Использование ПЦР и секвенирования для выявления и анализа генома коронавируса крупного рогатого скота

Кудрявцев, Владислав Александрович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Использование ПЦР и секвенирования для выявления и анализа генома коронавируса крупного рогатого скота
ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Использование ПЦР и секвенирования для выявления и анализа генома коронавируса крупного рогатого скота"

На правах рукописи

КУДРЯВЦЕВ Владислав Александрович

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ПЦР И СЕКВЕНИРОВАНИЯ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ И АНАЛИЗА ГЕНОМА КОРОНАВИРУСА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА

03.00.06 "Вирусология"

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Владимир — 2004

Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении "Федеральный центр охраны здоровья животных"

Научный руководитель: кандидат биологических наук, старший научный сотрудник, АЯНОТ Павел Константинович

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

старший научный сотрудник ГЛОБЕНКО Людмила Алексеевна (ФГУ "Федеральный центр охраны здоровья животных");

доктор биологических наук, профессор ЦЫБАНОВ (Годном Жамьянович (ГНУ ВНИИВВИМ, г. Покров);

Ведущая организация: ФГУ "Всероссийский государственный Центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов" (ФГУ -ВГНКИ", г. Москва).

Зашита диссертации состоится октября 2004 г. а/р часов на заседании диссертационного совета Д 220.015.01 при ФГУ "Федеральный центр охраны здоровья животных" по адресу: 600901, г. Владимир, пос. Юрьевец.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУ "Федеральный центр охраны здоровья животных".

Авторефератразослан "лк' августа 2004 г.

Ученый секретарь д и с с е р т гсовета ■ М . Семенова

канд. биол. наук, с.н.с.

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Инфекционные болезни желудочно-кишечного тракта молодняка КРС представляют собой одну из важнейших проблем современного животноводства. Многочисленными исследованиями было установлено, что одним из основных факторов в этиологии диареи телят является коронавирус КРС (KB КРС), который относят к роду Coronavirus семейства Coronaviridae. Вирус поражает преимущественно органы пищеварительного тракта животных, вызывая острые энтериты, однако он также может являться причиной воспаления верхних дыхательных путей и пневмонии. Заболевание наносит серьезный ущерб сельскому хозяйству во всем мире ввиду высокой контагиозности, высокого процента гибели и выбраковки телят (до 40-50% и более) и продолжительного, до нескольких месяцев, снижения молочной продуктивности у коров. Наиболее широко и остро болезнь протекает в стойловый период, особенно при массовых отелах.

KB КРС способен персистировать в стадах на протяжении нескольких лет без видимых клинических проявлений, периодически вызывая вспышки заболевания. В период бессимптомного персистирования вируса для его выявления требуются высокочувствительные методы. Низкая устойчивость вирионов к внешним воздействиям также осложняет выявление патогена, поэтому традиционные методы выявления KB КРС (электронная микроскопия, иммунофлуоресцентный анализ, реакция гемагглютинации) не всегда способны установить присутствие вируса. Кроме того, проведение тестов, основанных на гемагглютинации. затруднено тем. что образцы фекалий, используемые для диагностики этого заболевания, содержат неспецифические гемагглютинирующие агенты. Выявление в сыворотке крови животных вирусспеиифических антител не всегда позволяет судить о наличии возбудителя, т.к. у телят их присутствие может быть обусловлено колостральным иммунитетом, а у взрослых животных вакцинацией или заболеванием, прошедшим в более раннем возрасте.

Применение методов молекулярной биологии, таких как ГТЦР и секвенирование открывает широкие возможности для выявления и изучения инфекционных агентов. От традиционных методов диагностики ПЦР отличает высокая аналитическая чувствительность и специфичность, что позволяют установить присутствие вируса в исследуемой пробе даже по фрагменту генома. Секвенирование амплифицированного в ПЦР участка вирусного генома и

последующий анализ полученных данных подтверждает специфичность реакции и позволяет идентифицировать и дифференцировать штаммы и изоляты вируса. Поскольку проводимые ранее диагностические исследования показали широкое распространение KB KPC на территории РФ, разработка методики выявления и штаммовой дифференциации вируса на основе ПЦР и нуклеотидного секвенирования с последующим анализом амплифицированных нуклеотидных последовательностей генома изолятов, выявленных на территории Российской Федерации, которая прежде не изучалась, имеет как научное, так и практическое значение.

Цель и задачи исследований. Основной целью данных исследований являлась разработка методов выявления и штаммовой дифференциации коронавируса ^^ a также анализ первичной структуры изолятов, выявленных на территории РФ и штаммов, изученных ранее.

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

- разработать методы выявления и штаммовой дифференциации коронавируса КРС

из различных биоматериалов на основе ПЦР и секвенирования вариабельных областей генома;

- на примере референтных штаммов коронавируса КРС определить оптимальные условия проведения ПЦР и секвенирования;

- изучить возможность применения разработанных методов для выявления коронавируса КРС в патматериалах от телят и взрослых животных;

- установить первичную структуру амплифицированных. фрагментов генома штаммов и полевых изолятов коронавируса КРС, создать банк данных нуклеотидных последовательностей;

- провести сравнительный анализ первичной структуры штаммов и полевых изолятов коронавируса КРС.

Научная новизна исследований. Впервые разработаны методы выявления и штаммовой дифференциации коронавируса КРС на основе ПЦР и нуклеотидного секвенирования амплифицированных фрагментов генома вариабельных областей гемагтлютинин-эстеразного (НЕ) и спайкового генов. Определены оптимальные условия проведения ПЦР и секвенирования. Показана возможность применения разработанных методов для выявления коронавируса КРС в образцах патматериала от телят и взрослых животных.

Впервые определена первичная структура вариабельных фрагментов НЕ и S генов изолятов коронавируса КРС, выявленных на территории РФ. Проведен

сравнительный анализ первичной структуры исследованых фрагментов генома штаммов и полевых изолятов коронавируса КРС. Нуклеотидные последовательности вариабельной области гемагглютинин-эстеразного гена тринадцати выявленных изолятов депонированы в GenBank (AY184411-AY184423).

Практическая значимость исследований. Разработаны, одобрены ученым советом и утверждены директором института: в 1999г. - "Методика выявления и штаммовой дифференциации коронавируса крупного рогатого скота с помощью ПЦР и секвенирования фрагмента НЕ гена" и в 2003г- "Методика выявления и штаммовой дифференциации коронавируса крупного рогатого скота с помощью ПЦР и секвенирования вариабельной области S гена". Установлена первичная структура вариабельной области гемагглютинин-эстеразного гена 3 штаммов коронавируса крупного рогатого скота из коллекции музея ВНИИЗЖ и 17 полевых изолятов. выявленных на территории РФ. Определена первичная структура вариабельной области спайкового гена 2 штаммов коронавируса крупного рогатого скота из коллекции музея ВНИИЗЖ и 8 полевых изолятов, выявленных на территории РФ. Данные методы применяются для выявления и штаммовой дифференциации ^ КРС в образцах различных биоматериалов как от живых, так и от павших животных. Результаты исследований учитываются при постановке диагноза.

Основные положения выносимые на защиту:

- метод выявления и штаммовой дифференциации коронавируса крупного рогатого скота, основанный на амплификации вариабельной области гематглютинин-эстеразного гена и сравнительном анализе первичной структуры амплифицированного фрагмента;

- метод выявления и штаммовой дифференциации коронавируса крупного рогатого скота, основанный на амплификации фрагмента S1B области спайкового гена и сравнительном анализе первичной структуры амплифицированного фрагмента:

- оптимизация условий проведения ПЦР и секвенирования при выявлении и штаммовой дифференциации коронавируса КРС;

- первичная структура исследуемых областей гемагглютинин-эстеразного и спайкового генов, ранее изученных и выявленных на территории РФ штаммов и полевых изолятов коронавируса крупного рогатого скота;

- сравнительный анализ первичной структуры изученных штаммов и изолятов коронавируса крупного рогатого скота.

Апробация работы. Основные материалы диссертации были доложены на конференции молодых ученых "Актуальные проблемы патологии свиней. крупного и мелкого рогатого скота" ВНИИЗЖ, г. Владимир (2002 г.), Международной научно-практической конференции "Актуальные проблемы болезней молодняка" г. Воронеж (2002 г.) и на 4-й Всероссийской научно-практической конференции "Генодиагностика инфекционных заболеваний" г. Москва (2002 г.).

Публикация результатов исследований. Результаты исследований изложены в 6 печатных работах.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 103 страницах и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, результаты собственных исследований и их обсуждение, заключение, выводы и приложения. Список литературы включает 142 источника. Работа иллюстрирована 16 рисунками и 10 таблицами.

Автор выражает искреннюю благодарность к.б.н. Г.Н. Дороненковой. к.б.н. С.А. Чупину, вед. биологу А.Е. Вечерову, вед. биологу М.И. Шульпину и вех. вр. А.М. Тиминой за помощь при выполнении отдельных этапов работы.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Материалы

Штаммы вируса, штамм Nebraska выделен в США в 1971 году из проб фекалий телят больных диареей [70], получен из Американской коллекции культур (American Type Culture Collection, ATCC).

штамм ВТ 42/82, полученный из коллекции Института экспериментальной и клинической ветеринарной медицины УААН, г. Харьков.

штамм ВНИИЗЖ, выделенный в 1998 г. из проб фекалий теленка с кишечной клиникой и используемый для изготовления инактивированных вакцинных препаратов.

Методы

Выделение суммарной РНК. Выделение РНК с некоторыми модификациями осуществляли по методу разработанному во ВНИИЗЖ (Грибанов О. с соавт. 1996). Синтез и амтификаиия кДНК. Реакцию обратной транскрипции осуществляли с использованием РНК-зависимой ДНК-полнмеразы (Temin H. and Baltimor D.. 1970). а амплификацию с помощью ДНК-зависимой ДНК-полимеразы (Mullis К.. 1983).

Секвенирование кДНК. Амплифицированные нуклеотидные последовательности определяли методом прямого секвенирования (Sanger F. et al., 1977). Анализ данных. Расчет праймеров и анализ нуклеотидных последовательностей штаммов и изолятов KB KPC, полученных из компьютерной базы данных GenBank, а также анализ нуклеотидных последовательностей, установленных в собственных исследованиях изолятов KB KPC осуществляли с помощью компьютерных программ OLIGO, version 3.3-251 (RychlikW., 1988-1990), SQ-MAX, версия 1.01В (Зинковский Ю., 1995), ALIGN, version 1.01 (Scientific and Educational Software, 1989), SEQPROGS (Knowles N.J., 19911992).

3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Разработка и применение метода выявления и штаммовой дифференциации коронавируса крупного рогатого скота с помощью ПЦР и секвенирования фрагмента НЕ гена

Исследование профиля вариабельности НЕ гена. Чтобы выявить вариабельный фрагмент генома, подходящий для дифференциации штаммов и изолятов вируса с использованием программы SQ-MAX был составлен профиль вариабельности НЕ гена KB KPC. Для этого было выполнено выравнивание имеющихся в GenBank на 1997 г. нуклеотидных последовательностей НЕ гена 8 штаммов KB KPC, выявленных в Америке, Канаде и Франции. Эти штаммы имели существенные различия во времени и географическом месте их выявления и, таким образом, соответствовали предъявляемым требованиям.

При сравнении 8 последовательностей общее количество позиций, По которым выявлены нуклеотидные замены, относительно не велико - уровень вариабельности НЕ гена, в основном, не превышает 5%. При этом фрагмент гена с 930 по 1160 нуклеотид, фланкированный консервативными участками, отличается генетической изменчивостью, превышающей 13%, и может быть использован для штаммовой дифференциации вируса, поэтому этот участок генома был выбран для исследования (рис. 1).

Данный фрагмент гена кодирует два потенциальных сайта N-гликозидной связи и почти полную последовательность второго потенциального полипептида НЕ гена. Кодируемая часть белка располагается рядом с карбокситерминальной последовательностью, формирующей гидрофобную а-спираль. Анализируемая область гена демонстрирует наиболее высокую генетическую изменчивость и фланкирована высоко консервативными участками.

Рис. 1. Профиль вариабельности НЕ гена. Получен последовательным сравнением фрагментов длиной 350 п., с шагом 1 нуклеотид. Штриховкой выделена анализируемая область НЕ гена. По оси абсцисс - номера нуклеотидов, по оси ординат — вариабельности (%).

Выбор праймеров, условий постановки ПЦР и секвенирования. Выбор праймеров для амплификации и секвенирования анализируемого фрагмента НЕ гена проводили с помощью программы Oligo, версия 3.3. Присутствие в НЕ гене большого количества адениловых и уридиловых нуклеотидов обуславливало низкую температуру отжига рассчитываемых олигонуклеотидов, что впоследствии могло негативно сказаться на специфичности реакции. Увеличение длины олигонуклеотидов с целью повышения температуры их отжига, сопровождалось резким повышением свободной энергии самокомплементарных структур. Таким образом, с помощью теоретических расчетов найти оптимальную пару праймеров было невозможно. Поэтому было синтезировано 3 комплементарных положительной цепи вирусной РНК и 5 комплементарных отрицательной цепи вирусной РНК праймеров, которые в большей степени отвечали предъявляемым требованиям (рис. 2). Их активность была проверена в ПЦР с использованием в качестве мишени РНК штамма Nebraska.

Для синтеза кДНК провели две реакции обратной транскрипции, в каждой из которых использовали праймер СН4 или СН4а, комплементарный положительной цепи вирусной РНК. Каждый из продуктов реакции обратной транскрипции, с соответствующим праймером и с каждым из четырех праймеров (CHI, CHla, CHI в и CHlc), комплементарных отрицательной цепи вирусной РНК, использовали для постановки реакции амплификации. Электрофореграмма продуктов ПЦР представлена на рис. 3.

< "," V.-TЛ С ■ - • 4 ■'• > ' - •

.■ ■•• г-."- ' ..'•■• <■■':■•< .

Рис. 3. Электрофореграмма продуктов ПЦР IIE гена КП КРС с праймерамн:

1. CHI-CH4; 2. CHla - CII4; 3. CHIb - СН4; 4. CHIc - СН4; 5. Маркер (фрагменты генома фага X, после рестрикции Eco 91. I - 117, 224, 702, 1264, 1571, 1929, 2323, 3675, 4324, 4822, 5686, 6369, 7242, 8454 п п.); 6. СИ I - СН4а; 7. Cilla - СН4а; 8. СИ Ib - СН4а; 9. СН 1с - СН4а.

Как видно из рисунка, с праймером СН4 выход ампликонов был больше, чем в реакциях в которых применялся праймер СН4а, что особенно хорошо видно при сравнении специфических фрагментов, полученных при использовании этих праймеров в паре с праймером СН1. В реакциях с праймерами CHla и СН1в, как в паре с СН4, так и с СН4а, синтеза неспецифических продуктов реакции не наблюдалось, однако, выход специфического продукта реакции с праймером СН1в был больше. Аналогичные результаты были получены и при других температурно-временных параметрах реакции. Таким образом, проведенные опыты показали, что в наибольшей степени предъявляемым требованиям отвечают праймеры СН1в и СН4, поэтому в дальнейшей работе для первой реакции амплификации применялась эта пара праймеров.

Праймеры СН2 и СНЗ так же эффективно выявляли присутствие вирусспецифической кДНК после 30 циклов реакции амплификации без образования неспецифических продуктов. В дальнейшем данная пара праймеров применялась для

постановки "nested" ПЦР и секвенирования. Специфичность реакции была проверена секвенированнем полученных продуктов ПЦР.

Оптимизация условий постановки, реакции включала подбор температурно-временных параметров и подбор концентрации компонентов реакционной смеси. Чувствительность реакции после двух раундов амплификации составила около 1,5 lg ТЦДзо/мл, ■ появления неспецифических продуктов реакции при этом не наблюдалось.

Апробация метода и анализ полученных данных. С помощью разработанного метода были исследованы штаммы KB KPC Nebraska, ВНИИЗЖ, ВТ 42/82 и пробы натматериала как от больных, так и от павших или вынуждено убитых телят и взрослых животных с кишечной или респираторной клиникой, поступивших из хозяйств Российской Федерации за период с октября 1997 года по декабрь 2002 года. Из 100 исследованных материалов геном KB KPC был выявлен в 20.

Для анализа использовали фекалии, соскобы эпителия кишечника, носовые истечения, смывы и соскобы трахеи, легкие, селезенку и лимфоузлы. Вирус выявляли в фекалиях, слизистой оболочке тонкого кишечника, в носовых истечениях, в смывах трахеи и в легких телят. В лимфоузлах и селезенке геном KB KPC не обнаруживали.

В наших исследованиях при энтеритах KB KPC выявляли у телят в возрасте от 2 дней до 2 месяцев. Данный срок проявления энтерической коронавирусной инфекции КРС является наиболее характерным и описан многими авторами (Langpap et al., 1979; Renolds et al., 1986; Mostl & Burki,1988). В двух случаях вирус был выявлен при диарейном синдроме у взрослых животных.

Клинические признаки респираторной KB инфекции КРС наиболее часто проявляются у телят в возрасте 2-16 недель (Thomas et al., 1982; McNulty et al., 1984; Reynolds et al., 1985; Singh et al., 1985; Saifet al., 1986; Saif, 1987; Mostl & Burki, 1989; Heckert et al., 1990, 1991a, c, d; Tsunemitsu et al., 1991). В наших исследованиях геном KB KPC был обнаружен в носовых истечениях, трахее и легких телят в возрасте от 1 до 10 месяцев. Нужно отметить, что у животных с респираторным синдромом вирус выявлялся довольно часто - в 7 случаях (35% от всех положительных результатов), в 2 случаях (10% от всех положительных результатов) его выявляли при смешанной (диарейной и респираторной) клинике, как в кишечнике, его содержимом, так и в разных отделах респираторного тракта.

У пораженных KB КРС животных наблюдалась депрессия, анарексия и дегидратация. Повышения температуры тела обычно не отмечалось. При диарее животные истошены фекалии часто желтого или зеленого цвета, иногда (у взрослых животных в обоих случаях) со слизью и кровью. При вскрытии в кишечнике отмечали гиперемию, катаральное и катарально-геморрагическое воспаление, кровоизлияния под слизистой. При респираторных заболеваниях отмечалось обильное слюнотечение, истечения из носовой полости, затрудненное дыхание, кашель. В трахее и бронхах часто обнаруживали серозный экссудат, а в легких острую катаральную бронхопневмонию или крупозное воспаление. Отмеченные признаки наблюдались почти у 150 животных из более чем 250 обследованных, однако подобную клиническую картину могут вызывать многие патогены КРС, поэтому диагностировать коронавириоз только по клинической картине без проведения лабораторных исследований практически невозможно.

В ходе исследования, были определены нуклеотидные последовательности фрагмента НЕ гена (918-1146 н.) штаммов KB КРС Nebraska. ВТ 42/82 и ВНИИЗЖ, а так же 17 выявленных нами полевых изолятов. Полученные и ранее опубликованные нуклеотидные последовательности этого участка НЕ гена 41 штамма и изолята KB КРС сравнили между собой.

Как было отмечено выше, высокая стабильность первичной структуры генома, нехарактерная для других РНК-содержащих вирусов и, в частности, представителей рода Coronavirus, наблюдается и при сравнении нуклеотидных последовательностей вариабельной области НЕ гена KB КРС. Максимальные различия между двумя сравниваемыми последовательностями составляют 5,7%. Из 228 позиций нуклеотидные замены были выявлены только в 36 (15,79%). Из них в 21 позиции (58,3%) замены выявлены только в одном случае. Все нуклеотидные замены приводят к смене 12 а.о. (33,3%), сайты гликозилирования при этом изменений не претерпевали. Замены в аминокислотной последовательности были распределены случайным образом. Сравнение антигенных свойств и полноразмерных аминокислотных последовательностей НЕ гликопротеина пяти изолятов зимней дизентерии и семи изолятов диареи неонатальных телят не выявило характерных отличий между двумя этими группами изолятов.

По данным Gelinas с соавт. (Gelinas et al., 2001), наличие пролина в 367 позиции коррелирует с вирулентностью KB КРС. Проведенный нами сравнительный анализ определенных нами и взятых из GenBank нуклеотидных последовательностей

позволил установить отсутствие пролина в этой позиции у штаммов Mebus, BCV L9, Nebraska- Quebec. Quebec/BCQ.3. Quebec/BCQ.571 и ВНИИЗЖ. В результате адаптации к клеточным культурам штамм Mebus утратил свои вирулентные свойства. Поскольку все эти штаммы были адаптированы к клеточным культурам, они, вполне вероятно, также утратили вирулентные свойства. Полевые изоляты, выявленные на территории РФ, практически все содержали пролин в 367 позиции. Исключение составляет изолят Кавернино/12/00, выявленный в содержимом тонкого кишечника от телят 1-2 месячного возраста с респираторной клиникой. Диспепсии при этом у телят не наблюдали. В образцах материала легких и трахеи вирус обнаружить не удалось. Таким образом, бессимптомное персистирование вируса в желудочно-кишечном и его отсутствие в респираторном тракте может свидетельствовать о низкой вирулентности или авирулентности изолята. Во всех остальных случаях наблюдалась прямая зависимость между локализацией вируса и клиническими признаками заболевания.

Вряд ли изменение только одного аминокислотного остатка может кардинально изменить вирулентность изолята KB КРС. Прямым доказательством-этого могло бы послужить сравнение биологических свойств двух штаммов вируса, которые различались бы только по данному аминокислотному остатку НЕ гена. Возможно, что данная аминокислотная замена является одной из нескольких генетических детерминант вирулентности KB КРС и дальнейшие исследования генома позволят ответить на данный вопрос.

На рис. 4 в виде дендрограммы представлен результат проведенного нами сравнительного анализа нуклеотидных последовательностей анализируемой области НЕ гена изученных штаммов и изолятов KB КРС.

Как видно из рис. 4, сравниваемые штаммы и изоляты, за редким исключением, различались по первичной структуре анализируемого фрагмента НЕ гена менее чем на 2%. Многие из них образуют группы со сходной нуклеотидной последовательностью. Такую группу образуют канадские изоляты Quebec/BCQ.376, Quebec/BCQ.3708, Ontario BCO.43277, Quebec/BCQ.701 и штамм респираторного KB КРС LSU-94LSS-O51-2. Изоляты Одинцово/06/00, Тула/05/99, Собинка/09/02, Юрьев-Польский/02/02, Собинка/01/01 и Балахна/09/00 также идентичны по этому признаку и отличаются от предыдущей группы менее чем на один процент. Подобные группы, с несколько большим отличием, образуют канадские изоляты Ontario BCO.44175 и Quebec/BCQ.3994 и, с еще большими отличиями, изоляты Quebec/BCQ.2442,

процент нуклеотидных отличии

Рис. 4. Дендрограмма, отражающая степень гомологии между штаммами и изолятами коронавируса КРС. Получена сравнением нуклеотидных последовательностей фрагмента НЕ гена (933-1161 н.).

Quebec/BCQ.1523, Quebec/BCQ.2508, Quebec/BCQ.2439 и референтный штамм респираторного коронавируса (ОК-0514-3, выявленный в штате Оклахома (США). Небольшие отличия от этих групп в первичной структуре имеют изоляты Quebec/BCQ.7373 и Ногинск/11/02.

Более 1% отличий нуклеотидных последовательностей наблюдаются у изолятов Собинка/04/00, Шуя/04/99, Суздаль/12/01, у идентичных по первичной структуре Кошкинск/11/00 и Тюмень/10/00, а также Quebec/BCQ.571 и Quebec/BCQ.3, европейского штамма ВТ 42/82 и канадского штамма зимней дизентерии Quebec/BCQ.2590. Изоляты Юрьев-Польский/03/00 и Меленки/11/99 образуют группу, но отличаются между собой более чем на 1%. Несколько обособленное положение занимают штаммы Mebus, BCV L9, Quebec, Nebraska, ВНИИЗЖ и изолят Кавернино/12/00, которые отличаются от остальных штаммов и изолятов на 2%.

Изоляты Ставрово/03/98, Ярославль/10/97 и штаммы LY 138 и BRCV-G95 максимально отличаются по нуклеотидным последовательностям от всех сравниваемых штаммов и изолятов.

Сравнение аналогичных участков генома различных штаммов и изолятов вируса может применяться для установления между ними филогенетических отношений. Филогенетическими мы называем отношения между штаммами и изолятами связанных общим происхождением. Эти отношения часто коррелируют с удаленностью территорий, на которых циркулируют исследуемые изоляты. а так же временем их выявления. Однако, как видно из дендрограммы, представленной на рис. 4, при сравнении анализируемого фрагмента НЕ гена KB KPC подобную связь проследить не удается.

Прежде всего, обращает на себя внимание факт относительно высокого сходства первичных структур штамма ВНИИЗЖ, а так же изолята, выявленного в Кавернинском районе Нижегородской области со штаммами Mebus и Nebraska, выделенными в США в 1971 году, а также, сходство канадских и американских штаммов и изолятов, выявленных с 1986 по 1998 г. и большинства других изолятов, выявленных в 1999-2002 годах на территории Российской Федерации. Сходная картина наблюдается и при сравнении российских изолятов между собой. Так, расстояние между хозяйствами Владимирской области, в которых были выявлены изоляты Ставрово/03/98 и Собинка/04/00 незначительно, как и разница времени их выявления. Тем не менее, отличие нуклеотидных последовательностей этих изолятов относительно велико. Напротив, четыре исследованные нами изолята KB KPC, выявленные в разных областях Российской Федерации, демонстрируют идентичность первичной структуры исследуемого фрагмента НЕ гена, что вполне могло бы являться следствием экономических связей между хозяйствами, в которых проводились исследования. Аналогичная картина наблюдается при рассмотрении штаммов и изолятов KB KPC, выделенных в США и Канаде. Например, штаммы Quebec/BCQ.2590, Quebec/BCQ.3 и Quebec/BCQ.571 и другие изоляты, выявленные в Квебеке при незначительной разнице во времени, значительно отличаются по нуклеотидным последовательностям, а штамм LY138, выделенный в США в 1965 году, практически в равной мере отличается от всех других сравниваемых штаммов и изолятов независимо от того, где и когда они были выявлены.

По всей видимости, полученные результаты сравнительного анализа обусловлены генетическими особенностями исследуемого участка генома. Главным

образом, по нашему мнению, это связано с низкой вариабельностью и локализацией возникающих замен. Как было показано выше, при сравнении 41 последовательности вариабельной области длиной 228 н., нуклеотидные замены были выявлены только в 36 позициях (15,79%). В 21 позиции (58,3%) замены выявлялись только у какой-либо одной из сравниваемых последовательностей. Такие мутации в равной степени отличают как филогенетически близкие изоляты, так и изоляты, неимеющие такой связи, и. поэтому, имея большое значение для штаммовой дифференциации, они не играют большой роли при установлении филогенетических отношений между изолятами вируса. В этом случае в сравниваемом фрагменте НЕ гена значение имеют остальные 15 позиций (41,67%), в 13 из которых (86,67%), следует особо отметив, обнаружены лишь 2 варианта нуклеотидов, что определяет высокую вероятность случайного совпадения нуклеотидов, что вполне может обуславливать сходство первичной структуры филогенетически удаленных и значительную разницу филогенетически близких штаммов и изолятов вируса.

Отмеченные выше особенности, по нашему мнению, не позволяют судить о филогенетической близости изучаемых штаммов на основании только лишь сравнительного анализа выбранного фрагмента НЕ гена, что могло бы иметь немаловажное значение для установления возможного источника инфекции. По крайней мере, имеющихся данных недостаточно для установления корреляции между степенью филогенетического родства различных штаммов О KPC и уровнем гомологии их первичной структуры. Для более детального анализа необходимо провести сравнение других участков вирусного генома. Это позволило бы установить, отражают ли полученные данные связь между филогенетическими отношениями различных штаммов О и уровнем сходства сравниваемых нуклеотидных

последовательностей.

Тем не менее, успешное выявление ^ KPC в образцах патматериала позволяет использовать предложенный метод для диагностики коронавирусной инфекции и дифференциации большинства штаммов и изолятов вируса и, в частности, для дифференциации штамма ВНИИЗЖ, используемого для изготовления вакцинных препаратов от полевых изолятов О ^^ циркулирующих на территории РФ, что имеет большое практическое значение.

Разработка и применение метода выявления и штаммовой дифференциации коронавируса крупного рогатого скота с помощью ПЦР и секвенирования вариабельной области S гена

Исследование профиля вариабельности 5 гена. Изучению структурно-функциональных особенностей белков-рецепторов традиционно уделяется большое внимание, поэтому первичная структура 8 гена КВ КРС, наряду с НЕ геном, относительно других участков генома, изучена хорошо. Особенно в этом отношении выделяется область 81В субъединицы Б1, кодирующая наиболее важные антигенные детерминанты белка, и сайт протеолитического расщепления. Эта область длиной 1147 н. была изучена у десяти штаммов КВ КРС, выделенных во Франции, Канаде и Америке.

Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей этой области гена отражает филогенетические отношения этих штаммов, которые, в данном случае, коррелируют с местом и временем их выявления. Вариабельность этого фрагмента гена достаточна для дифференциации всех десяти штаммов вируса, включая близкородственные штаммы, что выгодно отличает этот фрагмент генома от ранее исследуемого. Однако секвенирование фрагмента длиной 1147 н. очень трудоемко и для рутинной диагностики не оправдано. Поэтому из этого фрагмента для анализа был выбран участок длиной 598 нуклеотидов, содержащий большую часть вариабельной области этого фрагмента (рис.5). Сравнительный анализ этого участка

1000 2000 3000 4000

Рис. 5. Профиль вариабельности 8 гена. Получен последовательным сравнсиш фрагментов длиной 125 п., с шагом I пуклеотид. Штриховкой выделена анализируем область Б гена. По оси абсцисс - номера пуклеогидов, по оси орлишм вариабельность (%).

гена в общем виде также может отражать филогенетические отношения между данными штаммами и изолятами вируса. Вариабельность этого фрагмента так же. как и фрагмента длиной 1147 н., достаточна для дифференциации всех сравниваемых штаммов. Анализируемый фрагмент S1B области S гена (1551 - 2149 н.) располагается вблгаи от сайта протеолитического расщепления (763-768 а.о.). содержит 4 потенциальных сайта N-гликозидной связи и кодирует важнейшие антигенные детерминанты. Выбранный участок генома фланкирован консервативными участками, пригодными для гибридизации с праймерами. обладает достаточной вариабельностью, содержит важные функциональные сайты и. таким образом, отвечает предъявляемым требованиям, что и послужило основанием при его выборе для исследования.

Выбор праймеров, условий постановки ПЦР и секвенирования. Выбор праймеров для амплификации и секвенирования выбранного фрагмента S гена так же проводили с помощью программы Oligo, версия 3.3. Для индикации патогена разрабатывался "nested" вариант ПЦР. с двумя парами праймеров. Выбор праймеров на S гене, при относительно невысокой его вариабельности, как и в случае НЕ гена, был осложнен присутствием большого количества адениловых и уридиловых нуклеотидов.

Праймеры CS1 и CS4 были рассчитаны для первой стадии ПЦР, a CS2 и CS3 для "nested''-стадии, соответственно. Условия постановки реакции были отработаны с использованием РНК штамма Nebraska. Оптимизация условий постановки реакции включала подбор температурно-временных параметров и подбор концентрации компонентов реакционной смеси. Чувствительность реакции посте двух раундов амплификации составила около появления неспецифических продуктов

реакции при этом не наблюдалось.

Апробация метода и анализ полученных данных. Апробацию метода проводили как на лабораторных штаммах KB КРС, так и на полевых изолятах вируса, в том числе и выявленных ранее. В исследовании были использованы штаммы Nebraska и ВНИИЗЖ. пробы патматериала от больных, павших или вынужденно убитых телят и взрослых животных с кишечной или респираторной клиникой. С помощью данного метода обследовано около 60 патматериалов. Чувствительность этого метода не уступала ранее разработанному и составляла около Специфичность реакции была

подтверждена секвенированием амплифишфованных фрагментов.

В ходе исследования были установлены ну клеотндные последовательности фрагмента S гена (1551 - 2149 н.) штаммов КЗ КРС Nebraska и ВНИИЗЖ. а так же 8 палевых изолятов, выявленных на территории РФ. Полученные и ранее опубликованные ну клеотндные последовательности этого участка S гена 30 штаммов и изолятов KB КРС сравнили между собой.

Различия первичной структуры штаммов и изолятов KB КРС в анализируемой области S гена выше, чем в исследованной области НЕ гена. Максимальные различия между двумя сравниваемыми последовательностями в данном случае составляют 938%. Это обстоятельство обуславливает более высокую дифференцирующую способность исследуемой области S гена. При сравнении первичной структуры 30 штаммов и изолятов KB КРС, в том числе и филогенетически близких, нуклеотидные последовательности анализируемого фрагмента S гена были идентичны только у штаммов ВНИИЗЖ и Quebec. Таким образом, выбранный фрагмент генома подходит для штаммовой дифференциации вируса.

Из 598 возможных позиций замены были выявлены в 95 (15,89%). Из них значимыми были 32 (33,68%). Из 95 позиций, в которых выявлены нуклеотддные замены, в 49 (51,58%) замены были оригинальны, т.е. в этих позициях какой-либо один из сравниваемых штаммов отличался от всех остальных.

По опубликованным данным (Gelinas et ah, 2001), при сравнении S1 области S гликопротеина шести энтеропатогенных и четырех респираторных штаммов выявлено восемь позиций с характерными для энтеропатогенных и столько.же позиций с характерными для респираторных изолятов аминокислотными заменами. В исследуемой области S гликопротеина находятся три позиции (531,578 и 691) со специфическими для респираторных штаммов аминокислотными остатками.

По данным авторов (Gelinas et al., 2001), в 531 позиции у трех из четырех сравниваемых штаммов обнаружен глицин (G), однако это не совсем так. В действительности у сравниваемых штаммов Ontario/BCO.43277 и Ontario/BCO.44175 находятся аспарагиновая кислота (D) и аспарагин (N), соответственно (в обоих случаях данные были взяты из GenBank. accession numbers AF239308 и AF239309). Тальм образом, в 531 позиции специфичной аминокислотной замены для респираторных штаммов и изолятов KB КРС не наблюдается. 3 578 позиции у штаммов ОК-0514-3. Ontario/BCO.43277 и Ontario/BCO.44175 наблюдается замена треонина (Т) на серии (S), а з 691 позиции у штаммов Ontario/BCO.43277 и Ontario/BCO.44175 вместо аланина(А) находится треонин (Т). Однако, поскольку эти замены были выявлены в первом случае у

трех, а во втором у двух штаммов из восьми сравниваемых, вряд ли их можно назвать специфическими. Скорее они носят случайный характер. Изоляты Муром/01/01 и Юрьев-Польский/02/02, выявленные одновременно из респираторного и желудочно-кишечного трактов в 531 позиции имели аспарагиновую кислоту (D), в 578 треонин (Т), а в 691 аланин (А). Таким образом, достоверной корреляции между респираторными и энтеропатогенными штаммами и изолятами KB KPC по данным позициям нет. Корреляция наблюдалась только по 510 позициям (у всех респираторных штаммов был выявлен треонин, а у энтеропагогенных - серии), однако подтвердить или опровергнуть эти данные с помощью наших исследований, к сожалению, невозможно, поскольку эта позиция не вошла в область исследуемого нами фрагмента S гена.

Поскольку одни и тс же штаммы могут вызывать диарею неонатальных телят и зимнюю дизентерию (Traven et al., 2001) и отличий по гемагглютинирующим, ацетил-эстеразным, антигенным свойствам и первичной структуре между ними не выявлено (Kourtesis et al., 2001), что подтверждается и нашими исследованиями, можно предположить, что различные клинические проявления, вызванные KB KPC, обусловлены разницей в возрасте, иммунном статусе животных и вирулентности полевых изолятов.

На рис. 6 в виде дендрограммы представлен результат сравнительного анализа первичной структуры выбранного фрагмента S гена. По признаку сходства первичной структуры исследуемого фрагмента S гена большинство исследованных штаммов и изолятов можно разделить на четыре группы. В отдельную группу можно выделить пять выявленных нами изолятов: Меленки/11/99, Тюмень/10/00, Балахна/09/00, Собинка/01/01, Муром/01/01 и штамм респираторного 'коронавируса BRCV-G95, выделенный во Франции. Наибольшее сходство первичной структуры со штаммом BRCV-G95 демонстрирует изолят, выявленный в Меленковском районе Владимирской области, и несколько меньше изолят из Тюменской области. Уровень нуклеотидных отличий изолятов Собинка/01/01 и Муром/01/01, выявленных в разных районах Владимирской области, оказался выше, чем у изолята Балахна/09/00, выявленного в Нижегородской области. Максимальный уровень различий нуклеотидных последовательностей между представителями этой группы составляет 1,5%.

Также, менее чем на 2% отличается третья группа штаммов и изолятов. В нее вошли филогенетически близкие штаммы Mebus, BCV-L9, BCV-Vaccine, Quebec, a также штаммы Nebraska, LY-138, F-15 и ВНИИЗЖ и изоляты WI-l-SK, AF313395

(название изолята в GenBank не указано, поэтому приводится его номер) и Юрьев-Польский/02/02.

Рис. 6. Дендрограмма, отражающая степень гомологии между штаммами и изолятами коронавируса КРС. Получена сравнением нуклеотидных последовательностей фрагмента S гена (1551 -2149 н.).

С отличием более 2% от выше рассмотренных можно выделить четвертую группу штаммов и изолятов, в которую вошли изоляты Quebec/BCQ.20, Quebec/BCQ.9 и Quebec/BCQ.1523, выявленные в Канаде в 1989 и 1994 г. и американские штаммы ОК-0514-3 и LSU-94LSS-051-2.

Изоляты Quebec/BCQ.571, Ontaгio/BCO.43277, Суздаль/12/01 и Одинцово/06/00 максимально отличались по первичной структуре анализируемого фрагмента S гена, и не вошли не в одну из описанных групп.

Из представленной дендрограммы видно, что удаленность территорий и время выявления изолятов, в данном случае, не в полной мере коррелирует с уровнем сходства первичной структуры. Так, в первую группу вошли шесть изолятов, выявленных в Европе, пять из которых выявлены на территории РФ. Однако изоляты

Суздаль/12/01 и 0динцово/06/00. выявленные во Владимирской и Московской областях, отличались от них больше, чем штаммы и изоляты, выявленные в Америке и Канаде. Штаммы BRCV-G95 и F-15, выявленные во Франции, не смотря на не значительную разницу во времени их выявления, также не демонстрируют сходства первичной структуры. Изоляты. составляющие вторую группу, все были выявлены в Канаде, тем , не менее, изолят Quebec/BCQ.2070, как и изоляты Quebec/BCQ.20, Quebec/BCQ.9 и Quebec/BCQ.571 был выявлен в канадском штате Квебек в 1989 г., но его нуклеотидная последовательность анализируемого фрагмента S гена оказалась более сходна с изолятами выявленными в 1992 и 1998 г., а также с изолятом выявленным в штате Онтарио в 1997 г. Филогенетически близкие штаммы Mebus, BCV-L9, BCV-Vaccine и Nebraska демонстрируют сходство первичной структуры с штаммами Quebec и ВНИИЗЖ, а также изолятом Юрьев-Польский/02/02.

Для сравнения данных, полученных при секвенировании исследуемых фрагментов НЕ и S генов, были отобраны 22 штамма и изолята, у которых были установлены нуклеотидные последовательности обоих исследуемых фрагментов генома. Данные сравнительного анализа в виде дендрограммы представлены на рис. 7 (А и В).

Сходство первичной структуры по двум сравниваемым фрагментам генома, как уже было отмечено выше, демонстрируют штаммы Mebus, BCV-L9, BCV-Vaccine, Quebec и ВНИИЗЖ, а также Nebraska. Штамм Nebraska, вполне вероятно, тоже филогенетически близок штамму Mebus. Это вполне закономерно, принимая во внимание то, что различия в расстоянии и во времени их выявления не значительны. Сходство анализируемых нуклеотидных последовательностей S и НЕ генов наблюдается и у изолятов Ontario/BCO.44175 и Quebec/BCQ.3994, а также Quebec/BCQ.1523 и 0К-0514-3, что, возможно, отражает их филогенетическую связь. Сходство изолятов Ontario/BCO.44175 и Quebec/BCQ.3994 выглядит вполне естественно, поскольку они оба были выявлены в Канаде с разницей в один год, хотя низкий уровень отличий сравниваемых анализируемых областей генома изолята Quebec/BCQ.1523 и штамма 0К-0514-3, выявленными в Канаде и США, соответственно, с разницей в два года, скорее всего также является следствием близких филогенетических отношений между ними.

Рис. 7. Сравнительный анализ первичной структуры штаммов и изолятов KB KPC: А - по анализируемой области НЕ гена, В - по анализируемой области S гена, С • одновременно по обоим анализируемым областям.

Тем не менее, результаты сравнительного анализа этих областей генома у других исследуемых штаммов и изолятов различаются существенно. Так. штамм ВКСУ-095 и изоляты Меленки/11/99, Тюмень/10/00 и Балахна/09/00. имеющие значительные отличия по нуклеотидным последовательностям фрагмента НЕ гена, по 8 гену имеют высокий уровень сходства. И наоборот, изоляты Балахна/09/00, Одинцово/06/00, Собинка/01/01 и Юрьев-Польский/02/02 по первичной структуре фрагмента НЕ гена были идентичны, а по фрагменту 8 гена имеют большие отличия. Различия между полученными данными свидетельствуют о том. что, по крайней мере, один из фрагментов, не отражает филогенетических отношений между штаммами и изолятами вируса. Однако, отнести это только на счет фрагмента НЕ гена, несмотря на его генетические особенности, с полной уверенностью нельзя, т.к. корреляция времени и места выявления изолятов с уровнем сходства их первичной структуры в определенной степени, как и в случае 8 гена, все же наблюдается. И, как продемонстрировано выше, некоторые несоответствия между расстоянием и временем выявления штаммов и изолятов с уровнем сходства их первичной структуры могут быть обусловлены экономическими связями животноводческих хозяйств. Также вероятно, что оба исследуемых фрагмента не вполне корректно отражают искомую корреляцию. Поэтому был проведен сравнительный анализ соединенных нуклеотидных последовательностей исследованных фрагментов НЕ и 8 генов (рис. 7, С). Поскольку при таком подходе сравниваются более полные последовательности генома, результаты, возможно, будут более адекватны.

Из представленного рисунка видно, что штаммы и изоляты, выявленные с 1992 по 1998 г. в Канаде и США, можно выделить в одну группу. Нзоляты Балахна/09/00, Собинка/01/01, Меленки/11/99 и Тюмень/10/00, выявленные в РФ с небольшим-временным интервалом единой группы не образуют, и демонстрируют с выделенной выше группой некоторое сходство. Изолят Юрьев-Польский/02/02 сохраняет определенное сходство со штаммами, выявленными в 70-х г. в Америке и Канаде. Канадский изолят риеЪес/ВСр.571, выявленный в 1989 г.. и американский штамм ЬУ138, выявленный в 1965 г., также с ними сходны, но отличаются от них в большей степени. Французский штамм ВКСУ-095 и российские нзоляты Одинцово/06/00 и Суздаль/12/01 максимально отличались от всех других сравниваемых штаммов и изолятов КВ КРС.

Учитывая большую разницу в расстоянии, следовало ожидать разделения всех штаммов и изолятов как минимум на две группы - европейскую и американскую. Однако, ни в одном случае при сравнении первичной структуры подобной картины мы не получили. По данным сравнительного анализа исследуемых нуклеотидных последовательностей, прямой зависимости между уровнем различий нуклеотидных последовательностей и временем, а также местом выявления штаммов и изолятов не наблюдается, что вполне естественно, принимая во внимание степень развития современных экономических связей и коммуникаций, а также низкую вариабельность генома KB КРС. Кроме того, поскольку KB KPC способен долгое время изолированно персистировать в одном стаде, накапливая мутации, изоляты. выявленные в одном регионе, могут значительно отличаться. Поэтому, в данном случае, довольно сложно определить отражают ли какие-либо из полученных данных филогенетические отношения между штаммами и изолятами KB KPC. Таким образом, наличие филогенетических отношений между штаммами и изолятами KB KPC с высокой степенью вероятности можно утверждать лишь для тех. которые имеют значительное сходство первичной структуры по двум сравниваемым фрагментам, как, например, штаммы Mebus, BCV L9, Nebraska, Quebec и ВНИИЗЖ.

4. ВЫВОДЫ

1. Разработаны методики выявления генома и штаммовой дифферешшации коронавируса КРС из различных биоматериалов на основе ПЦР и секвенирования вариабельной области гемагглютинин-эстеразного (НЕ) и спайкового генов (S). Чувствительность этих методов составляет 1,5кТЦД5С/мл.

2. С помощью разработанных методик был выявлен геном 20 полевых изолятов коронавируса КРС. Присутствие 11 полевых изолятов коронавируса КРС было установлено в пробах фекалий и слизистой оболочки тонкого кишечника животных, 7 изолятов в носовых истечениях, смывах трахеи и в легких телят, 2 изолятов одновременно и в кишечнике, и в различных отделах респираторного тракта. В лимфоузлах и селезенке геном коронавируса КРС не был выявлен.

3. При энтеритах коронавирус КРС выявляли у телят, в возрасте от 2 дней до 2 месяцев, а также у взрослых животных. При респираторных заболеваниях вирус обнаруживали у телят в возрасте от 1 до 10 месяцев.

4. Определены нуклеотидные и соответствующие аминокислотные последовательности вариабельной области гемагглютннин-эстеразного гена 17 полевых изолятов выявленных на территории РФ и 3 штаммов коронавируса КРС. Созданный банк данных первичной структуры 41 штамма и изолята коронавируса КРС. выявленных на территории РФ и за рубежом, может быть использован для сравнительного анализа вновь выявляемых изолятов вируса.

5. Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей исследуемого фрагмента гемагглютинин-эстеразного гена 41 штамма и изолята коронавируса КРС позволяет проводить их идентификацию и штаммовую дифференциацию. Прямой корреляции между уровнем сходства исследованных фрагментов генома и временем, а также местом выявления вируса не установлено.

6. Определены нуклеотидные и соответствующие аминокислотные последовательности амплифицированного фрагмента S1B области S гена 8 полевых изолятов. выявленных на территории РФ и 2 штаммов коронавируса -КРС. Создан банк данных первичной структуры анализируемого фрагмента S гена 30 штаммов и изолятов коронавируса КРС.

7. Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей амплифицированного фрагмента S1B области S гена 30 штаммов и изолятов коронавируса КРС позволяет проводить их идентификацию и штаммовую дифференциацию. Корреляции между временем и местом выявления вируса с уровнем сходства первичной структуры не установлено.

8. Показано, что все изоляты коронавируса КРС, выявленные на территории РФ, как и большинство известных штаммов и изолятов в исследуемой области содержат три потенциальных сайта гликозилирования. Установлено, что для всех изученных штаммов и изолятов KB КРС характерно отсутствие в исследуемой области вставок и делеций.

9. Установлено, что штаммы и изоляты коронавируса КРС. имеющие сходство первичной структуры по двум исследуемым фрагментам генома с высокой степенью вероятности, имеют общее происхождение.

5. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

На основании проведенных исследований предлагаются для использования з практической работе рассмотренные и одобренные ученым советом и утвержденные директором ВНИИЗЖ методики:

"Методика выявления и штаммовой дифференциации коронавируса крупного рогатого скота с помощью ПЦР и секвенирования фрагмента НЕ гена" (1999г.): "Методика выявления и штаммовой дифференциации коронавируса крупного рогатого скота с помощью ПЦР и секвенирования вариабельной области S гена" (2003 г.).

Созданный банк нуклеотидных последовательностей вариабельных областей гемагглютинин-эстеразного и спайкового генов отечественных и зарубежных штаммов и полевых изолятов коронавируса КРС может быть использован для идентификации и дифференциации штаммов и полевых изолятов вируса.

6. СПИСОК НАУЧНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ

1. Кудрявцев В.А., Дороненкова Г.Н., Ломакин А.И., Прохватилова Л.Б., Аянот П.К., Гусев АЛ. Разработка метода ПЦР для выявления коронавируса

Акт. пробл. патол. с.-х. жив-ных: Матер, междунар. научно-практ. конф. - Минск. 2000.-С. 133-135.

2. Кудрявцев В.А., Прохватилова Л.Б., Мищенко В.А., Аянот П.К. Анализ вариабельной области гемагглютинин-эстеразного (НЕ) гена коронавируса КРС и возможность использования данных ее секвенирования в практических целях // Достижения молодых ученых - в вет. практ. (Матер, конф. молодых ученых). -Владимир, 2000. - С. 201-207.

3. Кудрявцев В.А., Аянот П.К., Дороненкова Г.Н. Амплификация и сравнительный анализ фрагмента S1B области S гена коронавируса крупного рогатого скота // Актуальн. пробл. болезней молодняка: Матер, междунар. научно-практ. конф. - Воронеж. - 2002. - С. 341-344.

4. Кудрявцев В.А.. Аянот П.К.. Дороненкова Г.Н., Гусев А.А. ПЦР и секвенирование вариабельной области гемагглютинин-эстеразного гена коронавируса КРС // Вестник РАСХН. - 2002. - №4. - С. 61-65.

5. Кудрявцев В.А., Дороненкова Г.Н.. Прохватилова Л.Б., Аянот П.К. Сравнительный анализ вариабельной области НЕ гена различных штаммов и изолятов коронавируса КРС // Актуальн. пробл. патологии свиней, крупного и мелкого рогатого скота: Матер, конф. молодых ученых. - Владимир, 2002. - С. 97-101.

6. Кудрявцев В.А., Дороненкова Г.Н.. Аянот П.К. Сравнительный анализ вариабельных фрагментов НЕ и 8 генов различных штаммов и изолятов коронавируса КРС // Генодиагностика инфекц. заболеваний: Сб. тез. 4-й Всерос. научн.-практ. конф. -М., 2002.-С. 345-347.

Отпечатано на полиграфической базе ФГУ "Федеральный центр охраны здоровья животных", тираж 90 экз., август 2004г.

#15455

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Кудрявцев, Владислав Александрович

1. ВВЕДЕНИЕ.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

2.1. Коронавирусная диарея новорожденных телят.

2.1.1. Эпизоотология.

2.1.2. Клинические признаки.

2.1.3. Патогенез и патологоанатомические изменения.

2.1.4. Диагностика.

2.1.5. Специфическая профилактика.

2.2. Коронавирусная инфекция дыхательных путей.

2.3. "Зимняя дизентерия".

• 2.4. Характеристика семейства Согопаутёае.

2.5. Структура вириона и физико-химические свойства коронавируса крупного рогатого скота.

2.6. Геном коронавируса крупного рогатого скота.

2.7. Основные структурные белки коронавируса крупного рогатого скота.

2.7.1. Нуклеокапсидный протеин.

2.7.2. Интегральный мембранный протеин.

2.7.3. Спайковый гликопротеин.

2.7.4. Гемагглютинин-эстеразный гликопротеин.

2.8. Репликация коронавируса крупного рогатого скота.

3. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

3.1. Материалы.

3.1.1 Штаммы вируса.

3.1.2. Оборудование.

3.1.3. Растворы и реактивы.

3.2. Методы.

3.2.1. Выделение суммарной РНК.

3.2.2. Реакция обратной транскрипции.

3.2.3. Амплификация кДНК.

3.2.4. Вариант ПЦР "continuous".

3.2.5. Очистка продуктов ПЦР.

3.2.6. Реакция секвенирования.

3.2.7. Компьютерный анализ данных.

4. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ.

4.1. Разработка и применение метода выявления и штаммовой дифференциации коронавируса крупного рогатого скота с помощью

ПЦР и секвенирования фрагмента НЕ гена.

4.1.1. Исследование профиля вариабельности НЕ гена.

4.1.2. Выбор первичной структуры праймеров.

4.1.3. Оптимизация условий постановки ПЦР и секвенирования.

4.1.4. Апробация метода и анализ полученных данных.

4.2. Разработка и применение метода выявления и штаммовой дифференциации коронавируса крупного рогатого скота с помощью

ПЦР и секвенирования вариабельной области S гена.

4.2.1. Исследование профиля вариабельности S гена.

4.2.2. Выбор праймеров, условий постановки ПЦР и секвенирования.

4.2.3. Апробация метода и анализ полученных данных.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Использование ПЦР и секвенирования для выявления и анализа генома коронавируса крупного рогатого скота"

Актуальность темы. Инфекционные болезни желудочно-кишечного тракта молодняка КРС представляют собой одну из важнейших проблем современного животноводства. Многочисленными исследованиями было установлено, что одним из основных факторов в этиологии диареи телят является коронавирус КРС (КВ КРС), который относят к роду Coronavirus семейства Coronaviridae. Вирус поражает преимущественно органы пищеварительного тракта животных, вызывая острые энтериты, однако он также может являться причиной воспаления верхних дыхательных путей и пневмонии. Заболевание наносит серьезный ущерб сельскому хозяйству во всем мире ввиду высокой контагиозности, высокого процента гибели и выбраковки телят (до 40-50% и более) и продолжительного, до нескольких месяцев, снижения молочной продуктивности у коров. Наиболее широко и остро болезнь протекает в стойловый период, особенно при массовых отелах.

КВ КРС способен персистировать в стадах на протяжении нескольких лет без видимых клинических проявлений, периодически вызывая вспышки заболевания. В период бессимптомного персистирования вируса для его выявления требуются высокочувствительные методы. Низкая устойчивость вирионов к внешним воздействиям также осложняет выявление патогена, поэтому традиционные методы выявления КВ КРС (электронная микроскопия, иммунофлуоресцентный анализ, реакция гемагглютинации) не всегда способны установить присутствие вируса. Кроме того, проведение тестов, основанных на гемагглютинации, затруднено тем, что образцы фекалий, используемые для диагностики этого заболевания, содержат неспецифические гемагглютинирующие агенты. Выявление в сыворотке крови животных вирусспецифических антител не всегда позволяет судить о наличии возбудителя, т.к. у телят их присутствие может быть обусловлено колостральным иммунитетом, а у взрослых животных вакцинацией или заболеванием, прошедшим в более раннем возрасте.

Применение методов молекулярной биологии, таких как ПЦР и секвенирование, открывает широкие возможности для выявления и изучения инфекционных агентов. От традиционных методов диагностики ПЦР отличает высокая аналитическая чувствительность и специфичность, что позволяют установить присутствие вируса в исследуемой пробе даже по фрагменту генома. Секвенирование амплифицированного в ПЦР участка вирусного генома и последующий анализ полученных данных подтверждает специфичность реакции и позволяет идентифицировать и дифференцировать штаммы и изоляты вируса. Поскольку проводимые ранее диагностические исследования показали широкое распространение КВ КРС на территории РФ, разработка методики выявления и штаммовой дифференциации вируса на основе ПЦР и нуклеотидного секвенирования, с последующим анализом амплифицированных нуклеотидных последовательностей генома изолятов, выявленных на территории Российской Федерации, которая прежде не изучалась, что имеет как научное, так и практическое значение.

Цель и задачи исследований. Основной целью данных исследований являлась разработка методов выявления и штаммовой дифференциации коронавируса КРС, а также анализ первичной структуры изолятов, выявленных на территории РФ и штаммов изученных ранее.

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

- разработать методы выявления и штаммовой дифференциации коронавируса КРС из различных биоматериалов на основе ПЦР и секвенирования вариабельных областей генома;

- изучить возможность применения разработанных методов для выявления коронавируса КРС в патматериале от телят и взрослых животных;

- установить первичную структуру амплифицированных фрагментов генома штаммов и полевых изолятов коронавируса КРС, создать банк данных нуклеотидных последовательностей;

- провести сравнительный анализ первичной структуры штаммов и полевых изолятов коронавируса КРС.

Научная новизна исследований. Впервые разработаны методы выявления и штаммовой дифференциации коронавируса КРС на основе ПЦР и нуклеотидного секвенирования амплифицированных фрагментов генома вариабельных областей гемагглютинин-эстеразного (НЕ) и спайкового (Б) генов. Определены оптимальные условия проведения ПЦР и секвенирования. Показана возможность применения разработанных методов для выявления коронавируса КРС в образцах патматериала от телят и взрослых животных.

Впервые определена первичная структура вариабельных фрагментов НЕ и S генов изолятов коронавируса КРС, выявленных на территории РФ. Проведен сравнительный анализ первичной структуры исследованых фрагментов генома штаммов и полевых изолятов коронавируса КРС. Нуклеотидные последовательности вариабельной области гемагглютинин-эстеразного гена тринадцати выявленных изолятов депонированы в GenBank (AY184411-AY184423).

Практическая значимость исследований. Разработаны, одобрены ученым советом и утверждены директором института: в 1999г. - "Методика выявления и штаммовой дифференциации коронавируса крупного рогатого скота с помощью ПЦР и секвенирования фрагмента НЕ гена" и в 2003г - "Методика выявления и штаммовой дифференциации коронавируса крупного рогатого скота с помощью ПЦР и секвенирования вариабельной области S гена". Установлена первичная структура вариабельной области гемагглютинин-эстеразного гена 3 штаммов коронавируса крупного рогатого скота из коллекции музея ВНИИЗЖ и 17 полевых изолятов, выявленных на территории РФ. Определена первичная структура вариабельной области спайкового гена 2 штаммов коронавируса крупного рогатого скота из коллекции музея ВНИИЗЖ и 8 полевых изолятов, выявленных на территории РФ. Данные методы применяются для выявления и штаммовой дифференциации KB КРС в образцах различных биоматериалов как от живых, так и от павших животных. Результаты исследований учитываются при постановке диагноза.

Основные положения выносимые на защиту:

- метод выявления и штаммовой дифференциации коронавируса крупного рогатого скота, основанный на амплификации вариабельной области гемагглютинин-эстеразного гена и сравнительном анализе первичной структуры амплифицированного фрагмента;

- сравнительный анализ первичной структуры штаммов и изолятов коронавируса крупного рогатого скота.

Апробация работы. Основные материалы диссертации были доложены на конференции молодых ученых "Актуальные проблемы патологии свиней, крупного и мелкого рогатого скота" ВНИИЗЖ, г. Владимир (2002 г.), международной научно-практической конференции "Актуальные проблемы болезней молодняка" г. Воронеж (2002 г.) и на 4-й Всероссийской научно-практической конференции "Генодиагностика инфекционных заболеваний" г. Москва (2002 г.).

Публикация результатов исследований. Результаты исследований изложены-в 6 печатных работах.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 103 страницах и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, результаты собственных исследований и их обсуждение, заключение, выводы и приложение. Список литературы включает 142 источника. Работа иллюстрирована 16 рисунками и 10 таблицами.

Заключение Диссертация по теме "Вирусология", Кудрявцев, Владислав Александрович

6. ВЫВОДЫ

1. Разработаны методики выявления генома и штаммовой дифференциации короиавируса КРС из различных биоматериалов на основе ПЦР и секвенирования вариабельной области гемагглютинин-эстеразного (НЕ) и спайкового генов (S). Чувствительность этих методов составляет 1,5 lg ТЦД50/мл.

4. Определены нуклеотидные и соответствующие аминокислотные последовательности вариабельной области гемагглютинин-эстеразного гена 17 полевых изолятов, выявленных на территории РФ и 3 штаммов коронавирус КРС. Созданный банк данных первичной структуры 41 штамма и изолята коронавируса КРС, выявленных на территории РФ и за рубежом, может быть использован для сравнительного анализа вновь выявленных изолятов вируса.

6. Определены нуклеотидные и соответствующие аминокислотные последовательности амплифицированного фрагмента S1B области S гена 8 полевых изолятов, выявленных на территории РФ, и 2 штаммов коронавируса КРС. Создан банк данных первичной структуры анализируемого фрагмента S гена 30 штаммов и изолятов KB КРС.

8. Показано, что все изоляты коронавируса КРС, выявленные на территории РФ, как и большинство известных штаммов и изолятов в исследуемой области содержат три потенциальных сайта гликозилирования. Установлено, что для всех изученных штаммов и изолятов КВ КРС характерно отсутствие в исследуемой области вставок и делеций.

9. Установлено, что штаммы и изоляты коронавируса КРС, имеющие сходство первичной структуры по двум исследуемым фрагментам генома, с высокой степенью вероятности имеют общее происхождение.

7. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

На основании проведенных исследований предлагаются для использования в практической работе рассмотренные и одобренные Ученым советом и утвержденные директором ВНИИЗЖ методики:

Методика выявления и штаммовой дифференциации коронавируса крупного рогатого скота с помощью ПЦР и секвенирования фрагмента НЕ гена";

Методика выявления и штаммовой дифференциации коронавируса крупного рогатого скота с помощью ПЦР и секвенирования вариабельной области Б гена".

Создан банк нуклеотидных последовательностей вариабельных областей гемагглютинин-эстеразного и спайкового генов отечественных и зарубежных штаммов и полевых изолятов коронавируса КРС.

5. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

С целью разработки метода индикации и идентификации KB КРС был исследован банк данных первичной структуры вируса. Наибольший объем данных, что имеет большое значение при подборе праймеров, был накоплен по НЕ гену. Сравнительный анализ опубликованных нуклеотидных последовательностей НЕ гена различных штаммов и изолятов KB КРС позволил выявить наиболее вариабельную область. В результате дальнейшего анализа были выбраны восемь праймеров, фланкирующих этот фрагмент генома. Четыре из них, которые, как было установлено в опыте, отвечали требованиям, были выбраны для ПЦР. На примере референтного штамма Nebraska были оптимизированы условия постановки реакции. Чувствительность и специфичность реакции была подтверждена на трех штаммах KB КРС. С использованием тех же праймеров успешно испытан вариант ПЦР "continuous".

С помощью разработанного метода исследованы пробы патматериала как от больных, так и от павших или вынуждено убитых телят и взрослых животных с кишечной или респираторной клиникой. Для анализа использовали фекалии, соскоб эпителия кишечника, носовые истечения, смывы и соскобы трахеи, легкие, селезенку и лимфоузлы.

Выделение суммарной РНК осуществляли с использованием фильтров GF/F (GF/C). От отечественных и зарубежных коммерческих наборов, как установлено в эксперименте, данный метод отличала быстрота, удобство, высокий выход продукта и низкая стоимость.

Геном KB КРС был выявлен в 20 случаях, что составляет 20% всех исследованных материалов. Вирус выявляли в фекалиях, слизистой оболочке тонкого кишечника, в носовых истечениях, в смывах трахеи и в легких телят. В лимфоузлах и селезенке геном KB КРС не обнаруживали.

В большинстве случаев при диарейном синдроме вирус выявляли у телят в возрасте 1-2 недель. Данный срок проявления энтерической коронавирусной инфекции КРС является наиболее характерным, тем не менее, KB КРС выявляли у телят в возрасте от двух дней до двух месяцев. В двух случаях вирус был выявлен при диарее взрослых животных.

Клинические признаки респираторной КВ инфекции КРС обычно проявляются у телят в возрасте 2-16 недель. В наших исследованиях геном КВ КРС был обнаружен в носовых истечениях, трахее и легких телят в возрасте от 1 до 6 месяцев. В одном случае вирус выявлен у коров с острой респираторной клиникой. Нужно отметить, что у животных с респираторным синдромом вирус выявлялся довольно часто - 45% всех положительных результатов, при этом в 10% случаев его выявляли при смешанной (диарейной и респираторной) клинике, как в кишечнике, его содержимом, так и в разных отделах респираторного тракта.

У пораженных КВ КРС животных наблюдалась депрессия, анарексия и дегидратация. Повышения температуры тела обычно не отмечалось. При диарее живот вздут, животные быстро худеют. Фекалии часто желтого или зеленого цвета, иногда (у взрослых животных в обоих случаях) со слизью и кровью. При вскрытии в кишечнике отмечали гиперемию, катарально-геморрагические воспаления, кровоизлияния под слизистой. При респираторных заболеваниях отмечалось обильное слюнотечение, истечения из носовой полости, затрудненное дыхание, кашель. В трахее и бронхах часто обнаруживали серозный эксудат, а в легких пневмонию и крупозное воспаление. Однако подобную клиническую картину могут вызывать многие этиологические агенты, поэтому для идентификации возбудителя решающее значение имеют лабораторные исследования.

В ходе исследования были установлены нуклеотидные последовательности фрагмента НЕ гена (918-1146 н.) 3 штаммов и 17 выявленных нами полевых изолятов КВ КРС. Полученные и ранее опубликованные нуклеотидные последовательности этого участка НЕ гена 41 штамма и изолята КВ КРС сравнили между собой.

Высокая стабильность первичной структуры генома, нехарактерная для других РНК-содержащих вирусов и, в частности, представителей рода Coronavirus, наблюдается и при сравнении нуклеотидных последовательностей вариабельной области НЕ гена КВ КРС. Максимальные различия между двумя сравниваемыми последовательностями составляют 5,7%. Из 228 позиций нуклеотидные замены были выявлены только в 36 (15,79%). Из них в 21 позиции (58,3%) замены выявлены только в одном случае. Все нуклеотидные замены приводят к смене 12 а.о. (33,3%), сайты гликозилирования при этом изменений не претерпевали. Замены в аминокислотной последовательности были распределены случайным образом. Сравнение антигенных свойств и полноразмерных аминокислотных последовательностей НЕ гликопротеина пяти изолятов зимней дизентерии и семи изолятов диареи неонатальных телят не выявило характерных отличий между двумя этими группами изолятов.

По данным веНпаз с соавт. [43] наличие пролина в 367 позиции аминокислотной последовательности НЕ гликопротеина коррелирует с вирулентностью КВ КРС. Полевые изоляты, выявленные нами на территории РФ, практически все содержали пролин в 367 позиции. Исключение составляет изолят Кавернино/12/00, выявленный в содержимом тонкого кишечника от телят 1-2 месячного возраста с респираторной клиникой. Диспепсии при этом у телят не наблюдали. В образцах материала легких и трахеи вирус обнаружить не удалось, что может служить подтверждением низкой вирулентности или авирулентности изолята. Во всех остальных случаях наблюдалась прямая зависимость между локализацией вируса и клиническими признаками заболевания.

Сравнительный анализ исследуемого фрагмента генома позволил дифференцировать большинство штаммов и изолятов вируса, однако с его помощью не удалось установить зависимость уровня сходства первичной структуры от времени и места выявления изолятов. Так, некоторые штаммы и изоляты, выявленные в Америке и РФ со значительной разницей во времени, демонстрировали сходство первичной структуры, и, наоборот, штаммы и изоляты одновременно выявляемые в одном регионе имели существенные различия.

По всей видимости полученные результаты сравнительного анализа обусловлены генетическими особенностями исследуемого участка генома. Главным образом, по нашему мнению, это связано с низкой вариабельностью и локализацией возникающих замен. Так, при сравнении 41 последовательности вариабельной области длиной 228 н. нуклеотидные замены были выявлены только в 36 позициях (15,79%), из которых при установлении филогенетических отношений между изолятами вируса, значение имеют только 15 позиций (41,67%). В 13 из них (86,67%) обнаружены лишь 2 варианта нуклеотидов. Это обстоятельство определяет высокую вероятность случайного совпадения, что вполне может обуславливать сходство нуклеотидных последовательностей филогенетически удаленных и значительную разницу филогенетически близких штаммов и изолятов вируса.

Однако не следует забывать, что при современном уровне развития коммуникаций распространение вируса прежде всего зависит не от расстояния, на котором находятся животноводческие хозяйства, а от их экономических отношений, и что распространению вируса способствует практика закупки племенного скота.

Отмеченные особенности, по нашему мнению, не позволяют судить о филогенетической близости изучаемых штаммов на основании только лишь сравнительного анализа выбранного фрагмента НЕ гена, что могло бы иметь немаловажное значение для установления возможного источника инфекции. По крайней мере, имеющихся данных недостаточно для установления корреляции между степенью филогенетического родства различных штаммов KB КРС и уровнем сходства первичной структуры их генома.

Альтернативный метод был разработан с целью увеличения дифференцирующей способности, а также, по возможности, для установления филогенетических отношений между штаммами и изолятами вируса.

Для амплификации и последующего анализа был выбран фрагмент генома длиной 598 н. (1551 - 2149 н.) S1B области S гена, кодирующей вариабельную область и наиболее важные антигенные детерминанты вируса. Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей этого фрагмента, в общем виде, отражал филогенетические отношения ранее изученных штаммов и изолятов KB КРС, выявленных в США, Канаде и Франции.

Для индикации патогена был разработан "nested" вариант ПЦР, с двумя парами праймеров. Условия постановки реакции были оптимизированы на референтном штамме Nebraska. Как показал эксперимент чувствительность метода составила 1,5 lg ТЦД50/мл, а его специфичность не уступала ранее разработанному. Апробацию метода проводили как на лабораторных штаммах KB КРС, так и на полевых изолятах вируса.

В ходе исследования были установлены нуклеотидные последовательности фрагмента S гена (1551 - 2149 н.) штаммов KB КРС Nebraska и ВНИИЗЖ, а так же 8 полевых изолятов выявленных на территории РФ. Полученные и ранее опубликованные нуклеотидные последовательности этого участка S гена 30 штаммов и изолятов KB КРС сравнили между собой.

Из 598 возможных позиций замены были выявлены в 95 (15,89%). Из них значимыми были 32 (33,68%). Из 95 позиций, в которых выявлены нуклеотидные замены, в 49 (51,58%) позициях какой-либо один из сравниваемых штаммов отличался от всех остальных. Из остальных 46 позиций в 27 (58,70%) встречаются 2 варианта нуклеотидов, что на 27,97% меньше чем в анализируемом фрагменте НЕ гена.

Ранее предполагалось, что по 531, 578 и 691 позициям аминокислотной последовательности S гена можно дифференцировать респираторные штаммы и изоляты KB КРС от остальных [43]. Однако полученные нами данные не подтвердили это предположение.

Различия первичной структуры штаммов и изолятов KB КРС в анализируемой области S гена выше, чем в исследованой области НЕ гена. Нуклеотидные последовательности анализируемого фрагмента S гена были идентичны только у штаммов ВНИИЗЖ и Quebec. Таким образом, выбранный фрагмент генома лучше подходит для штаммовой дифференциации вируса.

Тем не менее, прямой зависимости уровня сходства первичной структуры от времени и места выявления изолятов так же не наблюдалось. При этом данные результаты не подтверждали ранее полученные по НЕ гену. Различия между ними свидетельствуют о том, что, по крайней мере один из фрагментов (S или НЕ гена), не отражает филогенетических отношений между штаммами и изолятами вируса. Сравнительный анализ объединенных анализируемых нуклеотидных последовательностей так же не отразил искомой зависимости.

Таким образом, наличие филогенетических отношений между штаммами и изолятами KB КРС с высокой степенью вероятности можно утверждать лишь тогда, когда имеется значительное сходство первичной структуры по двум сравниваемым фрагментам, как, например, у штаммов Mebus, BCV L9, Nebraska, Quebec и ВНИИЗЖ.

Тем не менее, успешное выявление KB КРС в образцах патматериала позволяет использовать предложенные методы для диагностики коронавирусной инфекции и дифференциации штаммов и изолятов вируса и, в частности, для дифференциации штамма ВНИИЗЖ, используемого для изготовления вакцинных препаратов от полевых изолятов KB КРС, циркулирующих на территории РФ, что имеет большое практическое значение.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Кудрявцев, Владислав Александрович, Владимир

1. Вирусология: В 3 т. М.: Мир, 1989. - Т. 1. - С. 6.

2. Вишняков И. Ф., Лагуткин Н.А., Стрижаков А.А. и др. Коронавирусные инфекции животных. Покров, 1997. - 69 с.

3. Грибанов О.Г., Щербаков А.В., Перевозчикова Н.А. и др. Использование аэросила А-300 и фильтров GF/F (GF/C) для очистки фрагментов ДНК, ДНК плазмид и РНК // Биохимия. 1996. - Т.61, вып.6. - С. 1064-1070.

4. Грибанов О.Г., Щербаков А.В., Перевозчикова Н.А. и др. Простой метод выделения и очистки РНК // Биоорган, химия. 1997. - Т. 23, №9 - С. 763-765.

5. Зинковский Ю.В., Колосов С.Н., Дрыгин В.В. Программа построения профиля вариабельности гомологичных последовательностей биополимеров SQ-MAX // Пробл. инфекц. патологии с.-х. ж-ных: Тез. докл. конф. Владимир, 1997. -С. 165.

6. Исаева Е.В. Биологические свойства штаммов коронавируса крупного рогатого скота и метод контроля иммуногенной активности коронавирусной вакцины: Автореф. дис. канд. вет. наук. М., 1992. - 21 с.

7. Сатторов И.Т. Эпизоотология, диагностика, терапия и профилактика коронавирусного энтерита телят в условиях республики Таджикистан: Автореф. дис. д-ра. вет. наук. -М., 1995. -45 с.

8. Соколова H.J1. Коронавирусный энтерит телят (лабораторная диагностика и специфическая профилактика). М., 1993. - 46 с.

9. Сюрин В.Н., Самуйленко А.Я., Соловьев Б.В., Фомина Н.В. Вирусные болезни животных. М.: ВНИТИБП, 1998. - С.206-209.

10. Abraham S., Kienzle Т.Е., Lapps W., Brian D.A. Deduced sequence of the bovine coronavirus spike protein and identification of the internal proteolytic cleavage site // Virology. 1990. - Vol. 176. - P.296-301.

11. Acres S.D., Laing C.J., Saunders J.R., Radostits O.M. Acute undifferentiated neonatal diarrhoea in beef calves. Occurrence and distribution of infectious agents // Can. J. Сотр. Med. 1975. - Vol. 39. - P.l 16-132.

12. Akashi H., Inaba Y., Miura Y. et al. Properties of a coronavirus isolated from a cow with epizootic diarrhoea // Vet. Microbiol. 1980. - Vol. 5. - P.265-276.

13. Babiuk L.A., Sahara M., Hudson G.R. Rotavirus and coronavirus infections in animals // Prog. Vet. Microbiol. Immunol. 1985. - Vol. 1. -P.80-120.

14. Benfield D.A., Saif L.J. Cell culture propagation of a coronavirus isolated from cows with winter dysentery // J. Clin. Microbiol. 1990. - Vol. 28. - P.1454-1457.

15. Boireau P., Cruciere C., Laporte J. Nucleotide sequence of the glycoprotein S gene of bovin enteric coronavirus and comparison with the S proteins of two mouse hepatitis virus strains // J.Gen. Virol. 1990. - Vol. 71. - P.487-492.

16. Boursnell M.E.G., Brown T.D.K. Sequencing of coronavirus IBV genomic RNA: A 195-base open reading frame encoded by mRNA // Gene. 1984. - Vol. 29. - P.87-92.

17. Boursnell M.E.G., Binns M.M., Brown T.D.K. Sequencing of coronavirus IBV genomic RNA: three open reading frames in the 5' "unique" region of mRNA // J. Gen. Virol. -1985. Vol. 66. - P.2253-2258.

18. Bridger J.C., Wood G.N., Meyling A. Isolation of coronaviruses from neonatal calf diarrhoea in Great Britain and Denmark // Vet. Microbiol. 1978. - Vol. 3. - P.101-113.

19. Broes A., van Opdenbosh E., Willemans G. Isolement d'un coronavirus chez des bovins atteints d'enterit hemmoragique hivernale (winter dysentery) en Belgique // Ann. Med. Vet. 1984. - Vol. 128. - P.299-303.

20. Bulgin M.S., Ward A.C.S., Barrett D.P., Lane V.M. Detection of rotavirus and coronavirus shedding in two beef cow herds in Idaho // Can. Vet. J. 1989. - Vol. 30. -P.235-239.

21. Collinns J.K., Riegel C.A., Olson J.D., Fountain A. Shedding of enteric coronavirus in adult cattle // Am. J. Vet. Res. 1987. - Vol. 48. - P.361-365.

22. Crouch C.F., Acres S.D. Prevalence of rotavirus and coronavirus antigens in the feces of normal cows // Can. J. Comp. Med. 1984. - Vol. 48. - P.340-342.

23. Crouch C.F., Raybould T.J.G., Acres S.D. Monoclonal antibody capture enzyme-linked immunosorbent assay for detection of bovine enteric coronavirus // J. Clin. Microbiol. -1984.-Vol. 19. -P.388-393.

24. Crouch C.F., Ohmann H.B., Wattes T.C. et al. Chronic shedding of bovine enteric coronavirus antigen-antibody complexes by clinically normal cows // J. Gen. Virol. -1985. Vol. 66. - P.1489-1500.

25. Cruciere C., Laporte J. Sequence and analysis of bovine enteric coronavirus (F15) genom // Ann. Inst. Pasteur. -1988. Vol. 139. - P.123-138.

26. Cyr-Coats K. St., Storz J., Hussan K.A., Schnorr K.L. Structural proteins of bovine coronavirus strain L9: effects of the host cell and trypsin treatment // Arch. Virol. -1988.-Vol. 103.-P.3 5-45.

27. Czerny C.P., Eichhorn W. Characterization of monoclonal and polyclonal antibodies to bovine enteric coronavirus: establishment of an efficient ELISA for antigen detection in feces // Vet. Microbiol. -1989. Vol. 20. - P.l 11-122.

28. Dea S., Roy R.S., Begin M.E. Counterimmunoelectroosmophoresis for detection of neonatal calf diarrhea coronavirus: methodology and comparison with electron microscopy // J. Clin. Microbiol. 1979. - Vol. 10. - P.240-244.

29. Dea S., Roy R.S., Begin M.E. Physicochemical and biological properties of neonatal calf diarrhea coronaviruses isolated in Quebec and comporison with the Nebraska calf coronavirus // Am. J. Vet. Res. 1980. - Vol. 41. - P.23-29.

30. Dea S., Roy R.S., Begin M.E. Bovine coronavirus isolation and cultivation in continuous cell lines // Am. J. Vet. Res. 1980. - Vol. 41. - P.30-38.

31. Dea S., Michaud L., Milane G. Comparison of bovine coronavirus isolates associated with neonatal calf diarrhoea and winter dysentery in adult dairy cattle in Quebec // J. Gen. Virol. 1995. - Vol. 76. - P.1263-1270.

32. Deregt D., Babiuk L.A. Monoclonal antibodies to bovine coronavirus: characteristics and topographical mapping of neutralizing epitopes on the E2 and E3 glycoproteins // Virology. -1987. Vol. 161. - P.410-420.

33. Deregt D., Sabara M., Babiuk L.A. Structural proteins of bovine coronavirus and their intracellular processing // J. Gen. Virol. -1987. Vol. 68. - P.2863-2877.

34. Deregt D., Parker M.D., Cox., Babiuk L.A. Mapping of neutralizing epitopes to fragments of the bovine coronavirus E2 protein by proteolysis of antigen-antibody complexes // J. Gen. Virol. -1989. Vol. 70. - P.647-658.

35. Deregt D., Gifford G. F., Ijaz M. K. et al. Monoclonal antibodies to bovine coronavirus glycoproteins E2 and E3: demonstration of in vitro virus-neutralizing activity // J. Gen. Virol. 1989. - Vol. 70. - P.993-998.

36. Dubois-Dalcq M.E., Doller E.W., Haspel M.V., Holmes K.V. Cell tropism and expression of mouse hepatitis viruses (MHV) in mouse spinal cord cultures // Virology. 1982.-Vol. 119. -P.317-331.

37. Durham P.J.K., Stevenson B.J., Farquharson B.C. Rotavirus and coronavirus associated diarrhoea in domestic animals // N. Z . Vet. J. 1979. - Vol. 27. - P.30-32.

38. Durham P.J.K., Hassard L.E., Armstrong K.R., Naylor J.M. Coronavirus-associated diarrhea (winter dysentery) in adult cattle // Can. Vet. J. 1989. - Vol. 30. - P.825-827.

39. E1-Ghorr A.A., Snodgrass D.R., Scott F.M.M. Evaluation of an immunogold electron microscopy technique for detecting bovine coronavirus // J. Virol. Methods. 1988. -Vol. 19. - P.215-224.

40. Espinasse J., Viso M., Laval A. et al. Winter dysentery: a coronavirus-liked agent in the feces of beef and dairy cattle with diarrhoea // Vet. Rec. 1982. - Vol. 110. - P.385.

41. Gallagher T.M., Parker S.E., Buchmeier M.J. Neutralization-resistant variants of aneurotropic coronavirus are generated by deletions within the amino-terminal half of the spike glycoprotein // J. Virol. 1990. - Vol. 64. - P.731-741.

42. Guy J., Brian D.A. Bovine coronavirus genom // J.Virol. 1979. - Vol. 29. - P.293-300.

43. Hajer I., Storz J. Antigens of bovine coronavirus strain LY-138 and their diagnostic properties // Am. J. Vet. Res. 1978. - Vol. 39 - P.441-444.

44. Heckert R.A., Saif L.J., Hoblet K.H., Agnes A.G. A longitudinal study of bovine coronavirus enteric and respiratory infections in dairy calves in two herds in Ohio // Vet. Microbiol. 1990. - Vol. 22. - P.187-201.

45. Heckert R.A., Saif LJ., Myers G.W. Mucosal and systemic isotype-specific antibody responses to bovine Coronavirus structural proteins in naturally infected dairy calves // Am. J. Vet. Res. 1991. - Vol. 52. - P.852-857.

46. Hogue B.G., Kienzle T.E., Brian D.A. Synthesis and processing of the bovine enteric Coronavirus haemagglutinin protein // J. Gen. Virol. 1989. - Vol. 70. - P.345-352.

47. Horner G.W., Hunter., Kirkbride C.A. Coronavirus-liked agent present in faeces of cows with diarrhoea // N. Z. Vet. J. 1975. - Vol. 23. - P.98.

48. Hussain K.A., Storz J., Kousoulas K.G. Comparison of bovine Coronavirus vaccine and wild-type strains // Virology. 1991. - Vol. 183. - P.442-445.

49. Kapil S., Trent A.M., Goyal S.M. Excretion and persistence of bovine Coronavirus in neonatal calves // Arch. Virol. 1990. - Vol. 115. - P.127-132.

50. Kapil S., Pomeroy K.A., Goyal S.M., Trent A.M. Experimental infection with a virulent pneumoenteric isolate of bovine Coronavirus // J. Vet. Diagn. Invest. 1991. - Vol. 3. -P.88-89.

51. Kienzle T.E., Abraham S., Hogue B.G., Brian D.A. Structure and orientation of expressed bovine Coronavirus hemagglutinin-esterase protein // J. Virol. 1990. - Vol. 64. -P.1834-1838.

52. King B., Brian D.A. Bovine Coronavirus structural proteins // J. Virol. 1982. - Vol. 42. - P.700-707.

53. King B., Potts B.J., Brian D.A. Bovine coronavirus hemagglutinin-esterase protein 11 Virus Res. 1985. - Vol. 2. - P.53-59.

54. Kourtesis A.B., Gelinas A., Dea S. Genomic and antigenic variations of the HE glycoprotein of bovine coronaviruses associated with neonatal calf diarrhea and winter dysentery // Arch. Virol. 2001. - Vol. 146. - P. 1219-1230.

55. Langpap T. J., Bergeland M. E., Reed D.E. et al. Coronaviral enteritis of young calves: virologic and pathologic findings in naturally occurring infections // Am. J. Vet. Res. -1979.-Vol. 40.-P. 1476-1478.

56. Lapps W., Hogue B.G., Brian D.A. Sequence analysis of the bovine coronavirus nucleocapsid and matrix protein genes // Virology. 1987. - Vol. 157. - P.47-57.

57. Leibowitz J.T., Perlman S., Weinstock G. et al. Detection of a murine coronavirus nonstructural protein encoded in a downstream open reading frame // Virology. 1988. -Vol. 164. -P.156-164.

58. Lewis L.D., Phillips R.W. Pathophysiologic changes due to coronavirus-induced diarrhea in the calf// J. Am. Vet. Med. Ass. 1978. - Vol. 173. - P.636-642.

59. Lucas K., Busch M., Mossinger S., Thompson J.A. An improved microcomputer program for finnding gene or gene family-specific oligonucleotides suitable as primers for polymerase chain reaction or as probes // CABIOS. - 1991. - Vol. 7. - P.525-529.

60. Luytjes W., Bredenbeek P.J., Noten A.F. et al. Sequence of mouse hepatitis virus A59 mRNA2: indications for RNA recombination between coronaviruses and influenza C virus // Virology. 1988. - Vol. 166. - P.415-422.

61. Marsolais G., Assaf R., Montpetit C., Marois P. Diagnosis of viral agents associated with neonatal calf diarrhoea // Can. J. Comp. Med. 1978. - Vol. 42. - P.168-171.

62. McNulty M.S., Bryson D.G., Allan G.M., Logan E.F. Coronavirus infection of the bovine respiratory tract // Vet. Microbiol. 1984. - Vol. 9. - P.425-434.

63. Mebus C.A., White R.G., Stair E.L., et al. Neonatal calf diarrhea: results of a field trial using a reo-like virus vaccine // Vet.Med. Small Anim. Clin. 1972. - Vol. 67. - P. 173178.

64. Mebus C.A., Stair E.L., Rhodes M.B., Twiehaus M.J. Pathology of neonatal-calf diarrhea induced by a coronavirus-like agent // Vet. Pathol. 1973. - Vol. 10. - P.45-64.

65. Mebus C.A., Newman L.E., Stair E.L. Scanning electron, light and immunofluorescent microscopy of intestin gnotobiotic calf infected with calf diarrheal coronavirus // Am. J. Vet. Res. 1975.-Vol. 36.-P.1719-1725.

66. Montpetit M.L., Cassol S., Salas T., O'Shaughnessy M.V. OLIGOSCAN: A computer program to assist in the design of PCR primers homologous to multiple DNA sequences // J. Virol. Methods. 1992. - Vol. 36. - P. 119-128.

67. Moon H.W., McClurkin A.W., Isaacson R.E. et al. Pathogenic relationships of rotavirus, Esherichia coli, and other agents in mixed infections in calves // J. Am. Vet. Med. Ass. -1978.-Vol. 173. -P.577-583.

68. Mostl K., Burki F. Bovine coronavirus is also a cause of respiratory disease in calves // Proc. 11th Int. Symp. W.A.V.M.I. 1989. - P. 191.

69. Mullaney T.P., Newman L.E., Whitehair C.K. Hummoral immune respose of the bovine fetus to in utero vaccination with attenuated bovine coronavirus // Am. J. Vet. Res. -1988.-Vol. 49. — P.156-159.

70. Pallansch L., Beswick H., Talian J., Zelerkc P. Use of an RNA folding algorithm to choose regions for amplification by polymerase chain reaction // Anal. Biochem. 1992. -Vol. 185. -P.57-62.

71. Parker M.D., Cox G.J., Deregt D. et al. Cloning and in vitro expression of the gene for the E3 haemagglutinin glycoprotein of bovine coronavirus // J. Gen. Virol. 1989. -Vol. 70. -P.155-164.

72. Parker M.D., Yoo D., Babiuk L.A. Expression and secretion of the bovine coronavirus hemagglutinin-esterase glycoprotein by insect cells infected with recombinant baculoviruses // J. Virol. 1990. - Vol. 64. - P.1625-1629.

73. Parker M.D., Yoo D., Cox G.J., Babiuk L.A. Primery structure of the S peplomer gene of bovine coronavirus and surface expression in insect cells // J. Gen. Virol. 1990. -Vol. 71. -P.263-270.

74. Payne H.R., Storz J. Analysis of cell fision induced by bovine coronavirus infection // Arch. Virol. 1988. - Vol. 103. - P.27-33.

75. Payne H.R., Storz J. Scanning electron mocroscopic characterization of bovine coronavirus plaques in HRT cells // J. Vet. Med. 1990. - Vol. 37. - P.501-508.

76. Payne H.R., Storz J., Henk W.G. Bovine coronavirus antigen in the host cell plasmalemma // Exp. Mol Pathol. 1990. - Vol. 53. - P. 152-159.

77. Pensaert M., Callebaut P. The coronaviruses: clinical and structural aspects with some practical implications // A. Med. Vet. 1978. - Vol. 122. - P.301-322.

78. Radostits O.M., Acres S.D. The prevention and control of epidemics of acute undifferentiated diarrhea of beef calves in western Canada // Can. Vet. J. 1980. -Vol. 21. -P.243-249.

79. Rekik M.R., Dea S. Comparative sequence analysis a polymorphic region of the spike glycoprotein SI subunit of enteric bovine coronavirus isolates // Arch. Virol. 1993. -Vol. 135. -P.319-331.

80. Reynolds D. J., Chasey D., Scott A.C., Briger L.C. Evaluation of ELISA electron microscopy for the detection of coronavirus and rotavirus in bovine faeces // Vet. Rec. -1984.-Vol. 114. -P.397-401.

81. Reynolds D. J., Debney T.G., Hall G.A. et al. Studies on the relationship between coronaviruses from the intestinal and respiratory tract of calves // Arch. Virol. 1985. -Vol. 85. -P.71-83.

82. Reynolds D. J., Morgan J.H., Chanter N. et al. Microbiology of calf diarrhoea in southern Britain // Vet. Rec. 1986. - Vol. 119. - P.34-39.

83. Rodak L., Babiuk L.A., Acres S.D. Detection by radioimmunoassay and enzymelinked immunosorbent assay of coronavirus antibodies in bovine serum and lacteal secretions // J. Clin. Microbiol. 1982. - Vol. 16. - P.34-40.

84. Roseto A., Bobulesco P., Laporte L. et al. Bovine enteric coronavirus structure and studied by a freez-drying technique // J. Gen. Virol. 1982. - Vol. 63. - P.241-245.

85. Saif L.J. Passive immunity to Coronavirus and rotavirus infections in swine and cattle: enhancement by maternal vaccination // Infectious Diarrhoea in the Joung / Ed. by Tzipori S. et al. Amsterdam, 1985. - P. 456-467.

86. Saif L.J., Redman D.R., Moorhead P.D., Theil K.L. Experimentally induced Coronavirus infections in calves: viral replication in the respiratory and intestinal tracts // Am. J. Vet. Res. 1986. - Vol. 47. - P. 1426-1432.

87. Saif L.J. Development of nasal, fecal and serum isotype-specific antibodies in calves challenged with bovine Coronavirus or rotavirus // Vet. Immunol. Immunopathol. -1987.-Vol. 17.-P.425-439.

88. Saif L.J. A review of evidence implicating bovine Coronavirus in the etiology of winter dysentery in cows: an enigma resolved // Cornell Vet. 1990. - Vol. 80. - P.303-311.

89. Saif L.J., Brock K.V., Redman D.R., Kohler E.M. Winter dysentery in dairy herds: electron microscopic and serological evidence for an association with Coronavirus infection // Vet. Ree. 1991. - Vol. 128. - P.447-449.

90. Saif L.J., Redman D.G., Brock K.V. et al. Winter dysentery in adult dairy cattle: detection of Coronavirus in the feaces // Vet. Ree. 1988. - Vol. 123. - P.300-301.

91. Sanger F., Niclen S., Coulson R. DNA sequencing with chain terminating inhibitors // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1977. - Vol. 74. - P.5463-5467.

92. Sato K., Inaba Y., Kurogi H. et al. Hemagglutination by calf diarrhea Coronavirus // Vet. Microbiol. 1977. - Vol. 2. - P.83-87.

93. Sato K., Inaba Y., Tokuhisa S. Detection of bovine Coronavirus in feces by reversed passive hemagglutination // Arch. Virol. 1984. - Vol. 80. - P.23-31.

94. Schulze B., Gross HJ., Brossmer R. et al. Hemagglutinating encephalomyelitis virus attaches to N-acetyl-9-O-acelylated sialic acid as a receptor determinant // Virus Res. -1990.-Vol. 16. -P.185-194.

95. Schulze B., Gross H.J., Brossmer R., Herrler G. The S protein of bovine Coronavirus is a hemagglutinin recognizing 9-O-acetylated sialic acid as a receptor determinant // J. Virol. 1991. - Vol. 65. -P.6232-6237.

96. Schulze B., Wahn K., Klenk H.D., Herrler G. Isolated HE-protein from hemagglutinated encephalomyelitis virus and bovine Coronavirus has receptor destroying and receptor biding activity// Virology. 1991. - Vol. 180. - P. 221-228.

97. Schultze B., Heller G. Bovine Coronavirus uses N-acety-9-O-acetylneuraminic acid as a receptor determinant to initiate the infection of culture cells // J. Gen. Virol. 1992. -Vol. 73. -P.901-906.

98. Sharpee R.L., Mebus C.A., Bass E.P. Characterization of a calf diarrheal Coronavirus // Am. J. Vet. Res. 1976. - Vol. 37. - P.1031-1041.

99. Shockley L.G., Kapke P.A., Lapps W. et al. Diagnosis of porcine and bovine enteric Coronavirus infections using cloned cDNA probes // J. Clin. Microbiol. 1987. -Vol. 25. -P.1591-1596.

100. Singh D.K., Singh N.P., Singh G.K. Pneumoenteric syndrome in bovine neonates by bovine Coronavirus // Ind. J. Vet. Med. 1985. - Vol. 5. - P.55-57.

101. Skinner MA., Ebner D., Siddell S.G. Coronavirus MHV-JHM mRNA 5 has a sequence arrangement which potencially allows translation of a second, downstrream open reading frame // J. Gen. Virol. 1985. - Vol. 66. - P.581-592.

102. Skinner M.A., Siddell S.G. Coding sequence of Coronavirus MHV-JHM mRNA 4 // J. Gen. Virol. 1985. - Vol. 66. - P.593-596.

103. Snodgrass D.R., Fahey K.L., Wells P.W. et al. Passive immunity in calf rotavirus infections: material vaccination increases and prolongs immunoglobulin Gl antibody secretion in milk // Infec. Immun. 1980. - Vol. 28. - P.344-349.

104. Snodgrass D.R., Stewart J., Taylor J. et al. Diarrhoea in dairy calves reduced by feeding colostrum from cows vaccinated with rotavirus // Res. Vet. Sei. 1982. - Vol. 32. - P.70-73.

105. Snodgrass D.R., Terzolo H.R., Sherwood D. et al. Aetiology diarrhoea in young calves//Vet. Ree. 1986.-Vol. 119.-P.31-34.

106. Spaan W., Cavanagh D., Horzinak M.C. Coronaviruses // Immunochemistry of Viruses. The Basis for Serodiagnosis and Vaccines / Ed. by M.H.V. Regenmortel & A.R. Neurath. Amsterdam, etc., - 1988. - P. 359-379.

107. Stair E.L., Rhodes M.B., White R.G., Mebus C.A. Neonatal calf diarrhea: purification and electron microscopy of a coronavirus-like agent // Am. J. Vet. Ree. -1972. Vol. 33. - P.l 147-1156.

108. Storz J., Rott R., Kuluza G. Enhancement of plaque formation and cell fusion of an enteropathogenic Coronavirus by trypsin treatment // Infec. Immun. 1981. - Vol. 31. -P.1214-1222.

109. Storz J., Herrler G., Snodgrass D.R. et al. Monoclonal antibodies differentiate betwenn the hemagglutinating and the receptor-destroying activities of bovine Coronavirus // J. Gen. Virol. 1991. - Vol. 72. - P.2817-2820.

110. Takahashi E., Inaba Y., Sato K. et al. Epizootic diarrhoea of adult cattle associated with coronavirus-like agent // Vet. Microbiol. 1980. - Vol. 5. - P. 151-154.

111. TakahashiE., Akashi H., Inaba Y. Bovine epizootic diarrhoea resembling winter dysentery caused by bovine Coronavirus // JARQ. 1983. - Vol. 17. - P.37-42.

112. Thomas L.H., Gourlay R.N., Stott E.J. et al. A search for new microorganisms in calf pneumonia by the inoculation of gnotobiotic calves // Res. Vet. Sei. 1982. - Vol. 33. -P.170-182.

113. Thurber E.T., Bass E.P., Beckenhauer W.H. Field trial evaluation of a reo-coronavirus calf diarrhea vaccine // Can. J. Comp. Med. 1977. - Vol. 41. - P. 131-136.

114. Traven M., Naslund K., Linde N. et al. Experimental reproduction of winter dysentery in lactating cows using BCV-comparison with BCV infection in milk-fed calves // Vet. Microbiol. 2001. - Vol. 81. - P. 127-151.

115. Tsunemitsu H., Yonemichi H., Hirai T. et al. Isolation of bovine Coronavirus from feces and nasal swabs of calves with diarrhoea // J.Vet. Med. Sei. 1991. - Vol. 53. -P.433-437.

116. Van Balken J.A.M., de Leeuw P.W., Ellens D.J., Straver P.J. Detection of Coronavirus in calf faeces with a haemadsorbtion-eluation-haemagglutination assay (HEHA) // Vet. Microbiol. 1978. - Vol. 3. - P.205-211.

117. Van Kruiningen HJ., Khairallah L.H., Sassevile V.G. et al. Calfhood Coronavirus enterocolotis: a clue to the etiology of winter dysentery // Vet. Pathol. 1987. - Vol. 24. -P.564-567.

118. Vautherot J.F., Laporte J. Utilization of monoclonal antibodies for antigenic characterization of coronaviruses // Ann. Rech. Vet. 1983. - Vol. 14. - P.437-444.

119. Vautherot J.F., Madelain M.F., Laporte J. Topological and functional analysis of epitopes on the S (E2) and HE (E3) glycoproteins of bovine enteric coronavirus // Adv. Exp. Med. Biol. 1990. - Vol. 276. - P. 173-179.

120. Verbeek A., Tijssen P. Biotinylated and radioactive cDNA probes in the detection by hybridization of bovine enteric coronavirus // Mol. Cell. Probs. 1988. - Vol. 2. -P.209-223.

121. Verbeek A., Tijssen P. Polymerase chain reaction for probe synthesis and for direct amplification in detection of bovine coronavirus // J. Virol. Methods. 1990. - Vol. 29. -P.243-256.

122. Verbeek A., Dea S., Tijssen P. Detection of bovine enteric coronavirus in clinical specimens by hybridization with cDNA probes // Mol. Cell. Probes. 1990. - Vol. 4. -P.107-120.

123. Vlasak R., Luytjes W., Leider J. et al. The E3 protein of bovine coronavirus is a receptor-desroying enzime with acetylesterase activity // J. Virol. 1988. - Vol. 62. -P.4686-4690.

124. Vlasak R., Luytjes W., Spaan W., Palese P. Human and bovine coronaviruses recognize sialic acid-containing receptors similar to those of influenza C viruses // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1988. - Vol. 85. - P.4526-4529.

125. Waltner-Toews D., Martin S.W., Meek A.H., McMillan I. A field trial to test the efficacy of a combined rotavirus-coronavirus/E. coli vaccine in dairy cattle // Proc. 4th Int. Symp. Neonatal diarrhoea. 1983. - P.456-483.

126. Woode G.N., Bridger J.C. Viral enteritis of calves // Vet. Rec. 1975. - Vol. 96. -P.85-88.

127. Woode G.N., Bridger J.C., Meyling A. Significance of bovine coronavirus infection // Vet. Rec. 1978. - Vol. 102. - P.15-16.

128. Yoo D., Parker M.D., Babiuk L.A. Analysis of the S spike (peplomer) glycoprotein of bovine coronavirus synthesised in insect cells // Virology. 1990. - Vol. 179. -P.121-128.

129. Yoo D., Parker M.D., Babiuk L.A. The S2 subunit of the spike glycoprotein of bovine coronavirus mediates membrane fusion in insect cells // Virology. 1991. -Vol. 180. -P.395-399.

130. Zygraich N., Georges A.M., Vascoboinic E. Etiologie des diarrhées néonatales du veau. Résultats d'une enquete sérologique relative aux virus reo-like et corona dans la population bovine belge // Ann. Med. Vet. 1975. - Vol. 119. - P.105-113.

131. Zhang X., Kousoulas K., Storz J. Comparison of the nucleotide and deduced amino acid sequences of the S genes specified by virulent and avirulent strains of bovine Coronavirus // Virology. 1991. - Vol. 183. - P.397-404.

Информация о работе

Кудрявцев, Владислав Александрович
кандидата биологических наук
Владимир, 2004
ВАК 03.00.06

Диссертация

Использование ПЦР и секвенирования для выявления и анализа генома коронавируса крупного рогатого скота - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы