозы проводили по методика, изложенной в руководстве Haniatis 1*. et. al. (1984).

Выделение геногягай РНК рота- и коронавируса КРО осуществляли фенол-додецилсульфатным методом' при добавлении до 250 мкг/мл фермента протаиназн К ( "MercSc", Германия ).

Синтез хоронавирусЕОй кДНК осуществляли методом, разработанным Cubler U. & Hoffman B.J. (1383), о использованием набора " oDNA Synthesis Syst ere " ( "AraerEíiam", Великобритания ).

.Цитирование синтезированной кДЕЖ с линкерами и векторной ДИК проводили с использованием ДНК лигазы фага Т4. Упаковку in vitro, рассев рекомбинантных фагов и выделение фаговой ДНК осуществляли, согласно руководствам Т. Манкатиса и соав. ( 1984 ), а так&е Д. ГлоЕера ( 1988, 1989 ) и К. Дейвиса ( 1990 ).

Включение в ДНК радиоактивной метки проводили методом "ник-трансляции" (Rigby P.Y.J, st. al., 1977) и "рассеянной затравки" о исшлъзованизи наборов " Niok-Translatlon Kit " и " Multiprime DITA lahelins System" ("АтегвЬаш", Великобритания) к радиоактивных нуклеозидтрифосфатов £ct-32pjcCn?p ("Araarehacr"1 и F0 "Изотоп", Узбекистан).

Радио акткззоо мечевзе коронавирусной РНК проводили при помощи полинукшотдпкиназы фага Т4 ("Boehringsi-", Германия), с использованием [7-32p]ai? (F0 "Изотоп"),

Очистку мезеной ДНК и РНК от кевклхшжашхея радиоактивных нуклеотидов осуйбствпялг методом хроматографии с использованием биогеля Р-6 Ш ( "Bio-Rad", США ).

Рестрикцзпнный анализ реконбинантных ДНЕ фага к gt 10 к шшзмидных ДН2 проводили, используя рестрицирущие эндонуклеазы НПО "Фермент" (йгтва).

Электрофорез нуклеиновых кислот проводили с использованием электрофоретичеспого оборудования и .полишсрилаждЕнх гэлей фирмы "Pharmaoia", а также агэрозных гелей и буферов, ггрлготовлонЕых из реактивов фиря "Sigma" ( США ).

Перенос да к РНК на нейлоновую, мембрану НуЪошЫ? ("АтегяЪаш") осуществляли по методике, предложенной Southern Е. ( 1975 ), с использованием для переноса Юх SSG буфера.

Продгпбридазацив и гибридизацию иммобилизованных иа мекбрацэ ультрафиолетов®! облучением ДНК и . FHK. проводили в растворе, содержащем 5055 ^ормаажд, Gr ESC, 5z раствор Денхардта, 0.5g SDS и 100 мкг/мл Д9кат>рированЕой ДНК сперма лосося. После 16 час лнку-

бации при температуре 42°С мембрану отмывали or несвязавшейся меченой ДНК ИЛИ РНК в 2х SSC,0.2S6'SDS И 1x SSC.0.2S SDS по 30 мин при 65° С. Учет результатов гибридизации проводили при помощи авторадиографического метода с использование« рентгеновской пленки FM-B, "Kodak" ( США ) и усиливающего экрана.

2.2. Результаты исследования

2.2.1. Отработка метода молекулярной гибридизации

На первоначальном этапе исследований для отработки метода ДНК-РНК гибридизации мы использовали геномные РНК некоторых штаммов ротавируса крупного рогатого скота, выделенных в различных регионах страны, а такие рекомбшввтвдю ротанируснул плазшду pBRY-Об., любезно предоставленную нагл J.Cohen (IH3A, Франция). Эта плазмида состояла из вектора pBR 322 и интегриро-бэнной в его подклинкер кДНК- последоввтельвоств 6-го сегмента генома ротавируса КРС, кодирующего осноенсЗ протегн т? 6 вириона.

Качество выделения и счистки ротаяяруеннх НЕС определяли, провода злентрофоретипировачке препаратов .РНК методом диск-электрофореза в 10-15% градиентных' Еолиакрила^дных гелях на электрофоротической системе PhastSystem фираа "Pharmacia" (Швеция); этим Ее методом проверял! результаты разрабатываемого РНК-ДКК дот- гибрЕдизащгонного анализа фекальных образцов. Электрофоретип.. т.е. распределение 11 фрагмзнтов генома после электрофореза в лолиакрйлашдко;,; ■ геле, явлнет-ся характерным признаком для каздого штамма, ротавируса. Изменение электрофоре тической подвииности - фрагаэктов. обычно связано со значительным^ перестройками их нуклестлдных посгадовательностей, Бкпсчекщи.я потерю или ss перекос части генетического материала еэ другие фрагменты рставирусного генома. Несмотря на разлитая в профилях ляграцЕИ отдельных сегментов генома, все исследованные РНК принадлежали к идлптнокуп. электрофоре типу, что установлено путем сравнения с рефэронтш."л штаммом 84 11 ротавируса обезьян, обладающего "длинным" электрофореталом вследстзие значительной мобильности 10- и 11-го сегментов генома. ••

Для отработки метода дот-габридазационного внализа с очищенными РКК различных штаммов ротавируса КРС применяли разные типк иитроцзллюлозннх v. нейлоновых мембран, использовали различные метода нанесения и иммобилизации . ("пришивания")

образцов РНК на мембранные фильтры. Кроме того, осуществляли подбор компонентов гибридиз ацианной среда и температуры протекания ДНЕ-ЭДС гибрцдизационной реакции; при отмывке мембран использовали отмывочные смеси, варьирующие по составу и процентному соотношению ингредиентов. В зависимости от природа и способа меченая гибридизационного зонда- ("нйк"-трансляция -"Мий'Иргате") подбирали оптимальные количества вводимых в реакцию гибридизации зондов с учетом их удельной радиоактивности. Помимо этого исследовали влияние декстрансульфата, а также изначального объема гибрвдизационной смеси и продолжительности самой гибридизации.

Пример дот-гибрвдизационного анализа 18 образцов РНК при помощи кДНК- ротавирусного зонда представлен Еа рис. I. •Изолированную от плазмидной части конструкции рВНУ.об. 1.0 т.н.п. кДНК- последовательность 6-го сегмента генома ротавируса КРС метили "ник"-трансляцией и использовали в качестве зонда в реакции гибридизации с РНК, выделенными из фекальных образцов от телят с выраженной клинической картиной острой диареи. Этим методом было исследовано 30 образцов: образцы № 1-11 (1-ая группа) и М 12-18 (2-ая группа) были получены из Наро-Фоминского и Загорского районов Московской области, а образцы 19-30 (3-я группа) с Северного Кавказа (Чечено-Ингушетия). Как следует из рис. I, при чувствительности анализа, составляющей 25 пкг геномной ротазирусной ШК, в 14 из 18 образцов 1-ой и 2-ой групп нами было обнаружено присутствие ротавируса КРС.

Получены результата дот-гибридизационного анализа РНК 12 образцов 3-й группы. При помощи специфического зонда ротавирусную РНК выявляли в 5 образцах: чувствительность метода достигала 5 пкг геномной ротавирусной РНК. Всего специфическим ротавирусным зондом присутствие геномной РНК ротавируса КРС в образцах фекалий было обнарухсвво нами в 19 из 30 исследованных случаев возникновения диареи у телят.

Полученные дот- гиОридизационным анализом данные проверяли параллельными электрофоретическими исследованиями материала образцов и двумя методами серологического анализа.

Как следует из табл. I, во всех без исключения случаях результаты независимых дот- гибридизационных и электро-форетических исследований не противоречили друг другу; совпадение же полученных нами данных с результатами серологического

4 S 6 ? 8 9 iö U

Я ß С S) E F

tir

H

I

9

9

е

I ' л 1 О

! о 9

ш

ш

Рис. I. Дот-гибридизационный анализ выделенных из фекалий телят образцов РНК при помощи ротавирусного зонда

На рисунке представлены результаты гибридизации образцов 1-ой (№1-11) и 2-ой (&'£ 12-18) групп. Указанные образцы, а т контроли наносили на мембрану согласно слэдуго.ей схеме:

РНК •акке

Линия А: В: С: D: Е:

1-11. 1-11. 1-11. 1-11. 1-4.

6-9-

10-11.

F:

РНК образцов BS I-II в порядке возрастания номера Ю^Д разведения РНК этих образцов 10 ~ разведзния „ -10 разведения -¡: „ -последовательные десятшшвтные разведения гепомнсй РИС ротавируса КРС от 2b нг до 25 пкг, используемые в качестве внутреннего стандарта

- „ - ДНК и РНК глоточной культуры МБВК, на которой пассировали ротавирус КРС РНК ротавируса КРС, денатурированная кипячением, в течение .2 ;яш . -

РКС образцов ЯЯ 12-18 в порядке возрастания ^номера гапаратн тотавирусной РНК штампа РМ I КРС 10" разведения РНК, указанных для позиций Р. 1-9

1-7.

S-9. псепараты Ъотавирусной РНК штата

Q. ТГ|1 попса тгатттхо РШГ ХГГГДРПТГТПГГ

10-111 Н: 1-9-I: 1-910-11.

РНК ротавируса КРС, денатурированная О.Iii наон IU"? разведения РНК, указанных для позиций Р. 1-9 Ю-3

РНК ротавируса КРС, денатурированная при в течение 2 мин

80 С

Чувствительность метода составляет ротавируса КРС.

25 пкг геномной РНК

S

анализа наблвдалось в 13 случаях, составляя 812 для реакции диффузионной преципитации (РДП) и 6IS для иммуноферментного анализа (КФА). Несовпадения с результатами гибридизационного и электрофоре тического анализа отмечались в , РДП для образцов J» 2 и II, а такяэ в ИФА для образцов ЯЯ 12 , 20, 22 и 28: несмотря на присутствие геномной РНК, белковые компоненты ротавирусной частицы здесь не были обнаружены. Однако, точно так ке, положительные титры антигена, установленные в ИФА для образцов JfeS 23, 26 и 27, не подтвервдались результатами дот-гибридизационнпго и электрофоре тического анализа.

Таблица I.

Результаты исследования образцов на присутствие ротавнруса КРС дот- гибридизационнкм, электро-фореяческим и серологическим анализом ■

S& иссл. образцов Выявляемое дот-гибридаацией максимальное разведение РНК Регистрация РНК электрофорети-ческим методом Результаты РДП Титр в ИФА

I 10"? + . + не иссл.

2 IíTÍ + .- - !»

3 10Г3 + + N

4 — - - 1,

5 - - - W

6 7 I0"3 + + И f,

8 . ~' о — — П

9 101 + + W

10 Hfí + + И

II . IO"p + - It

12 10 Í +■ не иссл. —

13 va-i + - .. « . 1:8

14 nfi? + 1:32

15 io"á V- - .- • « - 1:4

16 io"á + ,, и 1:8

17 I0"o . .4 : - ' •• »т 1:16

18 Ю-"3 + * • г» 1:8

19 ~ о - ft -

20 io i + я -

21 10 i + « 1:32

22 4- ••А. . —

23 - - , ft 1:16

24 ■ - - -х< ■ п —

25 - - п -

26 - - п 1:32

27 ~ O - tt 1:8

28 10 í + W -

29 10" + - п 1:128

30 - - —

2.2.2. Разработка коронавирусного гибридизационного зонда Синтез коронавирусной кДНК осуществляли на линейной матрице РНК штамма КЛ 2 коронавируса KPG с использованием набора cENA Synthesis Kit ("Amersham", Великобритания) (рис. 2). Первую цепь кДНК синтезировали при помощи обратной . транскриптазн и олиго(<Ш)12_18- праймера , комплементарного ' поли (А)-области геномной РНК. Затем матричную цепь РНК полученного РНК-ДНК комплекса гидролизовали при помощи фермента РНК-азы Н, вторую цепь кДНК достраивали сразу двумя ферментами: .ДНК-полимеразой из E.coli и фага Т^ (Gubler U. & Hofiman B.J., 1983). •

По завершению синтеза кДНК- продукт использовали в реакции лигирования с короткой специфической последовательностью EooR I - Sma I адаптера, представляпцего собой специально синтезированный сайт рестрикции для эндоцуклеазы EooR I. j

BCY т

JUt

s'

3'

Ri&mt

^лляяяля

qrrrr

i'

РНЬпяН Ё&С

3'

ZffAnojifjte^nt

J

8CV E

cSM

Рис.2. Схема синтеза комплементарной ДНК ксроЕавируса крупного рогатого скота

Схема клонирования фрагментов кДНК коронавируса КРС приведена на рис. 3. Двухцепочечные молекулы кДНК с пришитыми по тупым концам адаптерами использовали для лигирования при помощи ДНК-лигазы фага Т^ с эквимолярными соотношениями левого и правого плеча ДНК фага X gt Ю; после этого рекомбинантные ДНК упаковывали в фаговую частицу. Упаковочный экстракт непосредственно использовали для амплификации библиотеки, высевая на чашки с агаризованной тга- средой и клетками E.ooli. С покрытого лизисными бляшками газона клеток снимали отпечатки-реплики на нитроцеллюлозные мембраны и проводили гибридизацию с радиоактивно-меченой РНК коронавируса крупного рогатого скота.

Из гибридизупцихся фаговых бляшек выделяли рекомбинантные фаговые ДНК, расщепляли их эндонуклеазой EooR I, разгоняли в агарозном геле, осуществляли перекос денатурированных фрагментов на нейлоновую мембрану Hybond N по методу Саузерна и гибридазовали с радиоактивно-меченой геномной РНК коронавируса крупного рогатого скота.

Из рекомбинантных фаговых ДНК, обнаруживших хорошую гибридизацию с коронавирусной РНК, изолировали кДНК-последовательности размером 1.о - 3.5 т.н.п. и использовали для переклонирования в эксцрессируадий плазмидный вектор pGSM4-z. Было отобрано 53 клона рекомбинантного фенотипа, формировавших на селективной среде с хромогбнннм красителем x-gal и индуктором лактозного оперона IPTG колонии, белого цвета. Рекомбшантный клон, выщеплящий из вектора pGEi4-z фрагмент протяженностью 2.7 т.ц.п., был выбран нами для амплификации лоронавирусной нДНК и ее испытания в качестве молекулярного гибридизационного зонда.

Специфичность коронавирусного зонда проверяли путем его гибридизации с нанесенными на мембрану геномными ДНК и РНК, выделенными из различных источников. Отмечалась гибридизация с содержащим коронавирус КРС культуральшм матери алом и рекоыбипан-тной коронавирусной плазмидой pBGV-2. В то se время не отмечалось гибридизации зонда с ДНК E.ooli, вектором клонирования pGE»4-z, а также нанесенными на мембрану в качестве отрицательных контролей геномными РНК ротавируса и РНК вируса диареи крупного рогатого скота.

Болнорвзмерным, включающим 2.7 т.н.п., коронавирусным зондом были исследованы образцы РНК, выделенные от животных 1-ой и 3-й групп (Рис. 4). Специфический зонд гибридизовался с 16 образцами

$ +

\\mmvn»

Я0Й1

Рис. 3. Схема клонирование кДНК коронавируса КРС в фаговых и плаз:лидшх векторах.

А

ß С а в

F

i 1 3 к б ч в 9 d O ii & & 4b £

в» « i. © 'А' -

0 ф

Ф

ЩФ

w—« 1 •а

Рис. 4. Дот-гибридизационный анализ выделенных из фекалий телят образцов РНК при помощи молекулярного коронавирусного зонда

Представлены результаты гибридизации образцоз РНК 1.-ой и 3-й . группу, (tös I-II и Ш 19-30).. с. ?..7 т.н.п. кДКК-.хоронашрусннм следующей последовательности:-

Линия А: 1--I2. денатурированные напзевзнием РНК .образцов 19-30 в порядке возрастания номеров •.»! 13-16. последовательные десятикратше разведения от 5 нг до 5 пкг 1.05 т.н.п.. фрагмента..зонда \>. В: 1-12. пэденатурироЕанныз РНК образцов 19-30 , 13-16. последоЕзтельные десятикратные разведения геномной РНК коронавируса КРС от 5.нг до 5'наг -■ с: 1-11. декатуриров<^таи нагреванием РНК образцов Ш J-II в порядке возрастания номеров / 13-16. последовательные • десятикратные разведения ■ геномной

D: 1-12.

13-16. последовательные -десяаТ'ХфатЕыеразведения гзно5шой РНК ротавируса КРС от 5 5' до U пкг Е: 1-?. различные препараты куль тур:*льзого.. коронавируса КРС

8. препарат ДНК ■ и РНК клеточной культуры ЛОК, па которой пассирозали ксронанирус КРС •

9. геномная РНК вируса диареи телят • 10-11. культуральный корокавирус КЛ 2 КРС

12. геномная РНК вируса парагриппа КРС 13-16. последовательные десятикратные разведения I.05 т.н.п Фрагмента зонда от Б нг до 5 пкг Р: 1-7- РпК различных препаратов культурзльного коронавируса КРС 8-12. препараты, указанные для позиций Е. 8-12 13-16. последовательные десятикратные разведения геномной

РНК коронавируса KFC от 5 нг до 5 пкг Чувствительность метода превышает 5 пкг геномной РНК корон; вируса КРС.

РНК из фекалий, геномной коронавирусной РНК и вирусосодержащпм культуральным материалом. При чувствительности реакции, превышающей 5 пкг геномной коронавирусной РНК, отсутствовала гибридизация с 7 выделенными образцами РНК, а такие всеми используемыми в реакции отрицательными коптролями: нуклеиновыми кислотами культуры клеток шзвк, на которых пассировали корснавнрус; РНК ротаЕируса КРС, РНК парагриппа КРС и РНК вируса диарея КРС.

Результата гибридязацконногс скрининга РНК при помощи 2.7 т.н.п. коронавируспсго зонда, а таяаэ результаты злектрофоре-тического и серологического исследования образцов приведены в табл. 2. Одновременно двумя методами - гибридизационннм и электрофоретическим - коронавирусный гастроэнтерит диагностировался у 14 животных,' за исключением двух случаев (образцы Ш I и 7) данные анализов по.яностьзо подтверждаю? друг друга.

Мояно предположить, что в образце .4 I произошел глубокий гидролиз ¿гаронавируспой РНК на мелкие фрагменты различной длины, гиОриднзугщиеся с зондом, но ез мягрирувдае в г-еле единой полосой. В случае образца по-зндзкону, произошла деградация одноеитэвой коронавирусной- РНК.'., при нанесения на мембрану вследствие РНК-езеого загрязнения. .

Исследованные дот- гибридизацией и электрофоретячески образцы фбкалай параллельно анализировались двумя серологическими методами. В 14 случаях результата серологического анализа подтверждали дет- гиОрэдязгциояннэ исследования: совпадение с рэзудьтзтгш роекцзи тормсяэшм гематглэтинацшг (РТГА) составляло д5% , с результатами хкауноферкентного анализа (ИФА) - 75%. Раахоздзнил результатов гибрядизацнонаого анализа с данными РТГА наблюдали в пяти случаях, которые касались образцов £15 1,3,6,7 и 10. По техническим щдкянам образца. РНК 2-ой группы не были исследоваш дот- гхбрлдззацией, .. что в определенной степени затрудняло сравнение этого метода с РТГА- анализом. Тем не менее, согласующиеся данные дот- гибридизации -и электрофореза не подтверждали результатов обнаружения коронавирусного антигена методом РТГА в трех образцах (ХЛ 3, 6 и 10 ) и методом ИФА в образце й 25, а такюэ отсутствие коронавирусного антигена, установленное гаймуЕофергкЕткм анализом в образцах й.1 21, 23 и 27.

Таблица 2.

Результаты исследования образцов на присутствие коронавируса КРС дот- гибридизационным, электро-форетическим и серологическим анализом

да Экстраполируемое Регистрация РНК

иссл. максимальное раз Тигр в Титр в ИФА

образ- ведение РНК) вы- электрофорети- РГГА

цов являемое зондом ческим методом

I м 8 10 и. _ _ не иссл.

2 + 1:4 ; п

3 1:8 N

4 ю * ю и + 1:32 И

5 + 1:4

6 - - 1:4 «

7 10 Э • 10"* + 1:16 п

8 9 + + 1:4 1:4 N П

10 — п - 1:4 «

II 10 и + 1:255 м

12 н9 иссл. + 1:256 г:

13 « + . 1:4096 и

14 « + 1:4095

15 „ + 1:4096 п

16 * + 1:4036 к

17 п + 1:4036 - 1»

18 " п ю У + 1:4036

19 + не иссл. 1:4095

20 ю й 10 2 ю У + и 1:4095

21 +. « -

22 + 1* 1:4036

23 10"? + к -

24 Ю"1 + 1Т 1:512

25 - - и 1:128

26 - ?т -

27 + п —

28 10 ^ + и 1:4096

29 ~ о - и _

30 + [Т 1:4095

Возможность независимого обнаружения з дифференциации возбудителей в одних и тех же образцах фэкалнй при смешенной форме рота- и коропавирусной кафекции КРС бидп подтверждена нами с использованием разработанных рота- и корзнавирусных кДНК-зондоз. Об атом свидетельствует анашз результатов дот-гибрадЕзеционных исследований, приведенных в табл.. I н 2. йз имевшихся з нашем распоряжении 30 выделенных образцов РНК при исследовании 8 образцов ( йй 4-6 , 8, 19, 24 , 25 и 30 ) рота-вирусный возбудитель ев обнаруживался ни одним из применяемых

методов. Тем не менее, последующими исследованиями с использованием разработанного коронавирусного зонда было установлено, что в шести из этязс случаев ( образцы № 4,5,8,19,24 и 30 ) острая диарея была обусловлена присутствием в кишечнике телят коронавирусов. В остальных двух случаях диарея могла быть вызвана каким-либо другим инфекционным агентом вирусной или бактериальной природы.

Таким образом, полученные данные по дот- гибридизационному и электрофоретичбскому анализу, представленные в таблицах I и 2, убедительно свидетельствуют о возможности . диагностирования одновременного . течения рота- и коронавирусной инфекции у 7 животных 1-ой и 3-й группы ( J6S 2, 9, II, 20-22 и 23 ). Во 2-оЯ группе присутствие ротззируса определяется указанными методами у всех животных ( J6S 12-18 ). В то же время отсутствие результатов дот- гибридязеционного исследования этих образцов коронаЕирусным зондом позволяет говорить о наличии . коронавирусного гастроэнтерита у животных 2-ой группы лишь на основании денных серолсгичзского анализа.

3 результате проведенных исследований были отработаны условия ДКК-ЕНК дот- гибрлдизациошюго анализа для обнаружения рота- и короязвирусных РНК при помощи .кЩН- зондов и" был сконструирован кДЕН- гибридизвцяоеннй зонд для идентификации Koponasspyca у КРС. Заключительным этапом исследования молекулярного коронавирусного зонда явилось зндонуклевзнсе картирование его нуклеотидной последовательности. Полученные в процессе выполнения ряда блот- гибридизаций радиоавтографы позволили нам достоверно распознать выщепляемые рестриктазами фрагменты корсназпруской кЛНХС и предложить рестрикционнув карту клонированной кДНК- последовательности, гибридазационного зонда:

EcoR I Xba I н1лй III t»sS2h-1-1-:-

¿j ' 450 600 1650 bp

полилишсэр

где X - сайт узнавания для эндонуклеазы Xba I;

Н - соотЕЭтстЕенно для эндонуклеазы Hind III в полилинкера плазмидного вектора pGHi4-Z.

SooR I

— I

§

€ 41

'¿I

*г

■г!

£ • &

гт-

со

Ст.

Г

у

I

Рисунок 5. Локализация клонированной области

на генетической кврте коронавзруса КРС.

Как видно из рис. 5, клонированный наш кДНК- фрагмент З^-концевой часта генома коронавируса - КРС, протяженностью 2.7 т.н.п., охватывает область двух важнейгага в функциональном отношении генов: и- нуклескалсидного и к- мембранного коронавирусного протеинов, а такие третьего гена, кодирующего неструктурный вирусный протеин с молекулярной массой 2-5 нД.

В Ы 3 О Д Ы:

1. Проведено электрофоре титрование' геномных FHK 8 кулътуралънкх штаммов, а такте 19 изолятов ротавируса крупного рогатого скота, выделенных от больных талят з различных регионах. Все изученные ротазируенке РНК характеризуются "длинным" электрофоретипом.

2. С использованием рззработанного для обнаружения ротавируса КРО кДНЕ- зонда отработаны простые методы подготовки исследуемого материала и оптимальные рэжиын проведения ДКК-РНК дот- гибридкза-щюееого анализа о целью идентификации инфекционного агента в яриеутстзяя зкоогоеекх Оак-гэриагьшх и взфусных ДНК л РНК.

3. Осуществлен молекулярный сантез комплементарных коронавирусных ДНК; получена нДНК- библиотека геноЕ ксронавируса крупного рогатого скота в фзгз. Я gt ю, а также клонэтека, включающая 53 pSKO?.«OKISH7EHX КЛОН5 2.coli с 1.С-3-5 т.н.п. кДНК- ВСТЕВКаМИ, пгфоярывгзщэлт взрусу.ого генс;-.:а.

4. ;1з яж/чзтэЪ клозотаки гэдолен клон, содержащий роксмбкаант-Е;,то пяазщду рс-вд-г Ы, на основе которой разработан гябрвдпза-цкокнай зонд для идвзтЕфвквщи коронавируса КРО.

5. Кетсдсм рестрикцксртюго анализа охарактеризована плазкида pQSi4-3 in, содаргндая 2.7 т.н.л. кдаа- гссроновярусзый фраггсэнт, вют-кааярш полшэ зуклеотцдрке последовательности мембранного н- гетмопротеизч л зуяаеокапеядаого к- фосфопротгиза коронанотуса КТО. Показана возможность использования клонированного фрагмента, ?. ткске отдельных его последовйтздкшстзй в качество глбрядзсеи?.-снног-о возда, используемого дкя ;ст£К5фасзд2Я :срзнгЕзрусз КРС.

6. Показана пришцщ&альная вожлозхность диагностики рота- п корокасирусно£ ¡^пгфэядял у КРС методе;« дот- гибридизации с использозсзге:,! разработанных рота- -и ксрснавируснпх зондов. При исслэдсвазя 30 образцов фехаяий кз 3 хозяйств установлено

присутствие ротавируса у 19, а коронавируса - у 16 телят. Смешанная рота- и коронавирусная инфекция выявлена у 7 из 30 обследованных кивотных.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. Предложен экспресс- метод электоофоретширования ротавирус-но2 РНК в микропластшах голкакриламидного геля.

2. Получена плазмида рОНМ-г ы, используемая в качестве источника молекулярного зонда, разработанного для. идентификации коронавируса крупного рогатого скота. Сконструированная плазглгдз рОШ4-!> Ь1 представляет основу для разработки системы шшлвфвкацвв вектор - хозяин, необходимей для синтеза к- к к-коронавирусных антигенов. ■

3. • Высокоспецифкческий и чувствительный метод идезтидакацш рота- к коронавирусов с помощью разработсяннх кДЖ- гибрадизаце-онных зоэдов моют быть рекомендован для пргккх^аского использования при диагностике рота- и коронавлрусной инфекции у крупного рогатого скота.

Список работ, опубликованных по теые дкссертацзи.

1. Grasuk, Y.H., 5okolova: li.L. Identifizierung der Rota- und Coronaviren de3 Rindss mit Hilfe dar ШЗ-HIC—Hybridisation 3 Rilmser Symposium и Immunologische Diagnostik untt Inanmoprophylaze animal er Yirosen "( Identification oX bovine Rota- and Coronaviruces with the help of DNA.-EKA- Hybridisation ) // Arbeitskreis " Imounolcgie und lamunoprophylaxe ". DDP., Greifswald, 1989. Seite 23-25.

2. G.F. Koromyelov, S.K. Artyushin, A.D. Zaberezbny, ar»d Y.N. C-i-a3h.uk. Development of Hybridisation Probes on the Dasis of Reocnbinant DMA to Identify Porcine Parvoviruses and Rotaviruses. // Arch, csper. Yet. med., Leipzig 44 ( 1990 ).

3- Канатов Б., Гоголев U.M., Артниш O.K., Гращук B.H. Электрофора типы ротавирусов телят // Депонирован в ВИНИТИ. !«., 1933.-й4 (222 )-- С. 144.